6b. diagnóstico microbiológico de la infección por el vih
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Diagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIH
Procedimientos en Microbiologiacutea Cliacutenica
Recomendaciones de la Sociedad Espantildeola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica
6b
Emiacutelia Cercenado Mansilla
Rafael Cantoacuten Moreno
Federico Garciacutea Garciacutea Antonio Aguilera Guirao
Marta Aacutelvarez Esteacutevez
Gabriel Reina Gonzaacutelez
Carmen Rodriacuteguez Martin
Editores Coordinador Autores
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M
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portada_seimcpdf 1 010914 1056
ISBN-13 978-84-617-1842-9
ISBN-10 84-617-1842-9
EDITORES
Emilia Cercenado Mansilla Servicio de Microbiologiacutea Hospital General Universitario Gregorio Marantildeoacuten
Madrid
Rafael Cantoacuten Moreno Servicio de Microbiologiacutea Hospital Universitario Ramoacuten y Cajal e Instituto Ramoacuten
y Cajal de Investigacioacuten Sanitaria (IRYCIS) Madrid
SUGERENCIA DE CITACIOacuteN
Aguilera Guirao A Aacutelvarez Esteacutevez M Garciacutea Garciacutea F Reina Gonzaacutelez G Rodriacuteguez Martin C Diag-
noacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIH 6a Garciacutea Garciacutea F (coordinador) Procedimientos en
Microbiologiacutea Clinica Cercenado Mansilla E Cantoacuten Moreno R (editores) Sociedad Espantildeola de Enfer-
medades Infecciosas y Microbiologia Cliacutenica (SEIMC) 2014
AVISO
Reservados todos los derechos Los documentos SEIMC o cualquiera de sus partes no podraacuten ser
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elaborado por la SEIMC (Sociedad Espantildeola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica) y su
contenido puede encontrase en la paacutegina web wwwseimcorgrdquo
Procedimientos en Microbiologiacutea Cliacutenica
Recomendaciones de la Sociedad Espantildeola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica
Editores Emiacutelia Cercenado Mansilla
Rafael Cantoacuten Moreno
6b Diagnoacutestico microbioloacutegico
De la infeccioacuten por el ViH 2014
Coordinador Federico Garciacutea Garciacutea1
AutoresAntonio Aguilera Guirao2
Marta Aacutelvarez Esteacutevez1
Gabriel Reina Gonzaacutelez3
Carmen Rodriacuteguez Martin4
1Servicio de Microbiologiacutea Hospital Universitario San Cecilio Granada 2Servicio de Microbiologiacutea Complejo Hos-pitalario Universitario Santiago de Compostela 3Servicio de Microbiologiacutea Cliacutenica Universitaria de Navarra 4Centro Sanitario Sandoval Madrid
IacutenDice Del DocUmento cientIacutefico
1 Introduccioacuten 6
2 Diagnoacutestico seroloacutegico 6 21 Recogida de la muestra 6 22 Transporte y conservacioacuten de la muestra 6 23 Manejo de la muestra en su recepcioacuten en el laboratorio de Microbiologiacutea 7 24 Procesamiento de la muestra 7 25 Infeccioacuten aguda 8 26 Pruebas raacutepidas de diagnoacutestico 8 27 Deteccioacuten de antiacutegeno p24 del VIH 8 28 Ensayos confirmatorios 8 29 Necesidad de un nuevo algoritmo diagnoacutestico 9 210 Criterios para la interpretacioacuten de resultados 10 211 Informe de resultados 10 212 La serologiacutea en la transmisioacuten madre-hijo y en la profilaxis post-exposicioacuten 11
3 Determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH 11
31 Teacutecnicas disponibles 11 32 Indicaciones 11 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR) 11 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten 13 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda 13 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal 13 33 Tipos de muestras para la determinacioacuten de la carga viral 13 34 Comunicacioacuten de resultados y variabilidad 14 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico 15 342 Factores que aumentan la CVP 15 343 Interpretacioacuten de viremias bajas 15 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento 15
4 Pruebas para la deteccioacuten de resistencias y tropismo viral 15 41 Teacutecnicas genotiacutepicas e interpretacioacuten del genotipo 16 42 Teacutecnicas fenotiacutepicas e interpretacioacuten del fenotipo 17 43 Prediccioacuten del fenotipo a partir del genotipo fenotipo virtual 17 44 Teacutecnicas para la determinacioacuten del tropismo viral 18 441 Meacutetodos fenotiacutepicos 18 442 Meacutetodos genotiacutepicos 18 45 Limitaciones de los tests de resistencia 19 46 Indicaciones 20 47 Los ensayos de resistencia como herramienta para epidemiologiacutea molecular 20
5 Puntos clave 21
51 Diagnoacutestico seroloacutegico 21 52 Determinacioacuten de la carga viral 21 53 Determinacioacuten de resistencias 22
6 Bibliografiacutea 22
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DocUmentos tEacutecnicos
1 PNT-VIH-01 Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el VIH2 PNT-VIH-02 Deteccioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH3 PNT-VIH-03 Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
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- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
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- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
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- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
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- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
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- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
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- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
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- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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ISBN-13 978-84-617-1842-9
ISBN-10 84-617-1842-9
EDITORES
Emilia Cercenado Mansilla Servicio de Microbiologiacutea Hospital General Universitario Gregorio Marantildeoacuten
Madrid
Rafael Cantoacuten Moreno Servicio de Microbiologiacutea Hospital Universitario Ramoacuten y Cajal e Instituto Ramoacuten
y Cajal de Investigacioacuten Sanitaria (IRYCIS) Madrid
SUGERENCIA DE CITACIOacuteN
Aguilera Guirao A Aacutelvarez Esteacutevez M Garciacutea Garciacutea F Reina Gonzaacutelez G Rodriacuteguez Martin C Diag-
noacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIH 6a Garciacutea Garciacutea F (coordinador) Procedimientos en
Microbiologiacutea Clinica Cercenado Mansilla E Cantoacuten Moreno R (editores) Sociedad Espantildeola de Enfer-
medades Infecciosas y Microbiologia Cliacutenica (SEIMC) 2014
AVISO
Reservados todos los derechos Los documentos SEIMC o cualquiera de sus partes no podraacuten ser
reproducidos almacenados trasmitidos distribuidos comunicados puacuteblicamente o transformados me-
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por la ley Cualquier publicacioacuten secundaria debe referenciarse incluyendo ldquoEste documento ha sido
elaborado por la SEIMC (Sociedad Espantildeola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica) y su
contenido puede encontrase en la paacutegina web wwwseimcorgrdquo
Procedimientos en Microbiologiacutea Cliacutenica
Recomendaciones de la Sociedad Espantildeola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica
Editores Emiacutelia Cercenado Mansilla
Rafael Cantoacuten Moreno
6b Diagnoacutestico microbioloacutegico
De la infeccioacuten por el ViH 2014
Coordinador Federico Garciacutea Garciacutea1
AutoresAntonio Aguilera Guirao2
Marta Aacutelvarez Esteacutevez1
Gabriel Reina Gonzaacutelez3
Carmen Rodriacuteguez Martin4
1Servicio de Microbiologiacutea Hospital Universitario San Cecilio Granada 2Servicio de Microbiologiacutea Complejo Hos-pitalario Universitario Santiago de Compostela 3Servicio de Microbiologiacutea Cliacutenica Universitaria de Navarra 4Centro Sanitario Sandoval Madrid
IacutenDice Del DocUmento cientIacutefico
1 Introduccioacuten 6
2 Diagnoacutestico seroloacutegico 6 21 Recogida de la muestra 6 22 Transporte y conservacioacuten de la muestra 6 23 Manejo de la muestra en su recepcioacuten en el laboratorio de Microbiologiacutea 7 24 Procesamiento de la muestra 7 25 Infeccioacuten aguda 8 26 Pruebas raacutepidas de diagnoacutestico 8 27 Deteccioacuten de antiacutegeno p24 del VIH 8 28 Ensayos confirmatorios 8 29 Necesidad de un nuevo algoritmo diagnoacutestico 9 210 Criterios para la interpretacioacuten de resultados 10 211 Informe de resultados 10 212 La serologiacutea en la transmisioacuten madre-hijo y en la profilaxis post-exposicioacuten 11
3 Determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH 11
31 Teacutecnicas disponibles 11 32 Indicaciones 11 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR) 11 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten 13 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda 13 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal 13 33 Tipos de muestras para la determinacioacuten de la carga viral 13 34 Comunicacioacuten de resultados y variabilidad 14 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico 15 342 Factores que aumentan la CVP 15 343 Interpretacioacuten de viremias bajas 15 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento 15
4 Pruebas para la deteccioacuten de resistencias y tropismo viral 15 41 Teacutecnicas genotiacutepicas e interpretacioacuten del genotipo 16 42 Teacutecnicas fenotiacutepicas e interpretacioacuten del fenotipo 17 43 Prediccioacuten del fenotipo a partir del genotipo fenotipo virtual 17 44 Teacutecnicas para la determinacioacuten del tropismo viral 18 441 Meacutetodos fenotiacutepicos 18 442 Meacutetodos genotiacutepicos 18 45 Limitaciones de los tests de resistencia 19 46 Indicaciones 20 47 Los ensayos de resistencia como herramienta para epidemiologiacutea molecular 20
5 Puntos clave 21
51 Diagnoacutestico seroloacutegico 21 52 Determinacioacuten de la carga viral 21 53 Determinacioacuten de resistencias 22
6 Bibliografiacutea 22
4
DocUmentos tEacutecnicos
1 PNT-VIH-01 Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el VIH2 PNT-VIH-02 Deteccioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH3 PNT-VIH-03 Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
5
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
6
1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
7
23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
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- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
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- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
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- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
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- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
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- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
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- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
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- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
Procedimientos en Microbiologiacutea Cliacutenica
Recomendaciones de la Sociedad Espantildeola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologiacutea Cliacutenica
Editores Emiacutelia Cercenado Mansilla
Rafael Cantoacuten Moreno
6b Diagnoacutestico microbioloacutegico
De la infeccioacuten por el ViH 2014
Coordinador Federico Garciacutea Garciacutea1
AutoresAntonio Aguilera Guirao2
Marta Aacutelvarez Esteacutevez1
Gabriel Reina Gonzaacutelez3
Carmen Rodriacuteguez Martin4
1Servicio de Microbiologiacutea Hospital Universitario San Cecilio Granada 2Servicio de Microbiologiacutea Complejo Hos-pitalario Universitario Santiago de Compostela 3Servicio de Microbiologiacutea Cliacutenica Universitaria de Navarra 4Centro Sanitario Sandoval Madrid
IacutenDice Del DocUmento cientIacutefico
1 Introduccioacuten 6
2 Diagnoacutestico seroloacutegico 6 21 Recogida de la muestra 6 22 Transporte y conservacioacuten de la muestra 6 23 Manejo de la muestra en su recepcioacuten en el laboratorio de Microbiologiacutea 7 24 Procesamiento de la muestra 7 25 Infeccioacuten aguda 8 26 Pruebas raacutepidas de diagnoacutestico 8 27 Deteccioacuten de antiacutegeno p24 del VIH 8 28 Ensayos confirmatorios 8 29 Necesidad de un nuevo algoritmo diagnoacutestico 9 210 Criterios para la interpretacioacuten de resultados 10 211 Informe de resultados 10 212 La serologiacutea en la transmisioacuten madre-hijo y en la profilaxis post-exposicioacuten 11
3 Determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH 11
31 Teacutecnicas disponibles 11 32 Indicaciones 11 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR) 11 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten 13 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda 13 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal 13 33 Tipos de muestras para la determinacioacuten de la carga viral 13 34 Comunicacioacuten de resultados y variabilidad 14 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico 15 342 Factores que aumentan la CVP 15 343 Interpretacioacuten de viremias bajas 15 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento 15
4 Pruebas para la deteccioacuten de resistencias y tropismo viral 15 41 Teacutecnicas genotiacutepicas e interpretacioacuten del genotipo 16 42 Teacutecnicas fenotiacutepicas e interpretacioacuten del fenotipo 17 43 Prediccioacuten del fenotipo a partir del genotipo fenotipo virtual 17 44 Teacutecnicas para la determinacioacuten del tropismo viral 18 441 Meacutetodos fenotiacutepicos 18 442 Meacutetodos genotiacutepicos 18 45 Limitaciones de los tests de resistencia 19 46 Indicaciones 20 47 Los ensayos de resistencia como herramienta para epidemiologiacutea molecular 20
5 Puntos clave 21
51 Diagnoacutestico seroloacutegico 21 52 Determinacioacuten de la carga viral 21 53 Determinacioacuten de resistencias 22
6 Bibliografiacutea 22
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DocUmentos tEacutecnicos
1 PNT-VIH-01 Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el VIH2 PNT-VIH-02 Deteccioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH3 PNT-VIH-03 Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
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- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
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- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
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- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
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- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
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- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
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- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
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- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
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- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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IacutenDice Del DocUmento cientIacutefico
1 Introduccioacuten 6
2 Diagnoacutestico seroloacutegico 6 21 Recogida de la muestra 6 22 Transporte y conservacioacuten de la muestra 6 23 Manejo de la muestra en su recepcioacuten en el laboratorio de Microbiologiacutea 7 24 Procesamiento de la muestra 7 25 Infeccioacuten aguda 8 26 Pruebas raacutepidas de diagnoacutestico 8 27 Deteccioacuten de antiacutegeno p24 del VIH 8 28 Ensayos confirmatorios 8 29 Necesidad de un nuevo algoritmo diagnoacutestico 9 210 Criterios para la interpretacioacuten de resultados 10 211 Informe de resultados 10 212 La serologiacutea en la transmisioacuten madre-hijo y en la profilaxis post-exposicioacuten 11
3 Determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH 11
31 Teacutecnicas disponibles 11 32 Indicaciones 11 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR) 11 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten 13 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda 13 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal 13 33 Tipos de muestras para la determinacioacuten de la carga viral 13 34 Comunicacioacuten de resultados y variabilidad 14 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico 15 342 Factores que aumentan la CVP 15 343 Interpretacioacuten de viremias bajas 15 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento 15
4 Pruebas para la deteccioacuten de resistencias y tropismo viral 15 41 Teacutecnicas genotiacutepicas e interpretacioacuten del genotipo 16 42 Teacutecnicas fenotiacutepicas e interpretacioacuten del fenotipo 17 43 Prediccioacuten del fenotipo a partir del genotipo fenotipo virtual 17 44 Teacutecnicas para la determinacioacuten del tropismo viral 18 441 Meacutetodos fenotiacutepicos 18 442 Meacutetodos genotiacutepicos 18 45 Limitaciones de los tests de resistencia 19 46 Indicaciones 20 47 Los ensayos de resistencia como herramienta para epidemiologiacutea molecular 20
5 Puntos clave 21
51 Diagnoacutestico seroloacutegico 21 52 Determinacioacuten de la carga viral 21 53 Determinacioacuten de resistencias 22
6 Bibliografiacutea 22
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DocUmentos tEacutecnicos
1 PNT-VIH-01 Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el VIH2 PNT-VIH-02 Deteccioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH3 PNT-VIH-03 Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
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- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
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- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
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- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
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- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
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- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
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- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
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- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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DocUmentos tEacutecnicos
1 PNT-VIH-01 Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el VIH2 PNT-VIH-02 Deteccioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH3 PNT-VIH-03 Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
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23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
6
1 introDUccion
En esta deacutecada se han cumplido 30 antildeos desde la descripcioacuten de la infeccioacuten por el virus de la inmuno-deficiencia humana (VIH) y el siacutendrome de la inmuno-deficiencia adquirida (SIDA) Durante este tiempo los laboratorios de Microbiologiacutea han tenido que hacer un gran esfuerzo para adaptarse a la demanda cliacutenica que requieren estos enfermos En los antildeos 80 y 90 tuvieron que desarrollar e implantar nuevas teacutecnicas para el diagnoacutestico microbioloacutegico de las infecciones oportunistas en la segunda mitad de los 90 se gene-ralizoacute el uso de las determinaciones de la carga viacuterica plasmaacutetica (CVP) lo que supuso el amanecer de la Microbiologiacutea Molecular y en la primera deacutecada de este siglo se implementaron las teacutecnicas de secuen-ciacioacuten para la deteccioacuten y anaacutelisis de las mutaciones que confieren resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales
El presente procedimiento constituye la tercera edicioacuten del ldquoDiagnoacutestico microbioloacutegico de la infeccioacuten por el VIHrdquo y en eacutel se han intentado reflejar y actualizar las principales tareas y cometidos que un laboratorio de Microbiologiacutea deberiacutea tener para realizar la atencioacuten integra al paciente infectado por el VIH Se han res-petado algunos contenidos de los procedimientos anteriores asiacute como el objetivo de la segunda edicioacuten (2006) orientar de forma conceptual y praacutectica la me-todologiacutea empleada en el diagnoacutestico y seguimiento de la infeccioacuten por el VIH Asimismo se mantiene su estructura en los 3 apartados anteriores diagnoacutestico seroloacutegico que ha sufrido una importante renovacioacuten intentando adecuarnos a las demandas diagnoacutesticas y epidemioloacutegicas actuales y contribuyendo a disminuir las oportunidades perdidas en cuanto al diagnoacutestico En una segunda parte se describe la determinacioacuten de la CVP y se hace una exhaustiva revisioacuten de los avan-ces tecnoloacutegicos y de las recomendaciones actuales ademaacutes de abordar un tema de enorme intereacutes cliacutenico la significacioacuten cliacutenica de la viremia persistente de bajo grado Finalmente en el tercer apartado se desarrolla el tema de las resistencias a los faacutermacos antirretrovi-rales incorporando como novedades las teacutecnicas de determinacioacuten del tropismo viral y el papel de las va-riantes minoritarias Asimismo se ha incorporado un cuadro resumen con los ldquopuntos claverdquo en cada uno de los capiacutetulos
Los autores de este procedimiento agradecen a todas las personas que han contribuido de una forma u otra
a que esta nueva versioacuten vea la luz especialmente al coordinador y autores de la edicioacuten de 2006 los Dres Loacutepez Bernaacuteldez de Quiroacutes Ortiz de Lejarazu Delga-do Vaacutezquez y Eiros Bouza
2 Diagnoacutestico seroloacutegico
El diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH se realiza me-diante la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos en el suero o plasma del paciente La eleccioacuten de la teacutec-nica apropiada y del algoritmo diagnoacutestico depende-raacuten del objetivo a alcanzar Las pruebas diagnoacutesticas son las que se utilizan de forma individualizada previo consentimiento informado oral o escrito con el fin de identificar una infeccioacuten por el VIH
21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
Se puede realizar en el mismo laboratorio o en distin-tos puntos de extraccioacuten de sangre y enviarse pos-teriormente al laboratorio El personal de estos pun-tos de extraccioacuten tiene que estar entrenado para la correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiquetado con sus volan-tes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso
Los laboratorios que reciben y almacenan los sueros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores Todos estos procesos son fundamentales para la posterior deter-minacioacuten de anticuerpos frente al VIH
22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
Despueacutes de su recogida las muestras de suero no se deben mantener maacutes de 24 horas a temperatura am-biente ni maacutes de 7 diacuteas entre 2ordmC y 8ordmC Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesaria la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se reco-mienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten Los sueros no deben inactivarse por calor
Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden en-viar refrigeradas con hielo entre 2ordmC y 8ordmC o con nie-ve carboacutenica para una temperatura igual o inferior a -20ordmC
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23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 3 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
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2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
7
23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico sero-loacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de ori-gen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos lle-vados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguien-do las normas de productos bioloacutegicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
El diagnoacutestico de infeccioacuten por el VIH se hace general-mente mediante un procedimiento de serologiacutea es de-cir la deteccioacuten de anticuerpos VIH-12 o la deteccioacuten simultaacutenea de anticuerpos VIH-12 y del antiacutegeno p24 del VIH-1 Los ensayos seroloacutegicos para esta determi-nacioacuten pueden ser de cribado (screening) o de confir-macioacuten Los ensayos de cribado identifican las mues-tras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contie-nen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
Como prueba de screening el inmunoensayo es el maacutes coste-efectivo para llevar a cabo en un entorno de laboratorio con un volumen importante de mues-tras Debido a la diversificacioacuten de la terminologiacutea en cuanto a la denominacioacuten de los inmunoensayos (EIA CLIA CMIA QIA etc) en este procedimiento se englo-ban todas con dicho teacutermino Estas teacutecnicas requieren equipos automaacuteticos y un teacutecnico experimentado y con competencias para realizarlas
Los inmunoensayos han ido evolucionando y se cla-sifican en funcioacuten de la base antigeacutenica utilizada Los de primera generacioacuten que incorporaban lisado viral como antiacutegeno eran relativamente sensibles pero careciacutean de especificidad y se detectaban los anti-cuerpos a los 40 diacuteas de la infeccioacuten Posteriormente se desarrollaron ensayos de segunda generacioacuten que utilizaban como antiacutegenos proteiacutenas recombinantes y peacuteptidos sinteacuteticos que detectaban anticuerpos fren-te a los subtipos del grupo M los grupos N y O y
tambieacuten frente al VIH-2 Con la utilizacioacuten de estos se acortoacute el tiempo de deteccioacuten de anticuerpos a 33-35 diacuteas de la infeccioacuten Los inmunoensayos de terce-ra generacioacuten o tipo saacutendwich detectan anticuerpos de clase IgG e IgM acortando el tiempo de deteccioacuten de 20 a 25 diacuteas Por uacuteltimo se han introducido las teacutecnicas de cuarta generacioacuten que detectan simultaacute-neamente anticuerpos y antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten a 13-15 diacuteas despueacutes de la infeccioacuten Con estas teacutecnicas de cuarta generacioacuten la sensibilidad aumenta y se reduce la posibilidad de un falso negativo aunque hay que tener en cuenta que esta circunstancia se puede dar sobre todo en la pri-mera fase de la infeccioacuten hasta que se produce la se-roconversioacuten (periodo ventana) y en menor medida en estadiacuteos finales de la infeccioacuten en pacientes con tratamiento inmunosupresor trasplantados de meacutedula oacutesea y en personas con alteraciones de linfocitos B
Actualmente se estaacute evaluando un nuevo inmunoen-sayo de cuarta generacioacuten que permite la deteccioacuten e identificacioacuten de forma individual de los anticuerpos del VIH-1 anticuerpos del VIH-2 y del antiacutegeno p24 del VIH-1
figura 1 Diacuteas transcurridos desde la fecha de infeccioacuten hasta que se positivizan las teacutecnicas de diagnoacutestico de infeccioacuten por el ViH-1
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
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8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
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10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
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22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
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25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-2
Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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La figura 1 muestra el tiempo hasta la positividad de los distintos marcadores y teacutecnicas para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por VIH
25 INFECCIOacuteN AGUDA
Es la primera etapa de la infeccioacuten por el VIH inmedia-tamente despueacutes de eacutesta y antes del desarrollo de los anticuerpos El 50 de las personas pueden desarro-llar manifestaciones cliacutenicas sugestivas de un siacutendro-me retroviral agudo En esta fase existen niveles ele-vados del virus y los pacientes presentan altas tasas de transmisioacuten debido a la alta carga viral por lo que el cribado en esta fase es especialmente importante para la prevencioacuten del VIH Se calcula que casi la mitad de las nuevas infecciones se producen desde una perso-na con infeccioacuten temprana Las pruebas convencio-nales para el diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH a veces no detectan la infeccioacuten aguda Al comienzo de la infeccioacuten hay un aumento de la carga viral en plasma que coincide con un pico en el nivel de antiacutegeno p24 Maacutes tarde la disminucioacuten de la carga viral y los niveles de antiacutegeno p24 coinciden con el incremento de los niveles de anticuerpos La infeccioacuten aguda se puede diagnosticar mediante la deteccioacuten del ARN-VIH en una muestra con un inmunoensayo negativo o cuan-do se detecta un inmunoensayo positivo con un test confirmatorio negativo o indeterminado y una prueba viroloacutegica (ARN-VIH o antiacutegeno p24) positiva
26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
Son teacutecnicas de raacutepida ejecucioacuten no necesitan apara-taje su lectura es visual y subjetiva y generan un resul-tado en menos de 30 minutos Cuando el resultado es reactivo se considera preliminar y se debe enviar una muestra del paciente al laboratorio de Microbiolo-giacutea para confirmar con teacutecnicas suplementarias En un principio las pruebas raacutepidas se usaban en situaciones de urgencia hoy diacutea tambieacuten se utilizan pruebas raacutepi-das con licencia CLIA en entornos no cliacutenicos comuni-tarios en farmacias y en laboratorios que procesan un nuacutemero bajo de muestras diarias Debido a su simpli-cidad coste y raacutepida respuesta la OMS recomienda el uso de pruebas raacutepidas en entornos de recursos limi-tados maacutes que para el diagnoacutestico en un laboratorio convencional Las pruebas raacutepidas se pueden realizar en fluido oral o en sangre capilar recogida por un pro-cedimiento sencillo mediante puncioacuten digital y no re-quieren muestra de puncioacuten venosa aunque tambieacuten se pueden realizar en muestras de suero o plasma Emplean antiacutegenos similares a los inmunoensayos Detectan la presencia de anticuerpos VIH-1 VIH-2 yo
el antiacutegeno p24 del VIH-1 La sensibilidad y la especi-ficidad son buenas Pueden ser de inmunoadherencia inmunocromatograacutefica (flujo lateral) y de inmunoadhe-rencia por inmunofiltracioacuten o inmunoconcentracioacuten aunque ambas se realizan en menos de 30 minutos estas uacuteltimas necesitan maacutes manipulacioacuten El incon-veniente de las pruebas raacutepidas es su lectura subjeti-va que puede generar dudas de interpretacioacuten en los resultados Estas pruebas tienen una alta sensibilidad y especificidad pero inferior a la de los inmunoensa-yos utilizados actualmente en el diagnoacutestico conven-cional Sin embargo las pruebas raacutepidas no pueden identificar las infecciones agudas donde auacuten no se han desarrollado anticuerpos especiacuteficos del VIH (fal-sos negativos) Aunque se dispone de alguna prueba raacutepida combinada (Combo) de cuarta generacioacuten que detecta anticuerpos y antiacutegeno p24 no parece ser tan sensible como la prueba combinada estaacutendar utilizada en los laboratorios La prueba raacutepida combinada tiene buen rendimiento para la deteccioacuten de la infeccioacuten por el VIH ya establecida y menor rendimiento para detec-tar la infeccioacuten aguda
27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
El antiacutegeno p24 es una proteiacutena del nuacutecleo viral que aparece en sangre despueacutes de la infeccioacuten por el VIH coincidiendo con el aumento del nivel del ARN viral Los ensayos disponibles han incrementado el rendi-miento diagnoacutestico con una sensibilidad del 89 a casi 100 en comparacioacuten con la deteccioacuten del ARN El ensayo de deteccioacuten del antiacutegeno p24 detecta un nivel de antiacutegeno que corresponde aproximadamente a un nivel de ARN del VIH de 30000 a 50000 copiasmL y se convierte en positivo aproximadamente de cinco a siete diacuteas despueacutes de la deteccioacuten del ARN viral El ensayo del antiacutegeno p24 tambieacuten estaacute dispo-nible en pruebas combinadas de anticuerpoantiacutegeno pero cuando el resultado es positivo no distingue si la deteccioacuten es de antiacutegeno o de anticuerpo Esta prue-ba apenas se utiliza hoy en diacutea su uso queda praacutecti-camente restringido a los ensayos tipo Combo y en algunos laboratorios se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten vertical
28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
Hasta ahora los maacutes usados son el Western Blot (WB) y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pue-den llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para po-der diagnosticarlo Existen tambieacuten ensayos especiacutefi-cos para VIH-2 Uno de sus principales inconvenientes
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
28 Stekler JD Swenson PD Coombs RW Dragavon J Tho-mas KK Brennan CA Devare SG Wood RW Golden MR HIV testing in a high-incidence population is antibody tes-ting alone good enough Clin Infect Dis 2009 49444-453
29 Van den Berk GE Frissen PH Regez RM Rietra PJ Evalua-tion of the rapid immunoassay determine HIV 12 for detec-tion of antibodies to human immunodeficiency virus types 1 and 2 J Clin Microbiol 2003 413868-3869
30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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es la lectura de las bandas para hacer la interpreta-cioacuten que la mayoriacutea de las veces es subjetiva por lo que es necesario establecer una norma de lectura en cada laboratorio La interpretacioacuten de los resultados es complicada la ausencia de bandas se interpreta como un resultado negativo y para valorar los resultados positivos se pueden aplicar varios criterios estableci-dos por distintas organizaciones La OMS considera un resultado positivo cuando hay al menos dos ban-das de glicoproteiacutenas el Center for Diseases Control (CDC) dos bandas de p24 gp41 y gp160gp120 la Cruz Roja Americana (ARC) tres bandas una de cada gen estructural y el Consorcio de Estandarizacioacuten de la Serologiacutea de Retrovirus (CRSS) establece que tiene que existir una banda de glicoproteiacutena maacutes otra que no sea de envoltura Tambieacuten se pueden seguir los cri-terios de interpretacioacuten suministrados por el fabricante del ensayo confirmatorio Se considera un WB indeter-minado cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad y es en este punto donde surgen maacutes problemas de interpretacioacuten Un resultado indeterminado puede ser debido a distintas causas infeccioacuten aguda o estadiacuteo muy avanzado de la enfer-medad recieacuten nacidos de madre seropositiva sueros inactivados por el calor pacientes con factor reuma-toide reacciones cruzadas con otros retrovirus y otras causas Un resultado de WB indeterminado hay que analizarlo meticulosamente y valorar las bandas reac-tivas ya que tienen distinto valor predictivo En estos casos es conveniente realizar la determinacioacuten de una carga viral para evaluar una posible infeccioacuten aguda y al mismo tiempo solicitar una nueva muestra Al anali-zar eacutesta puede ocurrir que la situacioacuten de las bandas no haya cambiado en cuyo caso se puede tratar de una reaccioacuten inespeciacutefica o que las bandas hayan au-mentado en nuacutemero e intensidad y posiblemente sea una seroconversioacuten En todas estas situaciones hay que solicitar una nueva muestra al mes La compara-cioacuten directa de algunas de las teacutecnicas maacutes recientes con la prueba de WB ha demostrado que se obtienen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB resulte positivo o indeterminado
El algoritmo actual con inmunoensayo maacutes WB o LIA es lento costoso y requiere un equipo sofisticado que hace que sea difiacutecil llevar a cabo en entornos con po-cos recursos Por todo ello surge la necesidad de una prueba de confirmacioacuten maacutes sencilla maacutes barata y maacutes raacutepida Actualmente se dispone de un sistema de confirmacioacuten y diferenciacioacuten individualizada del VIH-1 y el VIH-2 Se trata de una prueba inmunocromatograacute-fica que contiene peacuteptidos recombinantes o sinteacuteticos especiacuteficos para el VIH-1 (gp160 gp41 p31 p24) y
para el VIH-2 (gp140 gp36) su lectura e interpretacioacuten estaacuten automatizadas lo que implica una lectura obje-tiva cada banda es interpretada de forma automaacutetica y cualitativa La emisioacuten del resultado final estaacute tam-bieacuten automatizado y se obtiene en menos de treinta minutos Posee un buen nivel de discriminacioacuten entre el VIH-1 y el VIH-2 mayor que el LIA
29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
Muacuteltiples estudios y diferentes organismos internacio-nales motivados por la necesidad de agilizar el diag-noacutestico de la infeccioacuten por el VIH abogan por la buacutes-queda de nuevos algoritmos con el propoacutesito de a) reducir la transmisioacuten del VIH que se ha demostrado que se produce fundamentalmente en las primeras se-manas de la infeccioacuten y b) intentar que no se pierdan oportunidades de diagnoacutestico disminuyendo el tiem-po de espera para los resultados positivos de la prue-ba del VIH consiguiendo asiacute la raacutepida notificacioacuten a los meacutedicos y a los pacientes Ademaacutes esta necesidad surge ante las limitaciones para confirmar la infeccioacuten del VIH-1 en muestras de pacientes con resultado del inmunoensayo de tercera o cuarta generacioacuten positivo y WB negativo o indeterminado Las pruebas suple-mentarias de anticuerpos del VIH no tienen por queacute limitarse al WB LIA o IFA Las guiacuteas aprobadas en el documento CLSI-M53-A (2011) incluyen un algoritmo que indica que las muestras reactivas en el screening con inmunoensayos de cuarta generacioacuten deben ser analizadas con un ensayo suplementario que sea ca-paz de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 Este nuevo algoritmo se ha puesto en marcha en EEUU con muy buenos resultados Asimismo se han aceptado otras pruebas como suplementarias incluyendo algunas que alternativamente podriacutean ser utilizadas como prueba de cribado siempre que las primeras pruebas y las suplementarias se utilicen con-juntamente como partes de un algoritmo aprobado
La propuesta de un nuevo algoritmo para los labora-torios asistenciales (figura 2) incluye en primer lugar realizar un inmunoensayo tipo Combo de cuarta gene-racioacuten que acorta significativamente el periodo venta-na Si resulta no reactivo se interpreta como negativo Si el inmunoensayo Combo de cuarta generacioacuten es reactivo se repite por duplicado inmediatamente y las muestras repetidamente positivas se analizan median-te un ensayo de diferenciacioacuten del VIH-1 y VIH-2 ase-gurando tiempos de respuesta lo maacutes cortos posibles Si este es concluyente se informa como positivo para el VIH-1 yo positivo para el VIH-2 y se recomienda
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
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8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
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10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
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22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
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25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-2
Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
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PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
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- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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solicitar el enviacuteo de una segunda muestra soacutelo para verificar que no han existido errores en la fase preanaliacute-tica pero no hay que esperar al resultado de eacutesta para emitir el diagnoacutestico Si el inmunoensayo Combo y el de diferenciacioacuten son discordantes se realiza una de-terminacioacuten del ARN VIH-1 y si eacuteste resulta positivo siempre que se obtengan valores altos (ver apartado de carga viral de este documento) se puede informar como una infeccioacuten aguda por el VIH-1 si el ARN VIH-1 es negativo estaremos ante la ausencia de infeccioacuten por el VIH-1 (falso positivo) o una posible infeccioacuten aguda por el VIH-2 situacioacuten muy poco probable dada la baja prevalencia de infeccioacuten por VIH-2 en Espantildea El algoritmo tambieacuten se puede comenzar con un in-munoensayo de tercera generacioacuten pero se perderaacute alguna infeccioacuten aguda al no tener la capacidad de detectar el antiacutegeno p24 del VIH-1
210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
Los inmunoensayos actuales tienen una sensibilidad mayor del 99 Sin embargo no hay que olvidar la importancia de los valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) que estaacuten condicionados por la pre-
valencia de la infeccioacuten por el VIH entre la poblacioacuten estudiada A menor prevalencia el VPP disminuye y mayor es la probabilidad de que se produzcan falsos positivosLas causas de los resultados falsos positivos son muy variadas errores en la identificacioacuten de la muestra he-moacutelisis contaminacioacuten microbiana del suero inactiva-cioacuten de la muestra por calor Tambieacuten se han notifica-do en pacientes con enfermedades autoinmunes en multiacuteparas en pacientes multitransfundidos o en he-modiaacutelisis en personas con infeccioacuten por otros virus como el VPH y el VHB en individuos recieacuten vacunados frente al VHB y la gripe y en pacientes con anticuer-pos frente a distintos antiacutegenos HLA
211 INFORME DE RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de cribado deben ex-presarse de forma clara y precisa para evitar situacio-nes diagnoacutesticas confusas y de ansiedad innecesaria en el paciente Se informaraacute con claridad si el suero es positivo para VIH-1 yo para el VIH-2 En el caso que no se llegue a un diagnoacutestico definitivo se daraacuten las pautas especiacuteficas a llevar a cabo para poder llegar a un diagnoacutestico concluyente
figura 2 algoritmo diagnoacutestico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 3 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
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2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
11
212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
El papel de la serologiacutea en el diagnoacutestico del VIH en el recieacuten nacido es limitado En este caso el diagnoacutes-tico requiere de teacutecnicas de biologiacutea molecular (ADN proviral o carga viral) ya que la determinacioacuten de anti-cuerpos carece de valor al detectarse los anticuerpos maternos En caso de serologiacutea positiva en el recieacuten nacido se requiere un seguimiento seroloacutegico de has-ta 6 meses para verificar la desaparicioacuten de anticuer-pos
Para la profilaxis post-exposicioacuten la serologiacutea se utiliza para el diagnoacutestico de la infeccioacuten VIH en el caso fuen-te de la exposicioacuten siguiendo las recomendaciones que se describen en los apartados anteriores Ade-maacutes se emplea para el seguimiento del personal que se ha visto expuesto
3 Determinacioacuten De carga Viral plasmAacutetica (cVp) Del ViH
La carga viral del VIH o viremia plasmaacutetica representa la cantidad de virus presente en plasma y se expresa como nuacutemero de copias de ARN por mililitro o en log10 Su determinacioacuten junto con el recuento de linfocitos CD4 son los paraacutemetros que se utilizan en la moni-torizacioacuten del tratamiento antirretroviral y para tomar decisiones respecto a cambio del mismo
31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
En la actualidad existen diversas teacutecnicas para la cuantificacioacuten de la carga viral que tan solo difieren en sus formatos tiempos y capacidad de procesamiento (Tabla 1) Dichas plataformas emplean la PCR a tiempo real que consigue altos niveles de sensibilidad ana-liacutetica reproducibilidad y linealidad Todas ellas incor-poran meacutetodos automatizados de extraccioacuten de ARN reduciendo el tiempo de procesamiento la variabilidad y el riesgo de contaminacioacuten permitiendo ademaacutes procesar un elevado nuacutemero de muestras Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold-Ct-) el nuacutemero de ci-clos de PCR que hayan transcurrido se usa para la
cuantificacioacuten Una de las ventajas de esta tecnolo-giacutea es que permite detectar y cuantificar la diana sin tener que manipular los tubos de reaccioacuten El liacutemite inferior de deteccioacuten variacutea entre las 20-100 copiasml dependiendo de la teacutecnica empleando un volumen de partida que variacutea entre 05-12 ml de plasma Detectan la CVP en todos los subtipos B y no-B del VIH-1 gru-po M algunas incluso el VIH-1 grupo O sin embargo no detectan la CVP de VIH-2 Se ha descrito variabili-dad entre dichas teacutecnicas sobre todo en la cuantifica-cioacuten de los subtipos no-B por lo que se recomienda la monitorizacioacuten de la CVP de un paciente siempre con el mismo sistema Si se hace inevitable el cambio de equipo hay que asegurarse de obtener una cuan-tificacioacuten basal del ARN VIH-1 nueva obtenida con la teacutecnica que se va a utilizar en el futuro Ademaacutes de estas plataformas se han desarrollado ensayos que permiten detectar una sola copia de ARN del VIH-1 no comerciales y utilizados en investigacioacuten
32 INDICACIONES
321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirre-troviral (TAR)La CVP es el principal factor para la monitorizacioacuten del TAR Eacutesta desciende de forma acusada tras la instau-racioacuten del TAR cuyo objetivo seguacuten la guiacutea de GESI-DA es reducir la carga viral raacutepidamente por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica (20-75 copiasmL) en 16-24 semanas y mantenerla suprimida el ma-yor tiempo posible ya que con este nivel de carga viral se ha demostrado que no se seleccionan mutaciones de resistencia Cuando la carga viral basal sea muy elevada el objetivo del tratamiento seriacutea un descenso superior a 1 log10 tras cuatro semanas Se recomienda medir la CVP al comienzo del TAR y a las 4 semanas y realizar el seguimiento cada 3-4 meses pudiendo espaciarse hasta los 12 meses su determinacioacuten en pacientes con cargas repetidamente suprimidas y es-tables cliacutenica e inmunoloacutegicamente (recuento de lin-focitos CD4 gt 350 ceacutelulasμL) Se considera que hay un fracaso viroloacutegico siguiendo las indicaciones de la guiacutea de GESIDA cuando la carga viral es detectable pasadas 24 semanas desde el comienzo del trata-miento antirretroviral o si tras alcanzar la indetectabi-lidad eacutesta vuelve a ser gt50 copiasmL en dos deter-minaciones consecutivas separadas 2-4 semanas En esta situacioacuten lo primero que es necesario comprobar es que haya un correcto cumplimiento terapeacuteutico la tolerabilidad del tratamiento y las interacciones entre faacutermacos y entonces decidir si realizar un estudio de resistencias Tambieacuten se determinaraacute la CVP en aque-llos pacientes con buen control viroloacutegico en los que
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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infeccioacuten por el VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
12
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isp
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ble
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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infeccioacuten por el VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 5 de 5
Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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se plantea una modificacioacuten del tratamiento por toxi-cidad farmacoloacutegica o una simplificacioacuten del reacutegimen Despueacutes de un cambio de TAR en este contexto se debe evaluar en un plazo de 3-6 semanas el mante-nimiento de la supresioacuten viroloacutegica y una vez demos-trada se puede continuar con las revisiones perioacutedicas cada 4-6 meses
322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacutenLa CVP se correlaciona con el riesgo de transmisioacuten del VIH de tal manera que cuanto mayor es la CVP mayor es el riesgo de transmisioacuten Aunque no puede excluirse completamente la transmisioacuten es poco pro-bable por debajo de 1000 copiasmL Esta cifra junto a las caracteriacutesticas de la exposicioacuten condicionan las di-ferentes pautas de profilaxis post-exposicioacuten En este sentido hay estudios en los que se ha demostrado que el descenso de la viremia en la poblacioacuten general (carga viral comunitaria) se ha correlacionado con un menor evento de transmisioacuten
323 Diagnoacutestico de infeccioacuten agudaEs necesario destacar que la elevada sensibilidad de los ensayos de cuantificacioacuten de la carga viral puede originar un uso inapropiado de los mismos como ocu-rre cuando se utilizan para el diagnoacutestico de la infec-cioacuten por el VIH durante las primeras semanas de la infeccioacuten cuando los anticuerpos especiacuteficos anti-VIH no son detectables En estas situaciones o cuando los inmunoensayos son positivos pero el confirmato-rio es negativo o indeterminado se puede emplear la CVP para realizar el diagnoacutestico siempre y cuando se obtenga un nivel de carga viral elevado Las pruebas de carga viral no se han desarrollado con una espe-cificidad suficiente y pueden causar falsos positivos por tanto cuando en estas situaciones se obtenga una carga viral baja es preferible utilizar otras pruebas geneacuteticas de tipo cualitativo con sensibilidad y espe-cificidad ampliamente demostrada como la deteccioacuten del ADN proviral No obstante las actuales teacutecnicas seroloacutegicas de cuarta generacioacuten al determinar antiacutege-nos ademaacutes del anticuerpo reducen significativamente el periacuteodo ventana
324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetalExisten situaciones especiales en las que la determi-nacioacuten de la CVP se puede emplear como diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH como es el caso del diag-noacutestico en recieacuten nacidos de madres infectadas ya que en estos casos los anticuerpos maternos se trans-fieren al nintildeo y el diagnoacutestico seroloacutegico podriacutea dar un falso positivo Se consideraraacuten vaacutelidos soacutelo aquellos
resultados en los que el nivel de viremia sea elevado (gt 5000 copiasmL) si no es preferible descartar la infec-cioacuten mediante el uso del ADN proviral Se necesita un seguimiento del recieacuten nacido de hasta 6 meses para descartar la infeccioacuten siempre y cuando no se haya administrado lactancia materna
33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
La muestra recomendada para realizar la determina-cioacuten de la CVP es la sangre anticoagulada con EDTA o citrato (ACD) en cantidad de 5-10 mL El plasma ob-tenido con heparina no es adecuado para detectar la viremia plasmaacutetica ya que es ampliamente conocido su efecto inhibidor sobre la PCR
Los tubos con EDTA son los maacutes ampliamente utiliza-dos En ellos el plasma se debe separar por centrifu-gacioacuten a 1000-1500xg (2000-2500 rpm en las cen-triacutefugas habituales) durante 10 minutos a temperatura ambiente Existe un tubo especial para teacutecnicas de biologiacutea molecular (Vacutainer PPT) con un gel que una vez centrifugado separa el plasma de la porcioacuten celular Este tubo PPT es praacutectico para transportar el plasma separado en el tubo primario sin embar-go parecen aumentar artefactualmente el nuacutemero de muestras con viremia de bajo nivel debido a la detec-cioacuten de ARN viral asociado a ceacutelulas Este hecho se podriacutea solucionar con una centrifugacioacuten adicional de la muestra previa a su procesamiento en el laboratorio de destino
En la tabla 2 se muestra la estabilidad maacutexima estudia-da del VIH-1 seguacuten el modo de almacenamiento para la determinacioacuten de la CVP es decir sin que disminu-ya su concentracioacuten en la muestra aunque cada casa comercial emite sus propias recomendaciones seguacuten sus estudios de validacioacuten para realizar serologiacutea o la PCR
En paiacuteses con pocos recursos se ha propuesto la uti-lizacioacuten de gotas de sangre seca (dried blood spots ndashDBS-) para determinar la carga viral del VIH de un paciente ya que este meacutetodo facilita la recogida trans-porte y conservacioacuten de las muestras La teacutecnica con-siste en realizar un pinchazo en el dedo o el taloacuten y depositar la sangre directamente sobre un papel de filtro que se deja secar a temperatura ambiente Una vez seco el DBS se puede almacenar con desecan-te y enviarse a los laboratorios centrales para realizar cuantificacioacuten o caracterizacioacuten del VIH En este so-porte el ARN viral permanece estable a temperatura
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ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 3 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
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2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
14
ambiente durante un largo periacuteodo de tiempo supone una metodologiacutea muy faacutecil y econoacutemica ademaacutes de facilitar el transporte como mercanciacutea no peligrosa al estar el virus inactivado Previo a la extraccioacuten de los aacutecidos nucleicos a partir de la muestra eacutesta debe ser reconstituida en medio liacutequido mediante el tratamiento teacutermico del DBS fragmentado con buffer de lisis de tejidos y proteinasa K
La carga viral realizada sobre DBS muestra una buena correlacioacuten con la CVP siendo el liacutemite de sensibilidad de la teacutecnica de 1000-5000 copiasmL aproximada-mente por lo que constituye una opcioacuten vaacutelida para la monitorizacioacuten del TAR en aacutereas geograacuteficas en viacuteas de desarrollo donde la deteccioacuten temprana del fraca-so viroloacutegico suele ser difiacutecil debido a las dificultades para realizar la CVP ndashequipamiento de alto coste falta de personal cualificado transporte y almacenamiento adecuado de muestras desde zonas remotas etc La carga viral en DBS sin embargo puede tambieacuten ge-nerar falsos positivos debido a la deteccioacuten de ADN proviral o ARN viral asociado a ceacutelulas La especifici-dad de la teacutecnica aumenta cuando las cuantificaciones son superiores a 3000 copiasmL cifra muy cercana al cut off propuesto por la OMS de 1000 copiasmL para determinar el fracaso viroloacutegico Esta deteccioacuten de ADN proviral y ARN asociado a ceacutelulas permite apli-car tambieacuten esta metodologiacutea en DBS para la detec-cioacuten precoz de la transmisioacuten madre-hijo de VIH en las aacutereas maacutes desfavorecidas con una sensibilidad y especificidad cercana al 100
Por otro lado se estaacuten desarrollando otras estrategias para poder determinar la CVP en pacientes de zonas
alejadas o rurales como la realizacioacuten de sencillos tests point-of-care (pruebas a pie de paciente) en microchip tras concentracioacuten de las muestras o la estabilizacioacuten y extraccioacuten del ARN en el centro asistencial antes de su enviacuteo al laboratorio central
Ademaacutes se ha aplicado la determinacioacuten de carga viral sobre muestras como LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos Normalmente se requiere la extrac-cioacuten previa de los aacutecidos nucleicos ya que la viscosidad de algunas de estas muestras impide su procesamien-to automaacutetico por algunos sistemas Mayoritariamente se trata de procedimientos aplicados en estudios de investigacioacuten para comparar riesgo de transmisioacuten o supresioacuten viroloacutegica fuera del plasma por lo que la in-terpretacioacuten de los resultados adquiere significado uacuteni-camente dentro del contexto en que se realiza
34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
Para expresar los resultados cuantitativos de la CVP se emplean habitualmente escalas logariacutetmicas Eacutestas permiten manejar maacutes faacutecilmente las cuantificaciones en valor absoluto que presentan los virus en replica-cioacuten que comprenden varios oacuterdenes de magnitud
La mayoriacutea de las teacutecnicas expresan los datos en valor absoluto y en escala logariacutetmica La variabilidad inhe-rente a las teacutecnicas moleculares para la determinacioacuten de la CVP es menor de 03 log10 por tanto cualquier resultado con una diferencia mayor de 02-03 log10
(equivalente al doble o la mitad en valor absoluto) se considera significativo desde un punto de vista teacutec-
tabla 2 estabilidad del ViH-1 para determinacioacuten de la carga viral plasmaacutetica
sangre completa 6 horas
plasma separado Temperatura ambiente lt24h
plasma separado 4ordmC lt7 diacuteas
plasma separado -20ordmC 1-3 meses
plasma separado -80ordmC gt3 meses
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
15
nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
22
53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
2 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Im-proving clinical laboratory efficiency introduction of systems for the diagnosis and monitoring of HIV infection Open Virol J 20126135-143
3 Baleriola C Johal H Jacka B Chaverot S Bowden S Lacey S Rawlinson W Stability of hepatitis C virus HIV and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples af-ter long-term storage at -20degC and -70degC J Clin Microbiol 2011493163-3167
4 Bennett B Neumann D Fordan S Villaraza R Crowe S Gi-llis L Performance of the new HIV-12 Diagnostic Algorithm in Floridarsquos public health testing population A review of the first five months of utilization J Clin Virol 2013 5829-33
5 Branson BM Stekler JD Detection of acute HIV infection we canrsquot close the window J Infect Dis 2012 205521-524
6 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for la-boratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI document M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
11 Garcia F Alvarez M Fox Z Garcia-Diaz A Guillot V Johnson M Chueca N Phillips A Hernaacutendez-Quero J Geretti AM Predicting antiretroviral drug resistance from the latest or the cumulative genotype Antivir Ther 201116373-382
12 Garcia F Palomares JC Martinez NM Alvarez M Suarez S Garciacutea F Rodriacuteguez JM Quero JH del Carmen Maroto M Study of different system for interpreting results of genotypic antiretroviral drug resistance tests Antiviral Therapy 2003 8251-252
13 Goumlkengin D Geretti AM Begovac J Palfreeman A Steva-novic M Tarasenko O Radcliffe K 2014 European Guide-line on HIV testing Int J STD AIDS 2014 Apr 22 [Epub ahead of print]
14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
24 Ryscavage P Kelly S Li JZ Harrigan PR Taiwo B Signifi-cance and clinical management of persistent low-level vi-remia and very-low-level viremia in HIV-1-infected patients Antimicrob Agents Chemother2014583585-3598
25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
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- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
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- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
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- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
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- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
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- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
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- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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nico La mayoriacutea de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una CVP detectable en un rango muy amplio Hay que considerar tambieacuten que para confirmar un fracaso viroloacutegico se debe confir-mar eacuteste con una segunda determinacioacuten
341 Respuesta al tratamiento y fracaso vi-roloacutegicoLos criterios de respuesta y fracaso viroloacutegicos si-guiendo la guiacutea de GESIDA son
bull Respuesta viroloacutegica reduccioacuten de la CVP supe-rior a 1 log10 tras 4 semanas desde el inicio del TAR y CVP menor de 50 copiasmL tras 16-24 sema-nas de iniciado el TAR
bull Fracaso viroloacutegico corresponde a cualquiera de las siguientes situaciones a) CVP detectable tras 24 semanas del inicio del TAR b) si tras alcanzar la CVP indetectable eacutesta vuelve a ser superior a 50 copiasmL en dos determinaciones consecu-tivas (separadas por 2-4 semanas) En pacientes con CVP muy elevadas (maacutes de 300000 copiasmL) pueden requerirse maacutes de 24 semanas para obtener una CVP indetectable
El fracaso viroloacutegico obliga a considerar distintos fac-tores falta de adherencia al tratamiento errores en la dosificacioacuten interacciones medicamentosas o alimen-tarias problemas de malabsorcioacuten o desarrollo de mu-taciones de resistencias a los faacutermacos ARV
342 Factores que aumentan la CVPAdemaacutes de la progresioacuten natural de la infeccioacuten la CVP puede aumentar raacutepidamente en situaciones en las que se produce un estiacutemulo inmunoloacutegico que au-menta la produccioacuten de partiacuteculas viacutericas por los lin-focitos infectados Si la medida de la CVP se efectuacutea tras un proceso infeccioso intercurrente o vacunacioacuten puede haber elevaciones transitorias El tratamiento de algunas coinfecciones como tuberculosis malaria herpes siacutefilis o gonorrea podriacutean reducir los niveles de CVP
343 Interpretacioacuten de viremias bajasEn un 15-30 de pacientes con CVP indetectable se detectan ocasionalmente episodios asilados y transi-torios de viremia de bajo nivel (inferior a 500 copiasmL) denominados blips Esta viremia vuelve espon-taacuteneamente a ser inferior a 50 copiasmL sin ninguacuten cambio en el TAR Los blips podriacutean estar causados por la replicacioacuten del VIH-1 en reservorios fluctuacio-nes bioloacutegicas o errores en el procesamiento y no parecen tener especial relevancia cliacutenica Las nuevas
teacutecnicas moleculares para determinar la CVP permiten detectar una proporcioacuten importante de pacientes con niveles de CVP comprendidos entre 20 y 50 copiasmL ademaacutes de otros con viremia detectable pero no cuantificable (lt20 copiasmL) Distintos autores han indicado que esta viremia de bajo nivel cuando se detecta de forma persistente se asocia con un mayor riesgo de fracaso viroloacutegico Aunque estos estudios por su caraacutecter retrospectivo han comparado pacien-tes con distintas caracteriacutesticas (nivel de CD4 tiempo previo de supresioacuten viroloacutegica o uso de ITINANs) lo que siacute es evidente es que en todos ellos incluso utili-zando diferentes ensayos de determinacioacuten de carga viral se reproducen los resultados Los autores de es-tos estudios concluyen de forma unaacutenime sobre la necesidad de estudios de intervencioacuten que confirmen sus resultados
Ademaacutes algunos pacientes pueden presentar fraca-so inmunoloacutegico es decir que no presentan una cifra adecuada de linfocitos CD4+ a pesar de mantener una CVP inferior a 50 copiasmL En estos casos tampoco se recomienda modificar el TAR con la excepcioacuten de ciertas combinaciones
344 CVP indetectable en pacientes infecta-dos pero sin tratamientoAlgunos pacientes infectados (5-7) despueacutes del pico de viremia intensa correspondiente a la infeccioacuten aguda pueden mantener la replicacioacuten del virus con-trolada por periodos prolongados en ausencia de tra-tamiento antirretroviral En estos casos la CVP puede ser indetectable durante meses Esta situacioacuten aun-que poco frecuente es normal y suele ocurrir en pa-cientes con diagnoacutestico de certeza de infeccioacuten que se encuentren asintomaacuteticos y con cifras de linfocitos CD4 normales En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de linfocitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica (VIH-1 grupo O grupo N variantes ge-neacuteticas del grupo M oacute VIH-2) esta situacioacuten se debe resolver por teacutecnicas seroloacutegicas y moleculares espe-ciacuteficas
4 prUebas para la Deteccion De resistencias Y tropismo Viral
Las pruebas para la deteccioacuten de resistencias a antirre-trovirales pueden clasificarse en dos tipos genotiacutepicas o fenotiacutepicas Los meacutetodos genotiacutepicos determinan las
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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plasmaacutetica del VIH
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 5 de 5
Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
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- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
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- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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mutaciones en la secuencia primaria de nucleoacutetidos del gen del VIH objeto de estudio comparaacutendola con la secuencia de una cepa salvaje La resistencia fenotiacutepi-ca se expresa en teacuterminos de concentracioacuten de faacuterma-co necesario para inhibir la replicacioacuten viacuterica en cultivo celular Generalmente se expresa en teacuterminos de CI50 indicando la concentracioacuten de faacutermaco requerida para reducir al 50 la produccioacuten viral in vitro La interpre-tacioacuten de estos valores es diferente dependiendo del faacutermaco implicado
41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
La secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos es el meacutetodo genotiacutepico de referencia para la determinacioacuten de la resistencia del VIH a los faacutermacos antirretrovirales Se obtiene informacioacuten completa de la secuencia de la regioacuten del genoma viral amplificada previamente por PCR empleando primers o dideoxinucleoacutetidos mar-cados de forma diferente para poder distinguirlos en-tre siacute Para ello el meacutetodo maacutes utilizado es el meacutetodo enzimaacutetico tambieacuten llamado de siacutentesis abortiva de los dideoxinucleoacutetidos o secuenciacioacuten tipo Sanger que utiliza la secuenciacioacuten unidireccional Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o primers y en-tonces se denomina secuenciacioacuten bidireccional Por cualquiera de los dos meacutetodos el resultado es una secuencia de nucleoacutetidos que una vez editada se tra-duce en una secuencia de aminoaacutecidos Esta secuen-cia de aminoaacutecidos se compara entonces con la de una cepa de referencia del VIH con el fin de determinar si existen mutaciones Asiacute se analizan principalmente las secuencias de la retrotranscriptasa (RT) proteasa e integrasa en busca de mutaciones que confieran resistencia al tratamiento En la actualidad hay equi-pos de secuenciacioacuten asistidos por ordenador que automatizan los pasos de electroforesis deteccioacuten y anaacutelisis de las bandas de secuenciacioacuten (patrones de picos llamados electroferogramas) y el ensamblaje de los fragmentos secuenciados Dicha automatizacioacuten ha permitido
bull Obtener una mayor sensibilidad de deteccioacutenbull Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares
de bases (en el caso que nos ocupa esto es in-suficiente y hay que recurrir a varias reacciones de secuenciacioacuten para poder estudiar todas las posiciones del gen pol relacionadas con resisten-cia)
bull Tener menor cantidad de paradas inespeciacuteficas de la ADN polimerasa por las estructuras secundarias en el ADN molde
bull Analizar los resultados maacutes raacutepidamente y reducir el tiempo de procesamiento de las muestras lo que permite disminuir el tiempo de respuesta para emisioacuten de resultados
Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de la teacutec-nica en concreto para la deteccioacuten de mutaciones de resistencia a faacutermacos en eacuteste caso frente a antirre-trovirales
Los ensayos de secuenciacioacuten comerciales maacutes uti-lizados han sido TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test (Siemens NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system (Abbott Diagnostics) El primero utiliza la secuencia-cioacuten bidireccional y la electroforesis en gel y permite investigar mutaciones en la RT y la proteasa el se-gundo emplea el meacutetodo unidireccional y la electro-foresis capilar y permite investigar mutaciones en la RT proteasa e integrasa Ambos sistemas ofrecen un software para la edicioacuten de las secuencias y un algo-ritmo propio de interpretacioacuten Se han realizado varios estudios comparativos que no establecen grandes di-ferencias en cuanto a ambas teacutecnicas
Debido a que es difiacutecil tener un profundo conocimien-to de la significacioacuten cliacutenica de todas las mutaciones los ensayos genotiacutepicos se suelen acompantildear de una interpretacioacuten de las mutaciones encontradas Es en este punto en la interpretacioacuten cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio El elevado nuacutemero de mutaciones de resistencia y la existencia de interaccio-nes entre ellas son algunas de las causas de los proble-mas en la interpretacioacuten Afortunadamente el modelo para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia es susceptible de ser informatizado porque los resul-tados de los tests genotiacutepicos se obtienen en formato de texto (una lista de nucleoacutetidos) y porque las reglas de interpretacioacuten son faacutecilmente computarizables Por esto hoy en diacutea la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia se hace principalmente sobre la base de algoritmos informaacuteticos en los que se introduce la se-cuencia nucleotiacutedica de la proteasa y retrotranscriptasa de VIH y se compara con la secuencia de una cepa patroacuten sin ninguna mutacioacuten (cepa salvaje o wild type) reconociendo entonces las mutaciones de resistencia
De hecho el genotipo del VIH-1 interpretado por un conjunto de normas del software predice la evolucioacuten viroloacutegica cuando se complementa con la informacioacuten cliacutenica como base para realizar un cambio de trata-miento Existen numerosos sistemas para interpretar el genotipo obtenido mediante secuenciacioacuten se han desarrollado maacutes de 25 sistemas de interpretacioacuten
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
2 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Im-proving clinical laboratory efficiency introduction of systems for the diagnosis and monitoring of HIV infection Open Virol J 20126135-143
3 Baleriola C Johal H Jacka B Chaverot S Bowden S Lacey S Rawlinson W Stability of hepatitis C virus HIV and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples af-ter long-term storage at -20degC and -70degC J Clin Microbiol 2011493163-3167
4 Bennett B Neumann D Fordan S Villaraza R Crowe S Gi-llis L Performance of the new HIV-12 Diagnostic Algorithm in Floridarsquos public health testing population A review of the first five months of utilization J Clin Virol 2013 5829-33
5 Branson BM Stekler JD Detection of acute HIV infection we canrsquot close the window J Infect Dis 2012 205521-524
6 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for la-boratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI document M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
11 Garcia F Alvarez M Fox Z Garcia-Diaz A Guillot V Johnson M Chueca N Phillips A Hernaacutendez-Quero J Geretti AM Predicting antiretroviral drug resistance from the latest or the cumulative genotype Antivir Ther 201116373-382
12 Garcia F Palomares JC Martinez NM Alvarez M Suarez S Garciacutea F Rodriacuteguez JM Quero JH del Carmen Maroto M Study of different system for interpreting results of genotypic antiretroviral drug resistance tests Antiviral Therapy 2003 8251-252
13 Goumlkengin D Geretti AM Begovac J Palfreeman A Steva-novic M Tarasenko O Radcliffe K 2014 European Guide-line on HIV testing Int J STD AIDS 2014 Apr 22 [Epub ahead of print]
14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
18 Montaner JS Lima VD Barrios R Yip B Wood E Kerr T Shannon K Harrigan PR Hogg RS Daly P Kendall P As-sociation of highly active antiretroviral therapy coverage population viral load and yearly new HIV diagnoses in Bri-tish Columbia Canada a population-based study Lancet 2010 376532-539
19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
24 Ryscavage P Kelly S Li JZ Harrigan PR Taiwo B Signifi-cance and clinical management of persistent low-level vi-remia and very-low-level viremia in HIV-1-infected patients Antimicrob Agents Chemother2014583585-3598
25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
28 Stekler JD Swenson PD Coombs RW Dragavon J Tho-mas KK Brennan CA Devare SG Wood RW Golden MR HIV testing in a high-incidence population is antibody tes-ting alone good enough Clin Infect Dis 2009 49444-453
29 Van den Berk GE Frissen PH Regez RM Rietra PJ Evalua-tion of the rapid immunoassay determine HIV 12 for detec-tion of antibodies to human immunodeficiency virus types 1 and 2 J Clin Microbiol 2003 413868-3869
30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 5
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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con amplias diferencias entre ellos en cuanto a base cientiacutefica validacioacuten cliacutenica etc Algunos de ellos son listados de mutaciones asociadas con resistencia a modo de tablas y otros estaacuten disponibles en internet como la paacutegina de la Sociedad Internacional de SIDA de EEUU (httpwwwiasusaorg) o la base de datos para secuencias de proteasa transcriptasa inversa e integrasa de la Universidad de Stanford (httphivdbstanfordedu)
Todos son faacutecilmente accesibles y presentan sistemas de interpretacioacuten sencillos para todos los faacutermacos disponibles Sin embargo en ninguno de los docu-mentos de consenso o paneles de expertos se emiten normas sobre cuaacutel debe ser la forma de interpretar los resultados de las pruebas genotiacutepicas Es maacutes cuan-do se comparan los algoritmos entre siacute existen serias discrepancias entre ellos En Espantildea disponemos del algoritmo de la Red de Investigacioacuten en SIDA que se actualiza perioacutedicamente y estaacute disponible en wwwretic-risnet
Finalmente hay que destacar que se debe interpretar el resultado de las pruebas de resistencia teniendo en cuenta la historia previa de tratamiento antirretroviral y en su caso estudios previos de resistencias que se hayan realizado al mismo paciente intentando dispo-ner del genotipo acumulado
42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
Los estudios fenotiacutepicos tienen la ventaja de valorar con mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente a cada faacutermaco y seguacuten este grado de sensibilidad se podriacutea valorar en un futuro la posibilidad de sobrepa-sar la resistencia aumentando los niveles plasmaacuteticos del faacutermaco Sin embargo los estudios fenotiacutepicos de-ben considerarse por el momento como poco viables principalmente por la complejidad laboriosidad de la teacutecnica y el tiempo necesario para la emisioacuten de re-sultados Esto ha provocado que queden limitados a meacutetodos que utilizan virus recombinantes y que soacutelo se realizan en laboratorios especializados de investi-gacioacuten yo de casas comerciales Los tres ensayos de virus recombinantes que se comercializan son Anti-virogram (Tibotec-Virco) PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM (Viralliance-SAS)
Existen distintos puntos de corte para la interpretacioacuten del fenotipo teacutecnico bioloacutegico y cliacutenico
a El punto de corte teacutecnico se establece en base a la
reproducibilidad del ensayo soacutelo nos informa si la CI50 de la cepa en estudio difiere significativamente de la de la cepa patroacuten por lo tanto no proporcio-na informacioacuten sobre la relacioacuten existente con la posibilidad o no de una respuesta cliacutenica al antirre-troviral en estudio
b El punto de corte bioloacutegico se basa en la media de la CI50 de cepas aisladas de pacientes naive y para cada antirretroviral Este punto de corte se esta-blecioacute en dos desviaciones estaacutendar por encima de la media de CI50 de dichas cepas este punto de corte es una buena medida de la sensibilidad a los antivirales del virus en estudio con respecto a los que circulan en la poblacioacuten no tratada e in-fectada por VIH pero tampoco proporciona ningu-na medida en relacioacuten con si un tratamiento seraacute efectivo o no
c El punto de corte cliacutenico se establece en base a la correlacioacuten de la CI50 a un antirretroviral con la respuesta cliacutenica medida en teacuterminos de descen-so de la carga viral en un determinado periacuteodo de tiempo es el punto de corte ideal pero la reali-dad es que no siempre existe una relacioacuten binaria resistencia-falta de respuesta sino que esto maacutes bien es un fenoacutemeno continuo por lo que se hace necesario definir intervalos que definan varias po-sibilidades de respuesta
La dificultad de la interpretacioacuten de las pruebas feno-tiacutepicas radica en la dificultad de disentildear ensayos cliacuteni-cos que avalen los puntos de corte cliacutenicos de cada antirretroviral Ademaacutes un problema antildeadido puede ser la variabilidad que a esto pueda aportar el tipo de ensayo fenotiacutepico que se realice
43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
El fenotipo virtual es la principal herramienta en este campo Disentildeado por Virco ha sufrido diversas modifi-cacionesactualizaciones A partir de 2005 se ha rede-finido recibiendo la nueva actualizacioacuten el nombre de vircoType HIV-1 su mayor novedad es que incorpora nuevos puntos de corte que en esta versioacuten son cliacute-nicos y ademaacutes define la resistencia a un faacutermaco de un modo continuo en vez de hacer una interpretacioacuten dual Asimismo incorpora informacioacuten sobre la resis-tencia a inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir y en determinados casos incluye el consejo de expertos en la interpretacioacuten final La potencia de esta herramienta para la interpretacioacuten viene avalada por el nuacutemero de series genotipo-fenotipo-respuesta viroloacutegica de que dispone
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-2
Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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Existen otras herramientas que predicen el fenotipo a partir del genotipo como geno2pheno (httpwwwge-no2phenode)
44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
La definicioacuten de tropismo viral en el VIH no ha sido desde su inicio un concepto fijo sino que ha tenido que ver progresivamente con el efecto citopaacutetico (ISNIS) con la cineacutetica de replicacioacuten (RBRAR) o con la facultad de infectar a diferentes liacuteneas celulares (MT o D-troacutepicas) hasta llegar a la definicioacuten actual basada en la capacidad que tiene el virus de utilizar un deter-minado correceptor como los receptores de quimio-cinas CCR5 y CXCR4 para poder entrar en la ceacutelula diana lo cual ha permitido clasificar a los aislados vira-les en variantes R5-troacutepicas X4-troacutepicas y Dual Mixtas (DM) en funcioacuten del correceptor utilizado
En estos uacuteltimos antildeos los estudios de tropismo han adquirido un especial intereacutes debido principalmente al disentildeo de faacutermacos antirretrovirales destinados a blo-quear estos receptores de quimiocinas La aprobacioacuten de los antagonistas de CCR5 que como el maravi-roc (MVC) presentan actividad especiacutefica frente a las variantes R5-troacutepicas ha generado la necesidad de disponer de ensayos para la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes candidatos a iniciar un tratamiento con este faacutermaco ya que la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas se ha asociado con el fracaso al tratamiento
441 Meacutetodos fenotiacutepicos Desde un principio los ensayos utilizados para la de-terminacioacuten del tropismo viral han sido de iacutendole feno-tiacutepica y estaacuten basados principalmente en la generacioacuten de virus recombinantes a partir de la envuelta del virus del paciente (ESTA-Trofile Tropitest Toulouse Tropism Test etc) en la combinacioacuten de meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos (Virco type HIV-1 PhenoX-R HIV-1 Phe-noscript Env etc) y finalmente en el cocultivo a partir de ceacutelulas mononucleares de sangre perifeacuterica (PBMC) del paciente con distintas liacuteneas celulares como U87 (Trocai) que pueden expresar uno o maacutes correceptores de CD4 o las claacutesicas MT2 para determinar el efec-to citopaacutetico viral Estos ensayos constituyen todaviacutea el meacutetodo de referencia para caracterizar el tropismo viral por su gran sensibilidad para detectar las varian-tes minoritarias CXCR4 yo CCR5 en los subtipos B y no-B del VIH-1 y ademaacutes representan el uacutenico meacutetodo para medir la resistencia a los antagonistas de CCR5 Sin embargo este tipo de ensayos presentan ade-
maacutes de un precio elevado complicaciones teacutecnicas y en especial logiacutesticas que dificultan su utilizacioacuten en la praacutectica cliacutenica
442 Meacutetodos genotiacutepicos En este contexto los meacutetodos genotiacutepicos basados en el anaacutelisis por secuenciacioacuten de la tercera regioacuten va-riable (V3) de la glicoproteiacutena de la envuelta gp120 del VIH-1 se presentan frente a los ensayos fenotiacutepicos como una alternativa maacutes econoacutemica raacutepida y factible de desarrollar en cualquier laboratorio de virologiacutea que cuente con tecnologiacutea para realizar estudios genotiacutepi-cos de secuenciacioacuten
En este sentido para las variantes virales R5 y X4-troacute-picas la secuencia de aminoaacutecidos de la regioacuten V3 de gp120 determina en gran medida el uso preferencial de CCR5 yo CXCR4 Aunque conviene resentildear que otras regiones de la envuelta como V1V2 y C4 tam-bieacuten parecen estar implicadas en este proceso A este respecto se han descrito desde un principio diferentes reglas y algoritmos para la prediccioacuten del tropismo viral (R5 X4) que se fundamentan en las caracteriacutesticas de la secuencia de aminoaacutecidos de dicha regioacuten Entre estas reglas encontramos la regla 1125 basada en la presencia de aminoaacutecidos baacutesicos en estas posicio-nes la regla de la carga neta en V3 y por uacuteltimo la combinacioacuten de ambas reglas que clasifica una varian-te como X4 siempre y cuando una de ellas lo haga Con posterioridad el estudio de la variabilidad natural en las secuencias de V3 y su asociacioacuten con los fenoti-pos R5 o X4-troacutepicos ha permitido la identificacioacuten de nuevos residuos y patrones de aminoaacutecidos relacio-nados con el tropismo viral y tambieacuten el desarrollo de diferentes bases de datos con informacioacuten genofenotiacute-pica de los aislados virales A partir de estas bases y a traveacutes de la utilizacioacuten de diferentes meacutetodos estadiacutes-ticos (support vector machine-SVM position specific scoring matrices-PSSM) se han disentildeado algoritmos bioinformaacuteticos que permiten predecir el uso del corre-ceptor basaacutendose en la secuencia geneacutetica completa de la regioacuten V3 de un determinado aislado viral La ma-yoriacutea de estos algoritmos se encuentran disponibles en paacuteginas webs de libre acceso (WetCat WebPSSM FortinbrasPSSM y Geno2pheno)
Los primeros estudios de correlacioacuten entre meacutetodos genotiacutepicos y fenotiacutepicos mostraron en general una baja sensibilidad de los primeros para la deteccioacuten de variantes X4-troacutepicas En general los ensayos genotiacute-picos basados en la secuenciacioacuten poblacional pre-sentan limitaciones teacutecnicas a distintos niveles (pro-ceso de retrotranscripcioacuten regioacuten estudiada bases
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
2 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Im-proving clinical laboratory efficiency introduction of systems for the diagnosis and monitoring of HIV infection Open Virol J 20126135-143
3 Baleriola C Johal H Jacka B Chaverot S Bowden S Lacey S Rawlinson W Stability of hepatitis C virus HIV and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples af-ter long-term storage at -20degC and -70degC J Clin Microbiol 2011493163-3167
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6 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for la-boratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI document M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
11 Garcia F Alvarez M Fox Z Garcia-Diaz A Guillot V Johnson M Chueca N Phillips A Hernaacutendez-Quero J Geretti AM Predicting antiretroviral drug resistance from the latest or the cumulative genotype Antivir Ther 201116373-382
12 Garcia F Palomares JC Martinez NM Alvarez M Suarez S Garciacutea F Rodriacuteguez JM Quero JH del Carmen Maroto M Study of different system for interpreting results of genotypic antiretroviral drug resistance tests Antiviral Therapy 2003 8251-252
13 Goumlkengin D Geretti AM Begovac J Palfreeman A Steva-novic M Tarasenko O Radcliffe K 2014 European Guide-line on HIV testing Int J STD AIDS 2014 Apr 22 [Epub ahead of print]
14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
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25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
19
de datos del algoritmo de interpretacioacuten) pero espe-cialmente destaca su baja sensibilidad para detectar variantes minoritarias presentes por debajo del 20 de la poblacioacuten viral que marca la diferencia con los meacutetodos fenotiacutepicos Los esfuerzos realizados inicial-mente para solucionar estas limitaciones incluyeron la mejora en el disentildeo y uso de los algoritmos asiacute como el incremento de secuencias con informacioacuten fenotiacute-pica en las bases de datos utilizadas Estas mejoras han permitido la validacioacuten cliacutenica de las herramientas genotiacutepicas al demostrar que estas son comparables en la prediccioacuten de la respuesta a MVC y en la ca-pacidad de identificar pacientes respondedores y no respondedores a pesar de su menor sensibilidad para detectar variantes X4-troacutepicas respecto de los ensa-yos fenotiacutepicos No obstante hay que considerar en el panorama terapeacuteutico actual la contribucioacuten de los faacutermacos administrados junto a MVC para conseguir la supresioacuten viral Dentro de este contexto la presencia de variantes X4-troacutepicas probablemente podriacutea tener un impacto relativo en la respuesta viroloacutegica Por todo esto las diversas guiacuteas de manejo de la infeccioacuten por VIH como la espantildeola de GESIDA y la de la DHHS estadounidense incluyen entre sus recomendaciones la posibilidad de determinar el tropismo del VIH-1 me-diante meacutetodos genotiacutepicos para guiar el uso terapeacuteu-tico de los antagonistas de CCR5
Por uacuteltimo y dentro de las mejoras realizadas en los meacutetodos genotiacutepicos merece una especial atencioacuten la introduccioacuten paulatina de nuevas metodologiacuteas de ge-notipado como las plataformas de secuenciacioacuten ma-siva de uacuteltima generacioacuten (454 Illumina PacBio Ion Torrent etc) que reducen el coste para la determina-cioacuten genotiacutepica del correceptor del VIH-1 con un nivel de sensibilidad en la deteccioacuten de variantes minoritarias comparable al de los ensayos fenotiacutepicos Sin embar-go hasta que estas plataformas simplifiquen su logiacutes-tica y la interpretacioacuten bioinformaacutetica de resultados los meacutetodos para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo viral basados en la secuenciacioacuten directa se presentan hoy en diacutea como la principal alternativa raacutepida fiable y factible de realizar en laboratorios de virologiacutea asisten-cial para la determinacioacuten del tropismo viral en la praacutecti-ca cliacutenica y para guiar el uso terapeacuteutico de los antago-nistas de CCR5 como el MVC A este respecto y como ayuda al microbioacutelogo hay publicado un documento de consenso y su correspondiente actualizacioacuten de 2011 para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo del VIH en la praacutectica cliacutenica En eacutel se recogen tanto recomen-daciones sobre las indicaciones cliacutenicas en pacientes naive y pretratados como de tipo teacutecnico (PNT con vo-lumen de partida nuacutemero de RT-PCRs determinacioacuten
en ADN proviral plataforma de secuenciacioacuten anaacutelisis de calidad de las secuencias expansioacuten e interpreta-cioacuten de las secuencias etc) que continuacutean estando vi-gentes a pesar del tiempo transcurrido
45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
En la actualidad la mayoriacutea de las pruebas genotiacutepicas o fenotiacutepicas incluyen durante su realizacioacuten la extrac-cioacuten del ARN viral y su posterior retrotranscripcioacuten en ADN De este ADN se amplifica la regioacuten genoacutemica que se desea investigar mediante reaccioacuten en cadena de la polimerasa (PCR) Los procedimientos de extraccioacuten y amplificacioacuten son cruciales para el posterior anaacutelisis del amplificado y la calidad de los resultados depen-deraacute directamente de la calidad de estas dos etapas del proceso En todos los ensayos descritos hasta la fecha se amplifican la proteasa y parte de la RT del VIH y en algunos se amplifica tambieacuten un fragmento del gen gag Las teacutecnicas de las que disponemos asegu-ran un 98-100 de eacutexito en la amplificacioacuten en mues-tras con una carga viral superior a 500-1000 copiasmL No obstante con las adecuadas modificaciones es posible amplificar praacutecticamente cualquier muestra con carga viral detectable es decir con maacutes de 50 copiasmL y estudios recientes han demostrado la utilidad cliacutenica de la determinacioacuten de resistencias en pacientes con viremia de bajo nivel incluso por debajo de 200 copiasmL Los ensayos estaacuten por lo general bien disentildeados y para la PCR inicial se utilizan regiones dentro de los genes gag-pol altamente conservadas entre los subtipos distintos del B ya sean no-B URFs (Unique Recombinant Forms) o CRFs (Circulating Re-combinant Forms)
Por otra parte ninguno de los meacutetodos genotiacutepicos o fenotiacutepicos asegura la deteccioacuten de todas las varian-tes o cuasiespecies virales en el paciente infectado por el VIH La mayoriacutea de las teacutecnicas soacutelo detectan una variante si eacutesta representa maacutes del 20 del total de la poblacioacuten Para asegurar la deteccioacuten de las variantes que representan menos del 20 tambieacuten llamadas variantes minoritarias es necesario recurrir a teacutecnicas especiales (clonacioacuten de los productos de amplifica-cioacuten PCR mediante diluciones al liacutemite o PCR a tiem-po real) que son de difiacutecil implantacioacuten en la rutina del laboratorio de secuenciacioacuten del VIH Este hecho ex-plica por queacute los meacutetodos que se utilizan actualmente predicen el fracaso de un faacutermaco pero no aseguran el eacutexito ya que las variantes minoritarias pueden ser por-tadoras de mutaciones de resistencia y seleccionarse mediante el empleo de ese faacutermaco en concreto
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
20
Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-2
Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 2 de 4
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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plasmaacutetica del VIH
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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Sin embargo la reciente introduccioacuten de meacutetodos de secuenciacioacuten de nueva generacioacuten conocidos como teacutecnicas de secuenciacioacuten masiva (UDS) que permiten la deteccioacuten de mutaciones de resistencia presentes hasta en el 05 de la poblacioacuten total y que han de-mostrado su utilidad cliacutenica sobre todo en pacientes que van a iniciar su primera liacutenea de tratamiento abren una posibilidad a su implantacioacuten en la rutina asisten-cial Ademaacutes al tratarse de teacutecnicas de secuenciacioacuten de genomas uacutenicos se puede obtener el dato de carga mutacional porcentaje de la mutacioacuten con respecto a la carga viral que estaacute demostrando su utilidad como verdadero paraacutemetro en la interpretacioacuten de las resis-tencias En la actualidad existen varias plataformas de UDS disponibles que se diferencian fundamental-mente en la longitud de las lecturas generadas y en la quiacutemica de la secuenciacioacuten En estos momentos la plataforma Roche 454 es la uacutenica que ofrece un pro-totipo de equipo comercial para uso en la rutina asis-tencial Con estos nuevos secuenciadores el coste de cada nucleoacutetido pasoacute desde los 10 USD en 1990 a 001 USD en 2012 La secuenciacioacuten masiva aplicada a las resistencias del VIH ha demostrado su utilidad para la eleccioacuten del mejor reacutegimen de tratamiento de inicio basado en no anaacutelogos de nucleoacutesidos Recien-temente tambieacuten se han presentado algunos datos sobre su utilidad para la eleccioacuten de un nuevo reacutegimen en los pacientes que ya han fracasado a varias liacuteneas de tratamiento No obstante el gran inconveniente de esta teacutecnica hasta el momento es la falta de automa-tizacioacuten Aunque se estaacuten desarrollando sistemas para poder automatizar las diferente etapas mientras esto no se resuelve hay que decir que actualmente son teacutec-nicas muy manuales y laboriosas consumen mucho tiempo y requieran de personal altamente cualificado por lo que hoy en diacutea estas plataformas son poco ope-rativas en el laboratorio de rutina
46 INDICACIONES
En este apartado se expondraacuten las recomendaciones maacutes recientes a nivel nacional (GESIDAPlan Nacional del SIDA Enero 2014) e internacional (Department of Health and Human Services DHHS Mayo 2014) que estos grupos de expertos realizan para conseguir una oacuteptima utilizacioacuten de las pruebas de resistencia
Los escenarios para la utilizacioacuten de las pruebas de resistencia son
a Pacientes sin tratamiento previo se debe realizar un test de resistencias en todos los pacientes en el momento del diagnoacutestico (GESIDA AII DHHS
AII) ademaacutes de repetirlo en el momento de iniciar tratamiento si este se difiere (GESIDA AIIDHHS CIII) Se han de investigar mutaciones trasmitidas en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que exista una alta sospecha (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tro-pismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI)
b Paciente con tratamiento antirretroviral recomen-dar en todo fracaso al TAR (GESIDA AI DHHS AI) para determinar el papel de la resistencia en el fracaso y disentildear un nuevo reacutegimen con el mayor nuacutemero de faacutermacos activos Se han de investi-gar mutaciones de resistencia en la integrasa viral soacutelo en aquellos casos en los que se fracasa a un inhibidor de la integrasa (DHHS CIII) Se debe realizar un test genotiacutepico para estimar el tropismo viral en aquellos casos en los que se vaya a iniciar tratamiento con un antagonista de CCR5 (DHHS AI) La DHHS recomienda realizar estudios de re-sistencia por encima de 500 copiasmL (BII)
Las guiacuteas de la DHHS recomiendan ademaacutes la reali-zacioacuten de los tests de resistencias en los casos en los que la supresioacuten viroloacutegica tras iniciar tratamiento es suboacuteptima (BIII) y en todas las mujeres embarazadas antes de iniciar tratamiento (AIII) Finalmente desacon-sejan su empleo despueacutes de suspender un tratamien-to (DIIII) por la reversioacuten de la mayoriacutea de las muta-ciones que no se detectariacutean al ser subpoblaciones minoritarias
47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
Como consecuencia de su alta diversidad geneacutetica el VIH-1 ha sido clasificado en 4 grupos (M O N y P) en base a la homologiacutea de secuencias geneacuteticas com-pletas o parciales Mientras que los grupos O N y P estaacuten restringidos principalmente a Aacutefrica Central el grupo M es el responsable de la pandemia del VIH-1 De este modo la mayoriacutea de las cepas que circulan en Espantildea al igual que en el resto del mundo per-tenecen a este grupo Por su parte la alta tasa de recombinacioacuten observada dentro del grupo M con-tribuye a incrementar su diversidad geneacutetica dando lugar a una gran variedad de variantes De acuerdo al anaacutelisis filogeneacutetico estas variantes se clasifican en subtipos subsubtipos e intersubtipos como las formas recombinantes circulantes (CRFs) y uacutenicas (URFs) Hasta el momento han sido identificados 9
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
2 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Im-proving clinical laboratory efficiency introduction of systems for the diagnosis and monitoring of HIV infection Open Virol J 20126135-143
3 Baleriola C Johal H Jacka B Chaverot S Bowden S Lacey S Rawlinson W Stability of hepatitis C virus HIV and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples af-ter long-term storage at -20degC and -70degC J Clin Microbiol 2011493163-3167
4 Bennett B Neumann D Fordan S Villaraza R Crowe S Gi-llis L Performance of the new HIV-12 Diagnostic Algorithm in Floridarsquos public health testing population A review of the first five months of utilization J Clin Virol 2013 5829-33
5 Branson BM Stekler JD Detection of acute HIV infection we canrsquot close the window J Infect Dis 2012 205521-524
6 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for la-boratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI document M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
11 Garcia F Alvarez M Fox Z Garcia-Diaz A Guillot V Johnson M Chueca N Phillips A Hernaacutendez-Quero J Geretti AM Predicting antiretroviral drug resistance from the latest or the cumulative genotype Antivir Ther 201116373-382
12 Garcia F Palomares JC Martinez NM Alvarez M Suarez S Garciacutea F Rodriacuteguez JM Quero JH del Carmen Maroto M Study of different system for interpreting results of genotypic antiretroviral drug resistance tests Antiviral Therapy 2003 8251-252
13 Goumlkengin D Geretti AM Begovac J Palfreeman A Steva-novic M Tarasenko O Radcliffe K 2014 European Guide-line on HIV testing Int J STD AIDS 2014 Apr 22 [Epub ahead of print]
14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
18 Montaner JS Lima VD Barrios R Yip B Wood E Kerr T Shannon K Harrigan PR Hogg RS Daly P Kendall P As-sociation of highly active antiretroviral therapy coverage population viral load and yearly new HIV diagnoses in Bri-tish Columbia Canada a population-based study Lancet 2010 376532-539
19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
24 Ryscavage P Kelly S Li JZ Harrigan PR Taiwo B Signifi-cance and clinical management of persistent low-level vi-remia and very-low-level viremia in HIV-1-infected patients Antimicrob Agents Chemother2014583585-3598
25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
28 Stekler JD Swenson PD Coombs RW Dragavon J Tho-mas KK Brennan CA Devare SG Wood RW Golden MR HIV testing in a high-incidence population is antibody tes-ting alone good enough Clin Infect Dis 2009 49444-453
29 Van den Berk GE Frissen PH Regez RM Rietra PJ Evalua-tion of the rapid immunoassay determine HIV 12 for detec-tion of antibodies to human immunodeficiency virus types 1 and 2 J Clin Microbiol 2003 413868-3869
30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 5
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
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- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
21
subtipos (A-D F-H J y K) 4 subsubtipos (A1 A2 F1 y F2) al menos 65 CRFs (httpwwwncbinlmnihgovpubmedterm=CRF65+and+HIV-1) y muacuteltiples URFs La distribucioacuten geograacutefica de los subtipos del VIH-1 es desigual asiacute el subtipo B en el que se basan la mayoriacutea de los estudios cientiacuteficos soacutelo representa un 10 de las infecciones sin embargo es el maacutes prevalente en los paiacuteses desarrollados incluyendo Europa Occidental y EEUU y de ahiacute su intereacutes El resto de subtipos y for-mas recombinantes que suelen agruparse como ldquosub-tipos no-Brdquo han experimentado estos uacuteltimos antildeos un incremento en su prevalencia en los paiacuteses desarrolla-dos como han puesto de manifiesto diferentes estu-dios de epidemiologiacutea molecular en Espantildea su preva-lencia se estima en torno a un 15 con incrementos significativos en la poblacioacuten nativa e inmigrante Ade-maacutes de su intereacutes epidemioloacutegico diferentes estudios han demostrado que la presencia de estos subtipos no-B puede ser relevante en aspectos cliacutenicos al tener implicaciones en el diagnoacutestico en la monitorizacioacuten del tratamiento en el disentildeo de vacunas en la pro-gresioacuten de la enfermedad en la actividad antiviral en el incremento de resistencias a antirretrovirales o en la barrera geneacutetica para el desarrollo de las mismas etc de ahiacute la importancia de la correcta caracterizacioacuten del VIH-1 en sus correspondientes subtipos B y no-B En este sentido el anaacutelisis filogeneacutetico es la teacutecnica de re-ferencia para el subtipado y discriminacioacuten entre sub-tipos y CRFs sin embargo debido a su complejidad necesita de personal entrenado que deberaacute conocer e interpretar los resultados de los anaacutelisis obtenidos en los programas de filogenia (PHYLIP software pac-kage DNADIST Clustal X MEGA) y por esta razoacuten no estaacute implementado en la praacutectica habitual del labora-torio de virologiacutea cliacutenica De cara a facilitar la realizacioacuten de anaacutelisis filogeneacuteticos en la praacutectica del laboratorio se han desarrollado varias herramientas de subtipa-do automaacutetico para el VIH-1 que usan las secuencias del gen pol obtenidas de los estudios genotiacutepicos de resistencia y que se encuentran disponibles en dife-rentes webs (REGA Standford geno2pheno NCBI STAR EuResist TherapyEdge y jpHMM) Aunque son raacutepidas faacuteciles de usar y muy uacutetiles para la identifi-cacioacuten del subtipo B presentan el inconveniente de su menor sensibilidad para la discriminacioacuten entre los subtipos no-B especialmente en las CRFs con res-pecto al anaacutelisis filogeneacutetico convencional Por lo que respecta al VIH-2 se han descrito 8 grupos (A-H) sien-do los maacutes frecuentes a nivel mundial el A y el B hasta el momento soacutelo se ha descrito una uacutenica forma de CRF (httpwwwhivlanlgovcontentsequenceHelp-Docssubtypes-morehtml)
5 pUntos claVe
51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
bull La deteccioacuten de anticuerpos frente al VIH en plasma o suero se debe realizar con un inmu-noensayo de screening o cribado que poseen una sensibilidad elevada y permite detectar la infeccioacuten por los distintos grupos de VIH-1 y por VIH-2
bull Las muestras reactivas se deben confirmar siempre con un ensayo de especificidad supe-rior que realizaraacute la diferenciacioacuten entre VIH-1 y VIH-2 Se recomienda emplear inmunoensayos de cuarta generacioacuten que detectan anticuerpos del paciente y antiacutegeno p24 viral que reduce el periodo ventana a 13-15 diacuteas Ante la sospecha cliacutenica de infeccioacuten aguda o bien ante eviden-cia seroloacutegica es aconsejable realizar la determi-nacioacuten de la carga viral plasmaacutetica del VIH
bull El uso de pruebas raacutepidas estaacute muy extendido pero hay que poner especial atencioacuten a su lectu-ra Un resultado reactivo siempre hay que confir-marlo en un laboratorio de Microbiologiacutea
bull El algoritmo diagnoacutestico de la infeccioacuten por el VIH debe permitir emitir un resultado positivo confirmado de forma raacutepida para contribuir a re-ducir la transmisioacuten y no perder oportunidades de diagnoacutestico
bull La mayoriacutea de las plataformas actuales emplean la PCR en tiempo real para cuantificar la carga viral plasmaacutetica (CVP)
bull La CVP es el principal factor para la monitori-zacioacuten del tratamiento
bull Otras indicaciones son el diagnoacutestico de la infec-cioacuten aguda diagnoacutestico de la transmisioacuten mater-no-fetal y la valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
bull Se suele realizar en plasma si bien tambieacuten se puede emplear DBS LCR semen muestras cervico-vaginales o tejidos
bull La comunicacioacuten del resultado de CVP se debe realizar en valor absoluto y escala logariacutetmica para facilitar su interpretacioacuten
bull Para paiacuteses en viacuteas de desarrollo se estaacuten de-sarrollando sistemas ldquopoint of carerdquo para la de-terminacioacuten de CVP
bull La CVP comunitaria sirve como herramienta epi-demioloacutegica para valorar el riesgo de transmisioacuten de VIH
bull Cualquier nivel de CVP supone un riesgo para el posterior fracaso viroloacutegico
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
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53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
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14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
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16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
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22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
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26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
22
53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
6 bibliografIacutea
1 Aacutelvarez Esteacutevez M Chueca Porcuna N Guillot Suay V Gar-ciacutea F Muntildeoz Medina L Vinuesa Garciacutea D Parra Ruiz J Hernaacutendez-Quero J Garciacutea Garciacutea F Quantification of viral loads lower than 50 copies per milliliter by use of the Cobas AmpliPrepCobas TaqMan HIV-1 test version 20 can pre-dict the likelihood of subsequent virological rebound to gt50 copies per milliliter J Clin Microbiol 2013 511555-1557
2 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Im-proving clinical laboratory efficiency introduction of systems for the diagnosis and monitoring of HIV infection Open Virol J 20126135-143
3 Baleriola C Johal H Jacka B Chaverot S Bowden S Lacey S Rawlinson W Stability of hepatitis C virus HIV and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples af-ter long-term storage at -20degC and -70degC J Clin Microbiol 2011493163-3167
4 Bennett B Neumann D Fordan S Villaraza R Crowe S Gi-llis L Performance of the new HIV-12 Diagnostic Algorithm in Floridarsquos public health testing population A review of the first five months of utilization J Clin Virol 2013 5829-33
5 Branson BM Stekler JD Detection of acute HIV infection we canrsquot close the window J Infect Dis 2012 205521-524
6 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for la-boratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI document M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
7 Diagnosis and management of acute HIV infection New York State Department of Health AIDS Institute Disponible en wwwhivguidelinesorg
8 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional so-bre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adul-tos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
9 Doyle T Smith C Vitiello P Cambiano V Johnson M Owen A Phillips ANGeretti AM Plasma HIV-1 RNA detection be-low 50 copiesml and risk of virologic rebound in patients receiving highly active antiretroviral therapy Clin Infect Dis 2012 54724-732
10 Garciacutea F Aacutelvarez M Bernal C Chueca N Guillot V Diagnoacutes-tico de laboratorio de la infeccioacuten por el VIH del tropismo vi-ral y de las resistencias a los antirretrovirales Enferm Infecc Microbiol Clin 2011 29297-307
11 Garcia F Alvarez M Fox Z Garcia-Diaz A Guillot V Johnson M Chueca N Phillips A Hernaacutendez-Quero J Geretti AM Predicting antiretroviral drug resistance from the latest or the cumulative genotype Antivir Ther 201116373-382
12 Garcia F Palomares JC Martinez NM Alvarez M Suarez S Garciacutea F Rodriacuteguez JM Quero JH del Carmen Maroto M Study of different system for interpreting results of genotypic antiretroviral drug resistance tests Antiviral Therapy 2003 8251-252
13 Goumlkengin D Geretti AM Begovac J Palfreeman A Steva-novic M Tarasenko O Radcliffe K 2014 European Guide-line on HIV testing Int J STD AIDS 2014 Apr 22 [Epub ahead of print]
14 Henrich TJ Wood BR Kuritzkes DR Increased risk of viro-logic rebound in patients on antiviral therapy with a detecta-ble HIV load lt48 copiesmL PLoS One 2012 7e50065
15 Iribaren JA et al Labarga P Rubio R Berenguer J Miroacute JM Antela A Gonzaacutelez J Moreno S Arrizabalaga J Chamorro L Clotet B Gatell JM Loacutepez-Aldeguer J Martiacutenez E Polo R Tuset M Viciana P Santamariacutea JM Kindelaacuten JM Ribera E Segura F Grupo de Estudio de Sida Consejo Asesor Cliacutenico del Plan Nacional sobre el Sida del Ministerio de Sa-nidad y Consumo Recomendaciones de GESIDAPlan Na-cional sobre el SIDA respecto al tratamiento antirretroviral en pacientes pacientes adultos infectados por el VIH (octu-bre 2004) Enferm Infecc Microbiol Clin 2004 22 564-642
16 Laboratory Biosafety Manual Third edition World Health Organization Geneva 2004
17 Malloch L Kadivar K Putz J Levett PN Tang J Hatchette TF Kadkhoda K Ng D Ho J Kim J Comparative evaluation
bull Los meacutetodos genotiacutepicos son los preferidos para la determinacioacuten de resistencias y para la esti-macioacuten del tropismo
bull Se pueden determinar resistencias en la tran-scriptasa reversa (RT) proteasa (Pro) e integrasa (INT)
bull En los estudios de resistencias del VIH la mayor variabilidad se produce a la hora de la interpre-tacioacuten
bull Las guiacuteas cliacutenicas recomiendan la determinacioacuten de resistencias tanto en pacientes naiumlve (soacutelo RT y Pro) como en los fracasos
bull Se debe considerar la determinacioacuten del tropis-mo viral en aquellos pacientes en fracaso con indicacioacuten de tratamiento con una antagonista de CCR5
bull La complejidad de las teacutecnicas de variantes mi-noritarias hacen que estas tecnologiacuteas aunque han demostrado su utilidad cliacutenica por el mo-mento sean poco accesibles a los laboratorios de rutina
bull Los estudios de resistencias aportan una infor-macioacuten fundamental para conocer la epidemi-ologiacutea molecular del VIH
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
18 Montaner JS Lima VD Barrios R Yip B Wood E Kerr T Shannon K Harrigan PR Hogg RS Daly P Kendall P As-sociation of highly active antiretroviral therapy coverage population viral load and yearly new HIV diagnoses in Bri-tish Columbia Canada a population-based study Lancet 2010 376532-539
19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
24 Ryscavage P Kelly S Li JZ Harrigan PR Taiwo B Signifi-cance and clinical management of persistent low-level vi-remia and very-low-level viremia in HIV-1-infected patients Antimicrob Agents Chemother2014583585-3598
25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
28 Stekler JD Swenson PD Coombs RW Dragavon J Tho-mas KK Brennan CA Devare SG Wood RW Golden MR HIV testing in a high-incidence population is antibody tes-ting alone good enough Clin Infect Dis 2009 49444-453
29 Van den Berk GE Frissen PH Regez RM Rietra PJ Evalua-tion of the rapid immunoassay determine HIV 12 for detec-tion of antibodies to human immunodeficiency virus types 1 and 2 J Clin Microbiol 2003 413868-3869
30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
PNT-VIH-01
Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 4 de 4
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 5
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
DOCUMENTO CIENTIacuteFICO
23
of the Bio-Rad Geenius HIV-12 Confirmatory Assay and the Bio-Rad Multispot HIV-12 Rapid Test as an alternative differentiation assay for CLSI M53 algorithm-I J Clin Virol 2013 58 (Suppl 1)85-91
18 Montaner JS Lima VD Barrios R Yip B Wood E Kerr T Shannon K Harrigan PR Hogg RS Daly P Kendall P As-sociation of highly active antiretroviral therapy coverage population viral load and yearly new HIV diagnoses in Bri-tish Columbia Canada a population-based study Lancet 2010 376532-539
19 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-In-fected Adults and Adolescents Disponible en httpaidsin-fonihgov Mayo 2014
20 Piwowar-Manning EM Tustin NB Sikateyo P Kamwendo D Chipungu C Maharaj R Mushanyu J Richardson BA Hillier S Brooks Jackson J Validation of rapid HIV antibody tests in 5 African countries J Int Assoc Physicians AIDS Care 2010 9170-172
21 Poveda E Paredes R Moreno S Alcamiacute J Coacuterdoba J Delgado R Gutieacuterrez F Llibre JM Garciacutea Deltoro M Her-naacutendez-Quero J Pulido F Iribarren JA Garciacutea F Update on clinical and methodological recommendations for genotypic determination of HIV tropism to guide the usage of CCR5 antagonists AIDS Rev 2012 14208-217
22 Puren A Gerlach JL Weigl BH Kelso DM Domingo GJ Laboratory operations specimen processing and handling for viral load testing and surveillance J Infect Dis 2010 201 (Suppl 1)S27-S36
23 Rosenberg NE Kamanga G Phiri S Nsona D Pettifor A Rutstein SE Kamwendo D Hoffman IF Keating M Brown LB Ndalama B Fiscus SA Congdon S Cohen MS Miller WC Detection of acute HIV infection a field evaluation of the Determinereg HIV-12 AgAb Combo Test J Infect Dis 2012 205528-534
24 Ryscavage P Kelly S Li JZ Harrigan PR Taiwo B Signifi-cance and clinical management of persistent low-level vi-remia and very-low-level viremia in HIV-1-infected patients Antimicrob Agents Chemother2014583585-3598
25 Salmona M Delarue S Delauguerre C Simon F Maylin S Clinical evaluation of BioPlex 2200 HIV Ag-Ab an automa-ted sceening method providing discrete detection of HIV-1 p24 antigen HIV-1 antibody and HIV-2 antibody J Clin Mi-crobiol 2014 52103-107
26 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficien-cy virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
27 Smit PW Sollis KA Fiscus S Ford N Vitoria M Essajee S Barnett D Cheng B Crowe SM Denny T Landay A Ste-vens W Habiyambere V Perriens JH Peeling RW Systema-tic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis PLoS One 2014 9e86461
28 Stekler JD Swenson PD Coombs RW Dragavon J Tho-mas KK Brennan CA Devare SG Wood RW Golden MR HIV testing in a high-incidence population is antibody tes-ting alone good enough Clin Infect Dis 2009 49444-453
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30 WHOUNAIDS Technical Update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013 wwwunaidsorg
24
DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
PNT-VIH-1
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 1 de 4
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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plasmaacutetica del VIH
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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Diagnoacutestico seroloacutegico de la infeccioacuten por el ViH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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infeccioacuten por el VIH
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
25
DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica para la determinacioacuten de marcadores seroloacutegicos del VIH en muestras de suero mediante meacutetodos de cribado y confirmacioacuten Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de micro-biologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pacientes infectados por el VIH o enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las pruebas de determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH deben adaptarse a los objetivos que se persigan En este documento se denominan pruebas diagnoacutesticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona de acuerdo con los principios cliacutenicos del consentimiento informado Su utilidad deriva de su capacidad para detectar o descartar la infeccioacuten por el VIH Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad bioloacutegica o vigilancia epidemioloacutegica las estrategias de empleo difieren Las caracteriacutesticas operacionales de las mismas deben valorarse en funcioacuten del contexto de aplicacioacuten y en funcioacuten de los objetivos que se pretenden se estableceraacute la eleccioacuten de la teacutecnica apropiada
a Teacutecnicas de inmunoensayo para el cribado
bull Inmunoensayo de tercera generacioacuten Para detectar anticuerpos emplean como soporte peacuteptidos recom-binantessinteacuteticos del VIH-1 y VIH-2 y antiacutegenos del VIH-1 del grupo O
bull Inmunoensayo de cuarta generacioacuten Se emplean como soporte tanto peacuteptidos recombinantessinteacuteticos del VIH-1 (incluyendo el grupo O) como anticuerpos para detectar antiacutegeno p24 reducieacutendose el tiempo de deteccioacuten en el periacuteodo ventana
b Teacutecnicas de confirmacioacuten
bull Estas teacutecnicas han de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 Entre los maacutes usados estaacuten los diversos formatos de Western Blot (WB) que han ido apareciendo en el mercado y el inmunoensayo en liacutenea (LIA) Ambas teacutecnicas pueden llevar antiacutegenos de envoltura del VIH-2 para poder diagnosticarlo Sin embargo existen otros ensayos que son capaces de confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y el VIH-2 y que consiguen resultados positivos diacuteas o semanas antes que el WB
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
Todos los laboratorios que realicen diagnoacutestico seroloacutegico de anticuerpos frente al VIH deben respetar las normas de seguridad de nivel 2 Las muestras de origen humano se deben considerar y manipular como potencialmente infecciosas En todos los procesos llevados a cabo es necesario utilizar guantes y eliminar los residuos reactivos y muestras en contenedores de seguridad para su eliminacioacuten posterior siguiendo las normas de productos bioloacute-gicos infecciosos Se han desarrollado directrices de buenas praacutecticas de laboratorio y si se respetan se puede garantizar la seguridad y mantener al miacutenimo los accidentes de laboratorio
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La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
La muestra adecuada para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH es el suero Las condiciones para la para la recogida y el transporte de la muestra deben contemplar
bull Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500xg (generalmente equivale a 2000-2500 rpm) durante 10 minutosbull Se precisa de una correcta y minuciosa identificacioacuten de los pacientes y sus muestras comprobar el etiqueta-
do con sus volantes correspondientes y guardar la confidencialidad en todo el proceso hasta que la muestra llegue al laboratorio para su procesamiento Los laboratorios que reciben y almacenan gran cantidad de sue-ros deben mantener un sistema de recepcioacuten y registro de muestras controlado para evitar errores
bull Para su transporte las muestras se deben preparar y etiquetar de acuerdo con las normas vigentes en el transporte de sustancias infecciosas Se pueden enviar entre 2ordmC y 8ordmC refrigeradas con hielo o con nieve carboacutenica a una temperatura igual o inferior a -20ordmC
bull Para minimizar las contaminaciones microbianas que podriacutean alterar las muestras se recomienda no prolongar la conservacioacuten entre 2-8ordmC maacutes allaacute de 7 diacuteas Si se preveacute un periodo de almacenamiento maacutes prolongado es necesario la congelacioacuten a -20ordmC o -80ordmC Se recomienda no someter las muestras a muacuteltiples ciclos de congelacioacuten y descongelacioacuten
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de marcadores de infeccioacuten por el VIH que han sido aprobados por la OMS y la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las in-dicaciones que proporcionan las compantildeiacuteas fabricantes Las estrategias de cribado y confirmacioacuten aconsejan el seguimiento de protocolos que se pueden consultar en la versioacuten desarrollada en el documento cientiacutefico de este procedimiento Los ensayos de cribado identifican las muestras reactivas y deben tener una sensibilidad superior y los ensayos de confirmacioacuten permiten conocer si las muestras reactivas con un ensayo de cribado contienen anticuerpos especiacuteficos para el VIH-12 y deben tener una especificidad superior
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan en teacuterminos cualitativos de positivo o negativo Se recomienda disponer de una teacutecnica de cribado de anticuerpos frente al VIH y utilizar un meacutetodo de confirmacioacuten para confirmar y diferenciar anticuerpos del VIH-1 y VIH-2
Del conjunto de pruebas realizadas deberaacute resultar la emisioacuten de un diagnoacutestico claro y concluyente o bien la formulacioacuten de recomendaciones precisas para el seguimiento y diagnoacutestico definitivo
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infeccioacuten por el VIH
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9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDiagnoacutestico seroloacutegico de la
infeccioacuten por el VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Deteccioacuten de la carga viralplasmaacutetica del ViH
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plasmaacutetica del VIH
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
27
DOCUMENTO TEacuteCNICO
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiologiacutea
Las pruebas estaacuten basadas en distintos principios teacutecnicos que han ido evolucionando con el tiempo la experien-cia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales A pesar de los avances logrados en el desarrollo de las mismas se siguen produciendo casos de falsos positivos y con menor frecuencia de falsos negativos
Estos errores deben ser minimizados y son atribuibles en parte al progresivo crecimiento de la demanda analiacutetica en los aacutembitos comunitario y hospitalario y pueden provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y desconcierto en los profesionales responsables de la misma La adopcioacuten de protocolos viables adaptados a la realidad de cada laboratorio pueden minimizar los errores del procedimiento
11 limitaciones Del proceDimiento
Las limitaciones que se presentan con estas pruebas son similares a los de otras pruebas de diagnoacutestico seroloacute-gico aunque en este caso adquieren una importancia mayor por las posibles consecuencias y la trascendencia cliacutenica de la infeccioacuten
Desde el punto de vista seroloacutegico en la infeccioacuten por el VIH se producen cambios en la dinaacutemica de produccioacuten de anticuerpos desde el momento de la seroconversioacuten El periacuteodo ventana con las actuales teacutecnicas de inmu-noensayo de cuarta generacioacuten se acorta a aproximadamente dos semanas de duracioacuten En los estadiacuteos finales de la infeccioacuten pueden desaparecer los anticuerpos frente a algunas de las proteiacutenas estructurales internas del VIH (p17 p24 p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios de positividad en el WB a pesar de existir una infeccioacuten
12 bibliografIacutea
1 Clinical and Laboratory Standards Institute Criteria for laboratory testing and diagnosis of HIV Approved Guideline CLSI docu-ment M53-A Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute 2011
2 WHOUNAIDS technical update on HIV incidence assays for surveillance and epidemic monitoring 2013
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infeccioacuten por el VIH
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
28
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Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
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eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
29
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de la determinacioacuten de carga viral plasmaacutetica (CVP) del VIH-1 en muestras de sangre mediante amplificacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de microbiologiacutea cliacutenica que realicen seguimiento de pa-cientes infectados por el VIH o a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las actuales plataformas para la determinacioacuten de la CVP emplean PCR a tiempo real previa extraccioacuten del ARN del VIH por meacutetodos automatizados y posterior retrotranscripcioacuten a ADNc Asimismo realizan en paralelo una purificacioacuten y amplificacioacuten de un control interno que garantiza una cuantificacioacuten precisa
La teacutecnica de cuantificacioacuten consta de las siguientes fases
1 Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasma con EDTA Estos equipos incorporan meacutetodos de extraccioacuten automaacutetica del ARN
2 Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten Todos ellos realizan una retrotranscripcioacuten previa del ARN del VIH-1 a ADNc posteriormente se amplifica la diana con una PCR a tiempo real generaacutendose moleacuteculas fluo-rescentes que estaacuten ligadas a sondas oligonucleoacutetidas que se unen especiacuteficamente al producto amplificado Los primers empleados son especiacuteficos para una regioacuten altamente conservada del gen pol o gag Cuando la fluorescencia excede una sentildeal miacutenima en el ciclo umbral (Cycle threshold ndashCt-) el nuacutemero de ciclos de PCR que hayan transcurrido se usa para la cuantificacioacuten
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los sistemas diagnoacutesticos
4 mUestras
La muestra adecuada para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir de sangre anticoa-gulada con EDTA o citrato Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de las 6 horas siguientes a su recogida
bull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 12 mL de plasma a criotubos con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 oacute 4 dependiendo del volumen de muestra) Identificar correcta-mente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubos
bull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmC Mantener a -70ordmC para almacenamiento a largo plazo
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5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
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Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante
Se utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la determinacioacuten de la CVP del VIH-1 que han sido aprobadas por la UE para esta aplicacioacuten Recomendamos por tanto seguir el protocolo y recomendaciones que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viacuterico tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabri-cantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Muchas de estas teacutecnicas requieren un alto volumen de muestra de partida por lo que en caso de tener que reali-zar diluciones por disponer de muestra insuficiente se recomienda utilizar para ello suero fisioloacutegico esteacuteril o agua de biologiacutea molecular
Se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta realizacioacuten de la teacutecnica
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Los resultados se expresan como copiasmL Es recomendable ofrecer simultaacuteneamente el equivalente en logarit-mo decimal de la CVP por la frecuencia de recomendaciones que estaacuten basadas en esta escala
En cada tanda de reaccioacuten se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-miento de la teacutecnica y la ausencia de contaminaciones respectivamente
Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 7 diacuteas
En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacioacuten real y el liacutemite de sensibilidad de la teacutec-nica
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
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HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
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plasmaacutetica del VIH
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elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
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bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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31
DOCUMENTO TEacuteCNICO
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Estas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de Microbiolo-giacutea Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras
La exigencia tradicional de divisioacuten de aacutereas para las teacutecnicas de amplificacioacuten es mucho menos criacutetica para algu-nas de las teacutecnicas actuales fundamentalmente basadas en PCR en tiempo real ya que no es necesario manipu-lar el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplificacioacuten y deteccioacuten en tubo cerrado
11 limitaciones Del proceDimiento
En un paciente con infeccioacuten por el VIH diagnosticada por serologiacutea que estaacute sintomaacutetico o tiene las cifras de lin-focitos CD4 disminuidas y que no recibe tratamiento antirretroviral una CVP indetectable deberiacutea hacer sospechar una variante no detectada por la teacutecnica de VIH-1 o VIH-2
Se pueden producir interferencias durante el proceso en muestras con restos de partiacuteculas eritrocitos o coaacutegulos de fibrina
En situaciones como extracciones de neonatos en las que es imposible disponer de la cantidad de plasma es-tablecida por la teacutecnica se puede recurrir a procesar una cantidad menor con la consiguiente modificacioacuten del umbral de deteccioacuten por ejemplo si se procesan 200 μL en lugar de 1 mL y el resultado es negativo debemos interpretar lt 250 copiasmL en lugar de lt20 copiasmL De la misma manera se debe multiplicar cualquier resul-tado positivo por el factor de dilucioacuten 5 en este caso para normalizar la CVP a 1 mL
12 bibliografIacutea
1 Alvarez M Chueca N Guillot V Bernal M del C Garciacutea F Improving Clinical Laboratory Efficiency Introduction of Systems for the Diagnosis and Monitoring of HIV Infection Open Virol J 20126135-143
2 Documento de consenso de GeSIDAPlan Nacional sobre el Sida respecto al tratamiento antirretroviral en adultos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (Actualizacioacuten enero 2014) Panel de expertos de GeSIDA y Plan Nacional sobre el Sida Disponible en httpwwwgesida-seimcorgcontenidosguiasclinicas2014gesida-guiasclinicas-2014-tarpdf
3 Griffith BP Campbell S Caliendo AM Human Immunodeficiency Viruses En Versalovic J Carroll KC Funke G Jorgensen JH Landry ML Warnock DW (eds) Manual of Clinical Microbiology 10th edition Washington DC ASM Press 2011 pp 1302-1322
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
HospitalDeteccioacuten de la carga viral
plasmaacutetica del VIH
PNT-VIH-2
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
elaboraDo reVisaDo Y aprobaDo
Nombre Firma Fecha Nombre Firma Fecha
eDicioacuten fecHa alcance De las moDificaciones
01 Edicioacuten inicial
copia registraDa nordmasignaDa a
Este documento es propiedad del Servicio de Microbiologiacutea del HospitalCentrohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip La informacioacuten en eacutel contenida no podraacute reproducirse total ni parcialmente sin autorizacioacuten escrita del Responsa-ble de su elaboracioacuten Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios
PNT-VIH-3 secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la
deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
32
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deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
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Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
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aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
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Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
33
DOCUMENTO TEacuteCNICO
1 propoacutesito Y alcance
Definir la metodologiacutea baacutesica de las fases preanaliacuteticas y postanaliacuteticas para la determinacioacuten de resistencias a antirretrovirales y para la prediccioacuten del tropismo viral en muestras cliacutenicas mediante secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologiacutea Cliacutenica que realicen la deteccioacuten de resistencias a antirretrovirales mediante teacutecnicas genotiacutepicas y a aquellos que enviacuteen muestras a laboratorios de referencia
2 fUnDamento
Las teacutecnicas de secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos permiten conocer la secuencia de bases de los genes pol (proteasa integrasa y transcriptasa reversa) y env (gp41 y V3 de gp120) y ademaacutes localizar los cambios de ami-noaacutecidos relacionados con la resistencia a los faacutermacos antirretrovirales y la prediccioacuten del tropismo viral
En la teacutecnica de secuenciacioacuten el proceso completo consta de cuatro fases
bull Fase de extraccioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de muestras de plasmasuerobull Fase de retro-transcripcioacuten y amplificacioacuten El ARN liberado de las muestras es transcrito en cDNA y pos-
teriormente se amplifica mediante el uso de primers especiacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1
bull Fase de amplificacioacuten para deteccioacuten proviral El ADN proviral se amplifica mediante el uso de primers es-peciacuteficos de las regiones (genes) correspondientes del genoma del VIH-1 Este procedimiento se reserva para investigacioacuten en muestras cliacutenicas con cargas virales bajas o indetectables
bull Fase de secuenciacioacuten El producto amplificado se somete a una nueva amplificacioacuten con concentraciones limitantes de dideoxinucleoacutetidos (ddNTPs) marcados (secuenciacioacuten unidireccional) y con primers especiacuteficos (si estos son los que estaacuten marcados entonces secuenciacioacuten bidireccional)
bull Fase de revelado Mediante el empleo de un secuenciador automaacutetico los amplificados purificados se resuel-ven mediante electroforesis capilar o vertical obtenieacutendose un electroferograma con la secuencia de bases
Finalmente la secuencia de aacutecidos nucleicos se edita y se compara mediante el empleo de un software especiacutefico o de programas de alineamiento de secuencias con una secuencia de referencia y sin mutaciones
3 DocUmentos De consUlta
bull Procedimientos relacionados con la recepcioacuten y registro de muestrasbull Procedimientos relacionados con higiene y seguridad en el procesamientobull Manuales de instrucciones de los meacutetodos comerciales utilizados
4 mUestras
Las muestras adecuadas para el estudio genotiacutepico de resistencias son plasma o suero Las condiciones para la recogida y el transporte cuando sea necesario desde otros laboratorios al laboratorio de secuenciacioacuten son
bull Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm durante 10 minutosbull En condiciones aseacutepticas (se recomiendan pipetas Pasteur esteacuteriles) transferir 1 mL de plasma a criotubos
con tapoacuten de rosca de 2 mL de capacidad (3 o 4 dependiendo del volumen de muestra)
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Controlar las posibles contaminaciones entre muestras a la hora de la secuenciacioacuten mediante el empleo de alguna herramienta que permita alinear la secuencia en estudio con todas las que se hayan realizado en el laboratorio (fingerprinting) Diferencias entre secuencias por debajo de 20 bases son indicativas de una posible contaminacioacuten Este procedimiento permitiraacute ademaacutes establecer viacutenculos epidemioloacutegicos en la transmisioacuten de cepas entre distintos pacientes
bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
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- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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34
DOCUMENTO TEacuteCNICO
bull Identificar correctamente (iniciales del paciente referencia en origen y fecha de extraccioacuten) los criotubosbull Congelar inmediatamente a -70ordmC o en su defecto a -20ordmCbull Enviar al laboratorio de secuenciacioacuten dos aliacutecuotas de cada paciente junto al volante de peticioacuten El resto de
aliacutecuotas se conservan en el laboratorio de origenbull En el momento de la recogida por la empresa de transportes introducir dos aliacutecuotas de cada paciente en un
recipiente de seguridad bioloacutegica (SARSTEDT o similar) y este en un contenedor de poliestireno para enviacuteo refrigerado con hielo seco Precintar y enviar
bull Nota Debe efectuarse la separacioacuten del plasma en las 2-3 horas desde el momento de la extraccioacuten La muestra se puede enviar sin congelar siempre que la recepcioacuten en el laboratorio de secuenciacioacuten se vaya a realizar en el mismo diacutea de la extraccioacuten En caso contrario es necesario congelarla en el laboratorio de origen
5 reactiVos Y proDUctos
Se utilizaraacuten los reactivos controles y calibradores propios de cada determinacioacuten No se utilizaraacuten materiales de dudosa procedencia o conservacioacuten ni aquellos que hayan superado su fecha de caducidad
6 aparatos Y material
Deberaacuten utilizarse las plataformas adecuadas para cada teacutecnica siguiendo las indicaciones de cada fabricanteSe utilizaraacute tambieacuten material general de laboratorio tanto inventariable como fungible
7 proceDimiento
Existen diversos meacutetodos comerciales para la realizacioacuten de la teacutecnica que no se van a describir Tan solo reco-mendamos centildeirse estrictamente al protocolo que proporcionan los fabricantes Para la extraccioacuten del ARN viral tambieacuten se propone emplear alguno de los meacutetodos que los fabricantes recomiendan ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos
Ademaacutes existen meacutetodos caseros o in house para la secuenciacioacuten de la proteasa de la RT de la integrasa y para la determinacioacuten genotiacutepica del tropismo de VIH-1
En ambos casos y en especial cuando se empleen meacutetodos caseros se recomienda la suscripcioacuten a alguacuten pro-grama de control de calidad externo
8 obtencioacuten interpretacioacuten Y eXpresioacuten De resUltaDos
Para la obtencioacuten de resultados se hacen entre otras las siguientes recomendaciones
bull Se necesitan secuencias bidireccionales de las regiones genoacutemicas correspondientes donde se localizan las mutaciones asociadas a la resistencia antiviral (codones 10-94 de la proteasa 41-236 de la RT 66-263 de la integrasa 36-138 de gp41 y 1-35 de V3 en gp120)
bull Al editar la secuencia es necesario revisar al menos todos los codones de resistencia Es recomendable revi-sar tambieacuten todos los cambios con respecto a la cepa salvaje elegida y todas las posiciones en que existan diferencias entre la secuencia 5acute y la 3acute Prestar especial atencioacuten a las mezclas (heterocigotos) y valorarlas especialmente cuando se presenten en ambas direcciones
bull La calidad de la secuencia se puede determinar en programas de libre acceso en internet (por ejemplo httphivdbstanfordedu)
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bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
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10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
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Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
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- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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bull En el informe de resultados se debe proporcionar la lista de mutaciones asociadas a su correspondiente re-gioacuten y un informe comprensible de la resistencia esperada a los distintos antirretrovirales con indicacioacuten ex-presa de la fuente utilizada para la interpretacioacuten de las mutaciones de resistencia y su fecha de actualizacioacuten Para ello se debe utilizar un algoritmo de reciente actualizacioacuten En la prediccioacuten del tropismo viral se indicaraacute ademaacutes del mismo la posibilidad de uso de los antirretrovirales disponibles
bull Se recomienda no tener una demora en la emisioacuten de resultados superior a 15-20 diacuteas
9 responsabiliDaDes
Deben estar descritas en el manual general de organizacioacuten del laboratorio de Microbiologiacutea y en las fichas de des-cripcioacuten de los puestos de trabajo El procedimiento deberaacute llevarse a cabo por personal teacutecnico cualificado con un entrenamiento especiacutefico La supervisioacuten de la teacutecnica y de los resultados emitidos deberaacute realizarla el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologiacutea Molecular que los emite
10 anotaciones al proceDimiento
Todo el personal del laboratorio de Microbiologiacutea deberaacute conocer las normas generales de seguridad e higiene Es-tas recomendaciones deberaacuten estar recogidas en un documento establecido por el laboratorio de MicrobiologiacuteaPara la realizacioacuten de la teacutecnica que se describe se deben tener en cuenta diversos aspectos estructurales apli-cables en general a todas las teacutecnicas de amplificacioacuten Para la secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos en general se precisan al menos tres zonas o aacutereas diferentes dentro del laboratorio 1) La denominada ldquozona limpiardquo donde se prepararaacuten los reactivos 2) La zona para la preparacioacuten de la muestra (fase de extraccioacuten) y preparacioacuten de las mezclas de amplificacioacuten y de secuenciacioacuten 3) el aacuterea para el manejo del material amplificado yo secuencia-do (fase de deteccioacuten) En cada zona de trabajo debe existir un material (pipetas puntas batas de laboratorio marcadores etc) especiacutefico de cada zona Nunca se debe trasladar material entre zonas salvo el estrictamente necesario y siempre en direccioacuten 1 a 3 Como recomendacioacuten general deberaacuten evitarse en lo posible las mani-pulaciones innecesarias y extremarse las precauciones tanto en lo referente al manejo de las muestras como a la dispensacioacuten de los reactivos
11 limitaciones Del proceDimiento
La sensibilidad de la teacutecnica se ve disminuida en gran medida cuando se emplean muestras con carga viral lt500-1000 copiasmL Se pueden emplear meacutetodos de concentracioacuten del aacutecido nucleico en el plasma y entonces se consiguen amplificar muestras con lt500 copiasmL Para pacientes tratados que no consiguen mantener una respuesta viroloacutegica sostenida se puede utilizar la deteccioacuten proviral de resistencias
El objetivo de esta determinacioacuten es proporcionar una herramienta uacutetil al cliacutenico para disentildear un reacutegimen de tra-tamiento antirretroviral en este sentido hay que destacar que estos meacutetodos no detectan variantes minoritarias y que por lo tanto no aseguran el eacutexito de un antirretroviral sino que maacutes bien predicen el fracaso El disentildeo del nuevo reacutegimen mejora si la interpretacioacuten va acompantildeada del consejo de expertos o si se ha reali-zado con un sistema experto que haya sido validado cliacutenicamente
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
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Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 5 de 5
Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
-
- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
-
36
DOCUMENTO TEacuteCNICO
Servicio Unidad de Microbiologiacutea
Hospital
Secuenciacioacuten de aacutecidos nucleicos para la deteccioacuten de resistencias
a antirretrovirales y prediccioacuten del tropismo viral
PNT-VIH-3
Edicioacuten Nordm 01 Paacutegina 5 de 5
Estos meacutetodos no son vaacutelidos para nuevas drogas hasta que se disentildean los algoritmos de interpretacioacuten y se validan cliacutenicamente
12 bibliografIacutea
1 Garciacutea F Aguilera A Pruebas de resistencia En ldquoResistencia a los antirretrovirales 2005rdquo Ed Soriano V Publicaciones Pernmayer 2005
2 Kwok J Higiccediluchi R Avoiding false positives with PCR Nature 1989 339237-2383 Panel on Clinical Practices for treatment of HIV infection Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and
adolescents Disponible enhttpaidsinfonihgov Mayo 20144 Shafer RW Genotypic testing for human immunodefficiency virus type 1 drug resistance Clin Microbiol Rev 2002 15247-277
- IacuteNDICE
- 1 INTRODUCCION
- 2 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
-
- 21 RECOGIDA DE LA MUESTRA
- 22 TRANSPORTE Y CONSERVACIOacuteN DE LA MUESTRA
- 23 MANEJO DE LA MUESTRA EN SU RECEPCIOacuteN EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIacuteA
- 24 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
- 25 INFECCIOacuteN AGUDA
- 26 PRUEBAS RAacutePIDAS DE DIAGNOacuteSTICO
- 27 DETECCIOacuteN DE ANTIacuteGENO p24 DEL VIH
- 28 ENSAYOS CONFIRMATORIOS
- 29 NECESIDAD DE UN NUEVO ALGORIacuteTMO DIAGNOacuteSTICO
- 210 CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIOacuteN DE RESULTADOS
- 211 INFORME DE RESULTADOS
- 212 LA SEROLOGIA EN LA TRANSMISIOacuteN MADRE-HIJO Y EN LA PROFILAXIS POST-EXPOSICIOacuteN
-
- 3 DETERMINACIOacuteN DE CARGA VIRAL PLASMAacuteTICA (CVP) DEL VIH
-
- 31 TEacuteCNICAS DISPONIBLES
- 32 INDICACIONES
-
- 321 Monitorizacioacuten del tratamiento antirretroviral (TAR)
- 322 Valoracioacuten del riesgo de transmisioacuten
- 323 Diagnoacutestico de infeccioacuten aguda
- 324 Diagnoacutestico de la transmisioacuten materno-fetal
-
- 33 TIPOS DE MUESTRAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 34 COMUNICACIOacuteN DE RESULTADOS Y VARIABILIDAD
-
- 341 Respuesta al tratamiento y fracaso viroloacutegico
- 342 Factores que aumentan la CVP
- 343 Interpretacioacuten de viremias bajas
- 344 CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento
-
- 4 PRUEBAS PARA LA DETECCION DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL
-
- 41 TEacuteCNICAS GENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL GENOTIPO
- 42 TEacuteCNICAS FENOTIacutePICAS E INTERPRETACIOacuteN DEL FENOTIPO
- 43 PREDICCIOacuteN DEL FENOTIPO A PARTIR DEL GENOTIPO FENOTIPO VIRTUAL
- 44 TEacuteCNICAS PARA LA DETERMINACIOacuteN DEL TROPISMO VIRAL
-
- 441 Meacutetodos fenotiacutepicos
- 442 Meacutetodos genotiacutepicos
-
- 45 LIMITACIONES DE LOS TESTS DE RESISTENCIA
- 46 INDICACIONES
- 47 LOS ENSAYOS DE RESISTENCIA COMO HERRAMIENTA PARA EPIDEMIOLOGIacuteA MOLECULAR
-
- 5 PUNTOS CLAVE
-
- 51 DIAGNOacuteSTICO SEROLOacuteGICO
- 52 DETERMINACIOacuteN DE LA CARGA VIRAL
- 53 DETERMINACIOacuteN DE RESISTENCIAS
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- 6 BIBLIOGRAFIacuteA
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