Amebas de vida libreAmebas de vida libreIntroducciónEpidemiologíaBiologíaPatologíaFormas clínicasDiagnósticoEstudios en León, Nicaragua

Byron Leiva T. MSc., PhDByron Leiva T. MSc., PhDDepartamento de Microbiología y ParasitologíaDepartamento de Microbiología y Parasitología

Facultad de Ciencias MédicaFacultad de Ciencias MédicaUNAN-LeónUNAN-León

IntroducciónIntroducciónAmebas de Vida Libre (AVL) representan un grupo de

amebas, que se encuentran distribuidas ampliamente en la naturaleza, entre las cuales se encuentran las especies de Naegleria, Acanthamoeba y Balamuthia.

AVL son protozoos inofensivos en la naturaleza. En 1965 Malcom Fowler y Rodney F. Carter reportaron

los primeros cuatro casos en humanos.Naegleria fowleri es un amoebaflagelado el cual produce

meningo- encefalitis amebiana primaria (MAP). Varias especies de Acanthamoeba son patógenos

“oportunistas” estas AVL son causantes de Encefalistis granulomatosa amebiana, infecciones en la piel, neumonía y queratitis.

EpidemiologíaEpidemiologíaEsta infección ha sido descrita en forma creciente

en el mundo, principalmente en EUA (en estados del sur, como Florida y Texas), Reino Unido, Australia, Nueva Zelanda y Checoeslovaquia.

En Latinoamérica han sido reportados casos en Venezuela, Brasil, Argentina, México y Perú considerándose estas dos últimas naciones como áreas endémicas.

En el año 2000 se reportó la descripción de 30 casos diagnosticados en Perú desde 1985.

10,000 casos de queratitis amibiana, a nivel mundial, 80% asociado a empleo inadeacuado de lentes contacto.

La meningoencefalits amibianaLa meningoencefalits amibiana

Causada principalmente por las siguientes especies de amebas de vida libre:

Género: NaegleriaN. fowleri

Género: AcanthamoebaA. culbesrtoni A. castellaniA. polyfaga A. astronixisA. rhysopodes

Genero: Balamuthia B. madrillarisGenero: Hartmannella H. vermiformes

Diferencias morfológicas de las amebas de Diferencias morfológicas de las amebas de vida libre causantes de meinigoencefalitisvida libre causantes de meinigoencefalitis

Naegleria AcathamoebaTrofozoito

Tamaño 15 – 25 µm 15 – 50 µmFlagelos presentes AusentesPseudópodos romos EspinososQuiste

Tamaño 7 – 15 µm 10 – 25 µmPared delgada doble

Naegleria, Acanthamoeba, Hartmanella 6

Naegleria fowleriNaegleria fowleri MorfologíaMorfología

Acanthamoea

Negleria

Amebas de vida libre trofozoitos

Balamuthia mandrillaris

Los trofozoitos miden de 15 a 60 m.μLos quistes miden de 15 a 30 m de diámetro μ

y tienen una triple pared

Vías de penetración de las amebas de vida Vías de penetración de las amebas de vida libre causantes de meningoencefalitislibre causantes de meningoencefalitis Naegleria:

Puerta de entrada : mucosa nasalInvasión del bulbo olfatorio a través de la placa cribiforme

Acanthamoeba:Puerta de entrada no determinado. Puede ser. Tracto respiratorio superior, piel, conjuntiva ocular.Diseminación hematógena al cerebro

Ciclo de vidaCiclo de vida

HÁBITAT DE AMEBAS DE VIDA LIBRE

PatologíaPatología

Acanthamoeba

N. fowleri

Naegleria fowleriNaegleria fowleri. . Naegleria spp. es un género de protistas

de la familia Vahlkampfiidae, en la clase Heterolobosea.

Actualmente se reconocen 8 tipos de N. fowleri, que se distinguen mediante pruebas de secuenciación de DNA

Factores patogénicos de Factores patogénicos de N. fowleriN. fowleri N. fowleri penetra vía nasal placa cribiforme → →

neuroepitelio olfatorio espacio subaracnoideo → →parénquima cerebral.- Tamaño del inóculo y virulencia de la cepa.- Mecanismos de contacto.- Fagocitosis. Altamente fagocítica. Utiliza amebostomas. - Proteína CD59-like en su superficie. Inhibe formación poro MAC (Complejo de ataque a la membrana). - Fosfolipasa, y actividad de neuraminidasa o elastasa – desmielinización, lisis celular. - Proteína formadora de poros – lisis celular.- Proteína citopática – apoptosis.- Actualmente se cuenta con el genoma mitocondrial completo de N. fowleri, y un segmento de 60 kb del genoma nuclear. Es importante para la patología y el diagnóstico

Patología de la meningo encefalitis amibiana Patología de la meningo encefalitis amibiana primariaprimaria

Naegleria:Meningitis purulenta y ecefalitis

hemorrágica necróticaLesiones en área olfatoria, cerebro

anterior y cerebelo.

Cuadro clinicoCuadro clinico Los signos y síntomas inician en promedio 1 -7 días después de la

exposición, el curso de la enfermedad es fulminante, con una mortalidad del 95%, habitualmente dentro de los 10 - 15 días posteriores a la aparición de manifestaciones clínicas:

Cefalea bifrontal, bitemporal Fiebre elevada Náusea, vómito Cambios en la conducta (irritabilidad, conductas aberrantes) Datos de irritación meníngea Confusión Convulsiones Parálisis pares craneales (III, IV, VI) x edema cerebral Progreso rápido hacia el coma Muerte: hipertensión intracraneal herniación cerebral paro ⇒ ⇒

cardiopulmonar

El género El género AcanthamoebaAcanthamoebaGrupo con alrededor de 24 especies, ha

sido reclasificado en 15 diferentes genotipos. La especie predominante en gran parte de

los casos corresponde al genotipo T4, y se sugirió que fuera denominado complejo A. castellanii (Booton G, Visvesvara G, et al. 2005.)La infección es de presentación insidiosa (semanas, meses). Vías de entrada de los trofozoítos: piel, aparato respiratorio bajo, nasal.

La infección del SNC asociada a La infección del SNC asociada a AcanthamoebaAcanthamoeba La mayor parte de los casos a personas

inmunocomprometidas, con HIV+/SIDAQuimioterapiaEnfermedades crónicas, debilitantes,

diabetes, lupus sistémico, cáncer, desnutrición y alcoholismo, TB, otras.

También influye el empleo excesivo de esteroides y antibióticos.

Factores patogénicosFactores patogénicos Las células inmunes presentes en cerebro sugieren un

desequilibrio en los niveles de citocinas, con sobreproducción de citocinas proinflamatorias.- Adhesión a células de la barrera hematoencenfálica (endotelio capilar, plexos coroides, membrana de la coroides) mediante la proteína de unión de la manosa (BMP) expresada en el trofozoíto.- Las serin-proteasas de Acanthamoeba alteran la integridad de la barrera hematoencefálica: degradan las uniones estrechas, incluyendo la zonal ocluddens1 y la ocludina.- Inducción de apoptosis- Fagocitosis mediante las llamadas copas de alimentación o amebostomas.- Se ha caracterizado una proteína formadora de poros, acantoporina.

Características clínicas de la Características clínicas de la meningoenceflitis por meningoenceflitis por AcanthamoebaAcanthamoebaEn pacientes inmunodeprimidos o con

enfermedad debilitante.Comienzo insidiosoAlteraciones mentales, alucinaciones,

convulsiones, cefalea, fiebre, signos de meningismo.

LCR purulento y con examen bacteriológico negativo

Síndromes causados por Síndromes causados por AcanthamoebaAcanthamoeba

Meningoencefalitis necrosante granulomatosa focal subaguda y crónica

Lesiones dermatológicas semejantes a micosis profundas

Ulceración corneal y uveitisDiseminación granulomatosa a diversos

tejidos

Acanthamoeba y Balamuthia pueden albergar Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes y Mycobacterium avium, mimivirus: Potencial como reservorios

Queratitis amibianaQueratitis amibianaHallazgos recientes implican al genotipo T4 -

principalmente A. castellanii en ~ 94% de los casos como agente etiológico de la queratitis de origen amibiano (Booton, Visvesvara et al, 2005; Booton et al. 2009).La enfermedad se asocia en el 80% de los casos a uso de lentes de contacto (limpieza y/o almacenamiento inadecuados) por sujetos sanos e inmunocomprometidos, a su empleo durante deportes acuáticos y a traumatismos corneales.

DiagnósticoDiagnóstico Es fundamental, y se basa en el hallazgo de los infiltrados

tempranos, antecedentes, signos y síntomas, aún antes de que aparezcan úlceras.

Se emplean:• Raspado de epitelio, para su observación en fresco y con diferentes tinciones: Giemsa, Tricrómica, PAS, Calcofluor white, este último permite observar infiltrado inflamatorio, quistes y trofozoítos.• En lesiones avanzadas, es necesario recurrir a la biopsia corneal.• Cultivo.• Microscopía confocal para el estudio del epitelio (costosa, y en sitios donde existe el equipo).• IFI, ELISA.• Técnicas recientes incluyen, con excelentes resultados, PCR.

Diagnóstico de la meningoencefalitis Diagnóstico de la meningoencefalitis amibiana primariaamibiana primariaImagenología: RMN y TAC se emplean

para visualizar la localización y extensión de las lesiones ("masa ocupativa", edema, hidrocefalia, otras)

Examen del LCR: Tinciones◦ No debe refrigerarse◦ No debe centrifugarse

Cultivo en placa de agar no nutritivo, con suspensión de E. coli.

Inoculación intranasal de ratonesInmunodiagnóstico: IFI, detección de anticuerpos

circulantes.Molecular: FISH, PCR.

Estudio en Nicaragua, a partir de diferentes Estudio en Nicaragua, a partir de diferentes fuentes de aguafuentes de agua

Byron Leiva, Emma Clasdotter, Ewert Linder and Jadwiga Winiecka-Krusnell Free-living Acanthamoeba and Naegleria spp. Amebae in water sources of

León, Nicaragua. Rev. Biol. Trop. Vol. 56 (2): 439-446, June 2008.

Diferentes fuentes de aguaDiferentes fuentes de aguaLugares:León: área urbana y rural, San Jacinto.Chinandega: Posoltega.Managua:Tipitapa, trapiche, trapichito.Boaco: Aguas claras.

Muestra:A partir de: Agua de tubo Corrientes Pozo Contenedores de agua.Tubo cónico 50 ml de agua.

Métodos de Identificación:Métodos de Identificación:

10 µm

Muestras de aguaFiltrada

Cultivo en agar- agar con bacteria (E. coli)

Microscopía TestFisiológicos

TestImmunohistoquímicos

Morfología/tamaño

Exflagelación/Termotolerancia

IFTincion de Cellulose

TestMolecular

FISH

Identification of Acanthamoeba

Identificación of Naegleria

cellulose staining FISH

FISH IF

Métodos de identificación Immunohistoquímicos y Métodos de identificación Immunohistoquímicos y molecularesmoleculares

Anticuerpos Monoclonales yPoliclonales anti-Naegleria

Fluorescence in situ hybridization (FISH), Sondas específicas de genes, 18S rRNA.

ResultadosResultadosDetección de amebas de vida libre en muestras de aguas de León y Detección de amebas de vida libre en muestras de aguas de León y areas geotermales.areas geotermales.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%

40°C 42°C >45°C 40°C 42°C >45°C

AcanthamoebaNaegleria

León Area GeotérmicasTemperature

ConclusionesConclusiones Nuestro estudio encontramos que Amebas de vida libre están

distribuidas ampliamente en diferentes fuentes de agua en Nicaragua.

Acantamoeba y amebas termotolerantes potencialmente patógenas han sido encontradas con alta prevalencia en las dos áreas estudiadas.

24 de 39 (61.5%) de amoebaflagellados podrían ser identificadas como Naegleria spp., 50% de ellas fueron asignadas como N. lovanensis. La prevalencia de N. lovanensis fue más alto en aguas de las áreas geotérmicas (56.3%) que en la área del municipio de León (37.5%).

La presencia de amebas termotolerantes como Negleria en diferentes fuentes de aguas, especialmente N. lovanensis es un indicador de la presencia de N. fowleri, esto sugiere la posible existencia de amebas patógenas en estos mismos lugares.

OTROS ESTUDIOSOTROS ESTUDIOS

Determinar la frecuencia de Amebas de vida libre en Determinar la frecuencia de Amebas de vida libre en las aguas de los diferentes ambientes del hospital las aguas de los diferentes ambientes del hospital España de Chinandega.España de Chinandega.

 Objetivos Específicos

Describir los diferentes ambientes del hospital con fuentes de agua.

Aislar e identificar los tipos de amebas de vida libre presente en las muestras de aguas estudiadas.

Relacionar las especies de amebas de vida libre aisladas con fuentes de aguas de los diferentes ambientes del hospital.

RESULTADOSRESULTADOSTABLA 1.Descripción del área con las diferentes fuentes de aguaTABLA 1.Descripción del área con las diferentes fuentes de agua

AMBIENTE

FUENTES DE AGUA

BAÑO LAVAMANOS PILA TOTAL

n n n n CIRUGIA 2 3 0 5

COCINA 0 1 4 5

CONSULTA EXTERNA0 5 0 5

DIALISIS 2 2 1 5

EMERGENCIA 3 2 0 5 LABORATORIO 0 5 0 5

MEDICINA 2 3 0 5

ORTOPEDIA 3 1 1 5

PATOLOGIA

0

5 0 5

UCI 1 3 1 5

TOTAL DE FUENTES AGUA 13 (26%) 30 (60%) 7 (14%) 50 (100%)

Tabla 2. Aislamiento e identificación de Amebas de vida libre Tabla 2. Aislamiento e identificación de Amebas de vida libre presente en las muestras de aguas estudiadas presente en las muestras de aguas estudiadas

Especie Cultivo Frotis Ex flagelación IFI Total

(+) (+) (+) **AbMo ***AbPoli

Acanthamoeba spp

10(20%) 10 *Neg No aplica 10 (20%)

Naegleria spp 2(4%) 2 2 *Neg 2 2 (4%)

AVL no identificadas

9 9 *Neg No aplica 9

Total 21(42%) 21 2 2 21

* Neg: Negativo **AbMo: Anticuerpos monoclonales * * * AbPoli: Anticuerpos policlonales

ConclusionesConclusiones

1. De 50 muestras examinadas, se encontró la presencia de 21 (42%) AVL. 2. De las fuentes de aguas del hospital, donde más se encontró AVL fue en lavamanos. 3. Se logró aislar un mayor porcentaje de amebas del género Acanthamoeba 10 (20%) y Naegleria 2 (4%). 4. De manera general se encontró AVL en lavamanos con 11 y en menor cantidad amebas fue en Pilas con 3. 5. De la presencia de Naegleria spp, fue identificada utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales por IFI.

6. En los ambientes donde más predominaron las AVL fue en las salas de cirugía 4 (19%), medicina 3 ( 14%) y emergencia 3 (14%).

“Identificación de amebas de vida libre en aguas de uso doméstico, en la comarca Chacraseca del Departamento de León”

UBICACIÓN GEOGRÁFICA DEL ÁREA DE ESTUDIO

Municipio de León

Comunidad de Chacraseca

COMUNIDAD DE CHACRASECA

SELECCIÓN DE MUESTRAS

Tabla Nº 4: Distribución de Amebas de Vida Libre según fuentes de agua

*Amebas de Vida Libre no identificadas

AVL Encontradas

Fuentes de Agua

Pozos PilasAgua

de Lluvia

Total

Naegleria spp 13 0 0 13

Acanthamoeba spp 2 1 0 3

Otros* 1 5 4 10

Negativa 10 0 0 10

Total 26 (72) 6 (17) 4 (11) 36

Agradecimientos:Agradecimientos:

Estidiantes de Bioanálisis, Medicina y Biología, UNAN-Leon Emma Claesdotter, Estudiante de Suecia. Personal del Dpto. De Microbiology, UNAN-Leon: Brenda Mora Oscar Arbizú Jairitzinnia Palacios William Morales (Fotos)

Sida/SAREC

Cerro Negro. 1999.

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