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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos

Análisis físico-químico de medicamentos veterinarios

Unidad Zoosanitarios

Majadahonda, 10 de junio de 2014

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Programa Jornada Zoosanitarios

Actividades de referencia y nuevos objetivos

Patricia Muñoz

Información procedente de EU-RLs: RIKILT (Wageningen), BVL (Berlín) y ANSES (Fougeres)

José Blanca y Patricia Muñoz

Análisis de cloranfenicol en orina por LC-MS/MS

Macarena Ramos

Análisis de formas conjugadas de boldenona

José Blanca

JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS Majadahonda, 10 de Junio 2014

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Programa Jornada Zoosanitarios

Análisis de antibióticos en tejido animal por LC-HRMS

Carmen Igualada

Laboratorio de Salud Pública de Valencia

Nuevas herramientas analíticas, nuevas perspectivas.

Antoni Rúbies

Agencia de Salud Pública de Barcelona


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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Actividades de referencia y nuevos objetivos

Patricia Muñoz. Unidad Zoosanitarios.

Análisis físico-químico de medicamentos veterinarios.

Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos. Majadahonda, 10 de junio de 2014

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Contenido

Principales actividades como LNR

Revisión de la configuración de los laboratorios

implicados en el PNIR

RPA: “Reference Point for Action”

Workshop ANSES 2013

Congreso Gante


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LEBA ZO


Categoría Guía: “Residuos de

medicamentos veterinarios en

alimentos y productos de

origen animal por cromatografía

líquida”.

Sulfonamidas

HPLC-PDA

Quinolonas HPLC-Fluor y

LC-MS/MS

Met. Nitrofuranos LC-MS/MS

Anfenicoles LC-

MS/MS b-agonistas LC-MS/MS

Tetraciclinas LC-MS/MS

Colorantes LC-MS/MS

Sulfonamidas,

trimetoprima y

dapsona LC-

MS/MS

Penicilinas LC-MS/MS

Aminoglucósidos LC-MS/MS

Hormonas LC-MS/MS

Gestágenos LC-MS/MS

Corticosteroides LC-MS/MS

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Sustancias para las que somos LNR (1)

Grupo A (2) : Sustancias con efecto anabolizante y sustancias no autorizadas

1. Estilbenos

3. Esteroides

4. Lactonas del ácido resorcílico

5. b-agonistas

6. Sustancias incluidas en el Anexo IV Reglamento 2377/90 cuadro II del Reglamento 37/2010 : sólo para cloranfenicol, nitrofuranos y dapsona

(1) Decisión de Ejecución de la Comisión de 28.3.2014

(2) Anexo I de Directiva 96/23/CE y BOE 7-agosto-1998 JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Majadahonda, 10 de Junio 2014

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Sustancias para las que somos LNR (1)

Grupo B (2) : Medicamentos Veterinarios (incluidos los no registrados) y contaminantes.

1. Antibacterianos

2f. Otras sustancias con actividad farmacológica:

- Corticosteroides

- Carbadox y olaquindox

3e. Colorantes


(1) Decisión de Ejecución de la Comisión de 28.3.2014

(2) Anexo I de Directiva 96/23/CE y BOE 7-agosto-1998

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ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN ENSAYOS DE APTITUD 2013

Cloranfenicol en músculo de porcino (60-ZO-13)

Penicilinas en músculo de porcino (61-ZO-13)

Anunciados en la CL Nº 316 (2 septiembre 2013)

Envío muestras: 24 de septiembre

Fecha límite entrega de resultados: 18 octubre

Informes definitivos: 15 noviembre

JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS


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Cloranfenicol en músculo de porcino (60-ZO-13)

2 muestras: o Muestra blanco o Muestra adicionada a 0,83 mg/kg de CAP

15 participantes (15 LC-MS/MS y 1 ELISA) Resultados en general satisfactorios:

o Todos los Z- scores fueron satisfactorios o 1 FP en la muestra blanco o 1 laboratorio no cuantifica (RPA: necesario cuantificar) o 1 laboratorio no informa de sus límites (aún estando

acreditado).



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Estado métodos físico-químicos

Ensayo Acreditados Sólo validados No validados

Cloranfenicol 2013 (músculo)

12/15 75 %

1/15 6%

3/15 19 %


5/11 46 %

3/11 27%

3/11 27 %



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Ensayo Acreditados


12/15 75 %

TODOS LOS MÉTODOS

11/13 85 %

SÓLO MÉTODOS UTILIZADOS EN PNIR



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2 muestras / 6 compuestos evaluados.

o Muestra blanco o Muestra adicionada: amoxicilina (75 mg/kg) y oxacilina

(344 mg/kg)

10 participantes (todos LC-MS/MS).


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Resultados satisfactorios para la mayoría de participantes:

o Z-scores: amoxicilina 7 S, 2 C y 1 NS* (total 10) y

oxacilina 6 S, 1 C y 2 NS* (total 9) o 2 FP en la muestra blanco y 2 FN* en muestra

adicionada (para el mismo participante) (*) Intercambio de muestras


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Ensayo Acreditados Sólo validados No validados

Penicilinas 2013 (músculo)

6/10 60 %

3/10 3%

1/10 1 %


2/7 29 %

1/7 14 %

1/10 57 %



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Ensayo Acreditados


6/10 60 %

TODOS LOS MÉTODOS

6/9 67 %

MÉTODOS UTILIZADOS EN PNIR



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ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN DE OTRAS COMPARACIONES

Gestágenos en grasa perirrenal (62-ZO-14) - ensayo bilateral -

No existen proveedores comerciales Petición de un laboratorio 2 muestras / 4 compuestos evaluados (MELA,

MEGA, MPA y CMA) o Muestra blanco o Muestra adicionada: MPA (1,49 mg/kg)

MEGA (0,51 mg/kg) 2 participantes (2 LC-MS/MS) Resultados satisfactorio


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ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN DE ENSAYOS DE APTITUD

ENSAYOS DE APTITUD PROGRAMADOS PARA 2014 (último cuatrimestre):

b-agonistas en hígado Tetraciclinas en músculo

Comunicación de laboratorio (septiembre)

Deben participar todos los laboratorios que realicen estas determinaciones para el PNIR


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CURSOS PROGRAMADOS PARA 2014 (último trimestre): b-agonistas en hígado Antibióticos en miel

Comunicación de laboratorio próximamente

(incluyendo formulario de inscripción)

ACTIVIDADES COMO LNR: CURSOS

JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS


• Número de participantes reducido • Contenido teórico-práctico

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PARTICIPACIÓN EN WORKSHOPS ORGANIZADOS POR EU-RLs

BVL (Berlín) del 14 al 16 de mayo 2013 CL Nº 304

ANSES (Fougeres) octubre 2013 CL Nº 336

RIKILT (Wageningen) noviembre 2013 CL Nº 356

RIKILT (Wageningen) mayo 2014 CL pendiente

BVL (Berlín) junio 2014

ANSES (Fougeres) octubre 2014


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PARTICIPACIÓN EN ENSAYOS DE INTERCOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR EU-RLs

RIKILT (Wageningen)

DES en orina (2014)

BVL (Berlín)

No ha organizado ensayos de b-agonistas ni en 2013 ni 2014.


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PARTICIPACIÓN EN ENSAYOS DE INTERCOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR EU-RLs

ANSES (Fougeres):

Metabolitos de carbadox en músculo (julio 2013) √

Colorantes en pescado (diciembre 2013) √

Cloranfenicol en músculo y orina (marzo 2014)

Antibióticos en leche (octubre 2014)


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ACTIVIDADES COMO LNR: DIFUSIÓN DE MÉTODOS


Cursos 2013:

Tetraciclinas: 6

Colorantes: 3

Peticiones de procedimientos:

Tetraciclinas: 4

b-agonistas: 4

Penicilinas: 2

Antibióticos miel: 1

Hormonas: 1

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ACTIVIDADES COMO LNR: COMUNICACIONES DE LABORATORIO


- Información de workshops

- Convocatorias de cursos y ensayos de intercomparación

- Otra información relevante

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Difusión del trabajo realizado por el EU-RL para antimicrobianos

(ANSES –Fougeres-): “Stability study for 53 antibiotics in solution

and in fortified biological matrices by LC-MS/MS”. Journal of AOAC

International, vol. 96, Nº 2, 2013.

Datos concretos sobre estabilidad de antibióticos en solución

y matrices biológicas.

Esquema de trabajo seguido para la realización de este

estudio

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Visita /Inspección del RIKILT (EU-RL)

El 17 de octubre del 2013 visitó el CNA un representante

del RIKILT

Aspectos

o Procedimiento de validación.

o Alcance acreditado.

o Actividades realizadas como LNR.


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Revisión de la configuración de los laboratorios

implicados en el PNIR


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Importante que los laboratorios conozcan y comprueben la información contenida en la aplicación PNIR. No siempre los laboratorios actualizan los datos

Esta información llega a la Comisión Europea, FVO, etc.

Se puede utilizar para diferentes finalidades: consulta (LNRs y otros), etc.

APLICACIÓN INFORMÁTICA PNIR: Configuración de laboratorios


De enero 2013 a marzo 2014, se han pedido 26 nuevos perfiles de acceso a la aplicación (perfil laboratorio consulta y perfil laboratorio) de 12 CCAA diferentes

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APLICACIÓN INFORMÁTICA PNIR Ejemplo configuración CNA grupo A3


Tipo de laboratorio: L.N.R Comunidad: Todos

Laboratorio: Centro Nacional de Alimentación Configuración/Año: Actual(01/01/2014)

Grupo: A3 Residuo: Todos

Matriz: Todos Especie: Todos

Animal: Todos Tipo análisis: Todos

Laboratorio privado: No Lab. Acreditado: Todos

Téc. Acreditada: No Téc. Validada: No

Tipo de análisis CN.: Confirmatorio SCR.: Screening Tipo de límite &beta: cc-Beta &alpha: cc-Alfa LD: Lim. Detec. LC: Lim. Cuant.

Grupo Residuo Laboratorio Matriz Especie Animal Técnica Lim. Tipo Lim. Acc. Estado Fecha Tp.Ana.

A3 16-beta-Hidroxiestanozolol Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

17 alfa nortestosterona, 19 nortestosterona, epinandrolona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,7 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Pienso LC-MSMS 5 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Acetoxiprogesterona Centro Nacional de Alimentación Grasa LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Alfa-boldenona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Beta-boldenona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Clormadinona acetato Centro Nacional de Alimentación Grasa LC-MSMS 0,5 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Epitrembolona, Alfa-Trembolona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,4 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Estanozolol Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Etinilestradiol Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,3 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Medroxiprogesterona acetato Centro Nacional de Alimentación Grasa LC-MSMS 0,5 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Megestrol acetato Centro Nacional de Alimentación Grasa LC-MSMS 0,2 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Melengestrol acetato Centro Nacional de Alimentación Grasa LC-MSMS 0,5 µg/kg α Presencia Acreditada CN.

Metilboldenona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,4 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Metiltestosterona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,4 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Nandrolona,beta-nortestosterona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,7 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


Trembolona, beta-trembolona Centro Nacional de Alimentación Orina LC-MSMS 0,4 µg/kg α Presencia Acreditada CN.


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Velar por que los LNR cumplan todas sus funciones, tal como se establece en el artículo 14 de la Directiva 96/23/CE del Consejo, especialmente en relación con la coordinación de las normas y los métodos de análisis para cada residuo en relación con todos los laboratorios que realizan pruebas del PCR y garantizar que los métodos utilizados en los laboratorios de la Comunidad Autónoma sean lo suficientemente sensibles como para detectar el abuso de sustancias ilegales, de conformidad con los valores recomendados del LR UE.

INSPECCIÓN FVO 2013: Recomendación 7


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Acciones tomadas: Se elaboró un procedimiento para la revisión de las configuraciones de los laboratorios del PNIR

1. Los LNRs elaboraron un informe individual para cada laboratorio (antes informes globales)

2. Comunicación directa LNR Laboratorio CCAA (con conocimiento del vocal y secretaria PNIR)

3. Los LNRs realizaron una segunda revisión para comprobar que el laboratorio tuvo en cuenta las recomendaciones del LNR.

4. Tomar medidas Reunión de la Comisión Nacional PNIR

INSPECCIÓN FVO 2013: Recomendación 7


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- Los laboratorio de las CCAA actualizaron su configuración

(1/10/2013 al 25/10/2013). - 1ª revisión de los LNRs (28/10/13 al 8/11/13)

33 laboratorios revisados Más de 3000 determinaciones ZO (CNA)

Se elaboraron 33 informes Sólo 2 laboratorios todo OK

Configuración de laboratorios PNIR 2014


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EJEMPLO DE INFORME INFORME DE EVALUACIÓN CONFIGURACIÓN PNIR 2014: MEDICAMENTOS VETERINARIOS MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS

COMUNIDAD AUTÓNOMA: XXXX LABORATORIO DE XXXX

SIN

CUMPLIMENTAR ESPECIE

LÍMITE

ACCIÓN OTROS

Gru

po

Hallazgos

Estado

del

método

Tipo

de

límite

Valor

de

límite

Especificar

No especificar

Presencia/

LMR

Estado

del

método

LC/LD

en lugar

CCa

LD

en

lugar

CCa no

coherentes

con LMR

CCa altos

en relacion

al LMR

fijado

Límites >

CMR

A1 1 A1 (músculo) X

2 Dietilestilbestrol (músculo y orina) X


6 17 alfa nortestosterona (músculo) X

7 17-alfa estradiol (músculo) X

8 17-beta estradiol (músculo) X


10 Zeranol (músculo) X

A5 13 A5 (agua-bebida, agua-acuicultura y

pienso) X

14 Clembuterol (hígado/ojo/agua-

bebida/agua-acuicultura) X

20 Salbutamol (hígado) X

B1 21 Dicloxacilina (músculo bovino) X

" 28 Oxacilina (músculo) X X

" 29 Sulfadimidina (huevos) X

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EJEMPLO DE INFORME (continuación)


RESUMEN DE LOS HALLAZGOS QUE DEBEN CORREGIRSE

Hallazgos OBSERVACIONES

1,5,9,12,13 Determinaciones sólo validadas. Todos los métodos deben estar acreditados según UNE-EN-ISO/IEC 17025

2-4, 6-8 Las Concentraciones Mínimas Recomendadas se superan para matriz músculo (en algunos casos hay un factor 5) y también se superan para

DES en orina.

10 y 11 Las Concentraciones Mínimas Recomendadas se superan para matriz músculo (en algunos casos hay un factor 5)

14 al 19 Las Concentraciones Mínimas Recomendadas se superan en todos los casos. Deberían ser inferiores. En algunos casos, el CCalfa es 12,5

veces mayor que la CMR (ej. clenbuterol, mabuterol, etc)

La Concentración Mínima Recomendada se supera ligeramente para clenbuterol en hígado. Tener en

cuenta en futuras mejoras del método.

20

No hay que especificar la especie ni el animal, una fila es suficiente. La situación legal, así como los datos del

laboratorio son iguales en todos los casos

21

Dicloxacilina músculo bovino: debe aparecer

CCa en lugar de LC

22

Doxiciclina en pieza de pescado debe poner

presencia (no hay LMR)

23, 24 y 29

Fenoximetilpenicilina, flumequina y sulfadimidina en

huevos debe poner presencia

25

Lincomicina riñón ovino: sustituir LC

por CCa.

26

Marbofloxacina en músculo avícola debe

poner presencia

27

Nafcilina en músculo avícola debe poner presencia, solo

hay LMR para rumiantes

28

Oxacilina en músculo debe poner siempre LMR (hay LMR para todas las especies destinadas

a la produccion de alimentos)

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- Frases generales incluidas en los e-mail que adjuntaban

los informes de evaluación:

“Hallazgos referidos a límites ligeramente superiores a las CMR deben tenerse en cuenta en futuras mejoras del método, si fuera el caso”

“En cuanto a los hallazgos de determinaciones no acreditadas, el laboratorio deberá proceder a su acreditación lo antes posible”



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- Correcciones de los laboratorios de las CCAA (11/11/13 al

15/11/13) - 2ª revisión de los LNRs (18/11/13 al 29/11/13)



25 laboratorios corrigen todos los hallazgos 6 laboratorios aún con hallazgos que corregir Determinaciones con límites que superaban en gran medida las concentraciones mínimas

recomendadas. Límites inadecuados (LC en lugar de CCa) CCa = LMR

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- 2ª revisión de los LNRs (continuación)



Se envía un e-mail a los 6 laboratorios pidiéndoles

justifiquen, antes del 29 de nov, por qué no han subsanado los hallazgos encontrados (2 lab incumplen el plazo)

Opciones que se dan a los 6 laboratorios aún con hallazgos que corregir: Eliminar las determinaciones: 3 lab Corregir errores: 3 lab Compromisos para la configuración PNIR 2015:

Bajar límites: 2 lab Corregir límites (LC a CCa): 2 lab

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- Reunión de la Comisión Nacional del PNIR (2/12/13)



Los LNRs informan de las conclusiones

de sus respectivas evaluaciones así como de las decisiones tomadas ante hallazgos no corregidos.

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Nº de determinaciones referencias CNA-ZO

Total Acreditadas Validadas

2991 2622 369

100 % 87,7 % 12,3 %

(Determinación: cada combinación de analito/matriz/especie/técnica)

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RPA

(“REFERENCE POINT OF ACTION”)


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CL Nº 330: MRPL a RPA


¿Sólo aplicable a

matrices

comestibles?

http://www.google.es/imgres?q=imagenes+de+preguntas&hl=es&sa=X&biw=1024&bih=673&tbm=isch&prmd=imvns&tbnid=1F25KJR60MsoxM:&imgrefurl=http://www.ongsci.org/es/index.php?option=com_content&task=view&id=99&docid=nXWjAzfytvm-fM&imgurl=http://www.ongsci.org/es/images/stories/faq_preguntas_frecuentes.gif&w=300&h=209&ei=kRjCT-HzFoWK0AXg7N24Cg&zoom=1&iact=hc&vpx=504&vpy=344&dur=215&hovh=167&hovw=240&tx=144&ty=106&sig=117039905333051842411&page=1&tbnh=121&tbnw=174&start=0&ndsp=16&ved=1t:429,r:8,s:0,i:127

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REGLAMENTO (CE) Nº 470/2009:

Por el que se establecen procedimientos comunitarios para la

fijación de los límites de residuos de las sustancias

farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal

Se introduce el término RPA (Reference Point for Action)

LMR: Límite máximo de residuos

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¿Y la

incertidumbre?


http://www.google.es/imgres?q=imagenes+de+preguntas&hl=es&sa=X&biw=1024&bih=673&tbm=isch&prmd=imvns&tbnid=1F25KJR60MsoxM:&imgrefurl=http://www.ongsci.org/es/index.php?option=com_content&task=view&id=99&docid=nXWjAzfytvm-fM&imgurl=http://www.ongsci.org/es/images/stories/faq_preguntas_frecuentes.gif&w=300&h=209&ei=kRjCT-HzFoWK0AXg7N24Cg&zoom=1&iact=hc&vpx=504&vpy=344&dur=215&hovh=167&hovw=240&tx=144&ty=106&sig=117039905333051842411&page=1&tbnh=121&tbnw=174&start=0&ndsp=16&ved=1t:429,r:8,s:0,i:127

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REGLAMENTO (CE) Nº 470/2009:

Por el que se establecen procedimientos comunitarios para la

fijación de los límites de residuos de las sustancias

farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal.

“No obstante, la fijación de valores de referencia a efectos de

intervención no debe ser un pretexto para permitir el uso de

sustancias no autorizadas o prohibidas para el tratamiento

de animales productores de alimentos. Por consiguiente,

todo residuo de tales sustancias de origen animal deberá

considerarse rechazable”.

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WORKSHOP ANSES 2013

“CONTROL OF ANTIMICROBIAL RESIDUES IN HONEY”

EU-RL Fougeres (Francia)

(10 y 11 de octubre 2013)


Centro

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Workshop ANSES 2013


Centro

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Novedades de la CE sobre legislación. Resultados de los PNCR de la EU. Continua el estudio de la estrategia más adecuada para el

establecimiento de límites en miel (LMRs o similar). Diseño de un protocolo de muestreo robusto utilizando ciprofloxacina.

Workshop ANSES 2013


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Workshop ANSES 2013


Presentación de ANSES sobre el análisis de cribado de antibióticos en miel por el sistema EvidenceTM Investigator (Inmuno-biosensores).

ANSES tiene previsto para 2014 analizar todas las muestras de miel del PNCR (200 aprox.) mediante el sistema Evidence ®. Confirmación posterior por LC-MS/MS.

Falsos positivos para quinolonas Luego no confirmados por LC-MS/MS.

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Workshop ANSES 2013


Presentación de métodos desarrollados por ANSES

para:

• Sulfonamidas en miel por LC-MS/MS • Tetraciclinas en miel por LC-MS/MS • Cloranfenicol en orina por LC-MS/MS (MIPS) • Metabolitos de carbadox y olaquindox por

LC-MS/MS • Estudio de depleción de carbadox en porcino

(musculo e hígado): DCBX es más persistente que el QCA

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7th International Symposium on hormone and veterinary drug

residue analysis

2-5 junio 2014

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NOTE: Avoid glass material

- 2 g homogenized sample (white egg and yolk)

- Add Internal standard (TBM and HGB solution)

- Extraction with 2 x10 mL of mixture: 2 % TCA, 0.4 mM Na2EDTA and

10 mM KH2PO4 in water (4)

- Ultrasonic bath. Centrifugation. Filtration by Millex filter

- Adjust at pH 6 with ammonium hydroxide and HCl

- Pass through an OASIS WCX SPE cartridge – 3 cc 60 mg 60 mm –

(previously conditioned with 3 ml of MeOH and 3 ml of water)

- Wash with 2 mL of water, 2 mL of 25 mM sodium citrate and 2 mL of MeOH

- Elute with 800 ml of 100 mM HFBA in MeOH with 2 % formic acid

- Inject into LC-MS/MS system

M. Ramos, M. Caneiro, A. Aranda, V. Gonzalo, R. Muñoz and P. Muñoz.

Centro Nacional de Alimentación (CNA). Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (AECOSAN). Ctra. Pozuelo-Majadahonda km. 5.1. Majadahonda 28220

(Madrid). Spain. [email protected]

References

1. A. Kaufmann, K. Maden. (2005) J.AOAC VOL 88 No 4.

2. A. Kaufmann, P. Butcher, K. Maden. (2011) Analytica Chemica Acta.

3. T. Plozza, V.C. Trenerry, P. Zeglinsky, H. Nguyen, P. Johnstone. (2011) International Food Research Journal 18 (3) 1077-1084.

4. GLC-AMG1.03 (USDA-FSIS) (http://www.fsis.usda.gov/Science/Chemistry_Lab_Guidebook/index.asp).

5. Commission Decision 2002/657/EC.

6. Commission Regulation (EU) Nº 37/2010.

Aminoglycosides (AMGs) are antimicrobial agents frequently used in treatment of human and animal diseases

caused by aerobic gram-negative bacteria. AMGs are legislated in the Commission Regulation (EU) Nº 37/2010 with

different MRL depending on matrix/specie combinations. In eggs, only Neomycin has MRL fixed (500 µg/kg), while

other AMGs are prohibited or are not legislated (unauthorized).

A robust and effective multiresidue method for detection and confirmation of AMGs in eggs has been

developed. Ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) operating in

positive multiple reaction monitoring (MRM mode) has been used for detection and confirmation of Spectinomycin

(SPT), Streptomycin (STR), Dihydrostreptomycin (DHS), Kanamycin (KNM) and Gentamicin C1 (GNT-C1) and

Gentamicin C1a (GNT-C1a). Tobramycin (TBM) and Higromycin-B (HGB) were used as internal standards.

The final procedure involves extraction at low pH followed by clean-up with weak cation exchange cartridge

(WCX). The compounds are separated with an ACE Excel C18-PFP column using HFBA as counter ion. The choice of

the elution solvent of WCX and the concentration of HFBA in the mobile phase were crucial to obtain a good peak

shape and an adequate MS/MS response.

The procedure has been validated as a qualitative /confirmatory method, according to Commission Decision

2002/657/EC. Stability studies in order to get information about the appropriate storage conditions were performed.

Results of the investigation are presented.

- Flow rate: 0.4 mL/min

- Column: ACE Excel 2 C18-PFP 2 µm, 100 x 2,1 mm

(Symta) at 40 ºC

- Column in line filter 2.1 mm, 0.2 mm (Waters)

- Injection volume: 5 ml (autosampler 20 ºC)

Acquity UPLC - Quattro Premier (Waters)

- ESI (+)

- Capillary : 3 kV

- Extractor: 3 V

- RF Lens: 0.0 V

- Dessolvation gas flow: 800 L/h

- Dessolvation Temperature: 450 ºC

- Source Block Temperature: 120 ºC

- Cone Gas flow: 50 L/h

- Gas Cell Pirani press: 3.00 e-3 mbar

- LM / HM 1 y 2 resolution: 13.5

- Ion Energy 1 / 2: 0.5 V /1 V

- Entrance /Exit : 1 / 2RESULTS

METHOD DEVELOPMENT: MAIN CONCLUSIONS

CONCLUSIONS

An effective and reliable method has been developed for the analysis of aminoglycosides in eggs. A qualitative /confirmatory validation has been performed for

the following compounds: Spectinomycin, Streptomycin, Dihidrostreptomycin, Kanamycin, Gentamycin C1 and Gentamycin C1A. All criteria required for

qualitative/confirmatory methods (Commission Decision 2002/657/EC) were fulfilled.

More studies are needed to improve the chromatographic separation of Gentamicin C2 and Gentamicin C2a. An alternative would be to consider the sum of

both without chromatographic separation.

Quantitative validation is in progress with very promising results.

* Quantitation trace

ANALYSIS OF AMINOGLYCOSIDES IN EGGS BY UHPLC-MS/MS

ELUTION SOLVENTS TESTED FOR MCX CARTRIDGE

• MeOH/ Ácido fórmico (2 % - 5 %) mixtures:No elution of KNM, TBM and GNTs• MeOH/ HCl (0,1 % - 0,3 %) mixtures:Bad chromatography for STR and DHS• MeOH/ Ácido fórmico (2 %) / HFBA mixtures:Good results for all compounds (elution powerand chromatography)

STR(582 > 263)

Area:1678

TR: 5.44

Area: 564

RT: 5.35

Area: 203

RT: 5.13 5 mM HFBA

10 mM HFBA

15 mM HFBA

20 mM HFBA

Area:1233

TR: 5.43

DHS

(584 > 263)Area: 1273

RT: 5.18

Area: 2143

RT: 5.46

Area: 3028

RT: 5.56

Area: 4148

RT: 5.59

Time

(min)

A1

(%)

B1

(%)Curve

0 95.0 5.0 ---

2.0 85.0 15.0 6

4.5 81.0 19.0 6

5.5 80.5 19.5 8

6.0 78.0 22.0 6

7.0 65.0 35.0 6

9.0 52.0 48.0 8

9.5 95.0 5.0 6

12.0 95.0 5.0 1

A1: 20 mM HFBA in water /acetonitrile 98:2

B1: 20 mM HFBA in acetonitrile /water 98:2

CompoundMRM

channelDwell

(s)Cone

(V)Coll(V)

HGB [IS] 528.0 > 177.0 0.05 40 25

Fu

nc

t. 1 (0

–6

.5 m

in)

SPT351.0 > 333.0* 0.05 30 20

351.0 > 207.0 0.05 30 25

STR582.0 > 263.0* 0.05 60 35

582.0 > 246.0 0.05 60 40

DHS584.0 > 263.0* 0.05 60 30

584.0 > 246.0 0.05 60 45

TBM (IS) 468.0 > 163.0 0.02 30 25

Fu

nc

t. 2 (6

.5-1

0 m

in)

KNM485.0 > 163.0* 0.02 25 25

485.0 > 324.0 0.02 25 15

GNT-C1478.0 > 322.0* 0.02 25 15

478.0 > 157.0 0.02 25 20

GNT-C1a450.0 > 322.0* 0.02 20 15

450.0 > 160.0 0.02 20 25

GNT-C2464.0 > 322.0* 0.02 20 15

464.0 > 160.0 0.02 20 25

MS METHOD

ANALYTICAL METHOD

HFBA CONCENTRATION IN MOBILE PHASE

The best resolution, peak shapes and responses were obtained with 20 mM HFBA in the mobile phase.

STANDARD SOLUTIONS STABILITY

Egg sample spiked at 100 mg/kg (CCa)

GNT-C1 (478 > 322)

GNT-C2 (464 > 322)

GNT-C1a (450 > 322)

TBM (468 > 163)

KNM (485 > 163)

DHS (584 > 263)

STR (582 > 263)

HGB (528 > 177)

SPT (351 > 333)

RT: 8.40

RT: 8.40RT: 8.31

RT: 8.26

RT: 8.09

RT: 5.65

RT: 5.48

RT: 5.09

RT: 3.67

RT: 7.52

GNT-C2 GNT-C2a

-Stable retention times

- Rapid chromatographic column

conditionning

- Linear response

- No ion supression working at

concentration lower than 25 mM.

- MS/MS remains clean enough and

it can be used for other analysis

alternately

CHROMATOGRAPHY WITH HFBA

* Most intense MRM channels

- Solvent: 0.2 % acetic acid + 20 mM HFPA in water/acetonitrile 80:20 - Store in polypropylene tubes, at - 20 ºC and in dark - Stock solutions 1 mg/mL- Mixture working solution 5 ng/mL

Stability period: 22 months in the conditions described above (t-Student test/F test)

INTRODUCTION

Dihydrostreptomycin

EXTRACTION AND CLEAN-UP

LC CONDITIONS TUNE PAGE

Centro

Nacional de

Alimentación

Gracias por

vuestra

atención

[email protected]

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