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SINTESIS Y MADURACIÓN DEL ARN

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Page 1: Sintesis

SINTESIS Y MADURACIÓNDEL

ARN

Page 2: Sintesis

TRANSCRIPCION

Proceso mediante el cual se sintetizacontinuamente una cadena de ARN de manera complementaria y antiparalela a una de lascadenas - la cadena molde -, la cual escomplementaria a la cadena codificadora, portanto, la cadena de RNA tiene idénticasecuencia a la cadena codificadora.

Page 3: Sintesis

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS

ARN polimerasa.• Núcleo

• Cataliza la

polimerización de NTPs

• Acción 5´- 3´

• No requiere cebador

• Subunidades: 2 α

1β, 1β´, 1ω y 1σ

• Se une a la hebra molde de - 40 a + 20

Page 4: Sintesis

Subunidades ARN pol

Subunidad σ:

• Se une débilmente al ADN

• Reconoce el sitio de inicio. Promotores

• Dirige la polimerasa a los promotores

• Se separa después de sintetizados 10 nts

Page 5: Sintesis

Elementos de la transcripción

Unidad de transcripción

Promotor + Secuencia + Secuencia codificadora terminadora

Monocistrónicas: contienen un solo gen (Eucariotas)Policistrónicas: contienen varios genes (Procariotas)

Page 6: Sintesis

Promotores

Secuencia de ADN donde se une la ARN pol

para iniciar la transcripción.

Longitud: 6 nts

Page 7: Sintesis

Footprinting del ADN

Page 8: Sintesis

Etapas de la transcripción

• Reconocimiento del moldeunión ARNpol – ADNSeparación del ADNDesenrrollamiento

• Iniciación: Permanencia / separación del promotor

• Elongación: transcripción en gusano• Terminación: ruptura de enlaces de H.

Page 9: Sintesis

Tra

nscr

ipci

ón m

edia

nte

AR

N p

olim

eras

a

Page 10: Sintesis

• TerminaciónS

ecue

ncia

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nG

C s

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e 4

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esid

uos

de A

.

Page 11: Sintesis

Control de la transcripción

• Interacción de proteínas con secuencias de ADN específicas

• Procariotas y eucariotas• Elementos de control de acción en cis

afectan la expresión de genes situados en la misma molécula

• Factores de acción en transgenes localizados en otro cromosoma

Page 12: Sintesis

Operón LacControl negativo de la transcripción

Genes

Β galactosidasa, Permeasa, transacetilasa

Page 13: Sintesis

Control positivo de la

transcripción• Represión por

catabolito• CAP: proteína

activadora del catabolismo

• Sitio de unión -60• CAP + sub α• Activación de

transcripción

Page 14: Sintesis

Type of RNA synthesized RNA polymerase

Nuclear genes

mRNA II

tRNA III

rRNA

5.8S, 18S, 28S I

5S III

snRNA and scRNA II and IIIa

Mitochondrial genes Mitochondrialb

Chloroplast genes Chloroplastb a Some small nuclear (sn) and small cytoplasmic (sc) RNAs are transcribed by polymerase II and others by polymerase III.b The mitochondrial and chloroplast RNA polymerases are similar to bacterial enzymes.T

rans

crip

cion

en

euca

riot

as

Page 15: Sintesis

ARN polimerasas

• Se componen de 8 a 14 subunidades cada una. Nueve conservadas, cinco relacionadas con las bacterianas

• Reconocen distintos promotores

• Transcriben diferentes genes

• Mecanismos transcripcionales conservados

Page 16: Sintesis

ARN polimerasa II

Factores de transcripción:

Proteínas específicas para la iniciación

Factores de transcripción generales:

Implicados en la transcripción de los

promotores para Pol II

5% del genoma humano codifica para los

factores

Page 17: Sintesis

Complejo polimerasa II

• Caja TATA: - 25• Requiere de 5 factores de

transcripción• Unión TFIID-TATA

TBP + TAFs (10 a 12)TFIIH:Helicasas (2) y Quinasa (1):fosforila la secuencia C-terminal dela polimerasa CTD (52) Tyr-Ser-ProThr-Ser-Pro-Ser libera y permite elreclutamiento de proteínas queinician la transcripción.Inr y DPE

Page 18: Sintesis

• Segunda secuencia de interés: Inr (secuencia iniciadora) DPE: elemento promotor curso abajo -30

• Aunque TBP sólo reconoce a TATA, se acerca al sitio de iniciación para que la transcripción se efectúe.

Page 19: Sintesis

Complejo proteico mediador:

• Solo en el interior celular• Permite que la polimerasa responda a los factores

de transcripción. • Asociadas al dominio C-terminal de la pol II,

cuando éste se fosforila, el complejo mediador se separa.

• Tras la fosforilación del CTD se unen factores de elongación y procesamiento.

Fig 6.14

Page 20: Sintesis

Transcripción por pol I y pol III

Se necesita la TBPFactores de transcripción: UBF y SL1*

UBF: Factor de unión curso arribaSL1: Factor de selectividad 1

Page 21: Sintesis

Complejo de iniciación

UBF: Factor de unión corriente arriba

SL1:Factor de selectividad 1

No hay caja TATA

Page 22: Sintesis

Transcripción por polimerasa III

• Tres promotores; dos al interior de la secuencia• TFIIIA inicia ensamblaje, C, B y pol

Page 23: Sintesis

snARN

• Contienen la secuencia TATA y un punto de unión o SNAP

• Reclutamiento de la ARN pol

• Inicio de la transcripción.

Fig. 6.16

Page 24: Sintesis

REGULACIONEN

EUCARIOTAS

Page 25: Sintesis

REGULACION

• Principalmente en la iniciación, aunque también en la elongación.

• Controlada por proteínas que se unen a secuencias reguladoras específicas y modulan la actividad de la ARN polimerasa.

• Las modificaciones en la estructura de la cromatina es importante para el control de la transcripción en eucariotas. Empaquetamiento

Page 26: Sintesis

Secuencias de regulación en cis:promotores y amplificadores.

Identificación de lassecuencias reguladoras• Las secuencias de

regulación se unen a un gen reportero.

• La expresión del gen reportero en células transfectadas determina la actividad de las secuencias reguladoras.

Page 27: Sintesis

Localización de secuencias reguladoras. Clase II

• Corriente arriba de la caja TATA: CCAAT y caja GC

• Las proteínas reguladoras se unen a estas secuencias y estimulan la transcripción

Promotor del gen de la timidina quinasa.

Page 28: Sintesis

Estimuladores o enhancers

• Identificadas en 1981 por Walter Schaffner en SV40

• Estimulan la transcripción de los promotores independientemente de su distancia y orientación.

Page 29: Sintesis

AC

CIO

N D

E L

OS

E

NH

AN

CE

RS

Page 30: Sintesis

Formación de bucles

Se forman por la interacción entre los factores detranscripción unidos a intensificadores y promotores o aARN polimerasa.

Page 31: Sintesis

Unión de proteínas a los estimuladores:

• Control de la expresión génica durante el desarrollo y diferenciación.*

• Respuesta celular a hormonas y factores de crecimiento.*

Page 32: Sintesis

Los amplificadores contienen múltiples secuencias que

ligan diferentes proteínas de regulación transcripcional.

Estimulador de la inmunoglobulina

La actividad de cualquier estimulador es específica para

el promotor de su gen diana.

Poseen elementos de regulación negativa y positiva.

Aisladores o insulators: Dividen los cromosomas en

dominios e impiden que los enhancers actúen en

dominios adyacentes-

Page 33: Sintesis

PROTEINAS DE REGULACION TRANSCRIPCIONAL

An

ális

is d

e p

rote

ínas

un

idas

a s

ecu

enci

ases

pec

ífic

as d

e A

DN

.M

ovil

idad

ele

ctro

foré

tica

Page 34: Sintesis

Factores de transcripción y sitios de unión

Factor de transcripción Sitio de unión consenso

Proteína de especificidad 1 (Sp1)

GGCGG

Proteína de unión al potenciador C/EBP

CCAAT

Proteína activadora 1 (AP1) TGACTCA

Proteínas de unión a octámeros (oct-1 y oct-2)

ATGCAAAT

Proteínas de unión a caja E CANNTG

Page 35: Sintesis

Cromatografía de afinidad por ADNPurificación de Sp1

• Se adhieren oligos a agarosa

• Proteínas celulares con Sp1

Page 36: Sintesis

Estructura y función de los activadores de la transcripción

Presentan 2 dominios: uno al ADN y otro a algún componente de la maquinaria transcripcional.

Page 37: Sintesis

Caracterización molecularDominios de unión al ADN

• Dominios dedos de zinc son bucles en los que una hélice α y una lámina β engloban un ión zinc por residuos decisteína e histidina. TFIIIA, SpI, receptores de hormonas esteroideas

Page 38: Sintesis

Dominio: hélice – giro – hélice

Tres o cuatro regiones helicoidales, una de lashélices tiene mayor contacto con el ADN, lasdemás estabilizan la unión. CAP

Page 39: Sintesis

Proteínas con dominios homeo

Page 40: Sintesis

• Dominio cremallera de leucinas

Dos cadenas polipeptídicas distintas, unidas por residuos de

leucina. El sitio de unión al ADN presenta lisina y arginina

Page 41: Sintesis

Dominio: hélice – bucle – hélice

Unidas por dos regiones helicoidales separadas porun bucle.

Page 42: Sintesis

Caracterización molecularDominios activadores de TFs

• Acídicos: ricos en aspartato, glutamato

• Ricos en residuos de prolina o glutamina

Mecanismos de estimulación de la

transcripción

• Interactúan con las proteínas del mediador y TF generales

• Interactúan con coactivadores que modifican la estructura de la cromatina

Page 43: Sintesis

Represores eucarióticos

• Se unen a secuencias específicas de ADN e inhiben la transcripción

Page 44: Sintesis

• Interfieren con la unión de otros factores transcripcionales al ADN

Page 45: Sintesis

Relación entre estructura cromatínica y transcripción

• Tanto activadores como represores regulan el proceso interactuando con otros componentes de la maquinaria o induciendo cambios en la estructura de la cromatina.

• El ADN se encuentra con histonas - Nucleosomas -.• Modificaciones sobre la cromatina a transcribir:

1. Asociación con proteínas HMGN2. Modificaciones de histonas3. Reorganización de nucleosomas

Page 46: Sintesis

1. Proteínas HMGNSu sitio de unión solapa al de la histona H1Se estimula la transcripción evitando la condensación provocada por la interacción de histonas 1.

2. Acetilación de histonasLas histonas H2A, H2B, H3 y H4 tienen dos dominios: uno para las interacciones con otras histonas y el enrollamiento del ADN alrededor del núcleoOtro dominio extremo amino-terminal que se extiende por fuera del nucleosoma- rico en lisina.

Page 47: Sintesis

Acetilación de histonas

HAT: Histona transacetilasaHDAC: Histona deacetilasa

Page 48: Sintesis

Metilación y fosforilación de histonasLas histonas se pueden modificar además por:

• Fosforilación de residuos de serina

• Metilación de residuos de arginina y lisina

• Adición de ubiquitina a residuos de lisina.

“código de histonas¨

Page 49: Sintesis

3. Factores remodeladores del nucleosoma

Son complejos proteicosque alteran la estructurade los nucleosomas sinretirar ni modificar a lashistonasLa ARN pol se apoya enlas HMGN y las histonaacetiltransferasas para lapolimerización

Page 50: Sintesis

Regulación por ARNs no codificantes

• Inhiben la traducción por ARN de interferencia (ARNi) el cual corta el ARNm mediante una ribonucleasa Fig 3.41

• Inhiben la transcripción induciendo la condensación por modificaciones a las histonas.

Inactivación del cromosoma X por un ARN no codificante transcrito por el gen Xist el que induce la metilación de la lisina 9 del extremo C terminal de la H3 induciendo la condensación a heterocromatina

Page 51: Sintesis

Metilación del ADN• Los residuos de

citosina pueden metilarse en el C-5

• Islas CpG

• Se inhibe por la acción de MeCP2 que se une al ADN metilado e inhibe la transcripción

• Forma complejos con la HDAC

Page 52: Sintesis

Metilación del ADNImprinting genómico

• Controla la expresión de algunos genes implicados en el desarrollo embrionario de mamíferos.

• Los genes impresos se expresan dependiendo si se heredan del padre o de la madre

• Gen H19 o Síndrome de Beckwith Weidemann*

Page 53: Sintesis

Impresión genómica

Mantenimiento de los patrones de metilación

Page 54: Sintesis

MADURACION Y

RENOVACION

DEL

ARN

Page 55: Sintesis

• La transcripción produce ARN no funcional a excepción del ARNm de los procariotas, los demás tanto en procariotas como en eucariotas deben pasar por una serie de procesos para ser funcionales.

Page 56: Sintesis

Maduración de los ARNr

La subunidad 5S es codificado por un gen independiente

Page 57: Sintesis

Maduración de los ARNtIndividualmente o con pre-tRNA

Corte en el extremo 5´por una ribozima ARNasaP

Corte en el extremo 3´por una ARNasa proteica

Adición de la secuenciaterminal CCA

Modificación de bases

Page 58: Sintesis

• Modificación de bases

Page 59: Sintesis

Maduración de ARNm en eucariotas

• En eucariotas el ARNm debe ser modificado en el núcleo para ser transportado al citoplasma.

• La maduración del pre-ARNm incluye:

modificación de extremos

eliminación de intrones

• Transcripción y maduración son simultáneas

• Está implicado el CTD de la ARN pol II .

Page 60: Sintesis

Primer paso: Adición de la cap de 7-metilguanosina

Enzimas adheridas a CTD-P (20-30 nts)

Estabiliza y alinea (5´)

Page 61: Sintesis

Segundo paso: Corte y Poliadenilación (3´)

Las secuencias de poliadenilación son reconocidas por una endonucleasa y una poli.A polimerasa asociadas al CTDLas colas poliA regulan la traducción y estabiliza al ARNm

Page 62: Sintesis

Tercer paso: Corte y empalme o splicing

Dos pasos:Corte en 5´y enlace entre el extremo 5´ del intrón y el grupo OH 2´de la A.Corte en 3´y unión simultánea de exones

Page 63: Sintesis

Esplicesomas

• Compuestos por: proteínas y

ARNsn (U1, U2, U4, U5 y U6). (50 – 200 nts)

• Proteínas (6-10) + Us Ribonucleoproteínas nucleares (RNPsn)

• U4 y U6 forman una única RNPsn.

Page 64: Sintesis

Ensamblaje del esplicesoma

Unión al sitio de corte 5´

Page 65: Sintesis

AUTOEMPALME

• En Tetrahymena, mitocondrias, cloroplastos y bacterias.

Page 66: Sintesis

Factores de corte y empalmeEn los pre-ARNm de mamíferos

Dirigen al esplicesoma al punto de corte y

empalme correcto.

Page 67: Sintesis

Corte y empalme alternativo

Determinación del sexo en Drosophila.

Page 68: Sintesis

Corrección del ARN

Procesos que alteran las secuencias codificadoras

de proteínas de algunos ARNm

Desaminación de citosina a uridina

Adenosina a inosina

Fig. 6.50

Apolipoproteína B 100 y 48

Page 69: Sintesis

Degradación de ARN

• Degradación de intrones

• Decaiminento del ARNm mediado sin sentido

• Fig. 6.51