sintesis

SINTESIS Y MADURACIÓNDEL

ARN

TRANSCRIPCION

Proceso mediante el cual se sintetizacontinuamente una cadena de ARN de manera complementaria y antiparalela a una de lascadenas - la cadena molde -, la cual escomplementaria a la cadena codificadora, portanto, la cadena de RNA tiene idénticasecuencia a la cadena codificadora.

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS

ARN polimerasa.• Núcleo

• Cataliza la

polimerización de NTPs

• Acción 5´- 3´

• No requiere cebador

• Subunidades: 2 α

1β, 1β´, 1ω y 1σ

• Se une a la hebra molde de - 40 a + 20

Subunidades ARN pol

Subunidad σ:

• Se une débilmente al ADN

• Reconoce el sitio de inicio. Promotores

• Dirige la polimerasa a los promotores

• Se separa después de sintetizados 10 nts

Elementos de la transcripción

Unidad de transcripción

Promotor + Secuencia + Secuencia codificadora terminadora

Monocistrónicas: contienen un solo gen (Eucariotas)Policistrónicas: contienen varios genes (Procariotas)

Promotores

Secuencia de ADN donde se une la ARN pol

para iniciar la transcripción.

Longitud: 6 nts

Footprinting del ADN

Etapas de la transcripción

• Reconocimiento del moldeunión ARNpol – ADNSeparación del ADNDesenrrollamiento

• Iniciación: Permanencia / separación del promotor

• Elongación: transcripción en gusano• Terminación: ruptura de enlaces de H.

Tra

nscr

ipci

ón m

edia

nte

AR

N p

olim

eras

a

• TerminaciónS

ecue

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de A

.

Control de la transcripción

• Interacción de proteínas con secuencias de ADN específicas

• Procariotas y eucariotas• Elementos de control de acción en cis

afectan la expresión de genes situados en la misma molécula

• Factores de acción en transgenes localizados en otro cromosoma

Operón LacControl negativo de la transcripción

Genes

Β galactosidasa, Permeasa, transacetilasa

Control positivo de la

transcripción• Represión por

catabolito• CAP: proteína

activadora del catabolismo

• Sitio de unión -60• CAP + sub α• Activación de

transcripción

Type of RNA synthesized RNA polymerase

Nuclear genes

mRNA II

tRNA III

rRNA

5.8S, 18S, 28S I

5S III

snRNA and scRNA II and IIIa

Mitochondrial genes Mitochondrialb

Chloroplast genes Chloroplastb a Some small nuclear (sn) and small cytoplasmic (sc) RNAs are transcribed by polymerase II and others by polymerase III.b The mitochondrial and chloroplast RNA polymerases are similar to bacterial enzymes.T

rans

crip

cion

en

euca

riot

as

ARN polimerasas

• Se componen de 8 a 14 subunidades cada una. Nueve conservadas, cinco relacionadas con las bacterianas

• Reconocen distintos promotores

• Transcriben diferentes genes

• Mecanismos transcripcionales conservados

ARN polimerasa II

Factores de transcripción:

Proteínas específicas para la iniciación

Factores de transcripción generales:

Implicados en la transcripción de los

promotores para Pol II

5% del genoma humano codifica para los

factores

Complejo polimerasa II

• Caja TATA: - 25• Requiere de 5 factores de

transcripción• Unión TFIID-TATA

TBP + TAFs (10 a 12)TFIIH:Helicasas (2) y Quinasa (1):fosforila la secuencia C-terminal dela polimerasa CTD (52) Tyr-Ser-ProThr-Ser-Pro-Ser libera y permite elreclutamiento de proteínas queinician la transcripción.Inr y DPE

• Segunda secuencia de interés: Inr (secuencia iniciadora) DPE: elemento promotor curso abajo -30

• Aunque TBP sólo reconoce a TATA, se acerca al sitio de iniciación para que la transcripción se efectúe.

Complejo proteico mediador:

• Solo en el interior celular• Permite que la polimerasa responda a los factores

de transcripción. • Asociadas al dominio C-terminal de la pol II,

cuando éste se fosforila, el complejo mediador se separa.

• Tras la fosforilación del CTD se unen factores de elongación y procesamiento.

Fig 6.14

Transcripción por pol I y pol III

Se necesita la TBPFactores de transcripción: UBF y SL1*

UBF: Factor de unión curso arribaSL1: Factor de selectividad 1

Complejo de iniciación

UBF: Factor de unión corriente arriba

SL1:Factor de selectividad 1

No hay caja TATA

Transcripción por polimerasa III

• Tres promotores; dos al interior de la secuencia• TFIIIA inicia ensamblaje, C, B y pol

snARN

• Contienen la secuencia TATA y un punto de unión o SNAP

• Reclutamiento de la ARN pol

• Inicio de la transcripción.

Fig. 6.16

REGULACIONEN

EUCARIOTAS

REGULACION

• Principalmente en la iniciación, aunque también en la elongación.

• Controlada por proteínas que se unen a secuencias reguladoras específicas y modulan la actividad de la ARN polimerasa.

• Las modificaciones en la estructura de la cromatina es importante para el control de la transcripción en eucariotas. Empaquetamiento

Secuencias de regulación en cis:promotores y amplificadores.

Identificación de lassecuencias reguladoras• Las secuencias de

regulación se unen a un gen reportero.

• La expresión del gen reportero en células transfectadas determina la actividad de las secuencias reguladoras.

Localización de secuencias reguladoras. Clase II

• Corriente arriba de la caja TATA: CCAAT y caja GC

• Las proteínas reguladoras se unen a estas secuencias y estimulan la transcripción

Promotor del gen de la timidina quinasa.

Estimuladores o enhancers

• Identificadas en 1981 por Walter Schaffner en SV40

• Estimulan la transcripción de los promotores independientemente de su distancia y orientación.

AC

CIO

N D

E L

OS

E

NH

AN

CE

RS

Formación de bucles

Se forman por la interacción entre los factores detranscripción unidos a intensificadores y promotores o aARN polimerasa.

Unión de proteínas a los estimuladores:

• Control de la expresión génica durante el desarrollo y diferenciación.*

• Respuesta celular a hormonas y factores de crecimiento.*

Los amplificadores contienen múltiples secuencias que

ligan diferentes proteínas de regulación transcripcional.

Estimulador de la inmunoglobulina

La actividad de cualquier estimulador es específica para

el promotor de su gen diana.

Poseen elementos de regulación negativa y positiva.

Aisladores o insulators: Dividen los cromosomas en

dominios e impiden que los enhancers actúen en

dominios adyacentes-

PROTEINAS DE REGULACION TRANSCRIPCIONAL

An

ális

is d

e p

rote

ínas

un

idas

a s

ecu

enci

ases

pec

ífic

as d

e A

DN

.M

ovil

idad

ele

ctro

foré

tica

Factores de transcripción y sitios de unión

Factor de transcripción Sitio de unión consenso

Proteína de especificidad 1 (Sp1)

GGCGG

Proteína de unión al potenciador C/EBP

CCAAT

Proteína activadora 1 (AP1) TGACTCA

Proteínas de unión a octámeros (oct-1 y oct-2)

ATGCAAAT

Proteínas de unión a caja E CANNTG

Cromatografía de afinidad por ADNPurificación de Sp1

• Se adhieren oligos a agarosa

• Proteínas celulares con Sp1

Estructura y función de los activadores de la transcripción

Presentan 2 dominios: uno al ADN y otro a algún componente de la maquinaria transcripcional.

Caracterización molecularDominios de unión al ADN

• Dominios dedos de zinc son bucles en los que una hélice α y una lámina β engloban un ión zinc por residuos decisteína e histidina. TFIIIA, SpI, receptores de hormonas esteroideas

Dominio: hélice – giro – hélice

Tres o cuatro regiones helicoidales, una de lashélices tiene mayor contacto con el ADN, lasdemás estabilizan la unión. CAP

Proteínas con dominios homeo

• Dominio cremallera de leucinas

Dos cadenas polipeptídicas distintas, unidas por residuos de

leucina. El sitio de unión al ADN presenta lisina y arginina

Dominio: hélice – bucle – hélice

Unidas por dos regiones helicoidales separadas porun bucle.

Caracterización molecularDominios activadores de TFs

• Acídicos: ricos en aspartato, glutamato

• Ricos en residuos de prolina o glutamina

Mecanismos de estimulación de la

transcripción

• Interactúan con las proteínas del mediador y TF generales

• Interactúan con coactivadores que modifican la estructura de la cromatina

Represores eucarióticos

• Se unen a secuencias específicas de ADN e inhiben la transcripción

• Interfieren con la unión de otros factores transcripcionales al ADN

Relación entre estructura cromatínica y transcripción

• Tanto activadores como represores regulan el proceso interactuando con otros componentes de la maquinaria o induciendo cambios en la estructura de la cromatina.

• El ADN se encuentra con histonas - Nucleosomas -.• Modificaciones sobre la cromatina a transcribir:

1. Asociación con proteínas HMGN2. Modificaciones de histonas3. Reorganización de nucleosomas

1. Proteínas HMGNSu sitio de unión solapa al de la histona H1Se estimula la transcripción evitando la condensación provocada por la interacción de histonas 1.

2. Acetilación de histonasLas histonas H2A, H2B, H3 y H4 tienen dos dominios: uno para las interacciones con otras histonas y el enrollamiento del ADN alrededor del núcleoOtro dominio extremo amino-terminal que se extiende por fuera del nucleosoma- rico en lisina.

Acetilación de histonas

HAT: Histona transacetilasaHDAC: Histona deacetilasa

Metilación y fosforilación de histonasLas histonas se pueden modificar además por:

• Fosforilación de residuos de serina

• Metilación de residuos de arginina y lisina

• Adición de ubiquitina a residuos de lisina.

“código de histonas¨

3. Factores remodeladores del nucleosoma

Son complejos proteicosque alteran la estructurade los nucleosomas sinretirar ni modificar a lashistonasLa ARN pol se apoya enlas HMGN y las histonaacetiltransferasas para lapolimerización

Regulación por ARNs no codificantes

• Inhiben la traducción por ARN de interferencia (ARNi) el cual corta el ARNm mediante una ribonucleasa Fig 3.41

• Inhiben la transcripción induciendo la condensación por modificaciones a las histonas.

Inactivación del cromosoma X por un ARN no codificante transcrito por el gen Xist el que induce la metilación de la lisina 9 del extremo C terminal de la H3 induciendo la condensación a heterocromatina

Metilación del ADN• Los residuos de

citosina pueden metilarse en el C-5

• Islas CpG

• Se inhibe por la acción de MeCP2 que se une al ADN metilado e inhibe la transcripción

• Forma complejos con la HDAC

Metilación del ADNImprinting genómico

• Controla la expresión de algunos genes implicados en el desarrollo embrionario de mamíferos.

• Los genes impresos se expresan dependiendo si se heredan del padre o de la madre

• Gen H19 o Síndrome de Beckwith Weidemann*

Impresión genómica

Mantenimiento de los patrones de metilación

MADURACION Y

RENOVACION

DEL

ARN

• La transcripción produce ARN no funcional a excepción del ARNm de los procariotas, los demás tanto en procariotas como en eucariotas deben pasar por una serie de procesos para ser funcionales.

Maduración de los ARNr

La subunidad 5S es codificado por un gen independiente

Maduración de los ARNtIndividualmente o con pre-tRNA

Corte en el extremo 5´por una ribozima ARNasaP

Corte en el extremo 3´por una ARNasa proteica

Adición de la secuenciaterminal CCA

Modificación de bases

• Modificación de bases

Maduración de ARNm en eucariotas

• En eucariotas el ARNm debe ser modificado en el núcleo para ser transportado al citoplasma.

• La maduración del pre-ARNm incluye:

modificación de extremos

eliminación de intrones

• Transcripción y maduración son simultáneas

• Está implicado el CTD de la ARN pol II .

Primer paso: Adición de la cap de 7-metilguanosina

Enzimas adheridas a CTD-P (20-30 nts)

Estabiliza y alinea (5´)

Segundo paso: Corte y Poliadenilación (3´)

Las secuencias de poliadenilación son reconocidas por una endonucleasa y una poli.A polimerasa asociadas al CTDLas colas poliA regulan la traducción y estabiliza al ARNm

Tercer paso: Corte y empalme o splicing

Dos pasos:Corte en 5´y enlace entre el extremo 5´ del intrón y el grupo OH 2´de la A.Corte en 3´y unión simultánea de exones

Esplicesomas

• Compuestos por: proteínas y

ARNsn (U1, U2, U4, U5 y U6). (50 – 200 nts)

• Proteínas (6-10) + Us Ribonucleoproteínas nucleares (RNPsn)

• U4 y U6 forman una única RNPsn.

Ensamblaje del esplicesoma

Unión al sitio de corte 5´

AUTOEMPALME

• En Tetrahymena, mitocondrias, cloroplastos y bacterias.

Factores de corte y empalmeEn los pre-ARNm de mamíferos

Dirigen al esplicesoma al punto de corte y

empalme correcto.

Corte y empalme alternativo

Determinación del sexo en Drosophila.

Corrección del ARN

Procesos que alteran las secuencias codificadoras

de proteínas de algunos ARNm

Desaminación de citosina a uridina

Adenosina a inosina

Fig. 6.50

Apolipoproteína B 100 y 48

Degradación de ARN

• Degradación de intrones

• Decaiminento del ARNm mediado sin sentido

• Fig. 6.51