lo que debo recordar de western blot - wordpress.com · las proteínas al tener una carga negativa...

LoquedeborecordardeWesternBlotDefinición

Esunatécnicadeinvestigaciónydiagnosticoqueseutilizaparadetectarlapresenciadeproteínasdeunpesoespecifico

Elprocedimientodemanerageneralconsistenen:

• Unpasodeseparacióndelasmuestrasenunamatrizdeacrilamida(puedeserencondicionesreductorasonativas).

• Unpasodetransferenciadelasproteínasseparadasaunamembrana(nitrocelulosaoPVDF)

• Unpasodeincubacióndelamembranaconelanticuerpoespecificoparalaproteínaquesedeseadetectar.

• Unpasodedeteccióndelaproteínamedianteunareacciónquímicaofísica

Recordemosquelasproteínastendránunpatróndemigraciónquedependerádeeltamañodelamuestraquesedeseadetectar,asícomolaconcentracióndeacrilamidaquetenganuestrogel.

ElSDSeselcompuestoquenospermitirásepararlasmuestrasmediantesumigraciónenlamatrizdeacrilamidacuandoseapliqueunacorrienteeléctrica,demaneraquelasproteínasaltenerunacarganegativa(conferidaporelSDS)lespermitirámigrarhaciaelpolopositivo.

ComosepuedeapreciarenlafiguraanteriorelSDSleconfierealasproteínasunacarganegativadebidoaqueesteseunealasecuenciadeaminoácidoseinhibelaformacióndeestructurassecundarias.

Despuésdelaelectroforesistendremoselsiguienteresultado:

Dondesepuedeapreciarqueelpatróndemigraciónmantienealasproteínasdemayortamañoenlaspartessuperioresdelgel,mientrasqueenlaparteinferiorseaprecianlasproteínasdemenortamaño.Ladiferenciaquetenemosentrecondicionesnativasycondicionesreductorasesjustamentelaadicióndeagentesdesnaturalizantesdeproteínas.Asípodemossaber(encondicionesnativas)elpesoquetienenproteínasconestructurascuaternarias.

Unavezquetenemosnuestrogelconlasproteínasseparadas,comenzamoselprocesodetransferencia,queconsisteenlamigracióndelasproteínasaunamembranaparasuposteriordetección.

Elpasodedetecciónsellevaacabomedianteelusodeunanticuerpoprimarioqueesespecificoparalaproteínaquesedeseadetectaryunanticuerposecundarioqueesespecificoparalaparteconstantedelanticuerpoprimario,deestamaneraelanticuerposecundariosoloseunealanticuerpoprimarioypermiteladetecciónespecificadelaproteínadeseada.

Existendiversostiposdedeteccióncomo:• Colorimétrico:quepermiteladeteccióndelaproteínadeseadamedianteuna

reaccióndeunamoléculaasociadaalanticuerposecundarioconunsustratoquedarácomoproductounaseñalcolorimétrica.

• Quimioluminiscencia:estareacciónesparecidaalacolorimétricasoloqueenelmomentoqueseactúasobreelsustratoseemiteunaseñaldeluzquepuedesercaptadaporunacámaraultrasensible.

• Fluorescencia:Estareacciónserealizamedianteelusodeunrayolaseryesdetectadaporunsistemasensibleaunespectrodeterminadodelaluzvisible(puedendetectarsediversasproteínasalmismotiempo,conelusodediversosfluorocromos).

UnejemplodelusodeWesternBlotenlaclínicaesladeteccióndeanticuerposcontralasdiferentesproteínasdeVIH.Comosepuedeverenlasiguientefiguralosanticuerposespecíficosparalasdiferentesproteínasdevirussehacenpresentesenelsuerodepacientesinfectadosconformelainfeccióncrónicaseestablece.