técnicas de biologia molecular en la infección por vih

Técnicas de Biologia Molecular en la infección

por VIHMIR 3º: Leandra Robles

Contenido

1. Introducción y aspectos generales.

2. Epidemiología de la infección por VIH

3. Recomendaciones y técnicas diagnósticas.

4. Monitorización

5. Conclusiones

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INTRODUCCIÓN

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2007

25.000.000 personas

Han muerto por el SIDA, según OMS.

2020

38.000.000

Casos en el mundo, según ONUSIDA.

1981

Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida

Grupo de pacientes jóvenes con neumonia por Pneumocystis jirovecci y sarcoma de Kaposi.

1983

Aísla e identifica el virus

Detección, prevención y tratamiento.

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INTRODUCCIÓN

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INTRODUCCIÓN

• 3500 casos nuevos de infección por VIH en España (9 casos/100000 hab).• La mediana de edad es 36 años en hombres y 39 años en mujeres.

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ASPECTOS GENERALES DE LA INFECCIÓN POR VIH

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ASPECTOS GENERALES DE LA INFECCIÓN POR VIH

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VIH-1

• Afectación global

• 4 grupos: M, N, O, P.

• M: A-K, el subtipo Cafecta a máspersonas en elmundo, el subtipo Bes la variante deEUROPA y EEUU.

• Formas circulantesrecombinantes(CRFs) y formasrecombinantesúnicas (URFs).

VIH-2

• África occidental

• Produce unaenfermedad menosagresiva.

• Destruye lentamenteel sistema inmune.

• Transmisión verticales más difícil.

ASPECTOS GENERALES DE LA INFECCIÓN POR VIH

VIH-1

▸ Es un lentivirus envuelto por una membrana lipidicaque encierra una cápsula viral de forma cónica óicosaedrica.

▸ Hay una serie de proteinas de la envuelta, que seencuentran asociadas en forma de heterotrímero.

▸ Gen gag: codifica proteinas del core y la matriz.

▸ Gen pol: enzimas PR, RT, IN.

▸ Gen env: proteinas de la envuelta (Gp 160 y dossubunidades: gp 120 y gp 41).

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CICLO VITAL

▸ Ciclo infectivo inicial: Receptor CD4y el correceptor de quimiocinasCCR5.

▸ Infección: las cepas que infectannuevas celulas usan el correceptorCXCR4 (presente en LT CD4+).

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CICLO VITAL

Primera parte

•Unión de la proteínagp120 al receptor CD4y a un correceptor.

•Cambios en el virus yen la membranacelular

•Liberación de lacápsula viral alcitoplasma

•ADN de doble cadenaque se integra en elcromosoma celular

Segunda parte

•Empaquetamiento

•Ensamblamiento

•Citoplasma junto a lamembrana celular

•Formación de un virióncompleto que sale alexterior mediantegemación.

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RECOMENDACIONES PARA REALIZAR EL DIAGNÓSTICO DE VIH

1. Personas con criterios clínicos compatibles con infección por VIH/SIDA.2. Personas sin sospecha clínica de infección por VIH/SIDA:

2.1) Prueba obligatoria de VIH2.2) Oferta rutinaria de la prueba VIH2.3) Oferta dirigida de la prueba de VIH.

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TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS DEL VIH

• El diagnóstico de la infección se realizahabitualmente empleando un inmunoensayocapaz de detectar anticuerpos frente a VIH-1 yVIH-2 (técnicas de tercera generación) o dedetectar simultáneamente anticuerpos VIH-1/2 yantígeno p24 (técnicas de cuarta generación).

• Las muestras reactivas a través de estosmétodos, de muy elevada sensibilidad, debenser confirmadas con técnicas de altaespecificidad.

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TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS DEL VIH

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TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS DEL VIH

Estás técnicas van a permitir diferenciardistintos anticuerpos producidos por elhuésped frente a diferentes antígenosvirales. VIH-1: gp41, gp120, gp160, p17, p24,

p31. VIH-2: gp36, gp105.

TEST REACTIVO

WESTERN BLOT (WB)

INMUNOENSAYO ENZIMATICO (EIA)

INMUNOCROMATOGRAFIA (FLUJO

LATERAL)

Positivo: Detecta dos bandas.Indeterminado: Una banda ó dos bandasde diferentes tipos virales.Negativo: ninguna.

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ALGORITMO DIAGNÓSTICO DEL VIH

DIAGNÓSTICO

▸ Uso de técnicas moleculares:

▸ Tercer paso del algoritmo diagnóstico de rutina.

▸ Diagnóstico de transmisión vertical.

▸ Cribado de donantes de componentes sanguíneos.

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Resultados no congruentes entre el test de cribado y la técnica confirmatoria.

DETECCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

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Retrotranscripción previa

Plasma

Detección de ADN proviral

Sangre total

• Se recomienda que sea de detección cualitativa.

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VIH Ag/Ac Positivo

AVISO CARGA VIRAL

VIH Técnica Alternativa

(Roche)

Prueba confirmatoria

LIA

DETECCIÓN CARGA VIRAL

ALGORITMO DIAGNÓSTICO DEL VIH

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ALGORITMO DIAGNÓSTICO DEL VIH

MONITORIZACIÓN

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Determinación de carga viral

Número de Lt CD4+

circulantes

Se expresa como número de copias de ARN por mililitro.

Permite conocer la eficacia del tratamiento e identificar un posible fracaso.

Reduce el riesgo de resistencia a los fármacos.

Indicador centinela de replicación viral activa.

MONITORIZACIÓN

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Recomendaciones:

La CV debe realizarse en todo paciente diagnosticado antes de iniciar el tratamiento antirretroviral y

cuatro semanas después de su comienzo.

Se debe monitorizar de forma periódica cada 3-6 meses hasta alcanzar supresión viral.

Si se alcanza la supresión viral, la monitorización se puede realizar cada 6 meses.

Paciente estable (CD4+ >300 células/mm3), buena adherencia y CV suprimida durante al menos 2

años, se considera determinar controles cada 6-12 meses.

Después de iniciar el tratamiento, la CV debe descender rápidamente, transcurridas 16-24 semanas se debería alcanzar la supresión virológica (<50 copias/mL).

MONITORIZACIÓN

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La muestra recomendada es sangre con EDTA.

Otras muestras y fluidos (LCR, semen, biopsia de

mucosas, etc) se utilizan en el contexto de

investigación pero no como rutina habitual.

En algunos países con pocos recursos, se utiliza la

determinación con gotas de sangre seca. Alta

sensibilidad en el diagnóstico perinatal y CV >5000

copias/mL.

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Confirmar la infección por el VIH-1 en pacientes con anticuerpos reactivo.

Valorar el pronóstico del paciente por medio de la determinación de la carga viral

del VIH-1.

Monitorizar los efectos de la terapia antirretroviral por medio de la determinación de

los cambios de los niveles de ARN del VIH-1 durante el curso del tratamiento.

Determinar si es necesario practicar una cesárea (para mujeres embarazadas con

una carga viral > 1.000 copias/ml)

USOS DE LA DETERMINACIÓN DE CV

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TÉCNICAS MOLECULARES

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CONCLUSIONES

En España hay aproximadamente 142000 personasinfectadas por VIH, de las cuales sólo el 82% conocen suestado de infección.

Se han propuesto distintas estrategias basadas en elanálisis de los grupos de riesgo para diagnosticar lainfección antes y aumentar el porcentaje de personasdiagnosticadas.

Los inmunoensayos de cuarta generación son losmétodos de cribado recomendados por los algoritmosdiagnósticos de la infección.

Si hay reactividad, se deben emplear pruebassuplementarias serológicas para diferenciar la infecciónpor VIH-1 y VIH-2, y/o pruebas de detección molecularde VIH-1.

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Muchas gracias