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Biomarcadores de exposición a alcohol. Interpretación de resultados

Luca MoriniDipartimento di Medicina Legale, Scienze Forensi e Farmaco-Tossicologiche, Università degli Studi di Pavia

Alcohol y embarazo, Murcia, del 1 al 2 de junio/2011

Diagnostico del uso y abuso de alcohol

Entrevista con el paciente Concentraciones de etanol en aire expirado, sangre y

orina -Glutamyltransferasa (GGT) Aspartato Aminotransferasa (AST) Volume Corpuscular medio (MCV) N-Acetyl-β-Hexosaminidase (Beta-Hex) Apolipoproteina J Acido Sialico Total 5-hydroxytryptophol (5-HTOL) Phosphatidyl Ethanol (PEth) Carbohydrate Deficient Transferrina (CDT)


Metabolitos Directos

Esteres etilicos de los acidos grasos (FAEE)

Etil glucuronido (EtG) y etil sulfato (EtS).


Matrices

Meconio

Pelo


Esteres etilicos de los acidos grasos (FAEEs)

Metabolitos no oxidativos del etanol.

Formados por esterificación del etanol con ácidos grasos libres endógenos y acyl-CoA/ ácidos grasos.


FAEEs in meconium

etil laurato

etil myristato

etil heptadecanoato (IS)


FAEEs in meconium

ethyl palmitate

ethyl palmitoleate

ethyl stearate

ethyl oleate

ethyl linoleate

ethyl linolenate

ethyl arachinodate


FAEEs en meconioAlcohol y embarazo, Murcia, del 1 al 2 de junio/2011

FAEEs en meconio

Klein J, Karaskov T, Korent G.

Fatty acid etil esters: a novel biologic marker for heavy in utero ethanol exposure: a case report.Ther Drug Monit. 1999 Dec;21(6):644-6. PMID: 10604826 [PubMed -indexed for MEDLINE]

Bearer CF, Lee S, Salvator AE, Minnes S, Swick A, Yamashita T, Singer LT.

etil linoleate in meconium: a biomarker for prenatal ethanol exposure.Alcohol Clin Exp Res. 1999 Mar;23(3):487-93.PMID: 10195823 [PubMed - indexed for MEDLINE]


FAEEs en meconio

Chan D, Bar-Oz B, Pellerin B, Paciorek C, Klein J, Kapur B, Farine D, Koren G.

Population baseline of meconium fatty acid etil esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto.

Ther Drug Monit. 2003 Jun;25(3):271-8. Erratum in: Ther Drug Monit. 2004 Oct;26(5):583. PMID: 12766552 [PubMed - indexed for MEDLINE]

183 muestras de meconio analizadas(84 de Toronto y 99 de Jerusalen)

La concentracion media de FAEEs fue mucho mayor en los casos de exposicion prenaltala alcohol severa confirmados

El etil myristato y el etil laurate se detectaron en practicamente todas las muestras (y no se correlacionaban con el consumo de alcohol)

La correlacion era mejor al aumentar la longitud de la cadena Se sugirio un valor de corte de 2 nmol/g


FAEEs en meconio

Garcia-Algar O, KulagaV, Gareri J, Koren G, Vall O, Zuccaro P, Pacifici R, Pichini S.

Alarming prevalence of fetal alcohol exposure in a Mediterranean city.

Ther Drug Monit. 2008 Apr;30(2):249-54. PMID: 18367990 [PubMed - indexed forMEDLINE]

• 159 meconios de 353 mostraron niveles de FAEEs iguales o superioresa 2 nmol/g (45%)

• Estudios preliminares mostraban un porcentaaje de casos positivosmucho menores (3.4% y 16.7%)

• Posiblemente debido a un patron de consumo de alcohol diario

(sobretodo de vino y cerveza) de las mujeres españolas


FAEEs en meconio : resumen

Marcadores directos fiables en el diagnóstico en la exposición fetal al alcohol

La mejor correlación aparece con las cadenas más largas

El etil laurato y el etil miristato no se correlacionan con la exposición a alcohol


FAEEs en pelo

Buena sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de abuso crónico de alcohol

Presencia incluso en abstemios

Dificultad para establecer un punto de corte adecuado: en el congreso de 2009 de la SoHT en Roma se estableció un punto de corte de 0,5 ng / mg utilizando 3 cm de cabello en el extremo proximal


FAEEs in neonatal hair

Caprara DL, Klein J, Koren G.

Baseline measures of fatty acid etil esters in hair of neonates born to abstaining or mild social drinking mothers.

Ther Drug Monit. 2005 Dec;27(6):811-5. PMID: 16306859 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Los mismos niveles medios de FAEEs en las madres abstemias y las consumidoras de cantidades moderadas de alcohol

Se deben analizar muestras de pelo de recién nacidos de mujeres con problemas de consumo excesivo de alcohol para comprobar la posible diferencia en las concentraciónes de FAEEs


etil glucuronido y etil sulfato

UDP-glucuronosyltransferasa

-D-etilglucuronido (EtG)

C8H14O7

(222.1945)

sulfotransferasa

etilsulfato (EtS)

C2H6O4S

(126.1313)

EtOH


EtG and EtS in meconium

La Glucuronidación hepática en el recién nacido humano es relativamente inmadura al nacer, lo que contrasta con la actividad de la sulfatación hepática neonatal que es mucho más madura . (Gow et al., Neonatal Hepatic Drug Elimination, Pharmacology & Toxicology 2001, 88, 3–15.)


EtG y EtS en meconio: primer estudio

Morini L, Marchei E, Pellegrini M, Groppi A, Stramesi C, Vagnarelli F, Garcia-Algar O, Pacifici R, Pichini S.Liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection for the measurement of etil glucuronide and etil sulfate in meconium: new biomarkers of gestational ethanol exposure?Ther Drug Monit. 2008 Dec;30(6):725-32.

BARCELONA ,ESPAÑA

BCN

REGGIO EMILIA, ITALIA

RE




Desarrollo del método analítico para la determinación de ETG y ETS en meconio

Recogida de muestras de meconio en la Unidad Neonatológica del Hospital del Mar de Barcelona y en la Unidad Neonatológica del Arcispedale de Reggio Emiliaù

Análisis de ETG, ETS y FAEEs en meconio



Muestras de meconio estadisticas

EtG EtS

ng/g nmol/g ng/g nmol/g

Reggio Emilia (n=32)

Min 5.0 0.022 1.0 0.008Max 796.2 3.586 13.1 0.104

Media 20.6 0.093 1.2 0.009Muestras <

LLOQ n=4 n=13

Barcelona(n=32)

Min 11.3 0.051 1.0 0.008Max 6309.3 28.419 437.5 3.472

Media 101.5 0.457 1.4 0.011Muestras <

LLOQ n=2 n=8




Barcelona, muestrasde meconio conFAEE < 2 nmol/g

(n=16)

Min 11.3 0.051 1.0 0.008

Max 1579.5 7.113 12.5 0.099

Media 41.5 0.187 0.7 0.005

Barcelona muestrasde meconio con

FAEE > 2 nmol/g(n=16)

Min 20.3 0.091 1.0 0.008

Max 6309.3 28.419 437.5 3.472

Media 211.5 0.953 2.5 0.020




Conclusiones del primer estudio:

La investigación del ETG y el ETS en meconio aparece como posible alternativa a los FAEEs en el diagnóstico de la exposición prenatal a etanol



EtG y EtS en meconio: segundo estudio

Morini L, Marchei E, Vagnarelli F, Garcia Algar O, Groppi A, Mastrobattista L, Pichini S. etil glucuronide and etil sulfate in meconium and hair-potential biomarkers of intrauterine exposure to ethanol. Forensic Sci Int. 2010 Mar 20;196(1-3):74-7. Epub 2010 Jan 8.

99 madres y recien nacidos analizados (49 de Reggio Emilia y

50 de Barcelona);

Pelo materno recogido (n=99);

Analisis de PFAEEs en pelo materno por HS/SPME-GC/MS (n=26);

Analisis de PEtG en pelo materno por LC-MS/MS (n=99);

Pelo neonatal recogido (n=35);

Analisis de PEtG en pelo neonatal por LC-MS/MS (n=35);

Meconio recogido(n=99);

Analisis de FAEEs por LC-MS/MS (n=98);

Analisis de EtG y EtS por LC-MS/MS (n=98);




Resultados en pelo:

Todas las muestras de pelo materno fueron< LLOQ para el HEtG y

para los HFAEEs;

Todas las muestras de pelo neonatal fueron < LLOQ para el HEtG.




Meconium results:Statistics Barcelona Reggio Emilia

EtG

Media (nmol/g)

Mediana (nmol/g)

% > LLOQ (0.022 nmol/g)

0.487

0.139

84.0

0.347

0.128

83.7

EtS

Media (nmol/g)

Mediana (nmol/g)

% > LLOQ (0.008 nmol/g)

0.022

0.023

14.0

0.012

0.010

26.5

FAEEs

Media (nmol/g)

Mediana (nmol/g)

% > 2nmol/g

8.972

0.098

34.0

0.445

0.000

10.4




Resultados en meconio:


EtG y EtS en meconio: niveles de referencia en la población

Morini L, Groppi A, Marchei E, Vagnarelli F, Garcia Algar O, Zuccaro P, Pichini S. Population Baseline of Meconium etil Glucuronide and etil Sulfate Concentrations in Newborns of Nondrinking Women in 2 Mediterranean Cohorts. Ther Drug Monit. 2010 Mar 23.

185 muestras de meconio analizadas (80 de Reggio Emilia y 105

de Barcelona);• 110 muestras de meconio de recién nacidos de madres no bebedoras

(confirmado por medio de cuestionarios y por tener concentraciónes de

FAEEs e meconio <2 nmol / g)

• 70 muestras de meconio de recién nacidos con exposición al etanol

incierta (no habria exposicion segun el cuestionario y niveles en meconio

de FAEEs<y> de 2 nmol / g)

• Cinco muestras de meconio de recién nacidos de madres con consumo

excesivo de alcohol (mediante cuestionario y con FAEEs> 50 nmol / g)




Media

(nmol/g)Min (nmol/g) Max (nmol/g)

Confidence

Interval 95%

EtG

Reggio Emilia muestras

(n=50)0.100 0.010 1.870 11.1

Barcelonamuestras

(n=60)0.140 0.020 1.570 8.6

EtS

Reggio Emilia muestras

(n=50)0.010 0.003 0.020 10.2

Barcelona muestras

(n=60)0.020 0.010 0.030 8.1

Estadisticas de EtG y EtS en meconio de los recien nacidos de madres abstemias




(ROC) curva para el EtG: La mejor sensibilidad y especificidad se obtuvieron para2 nmol/g




Conclusiones

El EtG y el ETS en meconio parecen ser tan sensibles y específicos como los FAEEs como

marcadores para el diagnóstico de la exposición intrauterina a etanol

Los resultados obtenidos muestran que hay una gran diferencia entre los niveles de EtG en

meconio de los hijos de madres que no beben alcohol durante el embarazo con los que

aparecen en los hijos de las madres que declaran un consumo significativo de alcohol

Se ha observado que 2 nmol / g de EtG es el valor de corte más sensible y específico en la

determinación de la exposición prenatal al alcohol




Conclusiones

El ETS, aunque rara vez se detecta en meconio, su determinacion podría ser también útil puesto que se ha encontrado en cuatro de los cinco hijos de madres bebedoras

Dado que un gran número de muestras de meconio no ha sido adecuadamente evaluados para EtG y ETS debido a la poca fiabilidad de los cuestionario auto-administrados en relación con los niveles detectados de FAEEs, la sensibilidad y la especificidad tanto del ETG y de los FAEEs en el diagnóstico de la exposición a alcohol intrauterina todavía está abierto a discusión y necesitan realizarse más estudios


EtG and EtS in meconium: Italian Baseline population study

S Pichini, E Marchei, F Vagnarelli, L Tarani, F Raimondi, R Maffucci, B Sacher, M Bisceglia, G Rapisardi, MR Elicio, Biban, P Zuccaro, R Pacifici, PhD, A Pierantozzi, L Morini,Assessment of prenatal exposure to ethanol by meconium analysis: results of an Italian multicentric studyAccepted for pubblication on ACER, 2011

Un total de 607 muestras de meconio se obtuvieron de los recién nacidos de siete hospitales públicos: Verona y San Daniele del Friuli, en el noreste del país, Reggio Emilia, en el centro-este, Florencia y Roma en el centro y Nápoles y Crotone en el sur-oeste de la península.

Los biomarcadores en meconio se midieron metodología validada utilizando cromatografía líquida- espectrometría de masas y los resultados se clasificaron con el valor de corte internacionalmente establecido de 2 nmol / g utilizando la suma de los siete FAEEs y de 2 nmol / g para el EtG, para diferenciar el consumo excesivo de etanol durante el embarazo del uso ocasional o ningun consumo en absoluto.




Sobre la base de los niveles corte mencionados anteriormente, la prevalencia total de recién nacidos expuestos prenatalmente al etanol fue del 7,7% : un 0% en Verona, el 4,0% en San Daniele del Friuli, un 4,9% en Nápoles, un 5,0% en Florencia, 6.2 % en Crotone, el 10,6% en Reggio Emilia y el 33,3% en Roma.

La positividad a los biomarcadores de la exposición neonatal se asoció con un bajo nivel de educación materna y una menor edad. Por otra parte, el mayor % de la exposición prenatal en la capital se relacionó significativamente con las caracteristicas sociodemográficas de la madre




Conclusiones:

La evaluación precisa de la exposición fetal a etanol, a través de la medición objetiva de biomarcadores en meconio, puede ser util para poder realizar de forma adecuada tanto el seguimiento como el tratamiento clínico y neurológico de los recién nacidos expuestos. Esto es particularmente importante en los casos de trastornos del espectro alcohólico fetal (FASD) ya que hasta ahora ningún estudio epidemiológico basado en la población ha examinado, en términos de riesgo relativo, la asociación entre la prevalencia de FASD y la exposición al alcohol gestacional.


EtG y ETS en placenta humana y tejidos fetales

Hemos desarrollado y validado método para la determinación del ETG y el ETS en placenta humana y tejidos fetales que se ha aplicado a una cohorte de 35 muestras procedentes de abortos voluntarios

El método ha demostrado por primera vez la presencia de estos dos metabolitos en la placenta y en los tejidos fetales

Cuatro de las 35 muestras dieron positivo. Y se ha observado una buena correlación entre las concetraciones de ETG y ETS en la placenta y el feto .

L Morini, M Falcón, S Pichini, O Garcia-Algar, P Danesino, A Groppi and A Luna, etil-glucuronide and etil-sulfate in placenta and fetal tissues by LC-MS/MS: biomarkers of transplacental ethanol transfer. Submitted for pubblication on Analytical Biochemistry, 2011


EtG y ETS en placenta humana y tejidos fetales

Estos datos son claves en la evaluación del posible paso transplacentario del EtG y el ETS

Esto confirmaria que el EtG y el ETS que se encuentran en el meconio no sólo serian debido a la metabolización del feto, sino también por la producción materna. Con estos dates se contribuye a comprender mejor el mecanismo de incorporación de estos dos metabolitos al meconio y otros aspectos importantes relacionados con el diagnóstico del FASD.

L Morini, M Falcón, S Pichini, O Garcia-Algar, P Danesino, A Groppi and A Luna, etil-glucuronide and etil-sulfate in placenta and fetal tissues by LC-MS/MS: biomarkers of transplacental ethanol transfer. Submitted for pubblication on Analytical Biochemistry, 2011


Proyectos en curso

Determinación de Phosphatidyl etanol en placenta humana (proyecto diseñado por el IMIM de Barcelona):

El Phospatdyl etanol en la sangre es un marcador sensible y específico de abuso crónico de alcohol

La determinación de este compuesto en la placenta humana puede ser útil para evaluar el consumo de etanol durante el embarazo.

Hasta ahora, el método está fase de validación, experimentos in vitro ya han sido desarrollados por el IMIM y estamos listos para evaluarlo como biomarcador de etanol


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