obtención de insulina humana mediante un cultivo de raíces
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
“Expresión de insulina y proinsulina humana en raíces
transformadas de Brassica oleracea var itálica (Brócoli)”
T E S I S
Que presenta
BERENICE GARCÍA REYES
Para obtener el grado de
DOCTORA EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. Graciano Calva Calva
Ciudad de México, Septiembre, 2018
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
ii
DECLARACIÓN
“Expresión de insulina y proinsulina humana en raíces transformadas de
Brassica oleracea var itálica (Brócoli)”†
Yo certifico que el contenido de esta tesis es el resultado de mi propio trabajo, excepto
donde se dan las debidas referencias a otros autores como parte complementaria de una
parte del trabajo. Esta tesis no ha sido presentada previamente en ninguna forma en este
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados ni en ninguna otra institución de
enseñanza.
BERENICE GARCÍA REYES
† El presente trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional
(CINVESTAV-IPN), bajo la dirección del Dr. Graciano Calva Calva, con el apoyo del
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) para una Beca de Doctorado
(203726) y del proyecto CONACyT 47678-Z.
M. en C. Berenice García Reyes
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iii
Comité Tutorial
Director de Tesis:
Dr. Graciano Calva Calva. CINVESTAV-DBB
Asesora:
Dra. Emma Gloria Ramos Ramírez CINVESTAV-DBB
Asesora:
Dra. Ma. Del Carmen Montes Horcasitas CINVESTAV-DBB
Asesor:
Dr. Fernando José Esparza García CINVESTAV-DBB
Asesor:
Dr. Armando Ariza Castolo CINVESTAV-DQ
Asesora:
Dra. María Luisa Villarreal Ortega CIB UAEM
M. en C. Berenice García Reyes
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iv
A MI HIJO
Miguel Ángel
Por ser la luz de mi vida………
A MIS PADRES
Alejandra y Ángel
Por que sin ellos, sería nada……..
Y A MI ABUELITA CONCHITA
Por que su amor inundó mi vida en todo momento………
M. en C. Berenice García Reyes
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v
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Graciano Calva Calva por su dirección y asesoría en el
desarrollo de este trabajo
A los asesores; Dra. Emma Gloria Ramos Ramírez, Dra. Ma. Del
Carmen Montes Horcasitas, Dr. Armando Ariza Castolo y Dr. Fernando José
Esparza García por sus oportunas y valiosas aportaciones para el desarrollo
de este trabajo.
Al Q.B.P. Octavio Gómez Guzmán por sus invaluables enseñanzas
A mis compañeros del laboratorio 19
A Dios por cada día concedido
M. en C. Berenice García Reyes
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vi
RESUMEN En este trabajo se presentan los resultados de la expresión y purificación de insulina
y proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica oleracea var.
italica con el cDNA del gen Ins que codifica para el péptido de la insulina humana.
El vector pDNR-Lib-Ins que lleva el cDNA del gen Ins y el gen de resistencia a
cloranfenicol se caracterizó por cortes con enzimas de restricción que flanqueaban el
cDNA. Varias regiones fueron amplificadas mediante primers denominados "preproinsulina
y proinsulina", específicamente diseñados para agregar las secuencias de restricción de Nco
I y Bgl II al cDNA del gen Ins. Por otro lado, el vector binario pCAMBIA 1105.1 fue
recuperado de una cepa de E. coli y después cortado con las enzimas de restricción
correspondientes para producir extremos cohesivo entre el vector y los fragmentos de
cDNA de la preproinsulina y proinsulina. Los productos de ligación (preproinsulina-
pCAMBIA 1105.1 y proinsulina-pCAMBIA 1105.1) se transfirieron a E. coli DH5α por
electroporación. La cepa de E. coli transformada con éxito fueron cultivadas en medios de
cultivo con estreptomicina para la selección de las transformantes adecuadas. Las
construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr, se confirmaron por PCR y se clonaron en
Agrobacterium rhizogenes LBA 9402 para la inducción de líneas raíces de brócoli
transformadas con el respectivo fragmento del gen Ins. Por otro lado, semillas de brócoli
fueron germinadas en medio B5 semisólido. Plántulas mostrando gran número de raíces se
utilizaron para establecer cultivos de raíces transformadas en medio líquido. Para la
inducción de raíces pilosas, varias plantas de 1-2 semanas de edad fueron infectadas con las
cepas Agrobacterium rhizogenes, LBA9402, pC1105.1 por punción y llevando las
construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr. Las raíces surgiendo del punto de punción se
propagaron en medio semisólido SH. Las líneas de raíces propagadas se utilizaron para
establecer cultivos en medio SH en presencia de Higromicina y para probar la actividad β-
glucuronidasa. Se establecieron tres cepas de raíces transformadas con la construcción
pCpINS-bgr para el estudio de la expresión de la proteína correspondiente.
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vii
ABSTRACT In this work the results for the expression and purification of the human insulin and
the proinsulin from hairy root cultures of Brassica oleracea var. italica (Broccoli), which
has been considered as a system model for the expression of some heterologous proteins
such as the human growth hormone and the HPV L1 protein, are presented.
The pDNR-Lib-Ins vector carrying the Ins cDNA and the chloramphenicol
resistance gene was restricted with enzymes flanking the cDNA. Several regions were
amplified using primers named ―preproinsulin and proinsulin‖ specifically designed to add
the restriction sequences of Nco I and Bgl II to the Ins cDNA. On the other hand, the binary
vector pCAMBIA 1105.1 was recovered from a strain of E. coli and cut with the
corresponding restriction enzymes to produce complementary ends between the vector and
the amplified preproinsulin and proinsulin cDNA. The ligation products (preproinsulin-
pCAMBIA 1105.1 and proinsulin-pCAMBIA 1105.1) were then cloned in E. coli DH5α by
electroporation. The E. coli strain successfully transformed were grown in culture media
added with streptomycin for selection. The constructs pCppINS-bgr and pCpINS-bgr, once
confirmed by PCR, were cloned in Agrobacterium rhizogenes for induction of hairy roots
of Broccoli transformed with the Ins cDNA gene. On the other hand seeds of Broccoli were
germinated in semisolid B5 mineral medium, and some seedlings showing great number of
roots were used to establish cultures of untransformed roots in liquid medium. For the hairy
roots induction, several 1-2 weeks old seedlings were infected by puncturing with the
Agrobacterium rhizogenes, LBA9402, pC1105.1, pCppINS-bgr and pCpINS-bgr strains.
From the puncture site hairy roots emerged and were propagated in semisolid SH medium.
The propagated tissue was used to establish cultures in liquid SH medium in presence of
hygromycin and test the β-glucuronidase activity. Three strains of hairy roots useful to
study the corresponding protein were established in liquid culture with the construct
pCpINS-bgr.
M. en C. Berenice García Reyes
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viii
Tabla de Contenido
i
RESUMEN ....................................................................................................................... vi
ABSTRACT ..................................................................................................................... vii
1 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1
2 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 3
2.1 Insulina ................................................................................................................ 3
2.1.1 Características generales proteína-hormona ................................................... 3
2.1.2 Biosíntesis y modo de acción ........................................................................ 5
2.1.3 El receptor de insulina ................................................................................... 8
2.2 Diabetes ............................................................................................................. 11
2.2.1 Características generales ............................................................................. 11
2.2.2 Incidencia en la población ........................................................................... 12
2.3 Métodos de producción de insulina..................................................................... 16
2.3.1 Métodos tradicionales ................................................................................. 17
2.3.2 Métodos biotecnológicos ............................................................................. 18
2.4 Cultivo de raíces transformadas como modelo de producción de compuestos
biológicamente activos ................................................................................................. 22
2.4.1 Medio de cultivo ......................................................................................... 23
2.4.2 Reguladores del crecimiento vegetal ........................................................... 24
2.5 Brassica oleracea var. italica (Brócoli) como modelo de expresión ...................... 27
3 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 31
4 HIPÓTESIS .............................................................................................................. 32
5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 32
5.1 GENERAL ......................................................................................................... 32
5.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 32
6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ........................................................................... 33
7 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 34
7.1 Material Biológico ............................................................................................. 34
7.1.1 Cepas bacterianas ........................................................................................ 34
7.1.2 Material Vegetal .......................................................................................... 34
7.2 Material para experimentos de Biología Molecular ............................................. 34
7.3 Reactivos generales, medios de cultivo y kits ..................................................... 35
7.4 Equipos .............................................................................................................. 36
7.5 Inducción de raíces transformadas ...................................................................... 36
7.6 Experimentos con explantes ............................................................................... 37
7.7 Determinación de la transformación por GUS .................................................... 38
7.8 Estudios para evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de
explantes de brócoli ...................................................................................................... 38
7.9 Cinéticas de crecimiento a nivel de matraz ......................................................... 39
7.10 Investigación de la presencia del cDNA en el DNA genómico del tejido vegetal 40
7.11 Extracción y cuantificación de proteína total soluble .......................................... 41
7.12 Inmunoensayo de ELISA para cuantificación de proteína ................................... 41
7.13 Ensayos de electroforesis (PAGE) ...................................................................... 41
7.14 Concentración de proteína en extractos proteicos................................................ 42
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7.15 Purificación de las proteínas heterólogas ............................................................ 42
7.16 Western Blot para proteínas purificadas por FPLC ............................................. 43
8 RESULTADOS ........................................................................................................ 45
8.1 Efecto de reguladores de crecimiento sobre diferenciación de explantes y
formación de raíces....................................................................................................... 45
8.1.1 Explantes de raíz ......................................................................................... 45
8.1.2 Explantes de hipocotilo ............................................................................... 49
8.1.3 Explantes de hoja ........................................................................................ 52
8.2 Cinético crecimiento y formación de proteína ..................................................... 54
8.2.1 Crecimiento................................................................................................. 54
8.2.2 Variación en la acumulación de proteína total soluble (PTS) ....................... 56
8.2.3 Variación en la proteína liberada el medio de cultivo ................................... 57
8.3 Establecimiento de nuevo protocolo para inducción de raíces transformadas ...... 58
8.4 Extracción y cuantificación de proteína .............................................................. 62
8.4.1 Por método de Bradford .............................................................................. 62
8.4.2 Por método de ELISA ................................................................................. 64
8.5 Purificación de la proteína heteróloga ................................................................. 65
8.5.1 Perfil proteico mediante electroforesis en gel de poliacrilamida ................... 65
8.5.2 Fraccionamiento, concentración y desalado de extractos proteicos .............. 67
8.5.3 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR POR FPLC .......... 70
9 DISCUSIÓN GENERAL .......................................................................................... 74
10 CONCLUSIONES .................................................................................................... 76
11 RECOMENDACIONES PARA INVESTIGACIONES FUTURAS .......................... 78
12 PRESENTACIONES EN CONGRESOS .................................................................. 79
13 ARTÍCULOS ........................................................................................................... 80
TITULO ........................................................................................................................... 80
REVISTA .......................................................................................................................... 80
AÑO ................................................................................................................................. 80
―Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica
(broccoli)‖ ........................................................................................................................ 80
CENIC Ciencias Biológicas.............................................................................................. 80
Vol. 41, 2010.................................................................................................................... 80
Issn: 0253-5688 ................................................................................................................ 80
2010 ................................................................................................................................. 80
―Cultivos de Raíces de Brassica oleracea var italica (Brócoli) transformadas con el cDNA
del Gen de la Preproinsulina Humana‖ ............................................................................. 80
XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, VII Congreso Internacional de
Ingeniería Bioquímica, VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero (México). 28, 29 y 30 de marzo 2012. Abstract
BML510GRA20120131 ................................................................................................... 80
. ........................................................................................................................................ 80
2012 ................................................................................................................................. 80
―Purificación de proinsulina a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica
oleracea var italica (Brócoli)‖ .......................................................................................... 80
2014 ................................................................................................................................. 80
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―Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces
transformadas de Brassica Oleracea Var (brócoli)‖ .......................................................... 80
CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, pp. 434-439, 2015 ................................................. 80
Issn: 2221-2450 ................................................................................................................ 80
2015 ................................................................................................................................. 80
14 REFERENCIAS ....................................................................................................... 81
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Indice de Figuras
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de la insulina humana . ........................................................... 3 Figura 2. Estructura tridimensional de la insulina humana.. ............................................................ 4 Figura 3. Procesamiento postraduccional de insulina. ..................................................................... 7 Figura 4. Arriba, insulina acoplada al receptor de insulina. ............................................................. 9 Figura 5. Complejidad de señales por la acción de insulina acoplada al IR. ................................... 10 Figura 6. Distribución geográfica de la prevalencia de diabetes en el año 2017. ............................ 13 Figura 7. Defunciones en México en el 2015. ............................................................................... 15 Figura 8. Entrada a la empresa Genentech. ................................................................................... 19 Figura 9. Ternera Patagonia. ........................................................................................................ 20 Figura 10. Lechuga, tabaco y semilla de cártamo. ......................................................................... 22 Figura 11.Brócoli (Brassica oleracea var. italica). ......................................................................... 28 Figura 12. Matriz de 25 tratamientospara evaluar el efecto de los reguladores............................... 47 Figura 13. Matriz de 25 tratamientos, en la segunda semana. ........................................................ 48 Figura 14. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 48 Figura 16. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 50 Figura 17. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 51 Figura 18. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3. .......................................................... 52 Figura 19. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 ........................................................... 53 Figura 20. Cinética de crecimiento de raíces de brócoli no transformadas. .................................... 55 Figura 21. Proteína total soluble por gramo de peso fresco ........................................................... 56 Figura 22. Cinética de proteína total soluble presente en el medio de cultivo. ............................... 57 Figura 23. Cultivos de raíces de brócoli no transformadas (A) y transformadas ............................. 58 Figura 24. Nuevo protocolo para la inducción de raíces transformadas . ....................................... 59 Figura 25. Reacción de PCR utilizando los primers para la amplificación . ................................. 62 Figura 26. Curva tipo de método Bradfford. ................................................................................. 63 Figura 27. Curva tipo de prueba de ELISA para INS humana ....................................................... 64 Figura 28. Condiciones de SDS-PAGE para observar el perfil proteico......................................... 66 Figura 29. Fraccionamiento con tubos Amicon. ............................................................................ 67 Figura 30. Fraccionamiento con tubos Amicon de 10 y 3 kDa ...................................................... 68 Figura 31. Calibración de pesos moleculares para la columna de filtración en gel ......................... 71 Figura 32. Perfil de elución de la muestra 30-3 kDa p14 y propuesta final ................................... 72 Figura 33. Fracciones de proteínas obtenidas por exclusión molecular mediante FPLC ................. 72
Indice de Tablas Tabla 1. Incidencia de diabetes en el mundo y proyección al 2040 ................................................ 12 Tabla 2. Diferencias en la secuencia de aminoácidos de insulinas de mamíferos ........................... 18 Tabla 3. Efecto de los reguladores de crecimiento sobre la diferenciación de tejido ...................... 39 Tabla 4.Tratamientos del diseño experimental para evaluar el efecto ............................................ 46 Tabla 5. Factor de elongación de raíces en cultivo in vitro ............................................................ 60 Tabla 6. Rendimiento y pureza de DNA genómico de raíces ......................................................... 61 Tabla 7. Rendimiento de proteína en cada línea de cultivo establecida .......................................... 63 Tabla 8. Fracciones obtenidas de la línea p14 .............................................................................. 69 Tabla 9. Marcadores de peso molecular utilizados para FPLC ...................................................... 70
1 INTRODUCCIÓN La proinsulina es el precursor natural de la insulina y se ha investigado como un
neuroprotector y para el tratamiento de la retinitis pigmentaria, que actúa sobre
degeneración de los fotorreceptores, la conectividad sináptica y la actividad funcional de la
retina. La preproinsulina es el precursor de la proinsulina y es un polipéptido de 110
aminoácidos con peso de 12 kDa que se produce en las células β de los islotes de
Langerhans en el páncreas como resultado del proceso de transcripción de la región
codificante del DNA del gen de la insulina (Cuadro 1). y Está constituido de cuatro partes:
una secuencia señal de 24 aminoácido y la molécula de proinsulina de 86 aminoácidos de la
cadena B (30 aa), péptido C (34 aa) y la -cadena A (21 aa). La insulina, por otra parte, es
una proteína de actividad hormonal cuya función principal es regular los niveles de glucosa
en la sangre (Malgor and Valsecia 2000; IDF 2010). La deficiencia en su modo de acción
produce el padecimiento conocido como diabetes (Shepherd and Khan 1999; Malgor and
Valsecia 2000; IDF 2010), la cual está reportada como primera causa de muerte en México
(IDF 2017). Su biosíntesis está descrita desde 2 precursores, preproinsulina y proinsulina,
anteriormente estos precursores únicamente estaban descritos como pro hormonas, pero en
la última década se ha confirmado la participación de proinsulina en procesos de desarrollo
y regeneración de tejido en el tratamiento de retinosis pigmentosa. La proinsulina e insulina
humana recombinante se ha expresado en diversos organismos, incluyendo bacterias,
levadura, hongos, células y órganos de animales y plantas transgénicas (Nykiforuk, Boothe
et al. 2006). No obstante que su producción comercial se ha limitado a microorganismos
como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, los sistemas basados en plantas ofrecen
varias ventajas respecto a producción, bioseguridad y economía (Deckers, Moloney et al.
1999). Debido a ello, se ha propuesto como alternativa de producción el uso de plantas
transgénicas o sus cultivos de células, tejidos y órganos, biotecnologías que desde hace
tiempo representan una opción real y económicamente viable (Deckers et al., 1999, Li et
al., 2006, Tzfira y Citovsky 2006). Estas tecnologías, tanto de células en suspensión como
cultivos de órganos, como el de raíces transformadas, pueden establecerse a nivel de
biorreactores o usarse para regenerar plantas transgénicas productoras de proteínas
terapéuticas con aplicaciones biotecnológicas (Carvalho et al., 1997, Bais et al, 2001, Kim
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et al., 2002b, Choi et al., 2006, Wilhelmson et al., 2006). En este trabajo se presentan los
resultados sobre la expresión de la proinsulina e insulina humana en cultivos de raíces
transgénicas con el objetivo de coadyuvar a la creciente demanda de estas proteínas debida
al aumento de la población que presenta problemas de diabetes. Como modelo de expresión
se utilizó Brassica oleracea var. italica debido a la disponibilidad de la metodología para
su transformación y su alta capacidad natural de acumular proteína (Cardoza and Stewart
2004). Como antecedente directo del presente trabajo se debe mencionar que en el proyecto
de Maestría se propuso una metodología para establecer cultivos de raíces de brócoli
transformados con los fragmentos prepro- y pro- insulina. En continuación, en este trabajo
se estudió la capacidad de expresión y producción de la proinsulina e insulina humana en
dichos cultivos en respuesta a la composición del medio de cultivo con el fin de proponer
alternativas de producción de estas proteínas usando como plataforma cultivos de raíces a
nivel laboratorio.
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2 ANTECEDENTES
2.1 Insulina
2.1.1 Características generales proteína-hormona
La insulina es un polipéptido con actividad hormonal formado por 51 residuos de
aminoácidos (Figura 1). Fue la primera estructura primaria de proteína que se determinó, la
primera proteína sintetizada y la primera obtenida por DNA recombinante al final de los
70`s (Bliss 1982, Shah et al., 1997). Su peso molecular es de aproximadamente 6 kDa,
dependiendo de la especie de la cual se obtenga (5.8 kDa para la humana) y está compuesta
por dos cadenas de aminoácidos (A y B) unidas por puentes disulfuro. La cadena A tiene 21
aminoácidos, y la cadena B 30 (Bell, Swain et al. 1979). Están unidas entre sí por 2 puentes
disulfuro se ubican entre los aminoácidos A-7/ B-7, y A-20/ B-19 (Tager and Steiner 1974).
Además la cadena A, tiene también un puente disulfuro interno entre los aminoácidos A-6/
A-11 (Chan, Keim et al., 1976; Lomedico, Chan et al., 1977; Shields and Blobel 1977). La
integridad tridimensional de la molécula es indispensable para ejercer sus acciones
farmacológicas. Las cadenas A o B, separadas luego de la destrucción de los puentes
disulfuro, carecen completamente de acción fisiológica (Malgor and Valsecia 2000). La
secuencia de amino ácidos de la insulina humana indicada en la Figura 1 fue determinada
por D. S. H. W. Nicol y L. F. Smith en 1960 (Nicol and Smith 1960) en base a la secuencia
de otras insulinas de seis especies reportadas anteriormente, encontrando que las
variaciones en las secuencias de estas, con la humana, son muy pocas.
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de la insulina humana (Nicol and Smith 1960).
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La estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de varias especies de insulina ha
sido estudiada desde 1969 (Adams 1969, Vinther 2012). Hay una serie muy amplia de
reportes, tanto de su forma nativa como de diversas mutantes que han sido obtenidas y
estudiadas para dilucidar su función específica. La cadena A (Figura 2), posee en su
estructura secundaria 2 alfa hélices (H1 y H2), así como un puente disulfuro intramolecular
entre aminoácidos de la misma cadena A. Dos puentes disulfuro, indicados en color
amarillo en la Figura 2, unen la cadena A con la B, la cual posee una alfa hélice (H1) y una
hoja beta, de manera que al acoplar ambas cadenas, se puede apreciar la estructura terciaria,
conocida como forma T. Sin embargo, cuando la hélice H1 de la cadena B va del
aminoácido B1 al B22 es conocida como forma R.
Esta hormona normalmente se encuentra en el torrente sanguíneo en forma dimérica
y monomérica, que es su forma de actuar biológicamente (Adams 1969), pero también se le
puede encontrar en forma de dímeros (por interacciones hidrofóbicas entre alfa hélices de
las cadenas B) y hexámeros (por interacciones con iones Zinc y Calcio).
Figura 2. Estructura tridimensional de la insulina humana. Arriba-izquierda estructura secundaria de la cadena A. Abajo izquierda Estructura secundaria de la cadena B. Derecha estructura terciaria de la insulina
humana, en color rojo se aprecia la cadena B, en color morado la cadena A (Adams et al., 1969).
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2.1.2 Biosíntesis y modo de acción
El gen que codifica para la insulina humana fue secuenciado en 1980 (Bell, Picket
et al., 1980). Se encuentra localizado en el extremo distal del brazo corto del cromosoma 11
(Harper, Ullrich et al. 1981). Al realizar el proceso de transcripción de la región codificante
del DNA da como resultada un mRNA maduro que no necesita de corte y empalme, es
decir, es la secuencia que da lugar a la molécula de cDNA (DNA complementario). Cuando
ese mRNA es traducido por los ribosomas adheridos al retículo endoplásmico se obtiene
una secuencia de aminoácidos denominada preproinsulina (Cuadro 1), la cual tiene un peso
de 12 kDa y consta de cuatro péptidos (Bell, Swain et al. 1979). En color amarillo se
muestra la secuencia que codifica para un péptido señal D de translocación a retículo
endoplásmico. En color gris se marca la secuencia de un péptido C que junto con las
cadenas A y B dan lugar a la proinsulina que es la molécula precursora de la insulina
conformada por la unión de las cadenas A y B después de removerse C.
Cuadro 1. Secuencia de aminoácidos de los cuatro péptidos de la preproinsulina
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERG
FFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS
LYQLENYCN
* Péptido señal D. Utilizado para la traslocación del péptido desde el citoplasma
al lumen del retículo endoplásmico rugoso a través del traslocón Sec 61 del retículo
endoplásmico rugoso en las células β del páncreas.
* Péptido de la cadena B de 31 aminoácidos. Cadena B de la insulina.
* Péptido C. Cadena removida por modificaciones postraduccionales para dar
lugar a las cadenas A y B unidas por un puente disulfuro. La longitud y secuencia de
esta cadena es muy variada entre especies. Va de 26 a 31 residuos de aminoácidos.
* Cadena A de 20 aminoácidos.
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Una vez que es translocado el péptido preproinsulina de 12 kDa al lumen del
retículo endoplásmico rugoso el péptido señal D es removido por una peptidasa (Figura 3)
localizada en ese sitio y degradado rápidamente en las células β (Steiner, Dochcrty et al.,
1984; Schwartz 1990). El péptido resultante, denominado proinsulina, con un peso de 9
kDa contiene las cadenas A, B y el péptido C, es entonces translocado al aparato de Golgi
para su procesamiento postraduccional (Figura 3a). La proinsulina, aún en estado lineal, es
plegada formado alfa hélices en las cadenas A y B que al mismo tiempo son orientadas para
la formación intramolecular de dos puentes disulfuro en la cadena B y uno en la cadena A,
dando lugar a la estructura terciaria nativa de la proinsulina (Orci, Ravazzola et al., 1986;
Orci, Ravazzola et al., 1987). Esta molécula es transportada al aparato de Golgi, donde es
empaquetada junto con iones Zn+2
y Ca+2
en vesículas de secreción y transformada a
insulina nativa mediante la remoción del péptido C por la acción de enzimas proteolíticas:
las prohormonas convertasas PC1 y PC2 así como una exoproteasa carboxipeptidasa E
(Hutton 1994). La acción de dichas enzimas se ve favorecida por la formación de dímeros
de proinsulina debida a interacciones entre los sitos hidrofóbicos de las cadenas B y
posteriormente con los iones Zn+2
y Ca+2
para formar tetrámeros por unión de dos dímeros
y hexámeros por unión de tres dímeros (Figura 3b). Esta forma hexamérica
(Zn2+
)2(Ca2+
)(Proin)6 es una especie muy estable que deja expuesto al péptido C de cada
monómero de proinsulina facilitando así su escisión para dar como resultado el péptido C
libre y la especie (Zn2+
)2(Ca2+
)(In)6 que es un hexámero de insulina (Figura 3b). Este
hexámero es inactivo y puede formar cristales. Es la forma en que se almacena la insulina
en las células. Así, el proceso de procesamiento postraduccional empieza en el retículo
endoplásmico, continúa en la región cis del aparato de Golgi y finaliza hasta las vesícula de
secreción en la región trans del mismo en las células beta localizadas en los islotes de
Langerhans del páncreas en donde se almacena en vesículas hasta su secreción cuando lo
requiere el organismo (Moore, Walker et al., 1983).
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Figura 3. Procesamiento postraduccional de insulina. A) acción de enzimas proteolíticas en sitios específicos
de la proinsulina para dar lugar a la insulina y el péptido C libre. B) Formación de los dímeros, tetrámeros y
hexámeros de la insulina por la acción de iones Zn+2, Ca+2 y regiones hidrófobas de la cadena B.
PROINSULINA Cadena B
Cadena A
Péptido C
INSULINA
Péptido C
Monómero
Dímero
Tetrámero
Dímero
PC1 PC2
cpE
Hexámero
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Los monómeros activos de insulina son la clave en el control del metabolismo
intermediario (Peter, Shepherd et al., 1999). Tiene un profundo efecto sobre el metabolismo
de los carbohidratos (glucosa) y lípidos. También significativa influencia en el
metabolismo proteico y mineral. La insulina estimula el hígado para acumulación de
glucosa en forma de glucógeno. Los desajustes en su acción tienen amplios y devastadores
efectos sobre órganos y tejidos. En su ausencia, varios tipos de células del cuerpo se tornan
incapaces de captar glucosa y comienzan a usar fuentes alternativas de energía como los
ácidos grasos. También, cesa la síntesis del glucógeno en el hígado.
2.1.3 El receptor de insulina
Los receptores de otras hormonas proteicas y los receptores para insulina están en la
membrana plasmática (Malgor and Valsecia 2000). El receptor para insulina es una
glucoproteína transmembrana de cuatro subunidades. Tiene dos subunidades alfa y dos
subunidades beta unidas por uniones disulfuro (Figura 4). Las cadenas alfa son
enteramente extracelulares mientras que las beta son extracelulares, transcelulares
(membrana) e intracelulares. La insulina se une a la porción N-terminal de la subunidad
alfa y al hacerlo ocasiona un cambio conformacional de la subunidad beta, cambio que
estimula la actividad cinasa del receptor.
El receptor es una tirosinocinasa. En otras palabras, funciona como una enzima que
transfiere grupos fosfato desde el ATP hacia los residuos tirosina en las proteínas blanco
intracelulares. La unión de la insulina a las subunidades, causa que las subunidades beta se
fosforilen a sí mismas (autofosforilación en 6 residuos de tirosina), activando de éste modo
la actividad catalítica del receptor.
El receptor activado (IR-insulina) fosforila un número de proteínas intracelulares
que alteran la actividad, generando respuestas biológicas en las vías del metabolismo
celular. Estas respuestas biológicas o cascada de señales que actúan en los diversos eventos
celulares, es tan compleja como se muestra en la Figura 5.
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Figura 4. Arriba, insulina acoplada al receptor de insulina.
Abajo, fosforilación del receptor de insulina y desencadenamiento de señales.
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Figura 5. Complejidad de señales por la acción de insulina acoplada al IR.
De lo anterior, un déficit de insulina, bien porque se secrete poco (células β
alteradas) o por una respuesta baja de las células blanco (IR), suprime el efecto
hipoglucemiante. Como consecuencia, aparece la diabetes mellitus. Así, la diabetes puede
producirse por 3 causas principales:
1. Disminución de la insulina plasmática
2. Mutaciones que inactivan el receptor de insulina
3. Fallos en las vías de señalización intracelular (disminución del efecto biológico)
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2.2 Diabetes
2.2.1 Características generales
La diabetes es una enfermedad crónica, de etiología aún no claramente conocida,
generalmente hereditaria, caracterizada por una predisposición genética recesiva, y
consiste, en esencia, en una alteración global del metabolismo, especialmente demostrable a
nivel del metabolismo de carbohidratos, debido primariamente a una deficiencia absoluta o
relativa de insulina (Shepherd and Khan 1999; Malgor and Valsecia 2000). Se caracteriza
por la existencia de hiperglucemia y glucosuria, y en su evolución provoca importantes
alteraciones del metabolismo de las proteínas, lípidos y electrolitos.
Es una afección crónica y para toda la vida que exige un monitoreo y control
riguroso (Malgor and Valsecia 2000). De no controlarse adecuadamente, puede ocasionar
altos niveles de azúcar en sangre. Éstos van asociados a largo plazo a lesiones del
organismo y al fallo de varios órganos y tejidos. Las complicaciones pueden ser:
Enfermedad cardiovascular, que afecta al corazón y vasos sanguíneos y puede llegar
a causar complicaciones letales, como enfermedad coronaria cardiaca que
provocaría infarto de miocardio y derrames cerebrales
Enfermedad renal o nefropatía diabética, que puede llegar a desencadenar una
insuficiencia renal total y la necesidad de diálisis o transplante de riñón
Enfermedad nerviosa o neuropatía diabética, que puede acabar por generar la
ulceración y amputación de los pies y las extremidades inferiores
Enfermedad visual o retinopatía diabética, caracterizada por lesiones de la retina del
ojo, que puede generar pérdida de visión
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2.2.2 Incidencia en la población
La incidencia poblacional de diabetes, es trascendental a nivel mundial y nacional.
Es por eso que un gran número de organizaciones y grupos de apoyo han sido creados
alrededor del mundo para propagar información y métodos de tratamiento (IDF 2007)
2.2.2.1 Nivel mundial
De acuerdo con la Federación Internacional de Diabetes (Tabla 1), más de 425
millones de personas en el mundo viven con diabetes. Aun con iniciativas conjuntas para
combatir la enfermedad, se estima que llegarán a 629 millones en 2040 (Tabla 1). El 20 de
diciembre de 2006, la Asamblea General de las Naciones Unidas aprobó la Resolución
61/225 (IDF 2007) que reconoce la diabetes como ―enfermedad crónica, debilitante y
costosa que tiene graves complicaciones, conlleva grandes riesgos para las familias, los
países y el mundo entero‖. Es la primera vez que se reconoce que una enfermedad no
contagiosa representa una grave amenaza para la salud mundial, de igual forma que las
epidemias de enfermedades infecciosas como la malaria, la tuberculosis y el SIDA.
Tabla 1. Incidencia de diabetes en el mundo y proyección al 2040
POBLACIÓN 2010 2017 2040
Población total en el mundo (mil millones) 7.0 7.5 9.5
Adultos de 29-79 años (mil millones) 4.3 4.8 6.4
Personas con diabetes entre 29-79 años (millones) 285 425 629
Prevalencia mundial de diabetes en personas entre 29-79 años (%) 6.6 8.8 9.9
Tomada de: Internacional Diabetes Federation (IDF 2017).
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2.2.2.2 Nivel nacional
México se encuentra entre los países con una prevalencia de diabetes estimada para
el año 2030 mayor al 12 % (Olaiz, Aguilar et al., 2007). Esto es, se encuentra entre los
países con mayor incidencia (Figura 6). Desde 1940 la diabetes ya se encontraba dentro de
las primeras 20 causas de mortalidad en México con una tasa de 4.2 por 100 000 habitantes.
Pese a ello, se le consideraba una enfermedad poco frecuente (1% de la población adulta).
Sin embargo, las consecuencias de la enfermedad crecieron a partir de 1970, cuando ocupó
el 15º lugar como causa de muerte. Diez años después ocupó el noveno lugar y para 1990
alcanzó el cuarto lugar como causa de mortalidad general (Salud 1995).
Figura 6. Distribución geográfica de la prevalencia de diabetes en el año 2017.
A partir del 2000 en México, la diabetes es la primera causa de muerte en mujeres y
la segunda en hombres, después de la cardiopatía isquémica, enfermedad resultante muchas
veces de la diabetes (Salud 2002). Contrario a lo observado con otras afecciones, como la
cirrosis hepática, la tasa de mortalidad por diabetes mellitus aumentó desde el año 2000 al
2003. En 2003, la diabetes representó 12.6% de las muertes ocurridas en el país y la edad
promedio al morir fue de 66 años. También genera un considerable efecto en los sistemas
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de salud, dado que fue la undécima causa de ingreso a hospitales de la Secretaría de Salud
durante el año 2000, sólo superada por factores de ingreso relacionados con embarazo,
accidentes, problemas perinatales y algunas de las infecciones o procedimientos quirúrgicos
más comunes (Salud 2002).
Asimismo, los periodos de hospitalización (6.1 días contra 3.5 días en personas con
y sin diabetes) y la elevada letalidad de la enfermedad elevan el costo de su atención.
Además, la diabetes fue la causa más frecuente de ceguera, insuficiencia renal terminal,
amputaciones no traumáticas e incapacidad prematura en México (Salud 2001). Como
causa de morbilidad, la diabetes mellitus tipo 2 produjo 287180 casos nuevos en el año
2000, ocupando el décimo segundo lugar dentro de las veinte principales causas de
enfermedad en el país (Salud 2003). Las cifras preliminares del INEGI publicadas en 2015
respaldan los reportes de las instituciones de salud pública en el país, teniendo a la diabetes
mellitus como la primera causa de muerte en México (Figura 7), con un 15% que se
traduce a 85 mil mexicanos (IDF 2017).
Los costos derivados para la atención de los pacientes diabéticos en los ámbitos
ambulatorio y hospitalario junto con la pérdida de productividad de la población afectada,
coloca a la diabetes mellitus dentro de las enfermedades de mayor costo social y carga
financiera para las instituciones de salud México. El tratamiento de las personas con
diabetes a base de terapia con insulina da por ende un enorme mercado. Tomando como
base un tratamiento estándar de 50 Unidades de Insulina por día (1500 U al mes), en
estados unidos, para el año 1996, a un precio de $18.10 U.S. dlls por vial de 10 ml (1000
U) , se generarían $330 U.S. dlls anuales ($ 6,105 pesos hoy en día) (Stern and Levy 1996).
Utilizando la misma base de cálculo, Kanakis y colaboradores reportan que para el año
2002 e insulinas de acción rápida (obtenidas de manera heterologa) un intervalo de $720 -
$1,164 U.S. dlls anuales ($ 13,320 - $ 21,534 pesos hoy en día) dependiendo de la
variedad de producto que se utiliza (Kanakis, Watts et al., 2002).
Entonces, se puede estimar que de acuerdo a la prevalencia pronosticada para el año
2040, para poder suplir la demanda de la insulina de los 629 millones de personas con
diabetes, el mercado anual mínimo estaría oscilando en aproximadamente $315 mil
millones de dólares. Para finales del año 2017 las tres compañías farmacéuticas líderes en
la producción de insulina son Novo con un 47%, 12% Aventis y 10% Lilly del mercado
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global, y reportaron un crecimiento del 24 %, 100 % y 200% respectivamente, para sus
ventas de insulina comparados con el año 2016, así como un aumento los precios de venta.
Con lo anterior queda establecida la importancia que tiene la producción de insulina
para el tratamiento de la diabetes mellitus, puesto que es necesario mejorar todas las
técnicas existentes y crear otras nuevas, que lleven la insulina en sus diferentes
presentaciones al mercado, así como la reducción de los costos de producción el cual
repercute en el costo de venta al público y así hacerla accesible a una mayor cantidad
población que padece esta enfermedad.
Figura 7. Defunciones en México en el 2015 (INEGI 2017).
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2.3 Métodos de producción de insulina
A través del tiempo la producción de insulina ha atravesado por diversas facetas que
van desde la extracción de tejido pancreático animal y síntesis o semisíntesis química hasta
la tecnología del DNA recombinante en sistemas procariontes, en animales y en vegetales.
Originalmente el método clásico de obtención era mediante la extracción directa a partir de
mamíferos; específicamente de ganado porcino y bovino (Bliss 1982), lo cual tenía grandes
implicaciones en cuanto a metodología, costos y sobre la actividad terapéutica de la
hormona. Sin embargo, investigaciones realizadas en las últimas décadas para conocer y
aplicar proteínas terapéuticas para el tratamiento de variadas afecciones han creado una
revolución en el campo de la biotecnología utilizando las técnicas del DNA recombinante,
con las cuales la mayoría de los genes pueden ser expresados en múltiples organismos, ya
sea microbianos, animales o vegetales.
El mayor problema de las biotecnologías basadas en DNA recombinante es
determinar cuál plataforma de expresión ofrece mayores ventajas respecto a seguridad,
producto biológicamente activo y costos de su producción (Meena and Harish 2001). Como
se ilustrará en las siguientes secciones, el uso de microorganismos permite producciones a
grandes escalas pero frecuentemente tiene la desventaja de dar productos que difieren
notablemente de los productos nativos y requieren por tanto de procesamientos posteriores
que en la mayoría de los casos iguala o supera en costo total de producción los sistemas
animales (Meena and Harish 2001). Los sistemas de células animales para expresar genes
de mamífero tienen la ventaja de formar productos idénticos a los de origen natural, no
obstante el cultivo de estas células solo se puede llevar a escalas limitadas de producción y
generalmente es muy costoso. De igual manera la utilización de animales transgénicos
como modelo de expresión de estos genes posea tanto la misma ventaja como el mismo
inconveniente en costos de mantenimiento (Meena and Harish 2001).
Los sistemas vegetales pueden ser atractivos y reales porque los costos de producción
pueden ser relativamente bajos, por ejemplo para el cultivo de las plantas transgénicas, las
cuales en algunos casos pueden utilizase directamente con fines terapéuticos al ingerirlas,
como en el caso de las denominadas vacunas comestibles. Además, la producción pueda
ser escalada a los niveles necesarios según la demanda del mercado. Además, al igual que
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los sistemas microbianos se pueden cultivar sus células, tejidos u órganos en biorreactores
de diferentes niveles (Meena and Harish 2001). En el caso de la insulina se podrían
establecer procesos de células, tejidos y órganos vegetales o la producción de plantas
transgénicas.
A continuación se detalla un poco más los métodos más utilizados en la producción
de insulina.
2.3.1 Métodos tradicionales
En enero de 1922 (en la Universidad de Toronto), la insulina bovina que difiere en 3
aminoácidos de la humana fue la primera suministrada a los seres humanos por inyección y
como aún no estaba pura produjo ámpulas de 7.5 cm en el lugar de la aplicación (Bliss
1982; Shah, Joshi et al., 1997). Esto último debido a que la proteína se obtuvo por
extracción de células pancreáticas y las técnicas de purificación no eran lo suficientemente
avanzadas. Sin embargo, más tarde se logró mejorar los procesos de purificación y se tornó
más segura, aunque finalmente esta insulina bovina fue sustituida por la porcina, la cual
solo difiere en un aminoácido comparada con la humana. No obstante, la calidad de la
insulina administrada en ese momento no se comparaba con la calidad de los productos de
hoy. También debido a las diferentes impurezas a menudo había reacciones de
hipoglucemia y se tenían reportes de dolor e inflamación en el lugar de la inyección. A
partir de 1922, debido a la demanda de nuevos medicamentos se concedió a varias
empresas licencias para la fabricación de Insulina. Se siguió trabajando con diferentes
formulaciones del extracto no puro de insulina animal para mejorar la respuesta en los
pacientes y obtener insulinas de acción prolongada, lenta y rápida. Para 1974, las técnicas
cromatográficas de purificación permitieron la producción de insulina de origen animal
con menos de 1 pmol/l de impurezas. El producto fue nombrado monocomponente MC por
la empresa Novo y Single Peak Insulin y Iletin II, por Eli Lilly. Antes de esto, la insulina
bovina y porcina en ocasiones causaban alergias y lipoatrofia (Teuscher 1974). Hoy, sin
embargo, no existen grandes diferencias entre la pureza de las insulinas animales y la
humana (Tabla 2).
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Tabla 2. Diferencias en la secuencia de aminoácidos de insulinas de mamíferos
ESPECIE POSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN LA
CADENA A
8 9 10
Res Ala Ser Val
Cerdo, Espermatozoide de Ballena Thr Ser Ileu
Ballena Ala Ser Thr
Oveja Ala Gly Ileu
Caballo Thr Gly Ileu
Fuente: (Nicol and Smith 1960).
Después de varios años, entre 1963-1966, la insulina humana fue sintetizada
químicamente en Alemania, por Meienhofer (Meienhofer, Schnabel et al., 1963), en China
por Kung (Kung, Da et al., 1966) y en los Estados Unidos por Katsoyannis (Katsoyannis,
Tometsko et al., 1966). Sin embargo, por razones económicas la producción química a gran
escala no ha sido posible. No obstante, se han establecido estrategias comerciales para la
semisíntesis a partir de la proteína porcina, cambiando el residuo del aminoácido Ala del
extremo del C-terminal de la cadena B por Thr, resultando la secuencia de aminoácidos
correspondiente a la secuencia de la insulina humana.
2.3.2 Métodos biotecnológicos
2.3.2.1 Biotecnología bacteriana
En 1978, la empresa Genentech de San Francisco, California reportó la producción
a nivel laboratorio de insulina humana transgénica o heteróloga utilizando E. coli como
sistema de expresión (Figura 8). Sin embargo, la carrera para la producción en masa
utilizando estas tecnologías fue ganada por Eli Lilly en 1982 (Chan, Weiss et al., 1981),
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19
cuando la FDA aprobó la Humulina R (rápido) y la Humulina N (NPH) para el mercado de
los Estados Unidos de Norteamérica. Esto fue seguido por la producción de insulinas
semisintéticas por las empresas de Novo, Actrapid HM y Monotard HM. Estos procesos
eliminaron la dependencia de las insulinas bovina y porcina y son los que se utilizan en la
actualidad para la obtención de insulina humana. Así, de 1996 a la fecha, se han introducido
en todo el mundo varios análogos de la insulina. Algunos de esos productos son Humalog
(Lilly), Lantus y Apidra (Aventis), Levemir y NovoRapid (Novo Nordisk), y otro número
de análogos que están actualmente a nivel de pruebas clínicas las llamadas insulinas basales
de nueva generación.
Figura 8. Entrada a la empresa Genentech de San francisco, California. Derecha, bacterias recombinantes de
E. Coli productoras de insulina humana.
Otro de los modelos competitivos para la producción heteróloga de insulina humana
son los producidos en sistemas de expresión como las levaduras Saccharomyces cerevisiae
(Thim, Hansen et al., 1986) y Pichia pastoris (Wang, Liang et al., 2001). No obstante estos
sistemas de expresión junto con E. coli, presentan ciertos inconvenientes para la
productividad así como la actividad de biológica de la insulina, como por ejemplo el
plegamiento correcto de la proteína. Aun así estos son los sistemas que se utilizan
actualmente para la producción industrial de insulina humana.
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20
2.3.2.2 Biotecnología animal
En busca de sistemas alternativos para la producción industrial, la insulina humana
también ha sido expresada en su forma de proinsulina (con algunas mutaciones en la
secuencia de la aminoácidos en la proteína) en cultivo de células de riñón de mono
(Yanagita, Nakayama et al., 1992). En este sistema se ha reportado que las células secretan
al medio de cultivo hasta un 60% del péptido activo. Del mismo modo se han obtenido
vacas (BioSidus 2007), capaces de producir un precursor de la insulina humana en células
de tejido mamario y secretarla junto con la leche de donde puede ser extraído, purificado y
modificado enzimáticamente para obtener el péptido activo (Figura 9). El uso de estas
técnicas puede reducir los costos de procesamiento postraduccional necesarios en los
sistemas de biotecnología bacteriana, puesto que las modificaciones posteriores que sufre el
producto en biotecnología animal son pocas o nulas. Sin embargo el costo total de proceso,
sobre todo en el mantenimiento de los cultivos de células animales así como del animal
completo está en desventaja con respecto los costos de biotecnología microbiana.
Figura 9. Ternera Patagonia I nació el 27 de febrero del año 2007 y estará produciendo leche con el péptido
proinsulina, el precursor de insulina a fin de este año (BioSidus 2007).
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21
2.3.2.3 Biotecnología vegetal
La biotecnología vegetal es un conjunto de tecnologías con potencial real para la
producción de proteínas heterólogas, especialmente aquellas con requerimientos
postraduccionales complejos (Ferl and Paul 2000). Se fundamenta en inducir el crecimiento
de células, tejidos y órganos vegetales in vitro en medios de cultivo definidos y bajo
condiciones controladas y asépticas (Calva and Rios 1999). Estas técnicas tienen como
fundamento el principio de la totipotencialidad de la célula vegetal, es decir, que cada
célula de una planta, independientemente de su posición en ella cuenta con una copia
completa del genoma de la planta madre, por lo que tiene la capacidad de regenerar una
planta completa con toda funcionalidad. Debido a ello, desde tiempo atrás se ha reconocido
que los sistemas basados en plantas transgénicas completas, o el cultivo in vitro de sus
célula tejidos y órganos ofrecen potencial, seguridad, economía, y capacidad para la
producción de proteínas heterólogas además de otro tipo de biofármacos basados en
metabolitos secundarios vegetales (Deckers, Moloney et al., 1999), representando una
opción real y económicamente viable para la producción de ambos tipos de compuestos.
Entre las ventajas de la biotecnología vegetal están que las plantas transgénicas ofrecen
estabilidad física, fisicoquímica y nutricional suficiente para poder llegar a cualquier parte
del mundo y entregar al receptor final los compuestos o proteínas transgénicas respectivas
en estado activo. Además este uso farmacéutico de plantas transgénicas es bien aceptado
por la sociedad, lo que contrasta con los temores y políticas en la población cuando el
objetivo es utilizarlas como alimentos transgénicos (Calva, Esparza et al., 2002; Calva and
Pérez 2005).
Con lo que respecta la insulina, haciendo uso de la biotecnología vegetal, se ha
reportado la expresión en cultivos de hoja de papa, en niveles del 0.05 % de la proteína
soluble total, ya sea como proteína independiente o de fusión con rendimientos del 0.1 %
de la proteína soluble total (Arakawa, Yu et al., 1998). También se ha logrado la expresión
de proinsulina como proteína de fusión a la sub-unidad B de la toxina del cólera (CTB-
Pins) en líneas de cultivos de células de hojas de tabaco y lechuga transformadas a nivel de
cloroplastos (Li, O’Leary et al., 2006) con un rendimiento del 16 % y 2.5 % de la proteína
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soluble respectivamente . De la misma manera esta proteína se ha expresado en semillas de
Arabidpsis thaliana, como proteína de fusión que se acumula en los cuerpos oleosos de las
semillas con rendimientos de hasta el 0.13 % de la proteína total (Nykiforuk, Boothe et al.,
2006). Con esta tecnología la empresa canadienses de biotecnología SemBioSys Genetics
Inc., ha anunciado haber logrado plantas transgénicas de cártamo productoras de insulina
humana con rendimientos de hasta el 1.2% de las proteínas acumuladas en semillas (Figura
10), niveles que permiten una explotación comercial viable. No se encontraron
antecedentes sobre la producción de insulina por raíces transformadas de plantas, Así, con
el objetivo de explorar el potencial de esta tecnología en la producción de proteínas
heterólogas, en el grupo de trabajo se establecieron cultivos de raíces Brassica oleracea
var. italica transformadas con el cDNA del gen de la insulina humana que es el antecedente
directo de este trabajo.
Figura 10. Lechuga, tabaco y semilla de cártamo acumuladoras de insulina humana (Nykiforuk, Boothe et al.,
2006).
2.4 Cultivo de raíces transformadas como modelo de producción de compuestos biológicamente activos
Los cultivos de raíces transformadas son desde hace tiempo una tecnología
ampliamente explotada, para la obtención de compuestos biológicamente activos,
principalmente de metabolitos secundarios de interés y de manera más reciente para la
producción de proteínas heterólogas de interés farmacéutico. Este es un sistema estable, el
tejido crece de manera acelerada comparado con las raíces normales sin necesidad de
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reguladores de crecimiento y es capaz de ofrecer productos en rendimientos considerables.
Para ello cada tipo de cultivo y especie requiere de la optimización de sus parámetros
nutricionales y de proceso. Algunos a considerar son: en cuanto al medio de cultivo, el tipo
y concentración de fuente de carbono, nitrógeno y fosforo (Norton and Towers 1986;
Christen, Aoki et al., 1992; Taya, Yakura et al., 1994; Wilhelmson, Hakkinen et al., 2006),
fuerza iónica del medio (Toivonen, Laakso et al., 1992), algunos parámetros de proceso
como pH, luz y temperatura (Hirata, Horiuchi et al., 1991; Hilton and Rhodes 1994; Yu,
Murthya et al., 2005) , reguladores de crecimiento (Rhodes, Parr et al., 1994; Bais, George
et al., 2001) y las condiciones del inoculo (Bhadra and Shaks 1995; Jeong, Park et al.,
2004).
2.4.1 Medio de cultivo
Un medio de cultivo, principalmente consiste en una solución de sales que proveen
de macro y micro elementos necesarios para el crecimiento de la planta completa junto con
vitaminas, aminoácidos y fuente de energía que usualmente es sacarosa. Los cultivos
vegetales para el crecimiento y desarrollo, generalmente, también dependen de la adición
de reguladores de crecimiento al medio (George, Hall et al., 2008).
El material vegetal puede ser cultivado tanto en medio liquido como en un medio
parcialmente solidificado con un agente gelificante. Dependiendo del tipo de cultivo y del
objetivo. El medio semisólido, es utilizado para el establecimiento de cultivos de explantes;
también se utilizan para el cultivo de callos u órganos de plantas, y para el mantenimiento
de cultivos por largos periodos. Los cultivos que crecen en medio sólido, solo una
superficie del explante, órgano o tejido se encuentra en contacto con el medio. Esto
significa que a medida que avanza el crecimiento puede ser que existan gradientes de
nutrientes, factores de crecimiento y productos de desecho del metabolismo, entre el medio
y el tejido (George, Hall et al., 2008).
El medio líquido se utiliza esencialmente, para los cultivos en suspensión, y son
preferidos para los experimentos críticos acerca de la nutrición, crecimiento y
diferenciación celular. También son utilizados en algunos trabajos de micropopagación.
Algunos órganos y tejidos, pequeños y grandes, también crecen bien sin soporte en medio
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24
líquido, cuidando que se encuentren con aireación mediante agitación o movimiento
(George, Hall et al., 2008).
El medio de cultivo para tejidos vegetales, no solo provee de estos nutrientes
inorgánicos, si no que usualmente un carbohidrato (comúnmente la sacarosa) remplaza el
carbón que la planta normalmente fija de la atmosfera mediante la fotosíntesis. Para
mejorar el crecimiento, algunos medios también incluyen cantidades traza de algunos
compuestos orgánicos, especialmente vitaminas, y reguladores de crecimiento vegetal
(George, Hall et al., 2008). En la literatura los medios más utilizados para el mantenimiento
y propagación de cultivos de diferentes Brassicae son el medio Murashige y Skoog (MS),
Gamborg (B5) y Schenck y Hildebrandt (SH).
Los cultivos vegetales para el crecimiento y desarrollo, generalmente, también
dependen de la adición de reguladores de crecimiento al medio. Los reguladores de
crecimiento vegetales son compuestos, los cuales, a concentraciones muy bajas, son
capaces de modificar el crecimiento o la morfogénesis de la planta. Los reguladores de
crecimiento frecuentemente necesitan ser alterados de acuerdo a la variedad de la planta, o
a diferentes etapas de cultivo, mientras que el medio básico puede estar sin cambiar. Por lo
que es preferible que los componentes nutricionales y de regulación sean tratados de forma
separada (George, Hall et al., 2008).
2.4.2 Reguladores del crecimiento vegetal
Los reguladores del crecimiento vegetal son compuestos que en combinaciones
específicas (tipo y concentración) pueden regular la diferenciación de los tejidos vegetales
en distintas direcciones (brotes, raíces, callos). Se clasifican en: auxinas, citocininas,
giberelinas, ácido abscísico y etileno (George, Hall et al., 2008).
Dentro de las giberelinas se encuentra el ácido giberelico (GA), cuyo efecto es
promover el crecimiento y elongación celular cuando se utiliza en concentraciones de 0.01
a 10 mg/l. Su efecto se debe a que:
Estimula la elongación del tallo
Estimula la floración
Ayuda a romper la dormancia de las semillas
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Puede iniciar el desarrollo de frutas sin semilla
Puede retrasar la senescencia en hojas de cítricos
Dado que se ha reportado que en raíces transformadas, solo y en combinación con
auxinas, promueve la acumulación de biomasa mediante la elongación y crecimiento de la
raíz primaria y el desarrollo de raíces secundarias, en concentraciones que varían de
acuerdo a la especie vegetal y línea celular de raíces transformada, en este trabajo se
evaluará el efecto de este compuesto en combinación con varias auxinas. Estas últimas
promueven la elongación celular (George, Hall et al., 2008). En orden ascendente de
potencia son el ácido indolacético (IAA), el ácido naftalenacético (NAA) y el ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D). Este último suprime fuertemente la organogénesis y se usa
para:
Estimular la iniciación de raíces y desarrollo de raíces secundarias
Estimular el crecimiento de flores
Suprimir la senescencia de hojas
Las raíces transformadas muestran una alta sensibilidad a las auxinas. Utilizando
únicamente auxinas se reporta una desorganización de la morfología radicular, sin embargo
la combinación y balance de auxina-citocinina puede conducir a un aumento en la biomasa.
Por otro lado, la adición de auxinas únicamente puede incrementar la biomasa en cultivos
de raíces transformadas.
Las citocininas promueven la división y diferenciación celular. Entre las más
comunes están la cinetina (Kin) y la benzilaminopurina (BAP). Su efecto se debe a que:
Estimulan división celular
Estimulan morfogénesis
Estimulan la expansión de hojas
En cultivos de raíces transformadas estos reguladores promueven una
desorganización celular cuando se utilizan solas; sin embargo en combinación con auxinas
pueden promover la acumulación de biomasa (George, Hall et al., 2008).
Se han utilizado combinación de auxinas y citocininas en la inducción de formación
y propagación de cultivos de tejidos; por ejemplo, explantes de Brassica nigra en un medio
con NAA 0.5 mg/l y 2.0 mg/l BAP o 2.0 mg/l Kin los cuales produjeron abundantes raíces
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pilosas. La mejor respuesta fue con la combinación de NAA 0.5 mg/l y Kin 2.0 mg/l. Las
raíces tuvieron una apariencia algodonosa (Das, Chandra et al., 2010).
En estudios para establecer cultivos de embriones de Brassica napus a parir de
explantes de hipocotilo en medio MS, una combinación de varias concentraciones de 2,4-D
y 2 mg/l de BAP produjo embriones somáticos, mientras 1-2 mg/l IBA y 1 mg/l BAP o
solamente 2mg/l de BAP produjo callos (Chamandosti, Majd et al., 2006). Partiendo de
explantes de cotiledones en medio MS se probaron siete diferentes brassicas (campestri,
nigra, oleracea, hirta, carinata, juncea y napus) encontrándose que los efectos
predominantes son el tipo de auxina, sus concentraciones y la especie utilizada. El rango
para la formación de callos se encuentra utilizando 1 mg/l de 2,4-D y las raíces son
inducidas preferentemente utilizando de 2-5mg/l NAA (Murata and Orton 1987). Por otro
lado, partiendo de raíces transformadas generadas de explantes de hoja y peciolo
transformadas con la cepa de A. rhizogenes A4T se regeneraron plantas transgénicas de B.
oleracea y B. campestri, generando brotes a partir de estas utilizando 5 mg/l BAP y 5 mg/l
NAA en medio LS-N, y co-cultivandolos hasta llegar a plantas de invernadero (Christey,
Sinclair et al., 1997).
Específicamente para variedades de Brassica oleracea se tiene reportado que
partiendo de protoplastos de coliflor (var. botrytis) utilizando medio B5 con 0.02 mg/l de
NAA y 2 mg/l BAP se producen raíces que con después de varias resiembras forman brotes
(Delpierre and Boccon-Gobad 1992). Para esta misma variedad se ha utilizado para su
propagación in vitro medio MS con BAP y GA3 (Bhalla and Weerd de 1999). Otra variedad
de oleracea (costata DC) utiliza medio liquido MS con 2 mg/L BAP y 0.1 mg/L NAA para
obtener brotes a partir de explantes de segmentos internodales, 1µM de GA3 para cultivo de
raíces y 1-2 mg/l 2,4-D en medio MS para obtener callos (Taveira, Pereira et al., 2009).
Específicamente para Brócoli se reporta que partiendo de explantes de cotiledones e
hipocotilo en medio MS suplementado con 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BAP se
inducen brotes/callos y en medio MS con 0.2 mg/l NAA se inducen raíces (Qin, Li et al.,
2007).
Con lo anterior es remarcable el uso del medio de cultivo adecuado y la
combinación de los reguladores de crecimiento para promover la acumulación de biomasa y
producción de proteínas de interés como en el caso de este proyecto la producción de
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insulina, en cultivos de raíces transformadas. Estas condiciones de cultivo pueden ser
escaladas a distintos niveles, ya sea cultivo en matraz o en biorreactores a nivel laboratorio
(en este caso), planta piloto o industrial.
En el caso de los cultivos en matraz Erlenmeyer, es difícil modificar el ambiente de
cultivo con estos matraces y se utilizan solo para cultivos de pequeña escala debido a las
limitaciones de aporte de aire. Un biorreactor equipado con fuente de aire, pH, temperatura,
es utilizado principalmente para el cultivo de raíces transformadas a gran escala (Choi, Kim
et al., 2006).
2.5 Brassica oleracea var. italica (Brócoli) como modelo de expresión
Brassica oleracea var. italica (Brócoli), es una crucífera muy semejante a la coliflor, pero
más alta y de inflorescencia verde (Figura 11). Presenta un mayor número de hojas, rígidas
y estrechas y es menos exigente en suelos y clima. Las hojas son de hasta 50 cm de
longitud y 30 cm de ancho, y varían en número, de 15 a 30, según el cultivar. Presentan
pecíolo más desarrollado que el repollo, alcanzando un tercio de la longitud total de la hoja.
La lámina es entera, de borde fuertemente ondulado y presenta un tono verde-grisáceo. En
la base de la hoja puede dejar a ambos lados del pecíolo pequeños fragmentos de lámina. El
tallo principal termina en la inflorescencia primaria, conformada por flores dispuestas en un
corimbo principal o primario, denominado pan o pella, que corresponde a la parte
comestible.
A partir de ramificaciones de las yemas axilares puede desarrollar inflorescencias
laterales secundarias, de menor tamaño que la principal. Los corimbos son verde claro a
púrpura, según el cultivar. Mantienen la estructura compacta por poco tiempo, hasta que se
elongan los pedúnculos y maduran las flores. La silicua protege la formación de más de
diez semillas, las que son redondas, de color pardo oscuro a rojizo y pequeñas (Cardoza
and Stewart 2004).
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Por ser originaria de una región sub-húmeda templada, está adaptado para soportar
condiciones de temperaturas moderadas, con agua fácilmente disponible, humedad relativa
media a alta y luminosidad moderada. La planta tolera heladas suaves, pero al estar la
inflorescencia presente se produce congelación y posterior pudrición de flores.
Por otra parte, ha sido calificado como la hortaliza de mayor valor nutritivo por
unidad de peso de producto comestible. Su aporte de vitaminas, principalmente C, B2
(riboflavina) y pro-vitamina A, es elevado; además suministra cantidades significativas de
minerales como Ca, K y especialmente P (Peirce 1987). Algunas variedades del género
Brassica, como brócoli y coliflor, contienen cantidades sustanciales de isotiocianatos (la
mayoría en su forma de sus precursores glucosinolatos) algunos de los cuales son muy
potentes inductores de enzimas de fase 2, estas enzimas son de desintoxicación y protegen
contra cáncer, mutaciones y otras formas de toxicidad como las formas reactivas del
oxígeno (Fahey, Zhang et al., 1997).
Figura 11.Brócoli (Brassica oleracea var. italica) (Peirce 1987).
En los últimos 30 años se ha realizado mucho trabajo para la mejora genética del
brócoli utilizando los métodos de tradicionales de selección y los de tejidos y células
vegetales. Se ha obtenido transgénicos de B. oleracea por varios métodos con
Agrobacterium reportados por varios grupos de investigación (David and Tempé 1988), La
mayoría de los autores, sin embargo, han informado de dificultades en una o varias de las
etapas de la transferencia de genes y la regeneración, lo que complica seleccionar uno de
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los protocolos como método de elección para la transformación de B. oleracea. No obstante
se han implementado una serie de mejoras en las etapas cruciales de transformación con
Agrobacterium rhizogenes, especialmente usando coadyuvantes como la arginina,
manopina y acetosiringona (Henzi, Christey et al., 2000). Dentro del grupo de trabajo se
han establecido diversos cultivos de raíces transformadas de brócoli, para el estudio de su
potencial para la producción de proteínas heterólogas como la hormona de crecimiento
humano, la insulina humana y la proteína L1 del virus del papiloma humano (García Lopez,
2008; García Reyes, 2009; Jimenez Antaño 2009). En el caso de la insulina, dichos
cultivos son el antecedente directo de este proyecto. Se establecieron cultivos de raíces de
Brócoli transformadas con el cDNA del gen Ins. El gen se aisló del vector pDNR-Lib-Ins
que lleva el cDNA del gen In.. Este vector que también lleva el gen de resistencia a
cloranfenicol fue extraído y sometido a restricción con las enzimas correspondientes que
flanquean el cDNA. Se amplificaron varias regiones del vector usando juegos de oligos
denominados preproinsulina y proinsulina, diseñados específicamente para añadir la
secuencia de las enzimas Nco I y Bgl II al cDNA del gen Ins. Por otra parte se recuperó el
vector binario pCAMBIA 1105.1 de una cepa de E. coli y se realizó la restricción con las
enzimas correspondientes para obtener extremos complementarios entre el vector y los
amplificados preproinsulina y proinsulina. Se realizó la ligación entre ellos (preproinsulina-
pCAMBIA 1105.1 y proinsulina-pCAMBIA 1105.1). Los productos de ligación fueron
clonados en E. coli DH5α por electroporación. Las cepas de E. coli transformadas se
crecieron en presencia de estreptomicina y las clonas resultantes se utilizaron para la
amplificación de los constructos pCppIns-bgr y pCpINS-bgr. Estos constructos una vez
caracterizados por PCR fueron clonados en Agrobacterium rhizogenes para la inducción de
raíces aéreas de Brócoli transformadas con el cDNA del gen Ins.
Por otro lado, se germinaron semillas de Brócoli en medio mineral semisólido B5 y
las plántulas que mostraron mayor cantidad de raíces fueron utilizadas para establecer
cultivos de raíces no transformadas en medio líquido. Para la inducción de raíces
transformadas, varias plántulas de 3-4 semanas de edad fueron infectadas por punción con
las cepas Agrobacterium rhizogenes; LBA9402, pC1105.1, pCppINS-bgr y pCpINS-bgr.
Del punto de punción se obtuvieron explantes con raíces transformadas que se propagaron
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en medio SH. El tejido propagado se usó para establecer cultivos en medio líquido, en
ausencia o presencia de higromicina y evaluar la reacción de GUS según el caso. Así se
obtuvieron líneas de raíces transformadas con distintos fragmentos del cDNA del gen Ins
las cuales mostraron propiedades de interés para estudiar la producción de insulina
modificando el medio de cultivo y las condiciones de proceso, tanto a nivel matraz como a
nivel biorreactor.
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3 JUSTIFICACIÓN
De lo anterior, es claro el potencial de la biotecnología vegetal en la producción de
proteínas con actividad terapéutica y la necesidad de incrementar la producción de insulina
para hacerla accesible a toda la población que la requiera. Aunque los métodos de
producción usando Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae han experimentado un
considerable refinamiento y optimización en las últimas décadas (Nykiforuk, Boothe et al.,
2006), estos no han alcanzado los niveles de producción para atender las necesidades de
toda la población con diabetes (IDF 2007; Olaiz, Aguilar et al., 2007). En este sentido, la
biotecnología vegetal ofrece la posibilidad de coadyuvar a esos niveles de producción y de
hacer llegar el producto a cualquier parte del mundo, incluyendo poblaciones marginadas
(Deckers, Moloney et al., 1999; Calva, Esparza et al., 2002; Calva and Pérez 2005). Otra
ventajas es que tanto los cultivos de células, tejidos y órganos en suspensión, como plantas
transgénicas completas pueden ser escalados a niveles industriales y usarse como fuente de
esta y otras proteínas terapéuticas (Gutierrez, Taylor et al., 1998; Hoshino and Mii 1998;
Perez and Ochoa 1998; Deckers, Moloney et al., 1999). En el trabajo de Maestría (García
Reyes 2009) se establecieron cultivos de raíces de Brassica oleracea var. italica (Brócoli)
transformadas con el cDNA del gen de la insulina humana. Así, en el presente proyecto se
investigará el potencial de estos cultivos sobre la expresión y producción de esta proteína
así como las condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento y desarrollo del
tejido transformado. Dadas las propiedades de las células vegetales en la biosíntesis de
proteínas heterólogas con requerimientos postraduccionales se espera que la proteína
heteróloga sea fisiológicamente activa.
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4 HIPÓTESIS
Las raíces transformadas de Brassica oleracea var itálica expresan los polipéptidos
de proinsulina e insulina bajo condiciones de cultivo apropiadas para su crecimiento
y desarrollo
5 OBJETIVOS
5.1 GENERAL
Establecer un proceso para la expresión de proinsulina e insulina humana
por cultivos de raíces transformadas de Brassica
oleracea var itálica
a nivel laboratorio
5.2 Objetivos Específicos
1) Evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de explantes de
brócoli para el establecimiento de cultivos de raíces
2) Establecer y seleccionar líneas de raíces transformadas con el cDNA del gen Ins
humano completo y el de la fracción codificante para la proinsulina
3) Evaluar la presencia de insulina y proinsulina en raíces transformadas
4) Integrar los resultados para proponer condiciones básicas de cultivo para expresar la
proinsulina e insulina a partir de cultivos de raíces transformadas
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6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
El plan de trabajo planteó dos temáticas a desarrollar para alcanzar los objetivos del
proyecto (Esquema 1).
Esquema 1. Estrategia Experimental. Como primera etapa se plantean las actividades correspondientes al
establecimiento de los cultivos. En la segunda etapa, se pretende caracterizar los cultivos (sus condiciones
nutricionales y de proceso) y la caracterización parcial de la proteína.
En una primera etapa, fue necesario caracterizar los cultivos, es decir, las condiciones
nutricionales y de proceso básicas para el desarrollo de los cultivos, tales como medio de
cultivo semisólidos y líquido, efecto del balance de fitohormonas reguladoras del
crecimiento, aireación y agitación constante, Lo anterior con respecto a las cinéticas de
crecimiento. Trabajando a nivel matraz. La segunda y paralela etapa abarcó los detalles
correspondientes al estado molecular de transformación de los cultivos con el cDNA del
gen INS humana, así como la expresión, purificación y parcial caracterización de las
proteínas de interés. Lo anterior dio paso a las dos vertientes que constituyen las bases para
establecer un proceso de producción a nivel matraz en laboratorio.
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7 MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Material Biológico
7.1.1 Cepas bacterianas
Clona 3950204 (Open Biosystems, USA) de E. coli llevando el cDNA del gen de la
insulina humana (Ins) insertado en el plásmido pDNR-Lib.
Cepa de E. coli DH5α para mantener y propagar los plasmidos correspondientes.
Cepa de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 la cual contiene el plásmido pRi-1855
del tipo agropina (Spano, Pomponi et al., 1982; Tzfira and Citovsky 2006).
Clonas de E. coli pCppINS-bgr, E. coli pCpINS-bgr, E. coli pCAMBIA 1105.1, A.
rhizogenes pCppINS-bgr, A. rhizogenes pCpINS-bgr, y A. rhizogenes 1105.1. Las cuales
contienen las construcciones de interés.
7.1.2 Material Vegetal
Los explantes fueron obtenidos de plántulas de Brócoli germinadas a partir de
semillas adquiridas de la casa happy flower.
7.2 Material para experimentos de Biología Molecular
El plásmido pDNR-Lib que contiene el cDNA del gen de la insulina humana (Ins)
fue obtenido de Open biosystems. El vector binario pCAMBIA 1105.1 fue obtenido de la
casa Cambia. Los siguientes oligos directo y reverso fueron diseñados previamente en el
trabajo de Maestría:
UNIVERSALES M13 extendidos
M13D: 5 ́TGGTCTCTCATGGGTAAAACGACGGCCAGT 3´
M13R: 5 ́TGGTCTCCGATCTCAGGAAACAGCTATGAC 3´
PREPROINSULINA
ODEINS: 5 ́TTTGGTCTCTCATGGAGCCCTCCAGGACAGGC 3´
OREINS: 5 ́TTTGGTCTCTGATCTGTTGGTTCAAGGGCTTT 3´
PROINSULINA
ODESPINS: 5 ́TTTGGTCTCTCATGGTTTGTGAACCAACACCT 3´
OREINS: 5 ́TTTGGTCTCTGATCTGTTGGTTCAAGGGCTTT 3´
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T4 DNA ligasa (Invitrogen 15224-025), para las ligaciones .
Enzimas de restricción EcoR I, Xho I, Nco I, Bgl II, Eco31 I (New England ).
Construcciones pCppINS-bgr y pCpINS-bgr, que contienen los fragmentos
preproinsulina y proinsulina integrados al vector binario pCAMBIA1105.1. Generadas en
el proyecto de maestría.
7.3 Reactivos generales, medios de cultivo y kits
SOLVENTES
Agua α, Fenol, Cloroformo, Etanol
VARIOS
NaHPO4, Triton X-100, EDTA, DMF, 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronido
(X-Gluc), NaOH, Nitrógeno líquido, Tris-HCl, DTT, PVPP, PMSF, ZnSO4,
CaSO4, MgSO4, Reactivo de Bradfford (Sigma-Aldrich B6916), Insulina
comercial (NOVO®)
MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS
Medio LB (Luria-Bertani), para crecer las cepas de Escherichia coli DH5α y
Agrobacterium rhizogenes LBA9402, las clonas 3950204 de E. coli, E. coli
pCppINS-bgr, E. coli pCpINS-bgr, E. coli pCAMBIA 1105.1, A. rhizogenes
pCppINS-bgr, A. rhizogenes pCpINS-bgr, y A. rhizogenes 1105.1
Agar, como agente solidificante
MEDIOS DE CULTIVO VEGETAL
Gamborg´s B5 (Sigma-Aldrich G5768), para germinar semillas de Brocoli
Vitaminas (Sigma-Aldrich M7150), adicionadas al medio B5 y MS
Schenck y Hildebrandt conocido como SH (Sigma-Aldrich S6765), para
cultivar explantes
Vitaminas (Sigma-Aldrich S3766), adicionadas al medio SH
Murashige and Skoog (MS) modificado o libre de NH4 (Sigma-Aldrich
M8280), para experimentos de diferenciación
Fitagel o gelrite, como agente solidificante para medios vegetales
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REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL
NAA (Sigma-Aldrich N0640), BAP (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich 3408),
GA3 (Sigma-Aldrich G7645)
ANTIBIOTICOS
Estreptomicina , Ampicilina, Kanamicina, Cloranfenicol, Cefotaxima,
Higromicina
KITS
PureLinkTM
(Invitrogen K2100-10) basado en la técnica de Birman y Dolly, para
extracción plasmidica
PlatinumR Super Mix High Fidelity (Invitrogen 12532-016) para amplificación
por PCR
Kit de ELISA
7.4 Equipos
Espectrofotómetro CAMSPEC (mod. M330)
Termociclador TECHNE (mod. TC312) PlatinumR Super Mix High Fidelity
(Invitrogen 12532-016)
Electroporador y cubeta de electroporación de 2mm
FPLC
7.5 Inducción de raíces transformadas
El objetivo fue proveer de manera constante material vegetal nuevo para actividades
posteriores. El material vegetal consistió en plántulas de Brócoli obtenidas mediante la
germinación de semillas en medio mineral semisólido (1.8 g/l fitagel) Gamborg´s B5
(Sigma-Aldrich G5768) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) pero sin
reguladores de crecimiento. Las plántulas de 3-4 semanas de germinación y sin hojas
verdaderas se usaron para la transfección por punción en hipocotilos por la generación de
una herida que desencadena las señales químicas entre planta-Agrobacterium promoviendo
así la transfección del TRi-DNA del plásmido bacteriano al genoma de la planta (Tzfira and
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Citovsky 2006) con las cepas antes mencionadas (Agrobacterium rhizogenes LBA9402,
Agrobacterium rhizogenes pC1105.1, Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y
Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr).
Para generar las líneas de raíces transformadas, después de una semana de la
infección se tomaron explantes de 1-1.5 cm de largo de los sitios de punción los cuales
fueron resembrados (de 2 a 3 veces) para propagar las raíces en medio mineral semisólido
(1.8 g/l fitagel) Schenck y Hildebrandt SH (Sigma-Aldrich S6765) adicionado con
vitaminas (Sigma-Aldrich S3766) y cefotaxima (400, 300 y 100 µg/ml en las distintas
resiembras) para eliminar la bacteria e higromicina como presión de selección (100 µg/ml)
de raíces transformadas. Las raíces transformadas se cultivaron en frascos con medio
mineral SH adicionado con vitaminas y adicionado con 1.8 g/l de fitagel. Se resiembra 1 g
de tejido meristemático para la conservación de las líneas.
Para cultivos en medio líquido, las líneas de raíces transformadas se resembraron
periódicamente, de dos a tres semanas, en medio mineral SH adicionado con vitaminas e
higromicina (100 µg/ml) en matraces de 125, 250 y 500 ml de volumen de operación con
¼ del volumen de medio mineral e inoculados con 1, 3 y 6 g de biomasa respectivamente.
Las raíces resultantes son sometidas a tinción histoquímica por la prueba de GUS
(descrita en la sección 7.2) y aquellas positivas a esta reacción fueron establecidas en
cultivo sumergido a nivel matraz en medio mineral SH (Sigma-Aldrich S6765) adicionado
con vitaminas (Sigma-Aldrich S3766), y cefotaxima para eliminar la bacteria (100 µg/ml).
7.6 Experimentos con explantes
Plántulas mayores a un mes y con hojas verdaderas se usaron para la obtención de
explantes de raíces, hojas e hipocotilo para el establecimiento de cultivos de raíces sin
transformar pare estudiar el efecto de reguladores del crecimiento sobre la diferenciación de
explnates. Se utilizó medio mineral SH (Sigma-Aldrich S6765) o Murashige and Skoog
(MS), según lo indicado en cada experimento.
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7.7 Determinación de la transformación por GUS
Este ensayo se realizó con el objetivo de comprobar la transformación de las raíces
con la proteína reportera, la cual está regida por el mismo promotor que la insulina. Para
ello a todas las líneas de raíces se les realizó la tinción histoquímica para detectar la
actividad de GUS para comprobar la transformación genética. Para ello se colocó un
fragmento de tejido radicular (1 cm) en 120 µl de buffer de tinción (50 mM NaHPO4 pH 7,
0.5 % Triton X-100, 10 mM EDTA) y 5 µl X-Gluc (20 mM X-Gluc en DMF). Se sometió
al vació por 1 hr, se incubo a 37 ºC toda la noche y se observo la tinción del tejido bajo
microscopio óptico a 25, 100, 160 y 200 X según el caso (Jefferson 1987; García 2009). El
sustrato para la tinción histoquímica de la actividad de β-glucuronidasa en tejidos y células
es 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronido (X-Gluc). Este sustrato forma un precipitado azul
en el sitio de actividad enzimática. La actividad enzimática de la glucuronidasa sobre el X-
gluc que es el ácido glucurónico (Karcher 2002), no es coloreado, por ello se usa un
producto derivado: el indoxil que reacciona con el oxigeno y produce, mediante una
dimerización oxidativa, el colorante insoluble índigo 4,4-dicloro-5,5-dibromoindigo
(Jefferson 1987; Karcher 2002).
7.8 Estudios para evaluar el efecto del balance hormonal sobre la diferenciación de explantes de brócoli
Con el objetivo de investigar el comportamiento de los explantes de brócoli ante el
estímulo de reguladores de crecimiento para la formación y propagación de raíces normales
y transformadas de Brócoli se ejecutó un diseño de cuadrados latinos de tres factores a
cinco niveles cada uno, produciendo 25 tratamientos con tres repeticiones con tres
explantes de hoja, hipocotilo y raíz (Tabla 3). Se prepararon 2.5 litros de medio de
regeneración, Murashige and Skoog (MS) modificado o libre de NH4 (Sigma-Aldrich
M8280) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) para los 25 tratamientos. Las
soluciones stock para cada regulador de crecimiento se llevaron a un volumen de 25 ml y
una concentración de 1 mg/ml para cada uno; NAA (Sigma-Aldrich N0640) usando como
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diluyente agua α y como solvente NaOH 1N, BAP (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich 3408)
diluyente agua α y como solvente NaOH 1N y GA3 (Sigma-Aldrich G7645) diluyente agua
α y como solvente etanol.
Tabla 3. Efecto de los reguladores de crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja,
cotiledones y raíz de plántulas de brócoli
Medio MS
(3% sacarosa, 1.8 g/l fitagel)
NAA (Auxina) mg/L
0 0.05 0.5 5.0 10.0
B
A
p
(CITOCININA)
mg/L
0 A B C D E
0.05 B A E C D
0.5 C D A E B
5.0 D E B A C
10.0 E C D B A
GA3: A = 0, B = 0.05, C = 0.5, D = 5, E = 10 mg/l.
Teniendo como variables de repuesta (cualitativas) diferenciación de tejido formación
de callo, raíz y brote; (cuantitativas) peso fresco y peso seco.
7.9 Cinéticas de crecimiento a nivel de matraz
Este experimento se realizó con el objetivo de investigar el comportamiento sobre el
crecimiento de cultivos no transformados y transformados así como el consumo de
nutrientes del medio SH y el efecto del ácido naftalenacético (NAA) sobre la producción de
proteína total soluble (PTS) por las raíces transformadas. Igualment, con este experimento
se determinó el momento adecuado para la extracción de la proteína heteróloga. Cada
cinética se realizó con 30 unidades experimentales (matraces de 125 ml) con un inoculo de
4 y 13 g peso fresco/L (raíces no transformadas de brócoli y raíces transformadas con 1105
respectivamente) con y sin 0,05 mg/l de NAA. Se determinó acumulación de biomasa por
peso fresco y peso seco, cantidad de proteína total soluble tanto en medio de cultivo como
en biomasa, y están por determinarse consumo de nutrientes (fuente de carbono, amonio,
nitrato y fosfato) así como la actividad de proteínas como proteasas y glucuronidasa.
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7.10 Investigación de la presencia del cDNA en el DNA genómico del tejido vegetal
Con el objetivo de investigar la inserción del cDNA de insulina en el
genoma vegetal, se realizó la extracción de DNA genómico del tejido de cada línea de
raíces transformadas mediante la técnica reportada por K. Edwards (Edwards, Johnstone et
al., 1991) con algunas modificaciones. El tejido vegetal fresco (100 mg) se maceró en un
eppendorf de 1.5 ml con una espátula de 15-20 s, se añadieron 500 µl de Buffer de
Extracción (200 mM Tris HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA y 0.5% SDS), se agitó
en un vortex por 5 s y se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 h. Después se
centrifugó a 13000 rpm por 2 min, se recuperó el sobrenadante en un nuevo tubo y se
añadió 1 ml de isopropanol (2:1) se mezcló por inversión y se dejó reposar en frío 1 h, se
centrifugó a 13 000 rpm por 5 min, se eliminó el sobrenadante y se secó el pellet al vacio,
finalmente se resuspendió en 25 µl de TE y se determinó su concentración y pureza
haciendo una dilución 10:1000 fragmento-agua α y midiendo absorbancia en un
espectrofotómetro Camspec (mod. M330) a 260 nm y 280 nm respectivamente. Los
resultados de la amplificación se analizaron por electroforesis en gel de agarosa.
El DNA genómico se utilizó como templado para PCR utilizando un
termociclador TECHNE (mod. TC312) con el kit Taq DNA polimerasa recombinante
(Invitrogen 11615-010) en una mezcla de reacción con concentraciones finales de Buffer
1x, 0.2 mM de dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM de cada oligo, 1 U Taq y 100 ng de
templado en un volumen total de 25 µl. Estas mezclas de reacción de sometieron a
condiciones de PCR de; 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 30 s de alineamiento y 72
ºC 30 s de extensión, en 40 ciclos. Esto para los amplicones de preproinsulina y
proinsulina observando los resultados por electroforesis en gel de agarosa. Para el amplicon
de 800 pb de pCAMBIA 1105.1 se utilizó el mismo kit Taq DNA polimerasa recombinante
(Invitrogen 11615-010) y las concentraciones ya mencionadas bajo condiciones de PCR
de; 94 ºC 30 s de desnaturalización, 60 ºC 30 s de alineamiento y 72 ºC 20 s de extención,
en 35 ciclos.
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7.11 Extracción y cuantificación de proteína total soluble
Se maceró en un mortero el tejido radicular (1 g) en presencia de nitrógeno líquido
hasta obtener un polvo fino, se colocó en tubos falcon de 50 ml y añadiendo 3 ml de buffer
de extracción (25mM Tris-HCl pH 7, 2mM EDTA, 1mM DTT, 1.5 % peso/vol PVPP, 1.6
mM PMSF y Triton X-100 (0.25 % vol/vol) por gramo de peso fresco de tejido, se agito en
baño de hielo por 1 hr y se centrifugó a 10 000 rpm por 20 min y se recuperó el
sobrenadante para determinar cantidad de proteína total soluble por el método de Bradfford
(Sigma-Aldrich B6916).
7.12 Inmunoensayo de ELISA para cuantificación de proteína
Con el objetivo de estimar la cantidad de proteína heteróloga presente en los
extractos proteicos de raíces, tanto en biomasa como en el medio de cultivo, se
implementaron ensayos de ELISA utilizando un kit de Invitrogen KAQ1251. Las
microplacas fueron leídas en un espectrofotómetro a 450 nm en un lector 680 de Bio-Rad.
El Kit utilizado detecta Insulina Humana sin reacciones cruzadas con proinsulina o
con otras proteínas debido a que está compuesto por tres anticuerpos monoclonales que
detectan distintos epítopes de insulina. Las muestras y estándares son colocadas en las
microplacas impregnadas con los anticuerpos se añade un segundo anticuerpo (que
reconoce a los anteriores) marcado con peroxidasa de rábano (HRP), se incuba y
posteriormente se lava, para añadir finalmente el sustrato (tetrametilbenzidina TMB-H2O2).
La reacción se detiene con HCl, y el producto de reacción un sustrato colorido que se lee
espectrofotométricamente donde la intensidad de color es directamente proporcional a la
cantidad de insulina.
7.13 Ensayos de electroforesis (PAGE)
Con el objetivo de investigar la presencia de las proteínas heterólogas en los
extractos de raíces transformadas y establecer condiciones experimentales para evaluar la
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expresión de proteínas heterologas en los extractos se realizaron Ensayos de electroforesis
en geles de poliacrilamida (PAGE). Las muestras de extractos proteicos se cargaron en
geles de poliacrilamida (16.5% T; 6% C; 6 M de urea) en condiciones desnaturalizantes-
reductoras (SDS-PAGE) y no desnaturalizantes (PAGE) con un buffer de Tris-Tricina y
bajo condiciones reportadas en la literatura (Schägger and Von Jagow 1987; Schägger
2006); las cueles favorecen resolver proteínas de 1-100 kDa con buena resolución de
bandas. Esta técnica nos permite observar el perfil proteico de los diferentes extractos
obtenidos de cultivos transformados y sin transformar así como la expresión en los cultivos
correspondientes de proteína heteróloga con una sensibilidad entre µg hasta 500 ng para el
caso de tinción con Coomasie o incluso hasta los 100 ng por tinción con nitrato de plata.
7.14 Concentración de proteína en extractos proteicos
Para concentrar los extractos proteicos previos al proceso de purificación, las
muestras fueron fraccionadas de acuerdo al peso molecular y desaladas pasando los
extractos proteicos a través de tubos Amicon Ultra. Las presencia y cantidad de proteínas se
monitoreó por PAGE. Los tubos Amicon Ultra utilizados fueron UFC900324, UFC901024
y UFC903024 (Millipore) compuestos por membrana de celulosa regenerada que por con
ultrafiltración tangencial rinden tamaños de corte de 3, 10 y 30 kDa, respectivamnte, con
respecto a proteínas globulares bajo condiciones de 12 ml de muestra por 25 min a 4ºC y
5000 g para un corte de 10 y 30 kDa y por 45 min para un corte de 3 kDa.
A las fracciones, tanto retenidas (concentradas) como filtradas (diluidas), se les
determino concentración de proteína total soluble por el método de Bradford, concentración
de proteína heteróloga por inmunoensayo de ELISA (Invitrogen KAQ1251) y se analizó
perfil proteico por SDS-PAGE (reductor) como se describió en secciones anteriores.
7.15 Purificación de las proteínas heterólogas
Se estableció un proceso de recuperación y purificación de las proteína heterólogas
por FPLC, equipado con una columna de exclusión molecular para resolver la mezcla de
proteínas contenidas en la fracción de 30-3 kDa. Se utilizó el equipo ÄKTApurifier (UPC
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900 GE) con sistema de control UNICORN realizando la detección a 254 nm utilizando la
lámpara de Hg; este equipo fue acoplado a una columna de filtración en gel Superdex 75
10/300 GL (17-5174-01 GE) con un volumen de columna de 24 ml, límite exclusión de 1 x
105, un rango de separación optimo de 3-70 kDa para proteínas globulares, un rango de
flujo recomendado de 0.5-1.0 ml/min máximo 1.5 ml/min, una presión máxima de 1.8 MPa,
volúmenes de muestra de 25-500 µl. Las condiciones de elución fueron bajo un gradiente
isocrático, 1.5 volumen de columna con un buffer de fosfatos 50 mM, 0.15 M NaCl, pH
7.0, un flujo de 0.4 ml/min y 300 µl de volumen de muestra.
Los marcadores de peso molecular empleados fueron: A) Transferrina (80 kDa) 1
mg/ml, Apomioglobina (17 kDa) 1 mg/ml, Ribonucleasa A (13.7 kDa) 1 mg/ml y
Citocromo C (12.4 kDa) 1 mg/ml; B) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml, Lisozima (14.3 kDa) 0.5
mg/ml y Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml; C) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml, Insulina (5.8 kDa) 1
mg/ml y Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml. Así como la muestra de 30-3 kDa de la línea p14
transformada con el cDNA de proinsulina. Lo anterior en un volumen total de 300 µl.
Colectando fracciones de 1 ml en cada corrida.
7.16 Western Blot para proteínas purificadas por FPLC
Con el objetivo de detectar las proteínas heterólgas en las fracciones purificadas por
FPLC se realizaron ensayos de Western Blot utilizando un anticuerpo primario precedido
de una separación en geles de acrilamida, según lo reportado previamente por García López
(2014).
Las muestras se cargaron en geles de poliacrilamida (16.5% T; 6% C; 6 M de urea)
en condiciones desnaturalizantes- no reductoras (SDS-PAGE) como se mencionó antes. La
electro transferencia a membrana de PVDF se realizó a 253 mA, por 60 min. 4ºC. Se
bloqueó la membrana con 5% de leche libre de grasa durante toda la noche y
posteriormente se incubó por 1 hr a temperatura ambiente con el anticuerpo primario a una
dilución 1:2000, según lo recomendado por el proveedor del anticuerpo, así como con el
anticuerpo secundario (dilución 1:15000 recomendado) marcado con HRP. Para el revelado
y detección se añadió el sustrato LUMINATA FORTE (WBLUF0100 de Millipore) y se
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visualizó la quimioluminiscencia por revelado en las placas fotográficas Kodak (MXB
6040331).
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8 RESULTADOS
8.1 Efecto de reguladores de crecimiento sobre diferenciación de explantes y formación de raíces
Con el objetivo de investigar si con el uso de reguladores de crecimiento se podía
favorecer el establecimiento de raíces transformadas en los cultivos, mediante un diseño de
cuadrados latinos (Tabla 4), se evaluó el efecto de tres reguladores del crecimiento (BAP,
NAA y GBA) a cinco niveles sobre la diferenciación de explantes, específicamente hacia la
formación de raíces a partir de explantes de raíz, hoja e hipocotilo (Figuras 12-19). Los
tratamientos se realizaron aleatoriamente por triplicado colocando los tres tipos de
explantes en cada unidad experimental (Cajas de Petri de 12 cm con 15 ml de medio de
cultivo MS suplementado con 30 g/l de sacarosa) y los resultados sobre la diferenciación de
tejido hacia la formación de callo, raíz y brotes se evaluaron a la primera (Figuras 12) y
segunda (Figura 13) semana de incubación. A las dos semanas de iniciado el experimento
las observaciones sobre la diferenciación fueron más evidentes, observándose respuestas
diferentes para cada tipo de explante. Estas observaciones sobre el efecto de los reguladores
sobre la diferenciación de explantes se apreciaron con más detalle produciendo graficas de
contorno (Figuras 14, 16, 18) y superficie de respuesta (15, 17, 19). En general, la zona que
favorece la formación de raíz a partir de explantes de raíz (Figura 14A), corresponde a las
concentraciones de 0 y 5 mg/l de BAP combinada con 0.05-5.0 mg/l de NAA. A
continuación se presentan los resultados en detalle para cada tipo de explante.
8.1.1 Explantes de raíz
En los tratamientos con explantes de raíces (Figuras 12 y 13), se observó que en los
tratamientos 2 (0.05 mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 3 (0.5 mg/l NAA - 0
mg/l BAP – 0.5 mg/l GA3 ) se favoreció la ramificación del tejido radicular, mientras que
en los tratamientos 6 (0 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 7 (0.05 mg/l
NAA – 0.05 mg/l BAP – 0 mg/l GA3 ) se favoreció sólo la elongación del explante. Como
se aprecia en las figuras 12 y 13, en ambos casos no se observó la formación de callos.
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Tabla 4.Tratamientos del diseño experimental para evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre
el crecimiento y diferenciación de tejido en explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli
Medio MS
(3% sacarosa,1.8 g/l fitagel)
NAA (Auxina) mg/L
0 0.05 0.5 5.0 10.0
BAP
(CITOCINA)
mg/L
0 TI
A
100 ml MS
0 NAA
0 BAP
0 GA3
T2
B
99.99 ml MS
5 µl NAA
0 BAP
5 µl GA3
T3
C
99.9 ml MS
50 µl NAA
0 BAP
50 µl GA3
T4
D
99 ml MS
500 µl NAA
0 BAP
500 µL GA3
T5
E
98 ml MS
1 mL NAA
0 BAP
1 ml GA3
0.05 T6
B
99.99 ml MS
0 NAA
5 µl BAP
5 µl GA3
T7
A
99.99 ml MS
5 µl NAA
5 µl BAP
0 GA3
T8
E
98.45 ml MS
50 µl NAA
5 µl BAP
1 ml GA3
T9
C
99.445 ml MS
500 µl NAA
5 µl BAP
50 µl GA3
T10
D
98.495 ml MS
1 mL NAA
5 µl BAP
500 µL GA3
0.5 T11
C
99.9 ml MS
0 NAA
50 µl BAP
50 µl GA3
T12
D
99.445 ml MS
5 µl NAA
50 µl BAP
500 µL GA3
T13
A
99.9 ml MS
50 µl NAA
50 µl BAP
0 GA3
T14
E
98.45 ml MS
500 µl NAA
50 µl BAP
1 ml GA3
T15
B
98.945 ml MS
1 mL NAA
50 µl BAP
5 µl GA3
5.0 T16
D
99 ml MS
0 NAA
500 µL BAP
500 µL GA3
T17
E
98.495 ml MS
5 µl NAA
500 µL BAP
1 ml GA3
T18
B
99.445 ml MS
50 µl NAA
500 µL BAP
5 µl GA3
T19
A
99 ml MS
500 µl NAA
500 µL BAP
0 GA3
T20
C
98.45 ml MS
1 mL NAA
500 µL BAP
50 µl GA3
10.0 T21
E
98 ml MS
0 NAA
1 ml BAP
1 ml GA3
T22
C
98.945 ml MS
5 µl NAA
1 ml BAP
50 µl GA3
T23
D
98.45 ml MS
50 µl NAA
1 ml BAP
500 µL GA3
T24
B
98.495 ml MS
500 µl NAA
1 ml BAP
5 µl GA3
T25
A
98 ml MS
1 mL NAA
1 ml BAP
0 GA3
Los 25 tratamientos se realizaron aleatoriamente por triplicado y tres explantes de cada uno de los tres tipos
explantes (hoja, hipocotilo, raíz) colocados en cada unidad experimental (Cajas de Petri de 12 cm con 15 ml
de medio de cultivo MS suplementado con 30 g/l de sacarosa.
A diferencia de los anteriores tratamientos, en todos los demás se observó primero
la formación de callo y enseguida diferenciación a raíz. Este comportamiento fue muy claro
después de dos semanas en los tratamientos donde la concentración de NAA fue de 5-10
mg/l y de 0.05-0.5 mg/l, donde se observó la formación de callo de manera abundante
(Figura 13). Esto se apreció más claramente en las gráficas de contorno y dispersión para la
diferenciación de explantes de raíz (Figura 14). En esas gráficas se puede apreciar que el
GA3 no influyó de manera significativa la formación de raíz a partir del tejido radicular del
explantes. Esto sugiere que el efecto principal de diferenciación podría ser producido por la
BAP, debido al rango más amplio de concentración de ese compuesto donde las que se
favorece la formación de raíz.
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Figura 12. Matriz de 25 tratamientos, en la primera semana, para evaluar el efecto de los reguladores de
crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli.
De la superficie de respuesta y dispersión para la diferenciación de explantes de raíz
a raíz (Figura 15), se observan dos máximos un de respuesta del 100% (color naranja) para
formación de raíz en las concentraciones de BAP y NAA mencionadas arriba, donde dado
la dispersión de los tratamientos (Figura 15B y 15D) se confirma que el GA no ejerce un
efecto significativo.
Con respecto a la formación de brotes, se pueden apreciar que se ve favorecida en
las zonas de más baja concentración de las res hormonas (Figura 13 y color morado en la
Figura 14), y la de callos a concentraciones ligeramente mayores que la de inducción de
brotes (color azul). Estos resultados se podrían utilizar para establecer cultivos de callos
embriogénicos provenientes de las líneas de raíces transformadas o de la planta completa.
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Figura 13. Matriz de 25 tratamientos, en la segunda semana, para evaluar el efecto de los reguladores de
crecimiento sobre la diferenciación de tejido de explantes de hoja, cotiledones y raíz de plántulas de brócoli.
Figura 14. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de raíz para la formación de
brotes, callos y raíces.
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Figura 15. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de raíz para la formación de tejido
radicular.
Estos resultados sobre la reacción de explantes de raíz a distintas concentraciones
BAP, NAA, y GA indican las zonas que promueven de manera favorable el crecimiento y
proliferación de raíz, En general, la zona que corresponde a las concentraciones de 0 y 5
mg/l de BAP combinada con 0.05-5.0 mg/l de NAA; el GA no es necesario. Estas
observaciones fueron consideradas en experimentos posteriores para mejorar la producción
de biomasa por las líneas de raíces transformadas.
8.1.2 Explantes de hipocotilo
Para los tratamientos con explantes de hipocotilo, en ambas semanas se observó
elongación y engrosamiento de los explantes y la formación de callo en ambos extremos
del corte del tejido en todos los tratamientos (Figuras 12 y 13). Dependiendo del
tratamiento estos callos se diferenciaron a la inducción de raíz o a la formación de más
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biomasa en los callos; sin embargo, a diferencia de lo observado con explanes de raíz, en
ningún tratamiento se observó la formación de brotes. Estos resultados sobre la inducción
de callo son similares a los reportados por Qin et al., (2007), pero en ese trabajo reportan la
formación de brotes/callo cuando se utilizaron 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BA (Qin,
Li et al., 2007). Estas diferencias podrían ser debidas al cultivar de brócoli utilizado en cada
estudio.
En el análisis de los resultados de los tratamientos con explantes de hipocotilo por
gráficas de contorno, dispersión y superficies de respuesta (Figuras 16 y 17), se observó
una respuesta natural del tejido a la acción del corte manifestándose en formación de tejido
calloso en el tratamiento T1 (Figura 13), el cual no fue sometido a la acción de ninguno de
los reguladores de crecimiento. La formación de callo (zona color morado) a partir de estos
explantes tuvo lugar en tres zonas: las máximas con 5-10 mg/l de NAA, las zonas mínimas
con 0 mg/l de BAP, en la zona máxima de BAP (10 mg/l) combinada con todas las
concentraciones de NAA y en la zona de 5 mg/l de NAA combinada con todas las
concentraciones de BAP. Sin embargo, a diferencia de los explantes de raíz, en este caso no
se apreció la formación de brotes aún a la segunda semana de cultivo bajo ningún
tratamiento; sin embargo, en estas gráficas también se confirmó lo observado en los
cultivos (Figuras 12 y 13), que bajo cierta combinación de reguladores del crecimiento, una
vez que se forma el tejido calloso en la zona de corte de los explantes, se inicia de manera
preferente la formación de raíz.
Figura 16. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hipocotilo para la formación de
brotes, callos y raíces.
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Observando el grafico de contorno de porciento de formación de raíz a partir de
explantes de hipocotilo (Figura 16A) y la gráfica de dispersión (Figura 16B), muestran que
la a concentraciones bajas de NAA ( 0.05-0.5 mg/l) combinadas con concentraciones de 0-5
mg/l de BAP y otra zona que abarca concentraciones de 8-10 mg/l de NAA, se promueve la
formación de raíz a partir del tejido de hipocotilos sin efecto por el GA (Figura 16B), con
la observación de que primero se aprecia aparición de tejido calloso. Analizando
únicamente la respuesta para la formación de raíces a partir de explantes de hipocotilo
(Figuras 13 y 14) y con apoyo de las gráficas de superficie de respuesta (Figura 17), se
puede observar que solo la zona que abarca concentraciones de 0-0.5 mg/l de NAA y de 0-
5mg/l de BAP favorece al cien por ciento la formación de raíz. En esta zona (naranja) y con
apoyo del gráfico de dispersión (Figura 17B), se confirma que no el GA no afecta la
formación de raíz.
Figura 17. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hipocotilo para la formación de
tejido radicular.
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52
Estos resultados con explantes de hipocotilo concuerdan parcialmente con lo
reportado por Qin et al., (2007), quien encontró que a partir de este tipo de explantes en
medio MS suplementado con 0.5 mg/l de NAA y 3.0 mg/l de 6-BA se inducen brotes/callos
(Qin, Li et al., 2007), a diferencia del presente trabajo donde en esa región se encontró
como respuesta la formación de raíz.
8.1.3 Explantes de hoja
Finalmente, en los tratamientos con explantes de hoja la principal respuesta fue la
presencia y crecimiento acelerado de tejido calloso, en algunos tratamientos acompañado
con la formación de raíces (Figuras 12 y 13). Al igual que la respuesta con los explantes de
hipocotilo, se observó primero la formación de tejido calloso y posteriormente,
dependiendo del tratamiento, generación de raíz a partir del tejido calloso o aumento del
tamaño del mismo. El análisis de estos resultados por gráficas de contorno, dispersión y
superficies de respuesta (Figuras 18 y 19), confirmó una respuesta natural del tejido de hoja
en formación de tejido calloso en el sitio de corte. Al igual que la respuesta con los
explantes de hipocotilo, no se observó respuesta de formación de brote en ninguno de los
tratamientos, además de que se apreció la misma zona para la muerte del tejido (color
naranja en la Figura 18A) y tampoco se detectó un efecto significativo de GA en el gráfico
de dispersión (Figura 18B).
Figura 18. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hoja para la formación de
brotes, callos y raíces.
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53
Figura 19. Efecto de la concentración de NAA-BAP- GA3 sobre explantes de hoja para la formación de
tejido radicular.
Analizando la respuesta para la formación de raíz a partir de explantes de hoja se
observa que esto sucede en un 100 % a concentraciones bajas de NAA y en combinación
con concentraciones bajas de BAP (Figura 19). Nuevamente, el GA no influyó de manera
significativa en la formación de raíz (Figura 20B). Según la gráfica de superficie de
respuesta (Figura 19A), esto sucede a concentraciones de 0.05-00.5 de NAA y muy bajas
de BAP, sin aparente influencia por el GA (Figura 19B).
Es necesario mencionar que hasta la fecha no encontraron reportes en la literatura
respecto al efecto de reguladores de crecimiento sobre la diferenciación y promoción de
raíces a partir de este tipo de explantes.
En resumen, la diferenciación depende del tipo de explante y de la concentración y
tipo de reguladores del crecimiento (Figuras 12 y 13). Para la formación de raíces a partir
de explantes de raíz (Figuras 14 y 15), se requieren 0.05 mg/l de NAA, 0 mg/l de BAP, y
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54
0.05-0.5 mg/l de GA; aunque con 0 – 0.5 mg/l de NAA, 0.05 mg/l de BAP y 0-0.05 mg/l de
GA se favorece la elongación de este explante. Por otro lado, para la formación de raíces a
partir de explantes de hipocotilo, se requieren 0-0.5 mg/l de NAA y 0-5mg/l de BAP
(Figuras 16 y 17). Finalmente, para la formación de raíz a partir de explantes de hoja se
requieren de 0.05-00.5 mg/l de NAA y 0-0.05 mg/l de BAP (Figuras 18 y 19). La presencia
de GA parece ser no requerida para la formación y mantenimiento de raíces a partir de estos
explantes.
De estos resultados se determinó que la concentración a utilizar de NAA, para
cultivos de raíces no transformadas y transformadas, fuera de 0.05 mg/l, sin BAP ni GA.
8.2 Cinético crecimiento y formación de proteína
El objetivo de este experimento fue investigar el comportamiento cinético del
crecimiento y contenido de proteína intracelular y extracelular de los cultivos de raíces
transformadas en comparación con los de raíces no transformadas. De los resultados
anteriores se determinó que la concentración a utilizar de NAA fuera de 0.05 mg/l, sin BAP
ni GA, tanto para cultivos de raíces no transformadas como para los de raíces
transformadas. Para el experimento se incluyeron cultivos de raíces de brócoli no
transformadas (BR) y transformadas por infección de plántulas con la cepa de A.
rhizogenes, la cual lleva el plásmido pRi-1855 del tipo agropina, transformada con el vector
binario pCAMBIA 1105.1 (1105), en ausencia (1105 y BR) o presencia (1105-NAA y BR-
NAA) de 0.05 mg/l de NAA.
8.2.1 Crecimiento
Por lo que respecta a la cinética de crecimiento (Figura 20), la acumulación de
biomasa fresca mostró que todos los cultivos presentaron la curva sigmoide típica, con fase
lag antes de los 3 días, exponencial entre los 2y 9 días y estacionaria entre los 9-15 días
(Figura 20). La mayor cantidad de biomas en los cultivos de raíces transformadas con
respecto a las no transformadas pudiera deberse en parte a la mayor cantidad de inóculo en
los cultivos de raíces transformadas, lo cual concuerda con lo reportado por Jeong et al.,
(2004) para cultivos de raíces transformadas de Panax ginseng, las raíces de brócoli
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55
transformadas (1105), en presencia o ausencia de NAA, notablemente presentan mayor
velocidad de crecimiento y duplican la biomasa inicial después de tres días de cultivo,
mientras que el tiempo de duplicación de raíces no transformadas (BR) fue alrededor de los
seis días, es decir tardan el doble de tiempo que los cultivos transformados. Esto concuerda
con lo reportado en la literatura que indica que las raíces transformadas presentan
velocidades de crecimiento mayores que las no transformadas (Kim et al., 2002a, b, Jeong
et al., 2004, Srivastava y Srivastava 2007, Das et al., 2010).
La presencia de NAA afectó positivamente el crecimiento de ambos tipos de raíces.
El cultivo de raíces transformadas suplementado con NAA muestra una mayor acumulación
de biomasa al llegar a la fase estacionaria que supera los 30 g biomasa fresca/l, superior en
un 20 % al cultivo de raíces transformadas sin NAA. Debe notarse que los cultivos de
raíces transformadas acumuló 3 veces más biomasa que los cultivos de raíces no
transformadas (Figura 20).
Figura 20. Cinética de crecimiento de raíces de brócoli no transformadas y transformadas inducidas con la
cepa silvestre de A. rhizogenes, la cual lleva el plásmido pRi-1855 del tipo agropina, transformada con el
vector binario pCAMBIA 1105.1, en ausencia (1105 y BR) o presencia (1105-NAA y BR-NAA) de 0.05 mg/l
de NAA.
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8.2.2 Variación en la acumulación de proteína total soluble (PTS)
En cuanto a la producción PTS en biomasa (Figura 21), todos los cultivos muestran
un periodo de adaptación de entre 3 y 5 días, donde la producción de proteínas muestra una
tendencia general a disminuir; posteriormente, la producción de proteína se mantiene en
promedio contante en valores de 35 µg PTS/g biomasa fresca.
La presencia de NAA, al igual que en la acumulación de biomasa, afectó
positivamente la acumulación de PTS. En los cultivos suplementados con NAA (BR-NAA
y 1105-NAA), se observó un incremento de PTS durante la fase estacionaria, en 100% y
15% respectivamente, respecto a los no suplementados con NAA. Esto puedes ser debido lo
reportado de que al NAA puede actuar promoviendo el procesamiento de transcritos a
proteínas durante el proceso de transcripción (George et al., 2008a, b), favoreciendo así la
formación de tejido meristemático, el cual se encuentra en las partes apicales de las raíces y
es el metabólicamente más activo dentro del tejido radicular (Rhodes et al., 1994, Gerge et
al., 2008). Es decir, al promover el NAA la formación de tejido meristemático con mayor
actividad metabólica se favorece la formación de proteínas.
Figura 21. Proteína total soluble por gramo de peso fresco. Los cuatro cultivos de raíces muestran un periodo
de adaptación de 3-5 días donde posteriores a ello la producción de proteína se mantiene constante resaltando
que los cultivos suplementados con NAA muestran un incremento en la producción notable desde el día 9,
comparados con los no suplementados.
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8.2.3 Variación en la proteína liberada el medio de cultivo
Con lo que respecta al contenido de proteína en el medio de cultivo, se observó que
en todos los cultivos acumulan cantidades lineales creciente con respecto al tiempo (Figura
22). Se aprecia que este incremento en la proteína extracelular empieza desde el periodo de
adaptación de 3 días para las raíces transformadas y de 6-7 para las normales, y no se
detecta una fase exponencial, pero si se vislumbra un decaimiento en la velocidad de
acumulación entre los 1-15 días , cuando los cultivos se encuentran en la fase estacionaria.
Debe notarse que las raíces transformadas muestran el doble de proteína respecto a las no
transformadas. Siguiendo el razonamiento expresado en la sección anterior para la proteína
intracelular, esto debe ser inherente a su acelerado crecimiento y por ende mayor actividad
metabólica en comparación con las normales.
Nuevamente el NAA afecta positivamente la cantidad de proteína extracelular, pero
el efecto es más claro en los cultivos de raíces no transformados. Entre las raíces no
transformadas se observa una diferencia del 10 % mayor de exudados proteicos cuando se
adiciona NAA; mientras que en los cultivos de raíces transformadas no se aprecia una
diferencia significativa ni un comportamiento diferente en el perfil de acumulación de
proteína cuando están o no adicionadas con NAA.
Figura 22. Cinética de proteína total soluble presente en el medio de cultivo. Se observó para todos los
cultivos el aumento en la cantidad de exudados proteicos con respecto al tiempo observándose un
comportamiento exponencial para todos los casos. De igual manera hay un doble de actividad en los cultivos
transformados en comparación con los normales.
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8.3 Establecimiento de nuevo protocolo para inducción de raíces transformadas
Con los resultados anteriores, el objetivo de esta sección fue el establecimiento de
un protocolo mejorado respecto al usado en la tesis de Maestría para la inducción de
cultivos de raíces transformadas de brócoli (Figura 23). Para fines de control y comparación
se estableció también el protocolo para el establecimiento de cultivos de raíces no
transformadas (Figura 24A). Varias de las actividades de este bloque experimental se
realizaron paralelamente a las anteriores y al mantenimiento de los cultivos, tanto de raíces
no transformadas. , como transformadas con A. rhizogenes LBA9402 y con A. rhizogenes
pCAMBIA1105.1 (Figura 24B-C), obtenidos a partir de los protocolos establecidos en el
trabajo de Maestría. De estos cultivos fue posible generar biomasa suficiente para los
estudios sobre las cinéticas de crecimiento y efecto de la presencia de NAA descritos en la
sección anterior.
Figura 23. Cultivos de raíces de brócoli no transformadas (A) y transformadas con Agrobacterium rhizogenes
LBA9402 (B) o con Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1 (C) utilizando el protocolo de Maestría y
mostrando sus diferencias morfológicas y pilosidad (panel medio), resistencia a higromicina (leyenda) y
niveles de expresión de GUS (panel inferior). Las micrografías tomadas se realizaron a 100X.
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Figura 24. Nuevo protocolo para la inducción de raíces transformadas. Mediante la punción de hipocotilos de
plántulas de brócoli de 1 semana de edad, con una jeringa infestada con A. rhizogenes (A = 0.8-1), se obtienen
raíces aéreas en el punto de punción e 1-2 semanas. Las raíces se propagan en medio SH semisólido y/o
líquido con vitaminas y Cefotaxima (100 µg/ml). Las positivamente transformadas con el plásmido
pCAMBIA1105.1 o construcciones derivadas de este deben dar respuesta positiva a la reacción de β-
Glucuronidasa (GUS) y mostrar resistencia a higromicina.
El protocolo desarrollado en el proyecto de Maestría para el establecimiento de
cultivos de raíces transformados a partir de la infección de hipocotilos de brócoli fue
mejorado sustancialmente por el uso de plántulas de una semana de edad en vez de
plántulas de 2-4 semanas (Figura 24): la eficiencia de transformación del tejido radicular
pasó de un 50 % a un 100 % en el protocolo actual sin necesidad del uso de agentes
estimulantes como la acetosiringona remendad por otros autores como Henzi, Christey et
al., (2000). Se atribuye el aumento en la eficiencia de transformación a que las plántulas
más jóvenes, que aunque su hipocotilo es más endebles y pueden tender a romperse
fácilmente, son más propensos a la infección, quizá porque el tejido es menos diferenciado
que los usados en los eventos anteriores donde se utilizaban plántulas de 2 a 4 semanas de
edad.
Utilizando el nuevo protocolo, aunque con rendimientos variables, se obtuvieron
líneas transformadas por infección con la cepa silvestre A. rhizogenes LBA9402 (9402), y
la misma transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105), y con las construcciones
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pCppINS (pp11) que lleva el cDNA codificante para preproinsulina, y la pCpINS (p14),
que lleva el cDNA codificante para proinsulina. Estas líneas de raíces presentaron
velocidades de crecimiento (medidos como factor de elongación FE) adecuadas y
produjeron resultados positivos a la reacción de β-Glucuronidasa (Tabla 5). Por lo tanto
deben llevar el T-DNA del plásmido pCAMBIA con los fragmentos de cDNA codificante
para los fragmentos de la preproinsulina y proinsulina.
Tabla 5. Factor de elongación de raíces en cultivo in vitro
LINEA F. E.
cm/d
Reacción
β-Gluc
Wt 0.2 -
9402 0.3 -
1105 0.4 +
pp11 0.3 +
p14 0.4 +
Las líneas de raíces se establecieron de acuerdo a la metodología descrita
en la Figura 13a partir de plántulas de brócoli (WT) y raíces aéreas
generadas en los sitios de punción de plántulas infectadas con A. rhizogenes
LBA9402 (9402), A. rhizogenes LBA9402 transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105), con la construcción pCppINS (pp11) que lleva el
cDNA codificante para preproinsulina, y con la construcción pCpINS (p14)
que lleva el cDNA codificante para proinsulina.
Debe mencionarse que las líneas de raíces transformadas con el plásmido
pCAMBIA y las construcciones derivadas de este, llevan el gen GUS, por lo que deben dar
reacción positiva para la expresión de esta enzima β-glucuronidasa, la cual en estos cultivos
se pudo observar tanto en el tejido, a lo largo del tejido radicular o sólo en algunas zonas
específicas del tejido donde se observan precipitados azules localizados (Figuras 23 y 24),
como en el medio de reacción (panel inferior en la Figura 24). Esto indica claramente que
esta enzima es intracelular y además puede ser excretada al medio de cultivo cundo se
cultiva en medio líquido.
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Varias líneas de raíces transformadas fueron probadas posteriormente para evaluar
el rendimiento y pureza de su DNA genómico (Tabla 6). Los rendimientos de DNA, si bien
fueron muy variables, produjeron cantidades suficientes para utilizar ese DNA como
templado para amplificar el DNA foráneo por reacciones de PCR, aun cuando las purezas
rindieron valores de 0.7 – 1.1. Debe mencionarse que los valores de pureza para considerar
un DNA altamente puro van de 1.8 – 2.0.
Tabla 6. Rendimiento y pureza de DNA genómico de raíces no transformadas (Wt) y
transformadas de Brócoli* utilizadas en este estudio
El DNA fue extraíido de raíces no transformadas (Br-Wt) y de raíces ransformadas con A. rhizogenes LBA
9402 (Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402 transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (Br-
pC1105) y con las construcciones pCpINS (línea p14, Br-pCpINS). Las claves corresponden a los carriles de
la Figura 25.
Finalmente, utilizando estos DNA genómicos como templado, mediante PCR
utilizando los primers para la amplificación del fragmento de 365 pb del cDNA de la
proinsulina a partir de DNA del genoma de línea de raíces no transformadas de brócoli (2.
Br-Wt), raíces de brócoli transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (3, Br-9402-1), A.
rhizogenes LBA 9402 transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (4, Br-pC1105)
y con las construcciones pCpINS (línea p14, Br-pCpINS) en comparación de la reacción de
PCR utilizando como templado el vector pCAMBIA1105 (6, pC1105) y el plásmido
comercial pDNR-LIBins, el cual lleva el cDNA del gen Ins completo, se comprobó la
generación de los fragmentos esperados para demostrar la presencia de los respectivos T-
DNA en las raíces transformadas. Como se esperaba, solo la línea p14 (carril 5) debería
amplificar igual que el control positivo del carril 1.
LINEA RENDIMIENTO
ng DNAgv/mg biomasa
PUREZA
A269/A280
DNAg
Wt 55 0.8 Br-Wt
9402-1 120 1.1 Br-9402-1
1105-1 55 0.7 Br-pC1105
pp11 65 1.0 Br-pCppIns
p14 90 0.9 Br-pCpINS
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Figura 25. Reacción de PCR utilizando los primers para la amplificación del fragmento de 365 pb del cDNA de la proinsulina a partir de DNA del genoma de línea de raíces no transformadas de brócoli (2. Br-Wt), raíces
de brócoli transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (3, Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402
transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (4, Br-pC1105) y con las construcciones pCpINS (línea
p14, Br-pCpINS) en comparación de la reacción de PCR utilizando como templado el vector pCAMBIA1105
(6, pC1105) y el plásmido comercial pDNR-LIBins, el cual lleva el cDNA del gen Ins completo. Como se
esperaba, solo la línea p14 (carril 5) debería amplificar igual que eñ control positivo del carril 1. Las claves de
los carriles corresponden con los de la tabla 6.
8.4 Extracción y cuantificación de proteína
8.4.1 Por método de Bradford
Con el objetivo de determinar la cantidad de proteína total soluble (PTS) en los
cultivos de raíces se preparó una curva tipo utilizando el método de Bradford (Figura
26). La regresión lineal de los datos generó una R2 de 0.98 y una ecuación Y=0.60x +
0.0474. Con esta relación se determinó posteriormente la cantidad de PTS en los
cultivos de raíz (Tabla 7). Se encontró que independientemente del tipo de cultivo, se
obtiene en promedio 0.5 mg de PTS por gramo de peso fresco de tejido. Dado el
protocolo de extracción que se aplica se tiene diluido en tres volúmenes de solución con
respecto a un gramo tejido, por lo que el contenido real es 0,15 mg de PTS/ml en
promedio.
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Figura 26. Curva tipo de método Bradfford. Realizando por triplicado la curva tipo para determinar
cantidad de proteína total soluble, se obtuvo una ecuación de la recta con R2 de 0.98.
Tabla 7. Rendimiento de proteína en cada línea de cultivo establecida
La proteína total soluble fue extraída y utilizada para determinar los rendimientos de proteínas
heterólogas en las líneas de raíces correspondientes; las no transformadas (Br-Wt) y de raíces transformadas con A. rhizogenes LBA 9402 (Br-9402-1), A. rhizogenes LBA 9402
transformadas con el vector vinario pCAMBIA1105 (Br-pC1105) y con las construcciones
pCpINS (línea p14, Br-pCpINS). Las claves corresponden a los carriles de la Figura 25.
LINEA F. E.
cm/d
Rx
GU S
PTS INSh
ELISA
mg/g mg/ml µg/ml
Wt 0.2 - 0,38 0,13 0.00
9402-1 0.4 - 0,36 0,12 0.04
1105-1 0.4 + 0,51 0,17 0.09
p14 0.4 + 1.03 0,34 0.25
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8.4.2 Por método de ELISA
Con el objetivo de cuantificar la producción de proteínas heterólogas se utilizó un
método ELISA mediante un kit que se utilizó asegura la detección de insulina sin reacción
cruzada con otras proteínas como proinsulina. Para ello se preparó un curva tipo y la
ecuación de la línea correspondiente en µUI/ml y en µg/ml, ambas con un coeficiente R2 de
0.96 (Figura 27).
Figura 27. Curva tipo de prueba de ELISA para INS humana. En base a los datos de estas curvas se
determinó la cantidad de Insulina humana en el extracto de la línea de raíces transformadas p14, en relación a
extractos negativos, sin insulina, obtenidos de raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402
silvestre (Wt, 9402) o transformada con el plásmido pCAMBIA 1105 (1105). La detección está en el orden de los 8 ng/ml y 250 µUI/ml como máximo.
Se debe recordar que nuestros cultivos están transformados con el cDNA de
proinsulina por lo que se esperaría una reacción negativa a ello, sin embargo, el extracto
proteico del cultivo p14 fue positivo a esta prueba detectando 0.25 µg/ml (Tabla 7), no así
los extractos correspondientes a las otras líneas (Wt, 9402 y 1105), lo que nos hace suponer
que en los cultivos que se establecieron transformados con el cDNA de proinsulina no solo
se está expresando este precursor, sino que se está llevando a cabo un procesamiento como
sucede de manera in vivo en las células β del páncreas de tal manera que el productor
resultante es positivo al confrontarlo con esta prueba.
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8.5 Purificación de la proteína heteróloga
8.5.1 Perfil proteico mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
Con el objetivo de investigar la presencia de las proteínas heterólogas en los
extractos de raíces transformadas y establecer condiciones experimentales para evaluar la
expresión de proteínas heterólogas en los extractos, se buscaron condiciones para observar
por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) el perfil proteico de los extractos
obtenidos en regiones de peso molecular (kDa) correspondientes a la preproinsulina (12
kDa) y a la proinsulina (9 kDa) que son los precursores que se expresan de manera directa
por el cDNA insertado y descrito con anterioridad, así como de la proteína procesada y
producto final de interés, la insulina (5.8 kDa). Para poder observar de manera completa el
perfil proteico y la zona menor a 50 kDa con buena resolución se utilizaron dos
concentraciones diferentes de poliacrilamida; 10% T y 3% C para el gel espaceador y 16.5
% T y 6 % C para el gel separador, en minigeles con dimensiones de 9cm x 1cm x 1mm y
9cm x 4cm x 1mm respectivamente (Figura 28).
Bajo las condiciones mencionadas podemos ver el perfil completo de los extractos
proteicos desde los 200 kDa o menos (usando un máximo de 4 µg de extracto) y las
diferentes especies de INS std; 5.8 kDa o 3.4 kDa y 2.4 kDa (cadenas unidas y separadas
respectivamente) con un límite de detección de 500 ng por banda usando tinción con
Coomasie.
Sabiendo las condiciones de esta técnica para dar seguimiento a la fracción proteica
de nuestro interés se procedió al primer paso de purificación planteado que es
concentración-fraccionamiento-desalado de los extractos usando tubos Amicon Ultra. Un
primer paso fue utilizar tamaño de corte de 30 kDa- 10 kDa y 3 kDa para extractos de la
líneas p14 (+ INS) 1105 (-INS) y 1105 spik (alimentada con INS) Figura 29.
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Figura 28. Condiciones de SDS-PAGE para observar el perfil proteico y el estándar de INS. Arriba: se
determinó trabajar con la concentración de 1.5 µg/pozo de INS std y los extractos proteicos de las líneas no
muestran deferencias en el perfil de pt esto observando concentración de 0.5-4 µg/pozo. Abajo: se corroboró
el perfil de corrimiento de diferentes MPMs junto con muestras de INS std para verificar el corrimiento y
resolución, también se observó por spiking (adición de Insulina estándar) el comportamiento del mismo en un
extracto crudo.
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8.5.2 Fraccionamiento, concentración y desalado de extractos proteicos
Para concentrar los extractos proteicos, previo al proceso de purificación, las
muestras fueron fraccionadas de acuerdo al peso molecular y desaladas pasando los
extractos proteicos a través de tubos Amicon Ultra. Las presencia y cantidad de proteínas se
monitoreó por PAGE (Figura 29).
Figura 29. Fraccionamiento con tubos Amicon de 30 y 3 kDa. Se observa teñido con Coomasie (Izquierda)
y con Plata (Derecha) el patrón de fraccionamiento usando tubos Amicon de 30 kDa de corte para separar el
grueso del extracto de la fracción más pequeña y tubos de 3kDa para concentrar la fracción de 30-3. Si bien se
puede separar gran cantidad de proteína para simplificar la purificación trabajando con proteínas menores a 50
kDa, la prueba de spiking por adición de Insulina estándar nos revelo que incluso usando un corte de 30kDa
se encuentra retenida en la fracción gruesa un remanente de la Insulina adicionada.
Se obtuvieron fracciones de 250 a 500 µl concentradas de 2 a 3 veces la
concentración inicial y separadas con base al tamaño de corte utilizando, recordemos que
esto es para proteínas en estado globular, es decir en una asociación tridimensional
determinada, misma que se forma con la insulina, la cual se asocia para formar dímeros,
tetrámeros, y preferentemente hexámeros como hemos descrito anteriormente y aun así se
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presume la asociación de estructuras más complejas, superiores a los 36 kDa. Estas
asociaciones se dan debido a condiciones de concentración de INS, pH y iones divalentes
(Zn +2
). Es decir en condiciones normales a pH fisiológico y concentraciones de 1 ng/ml se
favorece el estado monomérico, en soluciones farmacéuticas a pH de 7.0-7.8 por cada 100
UI (3.5 mg/ml) se añaden 0.017 mg de óxido de zinc para asegurar el estado más estable
(hexamérico), sin embargo es solución cercana al punto isoeléctrico (pI 5.4) se favorece un
estado monomérico y añadiendo un agente quelante (EDTA) se puede obtener una solución
de insulina en dicho estado, recordando que la asociación hexamérica y estos fenómenos se
describen desde el precursor proinsulina.
Figura 30. Fraccionamiento con tubos Amicon de 10 y 3 kDa. Se observa teñido con Coomasie (Izquierda)
y con Plata (Derecha) una retención completa de INS std en la fracción de10 kDa. Asi mismo en esta fracción
se detectan diferencias de expresión por debajo de los 20 kDa en la línea de raíces transformadas con el
cDNA de proinsulina (9 kDa), lo cual lógicamente no se observó en la línea 1105. La prueba de spiking
revelo que usando un corte de 10kDa se encuentra retenida en la fracción gruesa la Insulina (INS) adicionada.
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Trabajando con tamaños de corte de 10 y 3 kDa (Figura 30), se observó que hay
retención completa de la Insulina estándar (INS) en la fracción gruesa de 10 kDa (por lo
menos en los límites de concentración detectables por PAGE) y la fracción concentrada de
10-3 y con poca variedad detectable de proteínas de bajo peso molecular, asi mismo para la
fracción diluida 3 kDa.
Con lo anterior se propuso trabajar bajo condiciones que promuevan el estado
monomerico (5.8 kDa) como ya se mencionó anteriormente (pH 5.0 y 2 mM de EDTA)
para posteriormente aplicar el fraccionamiento de 30 y 3 kDa y separar del grueso de
proteínas de los extractos, las proteínas que nos interesan.
Se partió de un total de 60 g de biomasa acumulada en diferentes estadios de
crecimiento de la línea p14, para obtener un extracto crudo de 150 ml con una
concentración de proteína total soluble de 0.34 mg/ml y que contiene 0.31 µg INS/ml. Se
aplicó el tratamiento con tubos Amicon de 30 y 3 kDa (Figura 30), donde se obtuvieron las
fracciones siguientes mostradas en la Tabla 8. Se obtuvo un volumen de 2 ml
correspondientes a la fracción de 30 y 3 kDa, que mostró por análisis en PAGE concentrar
tamaños moleculares de proteína similares a los deseados.
Tabla 8. Fracciones obtenidas de la línea p14
FRACCION PTS
(mg/ml)
VOL. TOTAL
(ml)
PT
(mg)
˃ 30 p14 2.28 2.0 4.56
30-3 p14 0.49 2.0 0.98
˂ 3 p14 0.013 18 0.234
La proteína total soluble de la línea p14 (Br-pCpINS) fue fraccionada, concentrada
y desalada con los tamaños de corte de ˃ 30 p14, 30-3 p14 y ˂3 p14. Se generó un
cantidad aproximada de 1 mg para la fracción 30-3 p14 con tamaño de corte de 30-
3 p14, que monitoreada por PAGE,como se mencionó en la Figura 29, nos llevó al
siguiente proceso de purificación.
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8.5.3 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR POR FPLC
Con el objetivo de purificar las proteínas heterólogas de la fracción 30-3 p14 kDa
anteriormente mencionada se estableció un proceso de recuperación y purificación de las
proteínas heterólogas por FPLC equipado con una columna de exclusión molecular para
resolver las proteínas heterólogas de interés a partir de la mezcla de proteínas en el extracto.
Tabla 9. Marcadores de peso molecular utilizados para FPLC
MARCADOR PTs
A a) Transferrina 80 kDa 1 mg/ml
b) Apomioglobina (17 kDa) 1 mg/ml
c) Ribonucleasa A (13.7 kDa) 1 mg/ml
d) Citocromo C (12.4 kDa) 1 mg/ml
B 1) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml
2) Lisozima (14.3 kDa) 0.5 mg/ml
3) Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml
C I) BSA (66.4 kDa) 1 mg/ml
II) Insulina (5.8 kDa) 1 mg/ml
III) Vit B12 (1.3 kDa) 0.05 mg/ml.
Los marcadores de peso molecular A, B, y C, brindan un amplio panorama del comportamiento de las proteínas en columna de exclusión molecular, Dilucidando el comportamiento en tamaños
de 80 a 1.3 kDa tal como se puede observar en la Figura 31
La fracción se llevó a la columna de exclusión molecular para su separación con
base a tamaños. Para ello se llevó a cabo la calibración del equipo por tamaños utilizando
tres marcadores de peso molecular que se muestran en la Tabla 9 y los cuales abarcan el
rango de resolución óptimo de la columna (70-3 kDa).
Utilizando la información proporcionada por los tres marcadores de peso (A, B y C)
se generó una curva de calibración. Esta no es necesariamente lineal, como lo reporta la
literatura para columnas de exclusión molecular. Se grafica el pm (kDa) contra tiempo de
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elución (Figura 31), esta curva es polinomial de tercer orden con una R2
de 0.97, y nos
define el comportamiento de las proteínas del marcador por debajo de los 17 kDa. Al
utilizar los cromatogramas en conjunto de todos los marcadores en comparación con la
muestra 30-3 kDa p14 (Figura 32), la ecuación generada por la curva de tercer orden y los
volúmenes de elución de las señales x, y z se determina pesos de 14.7, 13.09 y N.D.
respectivamente. Con esta información y soportando con los determinado por SDS-PAGE
donde la proteína más pequeña que se observó en la fracción concentra 30-3 kDa p14 se
encuentra ligeramente arriba de los 6 kDa.
Figura 31. Calibración de pesos moleculares para la columna de filtración en gel con los tres marcadores.
Cuando se utilizó una mezcla los tres marcadores como patrón de peso, se trabajó con los límites de
resolución óptimo de columna y el comportamiento de las proteínas entre menores a 17 kDa, se obtuvo una
curva polinomial de tercer orden con un coeficiente de correlación aceptable (0.97).
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72
Figura 32. Perfil de elución de la muestra 30-3 kDa p14 y propuesta final de colección de las fracciones.
Se llevó a cabo entonces la colección de fracciones como se muestra en Figura 33.
Figura 33. Fracciones de proteínas obtenidas por exclusión molecular mediante FPLC. Se observó que las
últimas fracciones (x, y z) contienen las proteína con los tamaños moleculares esperados para preinsulina e
insulina. La fracción y presentó las proteínas de pesos moleculares corresponden al la proinsulina (9kDa) e
insulina (5.8 kDa).
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73
El volumen total a purificar de la fracción 30-3 kDa p14 es de 2 ml y por cada
corrida se pudieron trabajar 300 µl, completando la purificación de todo el volumen
realizando 7 corridas. Una vez que se colectaron los volúmenes totales de cada fracción de
interés se determinó proteína total soluble por Bradford y cada muestra se desalo y liofilizó
para tener condiciones para realizar las siguientes pruebas y análisis como SDS-PAGE y
Western Blot.
Figura 34. SDS-PAGE no reductor de las fracciones purificadas, desaladas y concentradas.
Con lo observado por análisis en PAGE es claro que se obtuvo una separación exitosa de
las proteínas por cromatografía de exclusión molecular (Figura 34). La reacción con
anticuerpos por el método de ELISA es específica para insulina y los tamaños de peso
molecular detectados por PAGE indican evidencia de las 2 bandas correspondientes a
insulina y proinsulina.
En resumen, en este sección se muestra que se logró la expresión de la preinsulina en
cultivos de raíces transformadas de brócoli y al parecer esta se transforma en insulina en el
tejido radicular.
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9 DISCUSIÓN GENERAL
Los de este trabajo muestran que se logró positivamente la expresión del cDNA que
codifica para la proinsulina humana en cultivos de raíces transformadas de brócoli. Para
ello se estableciendo las condiciones de cultivo en cuanto al tipo de medio y balance
hormonal. Algo interesante, pero que requiere de mayor experimentación, es que al parecer
la proinsulina transgénica se transforma intracelularmente en insulina.
Por lo que respecta a las condiciones nutricionales básicas, se utilizó el medio
mineral Schenck y Hildebrandt y los resultados del experimento de cuadrados latinos para
evaluar la triple interacción de las fitohormonas reguladoras de crecimiento y
diferenciación. Se establecieron las condiciones de mantenimiento, acumulación de
biomasa y proteína total tanto en esta biomasa como en el sobrenadante del medio de
cultivo. Donde, tal como se esperaba, no necesariamente la adición de los tres reguladores
(GA, BAP y NAA) de manera simultánea tendía un efecto positivo en los objetivos. Se
encontró entonces que la concentración de NAA fuera de 0.05 mg/l para lograr dichos
objetivos anteriormente descritos. Esto dado a que se estimuló el crecimiento y desarrollo
de tejido radicular sin comprometer la estabilidad del mismo y si bien no cambio directa y
significativamente la acumulación de proteína total soluble en la biomasa, si se logró elevar
directamente la cantidad de biomasa acumulada en un periodo de 15 a 20 días y propiciar la
acción metabólica de exudados proteicos al medio de cultivo en comparación de cuando no
se usa NAA.
Por otro parte, se pudo observar la expresión de insulina a partir de su precurso
proinsulina, ya que se seleccionó trabajar con una línea de raíces transformadas con el
cDNA del gen INS a partir de la fragmento que codifica para la proinsulina, y la evidencia
de inmuno ensayo específico para insulina logra detectar niveles considerables de la
proteina. A su vez durante todo el seguimiento via SDS-PAGE se logró detectar proteínas
de pesos moleculares bajos y correspondientes a los 9 y 5.8 kDa para proinsulina e insulina
respectivamente, verificando al final por Western Blot las señales positivas para ambas
bandas de peso molecular descritas ya que los anticuerpos seleccionados para ellos
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aseguran la hibridación con segmentos de ambos péptidos. Cabe destacar que se tomo
ventaja de esos bajos pesos moleculares de proinsulina e insulina, para establecer un
proceso de purificación basado en bajos pesos moleculares que nos permitió trabajar en una
región de poca diversidad proteica para los extractos de proteína total soluble del tejido
radicular.
Unificando ambas vertientes desarrolladas en este proyecto se reafirma el papel de
los cultivos de raíces transformadas de Brócoli como modelo no solo de expresión sino
también de producción de proteínas heterólogas, como lo fue para este caso, la proinsulina
y la insulina humana. Coadyuvando a los modelos biotecnológicos ya establecidos y
comercializados a nivel mundial para ambas proteínas de interés terapéutico y
farmacéutico.
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10 CONCLUSIONES
Usando medio SH se determinaron las condiciones de NAA, BAP y GA3 para
promover la formación de tejido radicular a partir de explantes de raíz, hipocotilo y
hoja.
o Bajo condiciones de 0 mg/l de BAP y 0.05-5.0 mg/l de NAA, se favorece al
100% la formación de raíz a partir de explante de raíz. Específicamente en
los tratamientos 2 (0.05 mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 3 (0.5
mg/l NAA - 0 mg/l BAP – 0.5 mg/l GA3 ) se promueve la ramificación y en
los tratamientos 6 (0 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0.05 mg/l GA3 ) y 7
(0.05 mg/l NAA – 0.05 mg/l BAP – 0 mg/l GA3 ) se promueve la
elongación.
o Los explantes de hipocotilo bajo condiciones de 0-0.5 mg/l de NAA y de 0-
5mg/l de BAP se desdiferencian y se promueve la formación de raíz.
o En concentraciones de 0.05-00.5 de NAA y BAP se promueve la formación
de raíz a partir de explantes de hoja.
La combinación de NAA como auxina y BAP como citocinina en concentraciones
bajas, promueven preferentemente la formación de raíz, a partir de cualquiera de los
tres tipos de explante raíz, hoja, hipocotilo) y no así de brotes. Se determió que la
concentración a trabajar de auxina NAA fuera de 0.05 mg/l para los cultivos
transformados y no transformados promoviendo así la acumulación de tejido
radicular en los cultivos no transformados y transformados
Se estableció y selecionó el cultivo transformado p14. Esta línea de raíces
transformadas integró en su DNA genómico el fragmento de 365 pb correspondiente
a la proinsulina humana. Dicha línea muestra un crecimiento acelerado con una
acumulación de biomasa de el triple en comparación con los cultivos no
transformados.
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La presencia de insulina y proinsulina en los tejidos radiculares fue evidenciada en
extractos de proteina total soluble por inmunoensayo para insulina (ELISA)
obteniendo concentraciones de 0.25 µg/ml. Así mismo se identificaron por pesos
moleculares en SDS-PAGE teniendo pesos correspondientes de 9 y 5.8 kDa para
proinsulina y para insulina respectivamente después de una purificación de
cromatografía de exclusión molecular.
Integrando los resultados se propone utilizar la línea p14 transformada con el cDNA
de proinsulina humana para estableces y refinar un proceso de producción a nivel
matraz con el uso de NAA a concentración de 0.05 mg/l.
De los resultados descritos y la conclusión de los mismos la hipótesis; ―Las raíces
transformadas de Brassica oleracea var itálica expresan los polipéptidos de
proinsulina e insulina bajo condiciones de cultivo apropiadas para su crecimiento y
desarrollo‖, es aceptada
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11 RECOMENDACIONES PARA INVESTIGACIONES FUTURAS
Establecer más líneas de raíces transformadas para realizar estudios comparativos
de productividad de proinsulina e insulina.
Evaluar la expresión a nivel de transcritos
Secuenciar a nivel DNA el material genético de las líneas de raíces transformadas y
a nivel proteína.
Comprobar la actividad biológica de las proinsulina e insulina
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12 PRESENTACIONES EN CONGRESOS
XV International Scientific Congress (CNIC 2010)
- Presentación Oral
28 Junio- 01 Julio de 2010
XLIV Congreso Nacional de Ciencias Farmacéuticas
-Presentación de Cartel
23 al 26 de Octubre de 2011
VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, XVIII Congreso Nacional de
Ingeniería Bioquímica y X Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular
-Presentación de Cartel
- Mejor trabajo del área de Biología Molecular
28 al 30 de Marzo de 2012
VIII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, XIX Congreso Nacional de
Ingeniería Bioquímica y XI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular
-Presentación de Cartel
9al 11 de Abril de 2014
XV International Scientific Congress (CNIC 2015)
- Presentación de Cartel
22 Junio- 26 Junio de 2015
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13 ARTÍCULOS
TITULO
REVISTA AÑO
“Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica (broccoli)”
CENIC Ciencias Biológicas
Vol. 41, 2010
Issn: 0253-5688
2010
“Cultivos de Raíces de Brassica oleracea var italica (Brócoli) transformadas con el cDNA del Gen de la Preproinsulina Humana”
XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero (México). 28, 29 y 30 de marzo 2012. Abstract BML510GRA20120131
.
2012
“Purificación de proinsulina a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica oleracea var italica (Brócoli)”
VIII Congreso Internacional de Ingeniería
Bioquímica, XIX Congreso Nacional de Ingeniería
Bioquímica, 80 Aniversario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, XII Jornadas Científicas de
Biomedicina y Biotecnología Molecular (Mazatlán,
Sinaloa, México; Abril 9-11, 2014). Adán Núñez Arévalo (Ed.). Memorias 2014. CD, Colegio Mexicano
de Ingenieros Bioquímicos. Azcapotzalco, México D. F.
Artículo BML439BGR20140204.
2014
“Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica Oleracea Var (brócoli)”
CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, pp. 434-439, 2015
Issn: 2221-2450
2015
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CINVESTAV – IPN
81
14 REFERENCIAS
Adams, M. J., T. Blundell, et al. (1969). "Structure of Rhombohedral 2-zinc Insulin
Crystals." Nature 224.
Arakawa, T., J. Yu, et al. (1998). "A plant based cholera toxin B subunitinsulin fusion
protein protects against the development of autoimmune diabetes." Nat. Biotechnol.
16: 934-938.
Bais, H. P., J. George, et al. (2001). "influence of exogenous hormones on growth and
secondary metabolite production in hairy root cultures of Cichorium intybus L. cv.
Lucknow local." In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 37: 293-299.
Bell, G. I., R. L. Picket, et al. (1980). "Sequence of the human insulin gene." Nature 284:
26-32.
Bell, G. I., W. F. Swain, et al. (1979). Nature (London) 282: 525-527.
Bhadra, R. and J. V. Shaks (1995). "Statistical design of the effect of inoculum cinditions
on growth of hairy root cultures of Catharanthus roseus." Biotechnol Tech 9: 681-
686.
Bhalla, P. L. and N. Weerd de (1999). "In vitro propagation of cauliflower, Brassica
oleracea var. botrytis for hybrid seed production." Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 56: 89-95.
BioSidus. (2007). from http://www.biosidus.com.
Bliss, M. (1982). The discovery of Insulin. Chicago, University of Chicago Press.
Calva, G., F. Esparza, et al. (2002). "como biorreactores para la producción de
biomoléculas y remoción de xenobióticos." Avance y Perspectiva 21: 1-7.
Calva, G. and J. Pérez (2005). "Plant cell tissue and culture." Tecnocultura 4.
Calva, G. and E. Rios (1999). Aspectos aplicados de la biotecnología. Mexico, D.F.
Cardoza, V. and C. N. Stewart (2004). "Invited review: brassica bitechonology." In Vitro
Cell. Dev. Biol.—Plant 40: 542–551.
Carvalho, E. B., S. Holihan, et al. (1997). Effect of root morphology on reactor design and
operation for production of chemicals. In: Hairy Roots. Reading, UK, Gordon and
Breach.
Chamandosti, F., A. Majd, et al. (2006). "In vitro Plant Regeneration from Callus of
Cotyledons in Canola (Brassica napus L.)." Pakistan Journal of Biological Sciences
9(2): 302-306.
Chan, S. J., P. Keim, et al. (1976). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1964-1968.
Chan, S. J., J. Weiss, et al. (1981). "Biosynthesis and periplasmic segregation of human
proinsulin in Escherichia coli. ." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5401-5404.
Choi, Y.-E., Y.-S. Kim, et al. (2006). Types And Designs Of Bioreactors For Hairy Root
Culture. Plan Tissue Culture Engineering. S. D. Gupta and Y. Ibaraki, Springer
Netherlands. 6: 161-172.
Christen, P., T. Aoki, et al. (1992). "Characteristics of growth and tropane alkaloid
production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium
rhizogenes A4." Plant Cell Rep 11: 597-600.
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
82
Christey, M. C., B. K. Sinclair, et al. (1997). "Regeneration of transgenic vegetable
brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation."
Plant Cell Rep 16: 587-593.
Das, J., I. Chandra, et al. (2010). "In vitro Regeneration of Hairy Root from Brassica nigra
in Response to Differenrt PGRs." Asian J Plant Sci 9(5): 271-275.
David, C. and J. Tempé (1988). "Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea
L. var. botrytis) by Agrobacterium rhizogenes." Plant Cell Rep 7: 88-91.
Deckers, H., M. M. Moloney, et al. (1999). "The case for recombinant production of
pharmaceutical proteins in plants." Annu. Rep. Med. Chem. 34: 237-245.
Delpierre, N. and J. Boccon-Gobad (1992). "An extensive hairy root production precedes
shoot regeneration in protoplast-derived calli of cauliflower (Brassica oleracea var.
botrytis)." Plant Cell Rep 11: 351-354.
Fahey, J., Y. Zhang, et al. (1997). "Broccoli sprouts: An exceptionally rich source of
inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens." Proc. Natl. Acad.
Sci. 94: 10367–10372.
Ferl, R. and A. L. Paul (2000). Biochemistry and Molecular Biology of Plants. USA,
American Society of Plant Physiologists.
García, E. (2009). "Establecimiento de cultivos de raíces de Brassica oleracea var. italica
(brócoli) transformadas con el cDNA del gen1 de la hormona del crecimiento
humano." Tesis de Maestría. Dpto. de Biotecnologia CINVESTAV-IPN, Mexico,
D.F.
García Reyes, B. (2009). Establecimiento de un cultivo de raíces de Brassica oleracea var.
italica (Brócoli) transformadas con el cDNA del gen de la insulina humana.
Biotecnología y bioingeniería. México, D.F., Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del IPN. Maestría: 71.
George, E. F., M. A. Hall, et al. (2008). The Components of Plant Tissue Culture Media I:
Macro- and Micro-Nutrients. Plant Propagation by Tissue Culture. E. F. George, M.
A. Hall and G.-J. D. Klerk, Springer Netherlands: 65-113.
George, E. F., M. A. Hall, et al. (2008). Plant Growth Regulators I: Introduction; Auxins,
their Analogues and Inhibitors. Plant Propagation by Tissue Culture. E. F. George,
M. A. Hall and G.-J. D. Klerk, Springer Netherlands: 175-204.
George, E. F., M. A. Hall, et al. (2008). Plant Growth Regulators II: Cytokinins, their
Analogues and Antagonists. Plant Propagation by Tissue Culture. E. F. George, M.
A. Hall and G.-J. D. Klerk, Springer Netherlands: 205-226.
George, E. F., M. A. Hall, et al. (2008). Plant Tissue Culture Procedure - Background. Plant
Propagation by Tissue Culture. E. F. George, M. A. Hall and G.-J. D. Klerk,
Springer Netherlands: 1-28.
Gutierrez, P., K. Taylor, et al. (1998). "Somatic embryogenesis and shoot regeneration from
transgenic roots of cherry rootstock Colt (Prunus avium X P.pseudocerasus)
mediated by pRi 1855 T-DNA of Agrobacterium rhizogenes." Plant Cell Rep 17:
581-585.
Harper, M. E., A. Ullrich, et al. (1981). "Localization of the human insulin gene to the
distal end of the short arm of chromosome 11." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(7):
4458-4460.
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
83
Henzi, M. X., M. C. Christey, et al. (2000). "Factors that influence Agrobacterium
rhizogenes-mediated transformation of broccoli ( Brassica oleracea L. var. italica)."
Plant Cell Rep 19.
Hilton, M. G. and M. J. Rhodes (1994). "The effect of varying levels of Gamborg´s B5 salts
and temperature on the accumulation of starch and hyoscyamine in batch cultures of
transformed roots of Datura stramonium." Plant Cell Tis Org Cult 38: 45-51.
Hirata, K., M. Horiuchi, et al. (1991). "Effect of near ultrea-violet light on alkaloid
production in multiple shoot cultures or Catharanthus roseus." Planta Medica 57:
499-500.
Hoshino, Y. and M. Mii (1998). "Bialaphos stimulates shoot regeneration from hairy roots
of snapdragon (Antirrhinum majus L.) transformed by Agrobacterium rhizogenes."
Plant Cell Reports 17: 256-261.
Hutton, J. C. (1994). "Insulin secretory granule biogenesis and the proinsulin-processing
endopeptidases." Diabetologia 37: 48-56.
IDF. (2007). "International Diabetes Federation." from http://www.idf.org.
IDF. (2010). "International Diabetes Federation." from http://www.idf.org/.
IDF (2917). International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 8th edn. Brussels,
Belgium: International Diabetes Federation, 2017. http://www.diabetesatlas.org
INEGI (2007). "Estadísticas Demográficas, 2005." Base de datos. CONAPO, INEGI y
COLMEX. .
Jefferson, R. (1987). "Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system."
Plant Mol. Biol. Rep. 5(4): 387-405.
Jeong, G. T., D. H. Park, et al. (2004). "Effects of inoculum conditions on growth of hairy
roots of Panax ginseng C.A. Meyer." Appl Biochem Biotechnol 113(116): 1193-
1203.
Kanakis, S. J., C. Watts, et al. (2002). "The business of insulin pumps in diabetes care:
clinical and economic considerations." Clinical Diabetes 20(4): 214-216.
Karcher, S. (2002). "Blue Plants: Transgenic Plants With The Gus Reporter Gene." ABLE
23: 29-42.
Katsoyannis, P. G., A. Tometsko, et al. (1966). "Insulin peptides XII. Human insulin
generation by combination of synthetic A and B chains." J Am Chem Soc 88.
Kim, Y. J., P. J. Weathers, et al. (2002). "Growth of Artemisia annua hairy roots in liquid-
and gas-phase reactors." Biotechnol Bioeng. 80(4): 454-464.
Kim, Y. J., B. E. Wyslouzil, et al. (2002). "Invited review: secondary metabolism of hairy
root cultures in bioreactors." In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 38: 1-10.
Kung, Y. T., Y. C. Da, et al. (1966). "Total synthesis of crystalline insulin." Sci Sin 15.
Li, D., J. O’Leary, et al. (2006). "Expression of cholera toxin B subunit and the B chain of
human insulin as a fusion protein in transgenic tobacco plants." Plant Cell Rep 25:
417-424.
Lomedico, P. T., S. J. Chan, et al. (1977). J. Biol. Chem. 252: 7971-7978.
Malgor, L. A. and M. E. Valsecia (2000). Farmacología Médica.
McKelvey, S. A., J. A. Gehrig, et al. (1993). "Growth of Plant Root Cultures in Liquid- and
Gas-Dispersed Reactor Environments." Biotechnol. Prog. 9(3): 317-322.
Meena, R. and P. Harish (2001). "Expression systems for production of heterologous
proteins (review article)." CURRENT SCIENCE 80(10): 1121-1128.
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
84
Meienhofer, J., E. Schnabel, et al. (1963). "Synthese der Insulinketten und ihre
Kombination zu insulactiven Präparaten." Z Naturforsch 18: 120.
Moore, H.-P. H., M. D. Walker, et al. (1983). Cell 35: 531-538.
Murata, M. and T. J. Orton (1987). "Callus initiation and regeneration capacities in
Brassica species." Plant Cell, Tissue and Organ Culture 11: 111-123.
Nicol, D. S. H. W. and L. F. Smith (1960). "Amino-acid sequence of human insulin."
Nature 187: 483-485.
Norton, R. A. and G. H. N. Towers (1986). "Factors affecting synthesis of polyacetylenes
in root cultures of Bidens alba." J. Plant physiol. 134: 633-636.
Nykiforuk, C. L., J. G. Boothe, et al. (2006). "Transgenic expression and recovery of
biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds."
Plant Biotechnology Journal 4: 77-85.
Olaiz, R. R., J. R. Aguilar, et al. (2007). "Diabetes mellitus en adultos mexicanos.
Resultados de la Encuesta Nacional de Salud 2000." Salud Publica Mex 49(s331-
s337).
Orci, L., M. Ravazzola, et al. (1986). 1. Cell Biol. 103: 2273-2281.
Orci, L., M. Ravazzola, et al. (1987). Cell 49: 865-868.
Peirce, L. C. (1987). Vegetables: characteristics, production and marketing. NY, Wiley,
NY.
Perez, E. and N. Ochoa (1998). "Regeneration of transgenic plants of Mexican lime from
Agrobacterium rhizogenes transformed tissues." Plant Cell Rep 17.
Peter, R., Shepherd, et al. (1999). "Glucose transporters and insulin action." The New
England Journal of medicine 341(4): 248-257.
Qin, Y., H.-L. Li, et al. (2007). "High-frequency embryogenesis, regeneration of broccoli
(Brassica oleracea var. italica) and analysis of genetic stability by RAPD." Sci Hort
111(3): 203-208.
Rhodes, M. J., A. J. Parr, et al. (1994). "Influence of exogenous hormones on the growth
and secondary matabolite formation in transformed root cultures." Plant Cell Tis
Org Cult 38: 143-151.
Salud, S. d. (1995). "Compendio Histórico. Estadísticas Vitales 1893-1995." Secretaría de
Salud (SSA).
Salud, S. d. (2001). "Estadística de egresos hospitalarios de la Secretaría de Salud 2000."
Salud Publica Mex 43: 494-510.
Salud, S. d. (2002). "Estadísticas de mortalidad en México: muertes registradas en el año
2000." Salud Publica Mex 44: 266-282.
Salud, S. d. (2002). "Morbilidad 1984-2002 en México." Secretaría de Salud (SSA).
versión en CD.
Salud, S. d. (2003). "Morbilidad, 2000. México." Secretaría de Salud 25-51.
Schwartz, T. W. (1990). Molecular Biology of the Islet of Langerhans. Cambridge, UK.,
205, Cambridge University Press.
Shah, S. N., S. R. Joshi, et al. (1997). "History of Insulin." J Assoc Physicians Ind 45: 4-9.
Shepherd, P. R. and B. B. Khan (1999). "Glucose transporters and insulin action." The New
England Journal of medicine 341(4): 248-257.
Shields, D. and G. Blobel (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2059-2063.
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
85
Spano, L., M. Pomponi, et al. (1982). "Identification of T-DNA in the root-inducing
plasmid of the agropine type Agrobacterium rhizogenes 1855." Plant Molecular
Biology 1: 291-300.
Srivastava, S. and A. K. Srivastava (2007). "Hairy root culture for mass-production of high-
value secondary metabolites." Crit Rev Biotechnol 27(1): 29-43.
Steiner, D. F., K. Dochcrty, et al. (1984). J. Cell Bio-chem 24: 121-130.
Stern, Z. and R. Levy (1996). "Analysis of direct cost of standard compared with intensive
insulin treatment of insulin-dependent diabetes mellitus and cost of complications."
Acta Diabetol 33: 48-52.
Tager, H. S. and D. F. Steiner (1974). Annu. Rev. Biochem. 43: 509-538.
Taveira, M., D. M. Pereira, et al. (2009). "In vitro cultures of Brassica oleracea L. var.
costata DC: Potential Plant Bioreactor for Antioxidant Phenolic Compounds." J.
Agric. Food Chem. 57: 1247-1252.
Taya, M., K. Yakura, et al. (1994). "Influence of medium constituents on enhancement of
pigment production by batch culture of red beet hairy roots." J. Ferment. Bioeng.
77: 215-217.
Teuscher, A. (1974). "Treatment of insulin lipoatrophy with monocomponent insulin."
Diabetologia 10: 211-214.
Thim, L., M. T. Hansen, et al. (1986). "Secretion an processind of insulin precursor in
yeast." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6766-6770.
Toivonen, L., S. Laakso, et al. (1992). "The effect of temperature on hairy root cultures of
Catharanthus ruseus: Growth, indole alkaloid accumulation and membrane lipid
composition." Plant Cell Rep 11: 395-399.
Tzfira, T. and V. Citovsky (2006). "Agrobacterium-mediated genetic transformation of
plants:biology and biotechnology." Plant biotechnology 17: 147-154.
Tzfira , T. and V. Citovsky (2006). "Agrobacterium-mediated genetic transformation of
plants:biology and biotechnology." Plant biotechnology 17: 147-154.
Vinther, T.N., Norrman, M., Strauss, H.M., Huus, K., Schlein, M., Pedersen, T.Å.,
Kjeldsen, T., Jensen, K.J. and Hubálek, F., 2012. Novel covalently linked insulin
dimer engineered to investigate the function of insulin dimerization. PLoS One,
7(2), p.e30882.
Wang, Y., Z.-H. Liang, et al. (2001). "Human insulin from a precursor overexpressed in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris and a simple procedure for purifying the
expression product." Biotechnol. Bioeng. 73(74-79).
Wilhelmson, A., S. T. Hakkinen, et al. (2006). "Heterologous expression of Vitreoscilla
hemoglobin (VHb) and cultivation conditions affect the alkaloid
profile of Hyoscyamus muticus hairy roots." Biotechnol Prog 22: 350-358.
Wilson, P. D., M. G. Hilton, et al., Eds. (1987). Fermentation studies of transformed root
cultures. In: International Conference on Bioreactors and Biotransformations.
London, Elsevier.
Yanagita, M., K. Nakayama, et al. (1992). "Processing of mutated proinsulin with tetrabasic
cleavage sites to bioactive insulin in the non-endocrine cell line, COS-7. ." FEBS
Lett. 31: 55-59.
Yu, K. W., H. N. Murthya, et al. (2005). "Ginsenoside production by nayri root cultures of
Panax ginseng: influence of temperature and light quality." J. Biochem. Eng. 23:
53-56.
M. en C. Berenice García Reyes
Biotecnología y Bioingeniería
CINVESTAV – IPN
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