análisis de trazas de somatropina en leche por lc-ms/ms y ... · • es una matriz compleja, con...

Análisis de trazas de Somatropina en leche por

LC-MS/MS y en modo MRM3

Dr. Fernando A. Iñón

Gte. investigación y Desarrollo – Gte. Capacitación y Aplicaciones

JENCK S.A.

11 de junio de 2015

SEGUNDAS JORNADAS DE ACTUALIZACIÓN ANALÍTICA INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA INDUSTRIAL

CENTRO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS DE LA INDUSTRIA LÁCTEA

INTI Lácteos - Sede Rafaela

Temario

• Importancia de la determinación de somatropina en leche

• Qué es y cómo funciona un LC-MS/MS y que tipo de

espectrómetros existen

• Ventajas y aplicaciones de equipos MS/MS híbridos

• Determinación de somatropina en leche mediante MRM y MS3

JENCK S.A.

• RECURSOS

o HUMANOS

o INFRAESTRUCTURA

JENCK S.A.

• Asesoramiento y provisión

de Instrumental analítico

• Calificación, certificación y

mantenimiento de

instrumental

• Capacitación

• Cursos

• Seminarios

• Desarrollo de aplicaciones

Capacitación Jenck S.A. 2015

• Cursos teórico-prácticos dictados en JENCK

• Seminarios de Innovación y Divulgación Tecnológica

• Seminarios del Departamento de Servicios de Posventa

• Cursos a medida (dictados en planta o laboratorio del cliente o

en JENCK)

• Cursos fuera de nuestra sede, en vinculación con universidades

y centros de investigación de todo el país

NOTIJENCK.COM.AR

GERENCIA DE

CAPACITACIÓN Y APLICACIONES

[email protected] .:. www.jenck.com

TEL: (54) 11-4014-5300 .:. FAX: (54) 11-4014-5353

mailto:[email protected]

http://www.jenck.com/

Somatropina en leche

• Tratamiento de vacas con Somatotropina Bobina recombinante(rBST) • aumentar su producción en leche (de 10-15%)

• promover su crecimiento,

• Favorecer, según ciertos estudios, la fertilidad.

Somatropina bovina recombinante en leche

• Tratamiento prohibido en muchos países • Comunidad Europea, Japón, Australia, Nueva Zelandia, Canadá,

• …Argentina (¿?!)

• se utiliza comúnmente en los Estados Unidos, ya que está autorizada por la FDA desde 1994.

• La mayoría de los métodos analíticos utilizados para detectar esta hormona implican inmunoensayos, • Incapacidad de diferenciar la hormona natural y la versión recombinante

• La rbST en leche se la encuentra presente en baja concentraciones (~ ng/ml, ppb), • La metodología implementada debe poser buena sensibilidad con elevada

confianza en su confirmación definitiva.


• De todas las matrices, la leche es la matriz más complicada para detectar rBST, ya que: • es una matriz compleja, con alto contenido de proteínas, lípidos y azúcares;

• contiene un gran número de proteínas que presentan propiedades fisicoquímicas similares a la rBST

• la concentración de rBST muy baja

• la caseína puede actuar como secuestrador de rBST • Secuestro de proteína: donde la proteína activa (en este caso la rBST) se un une a

un complejo proteico inactivo (en este caso la caseína)

• Remoción anticipada de caseínas podría afectar la recuperación de rBST

• La cuantificación de proteínas, especialmente en matrices ricas en proteínas, siempre ha sido un desafío

• Para resolver estos problemas, se debe utilizar técnicas especializadas • Que pueda validarse y defenderse legalmente

Somatropina y somatropina recombinate

• La formas natural y recombinante difieren por un aminoácido N-terminal,

• rBST, 190 aminoácidos, Peso molecular: 22kDa

• Ligera diferencia, pero significativa para que un método basado en espectrometría de

masas sea una alternativa viable

• varias ventajas, incluyendo la especificidad y sensibilidad.

Metionina Alanina

2 ptes disulfuro

53-164,181- 189


• Es necesario contar con una tecnología analítica diferencial

capaz de discriminar entre el efecto matriz y el analito en

cuestión (rbST);

• al intentar eliminar los interferentes de la matriz solamente por

métodos físico-químicos (extracción líquido/líquido, evaporaciones,

extracción y/o dispersión en fase sólida, cambio de fases, ect.), al fin

de obtener un extracto de inyección aceptable, involucra que en cada

paso adicional de limpieza disminuye el porcentaje de recuperación

del analito.

Comparación de metodologías

Inmunoensayos Se basa en la detección de la proteína entera

a través su unión a anticuerpos específicos

+ -

Alta sensibilidad No discrimina entre

BST y rBST

Facil de realizar

Cuantitativo

Espectrometría de masas

+ -

Discrimina entre BST

y rBST

Dificulta en la

purificación de la

matriz

Altísima sensibilidad No es fácil detectar

la proteína entera,

Digestión enzimática

previa para enfocarse

en el péptido N-

terminal

Principio del espectrómetro de masas (MS)

• Se aplica alto voltaje al eluido de la columna, formando una niebla por adición de nitrógeno (nebulización)

• Las gotas cargadas disminuyen su tamaño gradualmente hasta provocar la evaporación de iones.

• Los iones son separados por tamaños dentro del analizador.

• Al alcanzar el detector, los iones son contados.

Ión positivo

(molécula protonada )

Eliminación de

un protón

Ión Negativo

(molécula desprotonada)

Protón

イオン化したい化合物の分子

Separación en la

columna

Inyección de muestra

Introducción al MS

fase móvil

Adición protónica

Eluido de la

columna

Unidad de enfoque

Analizador Detector Fuente de iones

Región a presión atmosférica

Región de vacío

< ESI >

¿Cuál es el mayor beneficio de un MS como detector en

LC? • El mayor beneficio es:

• Adicionalmente al tiempo de retención, puede obtenerse información sobre la masa relacionada con cada compuesto, de forma sencilla y simultánea.

• La información de la masa permite reducir el riesgo de； • Identificación errónea del compuesto

• Error en la Cuantificación debido a la elución inesperada de interferencias, etc.

m/z 264

m/z 278

m/z 267

m/z 281

La posibilidad de

separar en función

de la masa

↓

Reduce el riesgo de

cometer errores de

identificación y

cuantificación

LC-MS: datos analíticos MS

(1) (2) (3)

(4) (5)

m/z

m/z

(5)

(4)

tiempo

(3) m/z 193

(2) m/z 582

(1) TIC

Espectro de masas

PDA (dispositivo de fotodiodos)

tiempo

(3) 210 nm

(2) 580 nm

cromatograma (2)

(3)

(4)

(5)

int.

int.

Espectro UV

nm

nm

(5)

(4) AU

AU

cromatograma

Espectrometría MS/MS

• Información estructural

• Identificación de compuestos desconocidos

• Selectividad adicional a la cromatografía

• Análisis de mezclas complejas

• No siempre se necesita de un cromatógrafo

• Mejor relación señal/ruidos (S/N)

• Análisis de trazas

• Bajo tiempo de desarrollo de métodos

Alta Sensibilidad y Selectividad en Modo MRM

Triple Cuadrupolos

Generación de Iones

Transporte de Iones

Filtro de Iones Filtro de Iones

Fragmentación

Ideal para “Targered Analysis” (Análisis de Compuestos Conocidos) que requiere

precisión en la cuantificación.

Circuito Iónico Electrónico “Esquiando en Pendiente”

Funcioes de la Fuente de Iones API

• Nexo de unión entre el HPLC y la primer región de vacío del

MS, todo a presión atmosférica.

• Generar iones en fase gaseosa

• Ionizar el analito (APCI, APPI o AP-MALDI).

• Nebulización de los iones en disolución (ESI o NSI).

• Desolvatar los cluster (analito(s) más solvente) antes de

ingresar al MS.

• Eliminar moléculas neutras e iones de carga opuesta a la

polaridad de trabajo antes de ingresar al MS.

Fuente de Iones API

API 3200TM, API 4000TM, API 4500TM, API 5000TM, API 5500TM, 3200 Q TRAP®, 4000 QTRAP®,

4500 QTRAP® 5500 QTRAP® poseen la Fuente de Iones API: Turbo VTM

Los “ turbo heate r” son

calentadores cerámicos del

a i r e q u e p r o m u e v e n l a

desolvatación de los iones.

Se puede programar su

temperatura desde Analyst®,

permitiendo tener para cada

tiempo cromatográfico (δΤ≥1

min.) diferentes temperaturas

que optimizan la señal. A su

v e z r e d u c e e l “ e f e c t o

memoria” y aumenta el rango

d e f l u j o s d e t r a b a j o .

ESI MS disolución en CH3CN:H2O:ác.acético 50:46:4

temp fuente: 100 oC.

thermolysin

34 kDa

proteinase K

29 kDa

ESI - macromoléculas

Gas Cortina

• Interfase ideal para

prevenir contaminación

• Permite una operación

robusta ideal para

secuencias largas.

Interfase de vacío para el sistema API 5000, 5500, 4500 y

5500 QTrap

Región Q1

10 µTorr

Q0,

Potencial

De entrada (EP)

4-7

mTo

rr

Curtain plate

Orifice plate,

Declustering

Potential (DP)

QJet

Diferencia de presiones debido al vacío aplicado por la bomba mecánica externa

Orificio de

Entrada al MS

Presión

atmosférica

Gas Cortina

Skimmer vs Guías

• Guías:

• Cuadrupolo solo RF

• Enfoca iones en Q0

• Introduce más iones y menos gas en Q0

• Más eficiente que un skimmer

QTRAP® 4500

Incrementa la sensibilidad

en todos los modos

4000 Q TRAP®

Nueva guía iónica IonDrive QJet

• Permite la entrada de más iones

• Guía RF de dos etapas • 1ra Etapa: Mejor captura iones entrantes por orificios grandes

• 2da Etapa : Mejor transferencia de iones a la región Q0

• Mayor robustez

• Mejor barrara contra especies neutras y micro gotas

• La eficiencia de transmisión es 2x veces mejor que la guía iónica QJet® original

API 6500, 6500 QTRAP

Sciex QTRAP 4500

High pressure Q0 and

QJet®2 ion guide

Most efficient ion focusing

940 kHz ion path

Extended mass range with best low mass

ion confinement

Qurved LINAC® collision cell

Shortest MRM cycles and highest scan speed

and reduced instrument footprint

Turbo V™ source and

Curtain Gas™ interface

Unmatched robustness

and ruggedness

Linear Accelerator™

Ion trap

More efficient and faster Q

TRAP® scanning

AcQuRate™ pulse counting detector

Highest reproducibility and accuracy

Modo de Barrido Q1 Q2 Q3 Propósito

Full-Scan Scanning Transmisión Total Trans. Total Info. PM

SIM m/z Fijo Transmisión Total Trans. Total Cuantificación

Producto m/z Fijo CE + Transmisión Total Scanning Info Estructural

MRM m/z Fijo CE + Transmisión Total m/z Fijo Cuantif. Específ.

Pérdida neutra Scanning CE + Transmisión Total Scanning Screening Tipo de

Compuestos

Precursor Scanning CE + Transmisión Total m/z Fijo Screening Tipo de

Compuestos

MRM Alta Resolución Scaning Alta

Resolución CE + Transmisión Total

Scaning Alta

Resolución

Cuantif. Específ. +

Cualif. Definitiva.

Multi Target

Screening m/z Fijo CE + Transmisión Total

m/z Fijo +

Scanning

Cuantif. Específ. +

Cualif. Definitiva.

Rojo: MS simple, Triple Cuad., QqTOF y Q TRAP® - Verde: Triple Cuad.,

QqTOF y Q TRAP® - Marrón: solamente QqTOF - Azul: solamente Q TRAP®

Modos de Barrido

Selected/Multiple Reaction Monitoring (SRM/MRM)

• Ventajas

• Monitoreo específico del analito

en cuestión.

• Altos ciclos de Barrido.

• “Simultáneos” Monitoreo de

Múltiples Transiciones.

• Desventajas

• Nula provisión de información

estructural.

• Las moléculas desconocidas

son ignoradas por el MS/MS

(Unknowns Screening).

m/z Fijo Transmisión

Total m/z Fijo

Q1 Q2 Q3

Identificación de Compuestos utilizando Relación de

Áreas o Alturas en modo MRM

Alternativa de Identificación a la Relación de Áreas o

Alturas en modo MRM, el modo FullScan MS/MS

Generación de Iones

Transporte de Iones

Filtro de Iones Filtro de Iones

Fragmentación

Atrapamiento de

Iones

Q3 en un Sistema Q TRAP® puede funcionar como Cuadrupolo o Trampa Lineal.

Ideal para “Targered Analysis” y para GUS (General Unknow Screening) que

requiere precisión en la Cuantificación y Confirmación Definitiva.

Atrapamiento y Barrido Full-Scan dentro de la Trampa

Lineal de Iones Q3

Tecnologías MS/MS

Trampa 3D Sensibilidad Full

Scan

MS3 (o más)

Q TRAP

Sensibilidad Full Scan MS y MS/MS

MS3

Sensibilidad MRM

Pérdida de Neutros

Barrido de Precursores

QqQ Sensibilidad MRM

Pérdida de Neutros

Barrido de Precursores

Ventajas de las trampas lineales de iones

• El analizador de masas (corazón del espectrómetro) es mucho más rápido que un triple cuadrupolo convencional.

• La tecnología Q TRAP posibilita la utilización de Bibliotecas Espectrales de Compuestos MS/MS

• Permite realizar MS3 y así aumentar la especificidad y sensibilidad significativamente.

• Q3 puede funcionar como Trampa Lineal y posibilita estudios de elucidación de estructuras (Ej.: Estudios de Impurezas de Plaguicidas y Metabolitos), dado que permite alcanzar una alta resolución en masa (~12 ppm)

• Es factible trabajar en modo GUS (General Unknows Screening), para investigar compuestos desconocidos

• La tecnología Q TRAP puede funcionar también como un Triple Cuadupolo, manteniendo las ventajas de éste, por ejemplo el amplio rango dinámico (en modo MRM), gran exactitud de cuantificación, etc.

Barrido realzado de ion producto (EPI)

1) Q1 Selecciona el Ión Precursor.

2) Q2 Genera los Iones Producto.

3) Q3 Atrapa y barre en modo Full-Scan los Iones Producto.

Q1 Q2 Q3

XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 1.4e4 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

0.0

2000.0

4000.0

6000.0

8000.0

1.0e4

1.2e4

1.4e4

In

te

ns

it

y,

c

ps

7.20

+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.028 to 7.344 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 4.5e5 cps.

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu

0.0

1.0e5

2.0e5

3.0e5

4.0e5

In

te

ns

it

y,

c

ps

174.0

104.0132.0 146.096.0

216.079.0

138.0110.0 125.9 128.0

+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 7.074 to 7.382 min from Sample 7 (10) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray) Max. 3136.9 cps.

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

In

te

ns

it

y,

c

ps

174.2

104.296.2

79.2

216.0

146.0132.2

138.2126.8

Confirmación con QqLIT o QqQ

(10ng/mL Atrazine) MRM

Barrido EPI (Q TRAP)

Pureza 95.6%

Barrido PI (QqQ)

Pureza 69.5%

x 100

XIC of +MRM (10 pairs): Exp 1, 216.1/174.0 amu from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 660.0 cps.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min

0

100

200

300

400

500

600

660

In

te

ns

it

y,

c

ps

7.21

+EPI (216.10) CE (35): Exp 2, 7.121 to 7.301 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - EPI dynFT 216.wiff (Turbo Spray) Max. 3.5e4 cps.

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu

5000.0

1.0e4

1.5e4

2.0e4

2.5e4

3.0e4

3.5e4

In

te

ns

it

y,

c

ps

174.0

96.1 216.079.0

145.9104.0

+MS2 (216.10) CE (35): Exp 2, 6.628 to 7.861 min from Sample 4 (0.5) of Data EPI vs MS2 - MS2 216.wiff (Turbo Spray) Max. 89.2 cps.

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230m/z, amu

0

20

40

60

80

89

In

te

ns

it

y,

c

ps

174.0

(0.5 ng/mL Atrazine)

Confirmación con QqLIT o QqQ

MRM

Barrido EPI (Q TRAP)

Pureza 76.5%

Barrido PI (QqQ)

No hay match

Influencia de la concentración en la búscada en

bibliotecas

0

48.2

76.5

87.1

92.395.6

0.00.02.00.0

54.6

69.5

99.7

98.8

R2 = 0.9992

0.0E+00

5.0E+04

1.0E+05

1.5E+05

2.0E+05

2.5E+05

3.0E+05

3.5E+05

4.0E+05

4.5E+05

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Concentration (ng/mL)

Peak A

rea (

counts

) M

RM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Linear calibration Fit (%) EPI Fit (%) MS21ng/mL

QTRAP® QqQ

Cuantificación vía MS3

MS/MS/MS Q1 Q2 Q3

1)

2)

3)

1) Selección del Ión Precursor.

2) Fragmentación.

3) Atrapamiento de Ión Producto.

4) Fragmentación del Ión Producto.

5) Escaneo y envío al detector de los

Iones Productos Secundarios.

4)

5)

MRM & MS/MS/MS

Malatión 10 ng/g en Manzana - % CV<5, recuperación entre 90-110 %

MS/MS/MS Aumento de la Selectividad y Sensibilidad

Interferencias en modo MRM

Muestras #1, 10 y 11

fortificadas con 0.25 pg/µL

10 de 33 sujetos presentan interferencias!!!

Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.50 pg/uL

para MRM 277-168 (transición con mejor LOQ).

(flechas indican sujeto con interferencia al TR del clenbuterol

Muestras blanco de orina de 33 sujetos diferentes. Intensidad normalizada a 0.05 pg/µL

para MS3 277168132

Selectividad en modo MS3

Muestras #1, 10 y 11

fortificadas con 0.25 pg/µL

Ninguno presenta interferencias, aún con un umbral 10 veces menor !!!

Determinación de rBST

• Pasos críticos en la preparación de muestras • Recordar que la rBST está en niveles muy bajos (1-5 ng/mL)

• Extracción de grasas de muestras

• Precipitación de proteínas

• Desnaturalización y optimización de la digestión

• Introducción de un estándar interno antes de la preparación de

la muestra es esencial para evaluar y compensar perdidas de

analito o variabilidad del procedimiento analítico

Metodología

• Se agrega estándar interno (hormona equina (rEST) ) a 10 mL de muestra

• Extracción en fase sólida en cartucho C4 • Se lava cartucho con solución acuosa al 0.1% en ácido trifluoroacetico (TFA), y luego con

solución 30:70 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)

• Se eluye con 7 mL de solución 80:20 (acetonitrilo : sol. aq 0.1% TFA)

• Se evapora hasta 1 mL

• Precipitación de proteínas • Se induce con metanol frío, se centrifuga y se seca el sobrenadante

• Digestión • El residuo se reconstituye con 120 µL de buffer carbonato de amonio y se digiere a 37°C,

con tripsina durante 16 hs

• Reconstitución • El digerido se evapora hasta sequedad y se reconstituye con 500 µL de solución 30:70

(acetonitrilo: sol aq. 0.2% ác. fórmico) agregando además antes de la inyección el péptido N-terminal C13 de la de la rBST

Metodología

LC-MS/MS de BST y rBST

Multiple Reaction Monitoring

MS/MS/MS

MRM MRM3

Hormona Secuencia péptido N-Terminal

Transiciones DP (V)

CE (V)

Transiciones DP (V)

CE (V)

AF2 (mv)

rBST MFPAMSLSGLFANAVLR 913.2/774.0 913.2/1047.6

35 37 913.2/774.0/791.0 35 37 0.2

rEST MFPAMPLSSLFANAVLR 933.2/794.2 35 38

rBST 13C6

MFP(A13C)MS(L13C)SG(L13C)F(A13C)N(A13C)V(L13C)R

916.2/777.0 35 37

Condiciones intrumentales

• Shimadzu Nexera XR • Fase móvil A: 90:10 (agua:acetonitrilo), Fase móvil B: 10:90 (agua:acetonitrilo) siempre

conteniendo 0.1% ác. fórmico.

• Columna150 mm x 2.1 mm x 3 µm C18 Interchrom QS Uptisphere HDO.

• Temperatura ambiente, Gradiente 25 min a 300 µL/min.

• MS/MS: SCIEX 5500 QTRAP • Equipado con fuente Turbo V™. Ionización electrospay aplicando 3500 V

XIC of +MS3 (913.20),(774.00): Exp 2, 790.309 to 790.... Max. 9.1e5 cps.

4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.0

1.0e5

2.0e5

3.0e5

4.0e5

5.0e5

6.0e5

7.0e5

8.0e5

9.0e5

Inte

ns

ity

, c

ps

5.66

4.626.094.71

7.846.69

S/N = 74.3


4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

Inte

ns

ity

, c

ps

5.67

4.724.904.56 5.75 6.05 6.39

S/N = 60.8

XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/774.000 Da from Sa... Max. 4610.0 cps.

4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Inte

ns

ity

, c

ps

5.58

5.94

4.25 4.34 4.62 6.016.335.00 6.60 7.605.18 7.39 7.686.83

S/N = 68.7

XIC of +MRM (8 pairs): 913.200/1047.600 Da from S... Max. 1085.0 cps.

4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1085

Inte

ns

ity

, c

ps

5.60

4.834.17 4.58

5.746.17

5.13 7.096.83 7.176.38 7.797.58

S/N = 32.6

rBST MRM 913.2 / 774.0

rBST MRM

913.2 / 1047.6

rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 791.0 rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 961.0

S/N = 74.3 S/N = 60.8

S/N = 68.7 S/N = 32.6

rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 960.9

rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 791.0

rEST MRM 933.2 / 794.2

rBST 13C6

916.2 / 777.0

Cromatograma iónico total rBST 10 ppb

TIC: from Sample 12 (milk, 2 ppb) of rbST 20110512.wiff (Turbo Spray) Max. 3.4e7 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0Time, min

0.0

5.0e6

1.0e7

1.5e7

2.0e7

2.5e7

3.0e7

3.4e7

In

te

ns

it

y.

..

4.66

4.88

4.51

5.63

5.97

6.67 8.89 13.858.28 9.66 9.95 10.90

XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 933.600/794.300 Da fro... Max. 1.1e5 cps.

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.00

2.00e4

4.00e4

6.00e4

8.00e4

1.00e5

Inte

ns

ity

, c

ps

5.71

XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 916.200/777.000 Da fro... Max. 1.8e5 cps.

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

1.8e5

Inte

ns

ity

, c

ps

5.63


3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.0

2.0e4

4.0e4

6.0e4

8.0e4

1.0e5

1.2e5

1.4e5

Inte

ns

ity

, c

ps

5.64

4.834.68


3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5Time, min

0.0

2.0e4

4.0e4

6.0e4

8.0e4

9.8e4

Inte

ns

ity

, c

ps

5.66

5.60

4.84

6.456.014.51

rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 791.0

rBST MRM3

913.2 / 774.0 / 961.0

rEST MRM 933.2 / 794.2

rBST 13C6

916.2 / 777.0

Cromatograma iónico total rBST 2 ppb

Curva de calibración

Conclusiones

• La espectrometría de masas permite un nuevo enfoque para la detección selectiva de rBST en leche,

• A diferencia de los métodos clásicos, permite diferenciar la forma nativa BST de la recombinante rBST

• Esto es un paso importantísimo para el control del uso (indebido) de esta hormona en la producción de leche

• El método presentado podría mejorarse, especialmente en la preparación de muestra para mejorar el porcentaje de recuperación de la rBST y mejorar aun más los límites de detección. Esto incluye el proceso de digestión con tripsina.

• La detección utilizando tecnología MS3 permite reducir significativamente interferencias de matriz, mejorando la relación S/N obtenida.

GERENCIA DE

CAPACITACIÓN Y APLICACIONES

[email protected] .:. www.jenck.com

TEL: (54) 11-4014-5300 .:. FAX: (54) 11-4014-5353

mailto:[email protected]

http://www.jenck.com/

análisis de trazas de somatropina en leche por lc-ms/ms y ... · • es una matriz compleja, con...

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