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F. Mocholí
Seminarios ABI, Noviembre 2007
Aspectos a tener en cuenta en el análisis de residuos de plaguicidas en vegetales por
LC/MS/MS
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Tiempos Pasados
Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos
muy limpios
Evitar contaminación cromatográfica
Mantener el sistema inerte
Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad
Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de
columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de
Fluorescencia)
Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC)
Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir
mejoras
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Tiempos pasados
Smash the vegetable sample (50g)
Homogeneize (20sec)
Filter
SPE/GPC
Evaporate
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
Reconstitute with 5ml Cyclohexane
Homogeneize (20sec)
Evaporate
10 fold concentration
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Tiempos pasados
Distintas técnicas para
distintos compuestos (UV,
derivatización para
Fluorescencia, etc.)
Pobre selectividad (longitud
de onda, espectro UV)
Baja sensibilidad
Limitado número de
compuestos
Duración de los
cromatogramas
DAD, 2mg/Kg standard
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LC/MS Ionspray
GC/MS
IonicA
naly
te P
olar
ity
Molecular Weight101 102 103 10104 105
Non-Ionic
GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular
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Evolución de LC/MS
Necesidad de confirmación por MS
Número de analitos en aumento
Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez)
Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo
de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto,
presión, etc.)
La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS
Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.)
Número de analitos en aumento
Identificación de desconocidos
Número de analitos en aumento
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Ionización por Electrospray
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Ion Spray (ESI)
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Ion Spray (ESI)
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Ion Spray (ESI)
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Ion Spray (ESI)
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Fuentes de ionización para ESI
Electrospray hasta 1 l/min
Dependiente de la Concentración
Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente) Flujos de líquido 5-200 ul/min
Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos
Dependiente de la Concentración
TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente) Flujos de líquido 5-1000 ul/min
Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos
Dependiente de la Concentración
Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases) Flujos de líquido 5-2000 ul/min
Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos
Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos
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Problema: Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco volátiles
Solución: Hacer que los iones describan un camino má o menos tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez)
Orthogonal
Pepperpot
Crossflow LCZ aQa
Off axis
Estrategias para mejorar la robustez
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OSA
N2
N2
TurboIonSpray®
Angle
Turbo V source®
Estrategias para mejorar la robustez
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Pares iónicos Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones
deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la
evaporación de los iones)
Efectos competitivos durante la evaporación de los iones Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc.
compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.
Supresión Iónica Reducción señal Analito
ESI: Mecanismo supresión iónica
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Menos señal a mayor concentración del tampón
Supresión señal iónica
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Comparación matrices Vegetales full scan
LechugaNaranjaUva
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Efecto Matriz
Columna 5 cm
Lechuga 0.010mg/Kg
Uva 0.010 mg/Kg
Columna 15 cm
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Q1 Q2 Q3
SISCIDFULL SCAN
MS/MS
Fuente Ioniz.
Fuente Ioniz.
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¿Qué “Dwell time” debo utilizar?1 transición MRM (1 compuesto)
Como media, se requieren 15 puntos (o al menos 10) para integrar con precisión un pico cromatográfico
30 segundosX
X
X
X
X
X
X
X
X
XX
X
X
X
X(Anchura del pico)/(número de puntos)=30/15 = 2 segundosSe necesita 1 punto cada 2 segundos (2000 ms)
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¿Qué “Dwell time” debo utilizar?2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual)
Si “dwell time” permanece constante; el tiempo para cada compuesto es 2000 ms: 2000 ms
+ 2000 ms-----------
2 compuestos: 4000 ms
30 segundos / 4000 ms = 7.5 puntos sólo!
30 segundos
XXXXXXXXXX
X
X
X
X
X X XX
X
X
X
X
X
X
X X X X X X X X X
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¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente?
“Dwell time” constante
=> El número de puntos para definir el pico cae rápidamente
Time MRM Puntos
2000 1 15
2000 2 7
2000 3 5
Número de puntos por pico constante
=> “Dwell time” debe disnimuir!
Dwell time (ms) MRM Puntos 3DTrap QqQ
2000 1 15 Sí Sí
1000 2 15 Sí Sí
667 3 15 Sí Sí
200 10 15 Sí/No Sí
100 20 15 No Sí
10 200 15 No Sí
Anchura de pico 30 s
En una columna de 2mm id, 3m la anchura de pico es
normalmente 10 s, así que se debe dividir todo por 3
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Anchura de pico 10 s
Para 10 puntos por pico cromatográfico
=> “Dwell time” debe disminuir!
Dwell time (ms)MRM Data points 3DTrap QqQ
1000 1 10 Sí Sí
500 2 10 Sí Sí
333 3 10 Sí Sí
100 10 10 Sí/No Sï
50 20 10 No Sí
10 100 10 No Sí
5 200 10 No Sí
A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna,
la anchura de pico también disminuye, pero para mantener el número de puntos,
debe disminuir el “Dwell time”
¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente?
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Prueba Columnas LC/MS. Analitos
Acephate Demeton-S-methyl sulfoxide Imazalil Omethoate
Acetamiprid Dichlorvos Imidacloprid Oxamyl
Aldicarb Diflubenzuron Indoxacarb Picoxystrobin
Aldicarb Sulfone Dimetomorph Linuron Propoxur
Aldicarb Sulfoxid Diuron Lufenuron Pyraclostrobin
Benfuracarb Ethiofencarb sulfone Methamidophos Spiroxamine
Carbendazim Ethiofencarb sulfoxide Methiocarb Tebufenocide
Carbofuran Fenhexamid Methiocarb sulfone Thiametoxam
Carbofuran 3OH Fludioxonil Methiocarb sulfoxide Thicloprid
Carbosulfan Flufenoxuron Methomyl Trifloxystrobin
Clofentezine Hexaflumuron Monocrotophos
Total analytes, 43
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Columnas Probadas
Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3m
Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3m
Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3m
QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3m
Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3m
Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3m
Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7m
Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5m
Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes
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LC/MS Columns Linearity Test
Número de compuestos con r2>0.996 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg,
3 replicas por concentración (18 inyecciones).
37
29
38
30
37
33
37
34
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1 2 3 4 5 6 7 8
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Prueba de anchura de pico LC/MS
Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos
Leyenda: Muy Ancho
Ancho
Bueno
Estrecho (muy bueno)
Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)
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Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS
RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8
2.72 Methamidophos 27 37 18 18 16 28 24 20
4.77 Acephate 25 35 15 28 33 30 38 17
5.24 Omethoate 27 38 8 27 28 26 9 9
5.46 Aldicarb Sulfoxid 12 10 6 9 13 9 8 8
5.65 Aldicarb Sulfone 8 8 6 7 10 8 7 8
5.74 Oxamyl 8 7 6 6 9 6 7 6
5.87 Carbendazim 9 10 8 10 12 9 10 9
5.92 Demeton-S-methyl sulfoxide 8 8 7 8 7 7 8 7
6.01 Methomyl 6 6 7 6 8 7 8 6
6.11 Thiametoxam 4 4 4 4 4 4 4 4
6.29 Monocrotophos 7 7 6 7 7 6 6 8
6.61 Ethiofencarb sulfone 7 6 6 7 7 6 6 6
6.72 Imidacloprid 5 5 5 5 5 5 6 5
6.73 Ethiofencarb sulfoxide 7 7 7 9 5 7 6 6
6.94 Methiocarb sulfoxide 6 5 6 6 6 6 6 6
7.16 Carbofuran 3OH 6 6 6 7 6 6 6 7
7.20 Acetamiprid 7 7 7 8 7 7 8 8
7.37 Methiocarb sulfone 6 6 6 7 6 6 6 7
7.65 Thicloprid 7 6 7 7 6 7 7 7
8.13 Aldicarb 6 5 6 6 5 6 6 6
8.73 Dichlorvos 7 6 6 7 6 7 7 7
8.77 Imazalil 6 8 6 8 7 6 9 7
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LC/MS Columns Peak Width Test
RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8
8.85 Propoxur 7 7 7 7 6 7 6 8
8.90 Carbofuran 8 6 7 8 7 8 9 6
9.58 Spiroxamine 8 9 11 11 22 6 20 9
9.95 Diuron 6 7 7 8 6 7 7 9
10.40 Linuron 7 7 6 6 6 5 6 7
10.50 Methiocarb 7 6 5 6 5 5 7 7
10.60 Dimetomorph 22 22 16 18 9 23 23 21
10.60 Fludioxonil 4 3 3 4 3 12 4 5
11.00 Fenhexamid 5 4 5 6 5 6 5 5
11.20 Diflubenzuron 6 5 5 6 8 6 5 5
11.20 Picoxystrobin 7 5 7 6 7 7 6 8
11.30 Tebufenocide 6 5 7 7 6 7 6 7
11.60 Pyraclostrobin 7 6 7 8 6 6 8 7
11.70 Clofentezine 6 6 6 4 10 7 7 8
11.80 Indoxacarb 5 5 4 6 6 5 4 5
11.90 Trifloxystrobin 7 5 7 8 6 8 6 6
12.00 Hexaflumuron 4 4 4 5 4 4 4 4
12.20 Benfuracarb 5 5 5 5 5 5 5 5
12.30 Lufenuron 4 6 3 5 4 4 12 5
12.50 Flufenoxuron 5 5 6 7 7 6 5 5
13.00 Carbosulfan 3 3 4 4 2 5 6 4
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30
Methamidophos 0.100 mg/Kg
1
8765
432
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31
Acephate 0.100 mg/Kg
1
8765
432
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32
Omethoate 0.100 mg/Kg
1
8765
432
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33
Oxamyl 0.100 mg/Kg
1
8765
432
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34
+Hexaflumuron 0.100 mg/Kg
1
8765
432
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Trap 3DSensibilidad Full Scan
MS3 (o más)
QqQSensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de Precursores
Q TRAP
Sensibilidad Full Scan
MS3
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de Precursores
Tecnologías MS
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Adquisición Dependiente de la Información (IDA)
Barrido en “Multiple Reaction
Monitoring” de cientos de compuestos
(solamente 1 transición por analito...)
Criterio IDA (umbral...)
Adquisición automática de espectros
en modo “Enhanced Product Ion
Scans” en la trampa
Sustracción de Fondo Dinámica y
Exclusión Dinámica
Búsqueda en bibliotecas de espectros
Umbral de señal Exclusión Dinámica
Barrido de MRM
Scans dependientes
Búsqueda de desconocidos
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Library CE=20V
Library CE=35V
Library CE=50V
CE=20VFit 0.956RFit 0.956Purity 0.955
CE=35VFit 0.953RFit 0.955Purity 0.951
CE=50VFit 0.735RFit 0.618Purity 0.607
Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil)
Metalaxil en uva
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Conclusiones
A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en
LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas
más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo:
Una disminución increíble en los límites de detección
Aumento en el número de compuestos en un único análisis
Gran Selectividad
Preparación de la muestra más sencilla
Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o
Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un
laboratorio de plaguicidas.
Y la historia continua...
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