Identificación del antígeno de superficie K en cepas deCampylobacter fetus subs. venerealis, intermedio y fetus

del UruguayMILTON CATTANEOEnfermedades InfecciosasFacultad de Veterinaria

A – RESUMEN

La vibriosis genital bovina es una enfermedad del ganado caracterizada por producirinfertilidad temporaria y abortos. El agente etiológico de la vibriosis bovina es elCampylobacter fetus. Dentro del género existen tres variedades patógenasvenerialis, intermedius y fetus. Se transmite en forma venérea y se localizan en elaparato reproductor del macho y la hembra. Un estudio realizado por el DILAVE enel año 2001esta enfermedad tiene una prevalencia para nuestro país en toros de un28.05 % y por establecimientos de un 37 %. Poseen antígenos termoestables (O),flagelares (H) y un antígeno superficial termolábil (K), denominado S-layer, quecubre al antígeno O. El antígeno K fue reconocido como factor en la generación deinmunidad y tener propiedades antifagociticas. Existen variaciones de este antígenodurante la infección lo que hace necesario saber las diferentes cepas que existen ennuestro país así como sus antigenos K para su utilización en la producción debiológicos. El objetivo de este trabajo es la identificación de la microcápsula encepas de Campylobacter fetus subs. venerealis, intermedio y fetus. Los resultadosmuestran la presencia de antígenos capsulares de superficie K en las cepasestudiadas

B – FUNDAMENTOS Y ANTECEDENTES

La vibriosis genital bovina es una enfermedad del ganado caracterizada porproducir infertilidad temporaria y abortos principalmente entre el quinto y sexto mesde gestación. El signo clínico en un rodeo es un bajo porcentaje de preñez, másacentuado en aquellos animales que no han tenido contacto previo con laenfermedad. Ha sido diagnosticado en humanos asociado a abortos, vaginosis ycuadros de gastroenteritis con diarrea.

Fue diagnosticada por primera vez por Mc Fadyean & Stockman en el ReinoUnido en 1913. Curiosamente el primer diagnóstico se llevó a cabo en un caso deabortos en ovinos. Theobald Smith en 1918 reconoció la presencia de estegermen en América y observó que era responsable de abortos e infertilidad enbovinos y lo reconoció también en los ovinos.

En nuestro país el primer diagnóstico fue realizado en 1967 por el Dr. Stella,utilizando técnicas de mucoaglutinación.El primer aislamiento del agente causal, se realizó a partir de mucus cérvico-vaginal

y lavado prepucial en 1969, habiéndose diagnosticado en el periodo 1969-70 lapresencia de la enfermedad en 29 establecimientos lecheros. (Stella 1971)

Durante el año 1971 se realizaron los dos primeros diagnósticos en ganado decarne (Stella 1971)Hasta el año 1973 se continuó realizando él diagnostico de la enfermedad poniendo

énfasis en el análisis muco vaginal de hembras con problemas reproductivos.

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A partir del año 1974 la técnica de diagnostico empleada fue el raspado y medio detransporte, la cual permite remitir material de cualquier zona del país. Entre los años1974-75 se realizaron 115 visitas obteniendo 42 diagnostico positivos y 73negativos, siendo el porcentaje de positivos de 36.52. Hay que destacar que losdatos obtenidos fueron casi en su totalidad, logrados sobre la base de una solavisita, cuando lo aconsejable es realizar cuatro visitas consecutivas con una semanade intervalo, para descartar la presencia de la enfermedad. (Tedesco, 1976)Los métodos reconocidos de la lucha contra la enfermedad son cuatro: creación del

doble rodeo, tratamientos del toro, vacunación e inseminación artificial, siendo esteúltimo método el único que permite erradicar la enfermedad (Del Baglivi, L. 1977)

Un relevamiento realizado en rodeos lecheros de la colonia Antonio Rubio de Saltoen los años 1996-1997 arrojo que un 8.6 % de los toros se encontraban afectadosde Vibriosis. (Irigoyen, J. 1997)

En un estudio realizado por el DILAVE sobre prevalencia de enfermedadesreproductivas que afectan al ganado de carne en el Uruguay, la vibriosis tiene unaincidencia por inmunofluorescencia directa estimada en toros para todo el Uruguayde un 28.05 %. La prevalencia estimada para los establecimientos es de 37 %.Siendo la prevalencia estimada por aislamiento en toros de 3.7 %. (Repiso, M y col.2001)

En Argentina, Villar & Spina en 1982 en un estudio de 15 años comprendiendo losaños de 1966-1981, detectaron una prevalencia de la infección de un 22 %, de untotal de 11.300 toros testados por la técnica de inmunofluorescencia.

Akhtar et al en 1990 en otro estudio en 3 establecimientos de California,EEUU, comprendiendo 400 hembras detectaron una prevalencia del 47 % de laenfermedad a través de la técnica de ELISA.

En Brasil los datos obtenidos en el ámbito nacional se remontan a la décadadel 60-70, hoy en día existe una falta de actualización sobre incidencia ycomportamiento de esta enfermedad.

D'Apice en 1956, en São Paulo, aisló por primera vez al agente etiológico delabomaso de un feto bovino abortado.

Castro en 1971, detecta una incidencia del 14.4 % de un total de 1068muestras de muco vaginal extraídas de bovinos del Estado de San Pablo, MinasGerais y Paraná.

Ramos & Guida en 1978 examinaron por mucoaglutinación, 4.092 bovinospor extracción de muco vaginal, localizadas en el Estado de Río de Janeiro, dandoreacción positiva en 12.95 %.

En Río Grande do Sul, Mies Filho en 1960, utilizó la prueba demucoaglutinación en muestras pertenecientes a 311 bovinos de leche, teniendocomo positivo a un 27 %.

Andrade en 1986, en Goiás, determinaron un 22.37 % de prevalencia, atravésde la técnica de mucoaglutinación, de un total de 1685 muestras provenientes debovinos lecheros

Genovez en el 1986 en São Paulo, examinaron 46 toros, identificando 11(23.9 %) animales positivos. (Gomez y Fernández 2001)

El agente etiológico de la vibriosis bovina es el Campylobacter fetus. Dentro delgénero existen tres variedades patógenas (venerialis, intermedius y fetus) y unsapófrito (C. spotorum susp. bubulus).

La diseminación de esta entidad es venérea en forma directa por el servicio oindirectamente por la inseminación con semen contaminado. También existe laforma oral de que los animales alcancen la infección y se provoque el aborto (fetusbiotipo fetus).

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Se han postulado varias teorías basándose en el mecanismo de acción deCampylobacter fetus, pero hoy predominan dos efectos fundamentales, su actividadespermicida y los cambios en la mucosa uterina para impedir el avance de lagestación. También la infección del embrión resulta aún una teoría aceptada

El toro es portador asintomático de la enfermedad. El número demicroorganismos presentes en el prepucio en variable. Los toros adultos son mássusceptibles a la infección debido a un mayor desarrollo de las criptas prepuciales,tanto en número como en dimensiones con respecto a los jóvenes.

El toro joven puede recuperarse de la infección en forma espontánea. El genero Campylobacter esta compuesto por organismos cortos, curvados, simples

o unidos en forma de espiral. Cuando fueron descritos por primera vez fueronclasificados como Vibrio dada su forma curvada y su motilidad. El nombre delgenero fue Vibrio por muchos años hasta que Sedal y Veron (1963) encontraron quemuchos miembros de la especie eran suficientemente diferentes como para ameritarun genero separado llamándolo Campylobacter.

El termino Vibriosis es aún aplicado a la enfermedad causada por lasespecies patógenas de este genero. Campylobacter es encontrado en el tractoreproductor y alimentario de humanos y animales.Bioquímicamente, las especies de Campylobacter son prácticamente inactivas, pero

todas son Oxidasa positiva y la mayoría produce catalasa. Las especies patógenasde Campylobacter han sido clasificadas por su habilidad a crecer entre 25 y 45grados centígrados.

Tienen forma de coma o S siendo, siendo este género Gram negativo. Los cuerposcon forma de coma tienen un solo flagelo polar mientras que los con forma de Stienen flagelos bipolares. Las especies catalasa positiva forman espirales cuando lasformas en S permanecen unidas. Las células en cultivos viejos forman cuerposcocoides o esfericos.

El crecimiento es microaerófilo a anaerobio, requiriendo una atmósfera de 10 a 20% de CO2 y las concentraciones de O2 deben ser reducidas a 5% o menos. Eloptimo crecimiento se obtiene a 37 grados con suero, agar sangre o thiol agar.Antibióticos como novobiocina y bacitracina pueden ser adicionados a los medios decultivo para inhibir el crecimiento de los contaminantes. (Plastridge et al. 1964)

Las colonias son usualmente visibles a los 2 días de incubación, sonredondeadas, de forma regular y consistencia butírica. Pueden ser traslucidas alinicio pero se vuelven opacas y su diámetro es de 1 a 3 mm.

Ambas subespecies poseen antígenos termoestables (O), flagelares (H) y unantígeno superficial termolábil (K), denominado S-layer, que cubre al antígeno O.Los antígenos O en C. fetos sub. venerialis son A-1 y A sub-1. Al menos tresantígenos están asociados con el flagelo (McCoy et al 1975) pero no son usados enla tipificación de rutina. El antígeno superficial exhibe variaciones durante lainfección (Corbeil et al 1975) pero la bioquímica de esta variación recién se halogrado descifrar, siendo este un cambio en los tres aminos terminales de lamicrocápsula (Dubreuil et al 1990)

El antígeno K (microcápsula) fue reconocido por Berg, Jutila & Firehammer (1971)como un importante factor en la inmunidad del tracto genital bovino en la infecciónpor C. fetos sub. Venerialis. Tiene las propiedades de ser antifagocitica (McCoy etal. 1975) y le confiere al microorganismo resistencia a la fagocitosis en el tractogenital. Solo posteriormente a la unión de anticuerpos específicos opsonizantes elmicroorganismo puede ser fagocitado. La microcápsula cubre al antígeno somático(O) al cual se encuentra unida por 2 iones Ca++ (Berger et al 1971),microorganismos con microcápsula no son aglutinados por anticuerpos Oespecíficos (Border et al 1974; Ristic 1957). Esta microcápsula es una glicoproteina

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(Winter 1978) y es destruida a 121 por 120 minutos (Berg 1971). Antisuerosproducidos a partir de microorganismos tratados con calor solo producenanticuerpos anti O y no causan aglutinación de células con microcápsula.

La enfermedad en las hembras va acompañada de una respuesta inmune local(Veron 1973). Las vacas convalecientes resultan protegidas transitoriamente contrainfertilidad característica de esta enfermedad pero frecuentemente no resultanlibres de la infección en el área cérvico-vaginal.( Vandesplassche et al 1963)Animales inmunizados sistemáticamente con organismos inactivados en adyuvantecompleto de Freund, también resultan protegidos contra la enfermedad (Wilkie et al1971). El mucus cérvico-vaginal de las vacas convalecientes contienen anticuerposde clase Ig A, mientras que los animales sistemáticamente inmunizados losanticuerpos detectados a este nivel son del tipo IgG. (Corbeil et al 1974). Ha sido demostrado que la actividad biológica de varias clases de inmunoglobulinas

a Campylobacter es variada, los anticuerpos del tipo IgA pueden inmovilizar pero noopsonizar C. fetus mientras que el tipo IgG pueden realizar ambas funciones.

Debido a que durante la infección existen variaciones a nivel del antígeno desuperficie, es de destacar la importancia de saber que tipos de estos antígenos seencuentran en las cepas aisladas en nuestro país, para así utilizarlas en laelaboración de biológicos o como control de las cepas que se utilizan en laproducción de vacunas extranjeras de venta en nuestra plaza.

Nuestro equipo de trabajo quiere poner a punto esta técnica y colocarla adisposición de todos los interesados para aplicarla en el material que va a serdestinado para la fabricación de biológicos, como así también tener una herramientapara poder analizar y controlar el material utilizado en la producción de vacunasdestinadas a controlar y erradicar a esta enfermedad que afecta a nuestrosganados.

C – OBJETIVO GENERAL

• Identificación del antígeno de superficie K en cepas de Campylobacter fetussubs. venerealis, intermedio y fetus.

OBJETIVOS PARTICULARES

• Creación de un cepario de Campylobacter spp. para posteriores estudiosgenéticos (PCR, ELISA, Inmunoblot)

• Selección de cepas con microcápsulas para el desarrollo de inmunógenos.• Puesta a punto de una técnica de aglutinación para titulación de Ac. en

animales vacunados.

D - MATERIALES Y METODOS

Se estudiaron 4 cepas vacinales de Campylobacter fetus spp., 2 subs. venerealis,1 subs. Fetus y 1 subs. Intermedio que se utilizan en la elaboración de vacunas deLaboratorios SANTA ELENA.

•Se identifico a la bacteria por medio de la técnica de Gram, IFD, MEB y MET.

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Producción de Antígenos: las cepas fueron cultivadas en agar sangre triptosapor 48 hs a 37 ºC en condiciones de micreaerofilia. El crecimiento de las placas fuesuspendido en formol salino 1 % y lavado 3 veces por centrifugación por 10 minutos.

Antígeno tratado con calor: El crecimiento de las placas fue suspendido en 0.1Mfosfato salino bufferado (PBS), ph 7.2 y autoclavado a 121 ºC por 2 hs. Las célulasfueron lavadas 3 veces por centrifugación 10 minutos.

Ambos antígenos para inmunización de los animales utilizados fueronconcentrados a una densidad óptica de 1 a 420 nm en espectrofotómetro y fueronconservados a 4 ºC hasta el momento de la inoculación.

Antígeno de test de aglutinación: El antígeno sin tratar fue usado para el testde aglutinación. El antígeno fue ajustado a una densidad óptica de 0.6 a 420 nm enespectrofotómetro.

Producción de antisuero: Se utilizaron dos conejos por cepa, un animal fueinoculado con el antígeno tratado con calor y el otro con el antígeno suspendido enformol ambos emulsionados en adyuvante oleoso (Adyuvac). La inoculación fue enforma subcutanea y con 2 revacunaciones con intervalo de 20 días. El sangrado delanimal se realizo a los 20 días de la ultima inoculación.

Prueba de aglutinación: Alícuotas de 50 ul de suero fueron colocadas porpocillo en placas de microaglutinacion, con diluciones a la 1/ 2. Se agrego 50 ul deantígeno a cada pocillo, se mezcló y se incubó la placa por 24 hs a 37 ªC. Unareacción positiva es la formación de un botón nítido en el fondo de la placa y elsobrenadante limpio. El título del suero es la dilución mas alta que de unaaglutinación completa.

Antisueros producidos contra los antígenos tratados con calor y no tratado de cadacepa fueron testados contra antígenos sin tratamiento térmico.

E - RESULTADOS

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F - DISCUSION

Los antígenos utilizados a una similar concentración de densidad óptica respondenen forma diferente, presentando menor titulo los animales inmunizados con losantigenos tratados con calor que los sin tratar.

Lo que hace pensar que este menor título se debe a la no presencia de los Agcapsulares los cuales son destruidos por calor, lo que demuestra un vez mas latermolabilidad de los mismos.

Los resultados obtenidos concuerdan con la bibliografía consultada (Van Der Walt,1987), quien realizó un estudio similar utilizando solamente cepas de Campylobacterfetus subs. Venerealis; a diferencia de nuestro trabajo que además estudio lassubs. Intermedio y fetus. Se comprueba que la metodología es útil para determinar la presencia demicrocápsulas (Ag. K) en las diferentes subs. de Campylobacter, además de serfácil de realizar y económica.

Se estima que la utilización de esta metodología puede ser empleada en laselección de cepas para producción de vacunas; así como para evaluar suconservación ya que pasaje seriados en medio de cultivo pueden inducir a lapérdida del antígeno capsular pasando estas cepas a ser no inmunogenicas.

La técnica microaglutinacion resulto ser de fácil utilización y patronizaciondemostrando que puede ser útil para la titilación de anticuerpos en animalesvacunados.

G - CONCLUSIONES

Se observa la presencia de antígenos capsulares de superficie en las cepasestudiadas.

Resultados que se deben de esperar en cepas que se utilizan en la producción devacunas.

Resultados similares fueron obtenidos por Van Der Walt, Martha L., 1987; Ristic,M., 1957

Se determina que la metodología utilizada es viable para la detección de antígenoscapsulares de superficie, siendo esta de bajo costo y sencilla

PURO 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240VF + + + + + + + + + + + +

VP + + + + - - - - - - - -

IF + + + + + + + + + - - -

IP + + - - - - - - - - - -

FF + + + + + + + + + + - -

FP + + + - - - - - - - - -

VF + + + + + + + + + + + +

VP + - - - - - - - - - - -

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H - AGRADECIMIENTOS

• Dr. Julián Bermúdez• Dr. Esteban Guerra• Dr. Martín Breijo – Área de Inmunologia - FV• Área de Inmunologia - Facultad de Veterinaria• Laboratorio Santa Elena• Eduardo Rolon – Laboratorio Santa Elena• Eduardo Duran – Laboratorio Santa Elena• Br. Alejandro Britos – Nutrición Animal -FV• Nutrición Animal – Facultad de Veterinaria• Danilo Fila - Histología – Facultad de Veterinaria• Br. Enrique Nogueira• Comisión de CIDEC• MEB – Facultad de Ciencias• MET – Facultad de Ciencias• Departamento de Genética – Facultad de Ciencias

I - BIBLIOGRAFIA

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