54885577 turbidimetria y nefelometria
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DGEST ITM SEP
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA
“José María Morelos y Pavón”
TURBIDIMETRÍA Y
NEFELOMETRÍA
Química analítica II
Eliel Rafael Romero
Gracia
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
5st SEMESTRE
MARÍA CRISTINA VIEYRA BRAVO
No control: 09120036
Miércoles 04 de Mayo del 2011
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ContenidoINTRODUCCIÓN.............................................................................................................................................................3
¿Cómo diferenciar la turbidimetría y la nefelometría? ............................................................................5
DEFINICIONES ...............................................................................................................................................................6
Turbidimetría ............................................................................................................................................................6
Nefelometría ..............................................................................................................................................................6
Elección entre turbidimetría y nefelometría ................................................................................................7
TURBIDIMETRÍA ...........................................................................................................................................................8
Dispersión de la radiación por partículas en disolución .........................................................................8
Turbidimetría fundamento ..................................................................................................................................8
Turbidímetros ...........................................................................................................................................................9
NEFELOMETRÍA ......................................................................................................................................................... 10
Procedimiento analítico .......................................................................................................................................... 11
Relación matemática ........................................................................................................................................... 12
Nefelómetro ............................................................................................................................................................ 13
TURBIDIMETRÍA VS NEFELOMETRÍA .............................................................................................................. 14
Tamaño de las partículas dispersantes........................................................................................................ 14
Selección de la longitud de onda..................................................................................................................... 14
Preparación de la muestra ................................................................................................................................ 14
APLICACIÓN ................................................................................................................................................................. 15
Imunoprecipitación.............................................................................................................................................. 15
Inmunodifusión radial ........................................................................................................................................ 15
Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony..................................................................................... 16
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................................................... 17
REFERENCIAS ............................................................................................................................................................. 17
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INTRODUCCIÓN
Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su rapidez,
a la gran gama de instrumentación disponible y sus grandes posibilidades de automatización.
Los métodos no espectroscópicos son aquellos en los que no hay intercambio de energía, sino
cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación electromagnética
La dispersión de radiación es un fenómeno fisicoquímico al incidir una radiación sobre una
superficie sólida, líquida o gaseosa y ser dispersa en diferentes direcciones debido a la
difracción y reflexión de la radiación por las distribución y orientación de las moléculas sobre
las cual inside la radiación.
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte
de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la longitud
de onda de la luz, del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en
relación con el medio que la rodea.
La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría.
La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de
partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz
de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una
buena disminución de la luz transmitida) ejemplo:
- Determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas
precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
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La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente
con ángulos que oscilan entre 15 y 90°). Utiliza como instrumento el nefelómetro en el que el
detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90° ejemplo:
- A 90°). Se suele utilizar para concentraciones más diluidas.
La turbidimetría y la nefelometría tienen una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar
con muestras gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación de
precipitados difíciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula
muy pequeño, suelen proporciona suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadas
en la dispersión de la luz que sustituye a las técnicas gravimétricas. Este tipo de aplicaciones
son frecuentes en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en plantas de procesos. Uno
de los principales campos de aplicación reside en estudios de polución de aire y agua, donde
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las dos técnicas se usan para determinar la transparencia y controlar el tratamiento de aguas
potables, efluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de aguas ambientales.
Las medidas de dispersión de la luz se utilizan también para determinar la concentración de
humos, polvo, niebla, aerosoles, etc.
A pesar de que los términos turbidimetría y nefelometría suelen restringirse a aquellas
aplicaciones en las que se mide la concentración de partículas en suspensión existen también
otros tipos de aplicaciones basados en las medidas de dispersión de la luz. Entre ellas
podemos citar la determinación de la forma y tamaño de las partículas así como la de los
pesos, moleculares (especialmente en el caso de polímeros).
¿Cómo diferenciar la turbidimetría y la nefelometría?
Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas
sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia La turbidez
es la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea dispersada y absorbida
más que transmitida en línea recta a través de la muestra. La turbidez es ocasionada por la
presencia de materia suspendida en un líquido. Hay dos métodos para medir la turbidez de
una muestra, la turbidimetría y la nefelometría. Son dos técnicas complementarias que se
utilizan para el análisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas.
La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de
la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo.
En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a
la disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de luz se hace con un
ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento usado en la nefelometría,
el nefelómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio en turbidimetría se utiliza el
turbidíemetro que es un fotómetro de filtro.
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DEFINICIONES
Turbidimetría
Es un método en el que se mide la disminución de la potencia de la radiación transmitida
debido a la dispersión. Se mide en un espectofotómetro UV/Vis.
Para determinar la concentración del analito mediante este método aplicamos:
En donde T es la transmitancia medida , es la intensidad de la fuente de radiación
transmitida, es la intensidad de la radiación de la fuente transmitida por un blanco. La
relación entre y la concentración de las partículas dispersas es similar a la proporcionada
por la ley de Beer:
Siendo la concentración de las partículas dispersantes expresada como masa por unidad de
volumen; es la longitud del camino óptico y es una constante que depende de varios
factores: tamaño, forma de las partículas dispersantes y la longitud de onda.
Nefelometría
Es un método para medir la intensidad de una radiación dispersa en un ángulo de 90 °C con
respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluorímetro.
Para determinar la concentración de analito en este método aplicamos:
Donde es una constante empírica del sistema, es la intensidad de la fuente de radiación
incidente. El valor de depende de una curva de calibración preparada, usando una serie de
patrones de concentración conocida.
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Elección entre turbidimetría y nefelometría
La elección entre turbidimetría y nefelometría viene dada por dos factores:
- Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación
procedente de la fuente. Cuando la concentración de partículas dispersantes en la
disolución es pequeña, será muy similar a . Por lo que la mejor elección cuando la
muestra contiene pocas partículas dispersantes es la nefelometría. La turbidimetría es
una buena técnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de
partículas dispersantes.
- Tamaño de las partículas dispersantes. En la nefelometría la intensidad de la radiación
dispersada a 90°C es mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se
produzca una dispersión Rayleigh. Si las partículas son mayores la intensidad de la
dispersión disminuirá a 90°C. En turbidimetría la señal consiste en la disminución
relativa de la radiación transmitida, por lo que el tamaño de las partículas
dispersantes es menos importante.
Generalmente, nefelometría y turbidimetría se utilizan en el análisis de la calidad química del
agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. También se
utilizan para la determinación de iones sulfato.
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TURBIDIMETRÍA
Dispersión de la radiación por partículas en disolución.
Cuando un haz de luz monocromática, de longitud de onda no absorbible choca contra las
partículas de una sustancia que está en suspensión, cambia la dirección de propagación del
haz de luz (en realidad sólo cambian de dirección algunos fotones del haz). Este efecto es
usado para determinar la presencia de un analito en suspensión ya que ese cambio de
dirección del haz y de su intensidad depende de muchos factores que una vez relacionados y
cuantificados permiten obtener los valores buscados.
Cuando un haz de radiación monocromática de una longitud de onda determinada —λ“, es
enfocada sobre un medio que contiene partículas de dimensiones menores a 3/2 —λ“, se
observa dispersión de radiación en todas las direcciones del espacio. Si la partícula presenta
mayores tamaños, la radiación puede ser reflejada o refractada. Existen dos tipos de
dispersión:
1. Elástica: radiación es absorbida por el analito y reemitida sin cambios en la energía
de la radiación. Es el caso de la dispersión Raileigh o las dispersiones de grandes
partículas.
2. Inelástica: la radiación es absorbida y reemitida con cambios en su energía.
Turbidimetría fundamento
La turbidimetría puede realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta. Cuando la
concentración de partículas en suspensión se mide por turbidimetría, la suspensión se pone
en una cubeta similar a un tubo de ensayo, que permite realizar las medidas de las energía
incidentes y transmitidas. La fuente de radiación más frecuentemente usadas es la lámpara de
wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación visible. Si ponemos en la cubeta
suspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que influya sobre los resultados
dando valores excesivamente altos. Los Turbidímetros pueden incorporar cualquier detector
que sea sensible a la longitud de onda transmitida.
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Existe una relación matemática determinada experimentalmente:
Donde:
P: es la energía de la radiación transmitida.
P´: es la energía de la radiación incidente.
b: espesor de la cubeta.
C: concentración de partículas disertantes por unidad de volumen.
f : constante que depende del tamaño partícula y longitud de onda.
Si aplicamos logaritmos, el término – , es lo que se conoce como turbidez. Si a ese logaritmo se le denomina como , sabiendo que T= It/Io=P/P` ; entonces,
deducido de la expresión anterior, y tomando como una constante, tenemos que:
Turbidímetros
Casi todas las medidas turbidimetricas se realizan con colorímetros o espectrofotómetros
ordinarios. También pueden usarse instrumentos visuales sencillos, tales como el
trubidímetro Parr o el colorímetro Duboscq.
La presente imagen representa el esquema de un trubidímetro, el Du Pont Modelo 430. Este
turbidímetro, que es mucho más sensible que los Turbidímetros ordinarios para
concentraciones bajas de materia en suspensión, se basa en el hecho de que la dispersión
provoca un cambio en el plano de polarización de la luz.
Diagrama esquemático de un
trubidímetro Du Pont modelo
430.
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El haz incidente se convierte en luz polarizada en un plano mediante el polarizador primario.
Después de atravesar la muestra el haz se divide en dos, mediante un espejo semi-plateado, y
se detecta con dos fototubos separados. Cuando la disolución de la muestra no tiene partículas
en suspensión, la fotocélula 1 da una respuesta máxima y la fotocélula 2 da una respuesta
mínima nula. La relación entre la señal 2 y la señal 1 es una media de la concentración de las
partículas en suspensión. Al aumentar la concentración de las partículas en suspensión en la
muestra, aumenta la señal de la fotocélula 2 y disminuye la de la fotocélula 1 y por esto la
razón de las dos señales permite una medida sensible de la turbidez. Este sistema de doble
haz minimiza el problema debido a la absorción por las partículas de la disolución pero tiene
el inconveniente de que no puede usarse cuando la disolución contiene sustancias
ópticamente activas. Este instrumento puede usarse tanto para muestras individuales como
para control en continuo de corrientes de fluidos.
NEFELOMETRÍA
Se basa en la detección de los complejos Ag-Ab, por la refracción que dichos complejos
producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo
correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la
cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados.
La nefelometría es un procedimiento analítico que se basa en la d is p er s i ón de la r ad i a c i ón q ue
atraviesan las partículas de materia. Cuando la l u z atra viesa un medio tra ns pare n te en el que
existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como
consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante,
solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la
misma en cualquier án g u l o . L a intensidad depende de: el número de partículas suspendidas,
su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la
longitud de onda de la radiación dispersada. La relación entre variables y es más factible un
tratamiento teórico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analíticos
específicos.
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El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:
1. La concentración: Mayor sea el número de partículas, mayor es la dispersión.
2. Tamaño de la partícula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla,
concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza iónica.
3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si
están coloreadas, se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que
la absorción del medio se reduzca al mínimo.
En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulación
del coloide. Sólo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables
que afectan el tamaño de partículas.
Procedimiento analítico
Se basa en la d is p er s i ón d e la rad i a c i ón q ue atraviesan las partículas de materia. Cuando la l u z
atraviesa un medio t r an s parente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se
dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no
supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación,
porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier án g ul o . L a intensidad depende
de: el número de partículas sus pendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la
partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. Cuando la
concentración de una suspensión de partícula es baja es preferible medirla por este método.
En este caso la suspensión se coloca en una cubeta colocada como se muestra en la figura
siguiente.
Fuente Filtro Cubeta Detecto|
El instrumento permite la medida de la intensidad de la dispersión S, la cual está relacionada
con la concentración. Las fuentes de radiación que se utilizan son de láser helio-neón,
lámparas de halógenos y lámparas de xenón, siendo el más frecuente el primero.
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Este consiste en un tubo largo y estrecho en el cual se introduce una mezcla de gas formada
por 7 partes de helio y 1 parte de neón al que se le aplica un voltaje para producir una
descarga eléctrica.
Relación matemática
La relación matemática entre la intensidad de dispersión, S y la concentración de partículas
suspendidas es raramente utilizada es suficiente con saber que existe una relación lineal entre
ellas a bajas concentraciones. Sin embargo la relación matemática que cumplen es
Donde:
C: es la concentración en%
: es la radiación dispersada
: es la radicación de la fuente incidente
: es una constante
|
Fuente C CuP Cr
Ángulo
S
Tf
C: filtro
Cu: cubeta (v. superior)
Cr: colector de radiaciones negro
Tf: tubo fotomultiplicador
El valor del ángulo oscila entre 30 y 70, su valor depende de la aplicación específica
seleccionada.
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Nefelómetro
Un nefelómetro es un i n s tr u m en t o pa ra medir
partículas suspendidas en un líquido. Esto lo hace
empleando una fot o c e l da c olocada en un ángulo
de 90° con respecto a una fuente luminosa.
La de n si d ad d e par t í c ulas e s entonces una
función de la luz reflejada por las partículas a la
fotocelda. Cuanta más luz se refleje en una
determinada densidad de partículas depende de
las propiedades de las partículas como su forma,
color y reflectividad. Estableciendo a una
correlación de trabajo entre turbidez y s ó l i d o s
s u s pe n d i d o s ( que más útil, pero generalmente
una más difícil de cuantificación de partículas)
debe ser establecido independientemente para
cada situación.
A los nefelómetros usados en las pruebas de calidad del agua, comúnmente se les
llaman turbidímetros. Sin embargo, pueden haber diferencias entre los modelos de
turbidímetros, dependiendo del arreglo geométrico de la fuente luminosa con respecto a la
fotocelda. Un turbímetro nefelométrico siempre monitorea la luz reflejada por las partículas y
no la atenuación debida a la turbidez.
Nefelómetro C-102
Este nefelómetro realiza un análisis de agua casi completo: cloro libre y
total, bromo, pH, hierro, yodo y ácido cianúrico. En el modo de medición
de turbiedad puede elegir entre los valores de calibración dados o los
valores definidos por el usuario. Por medio del reloj de tiempo real
integrado puede recuperar presionando la tecla los últimos datos de
calibración. En el rango de medición de turbiedad se puede poner un
punto de calibración libre entre 0,0 y 50,0 NTU (NTU Nephelometric
Turbidity Unit = FTU Formazin Turbidity Unit / Ratio 1:1). La turbiedad
se mide con el método USEPA.
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TURBIDIMETRÍA VS NEFELOMETRÍA
Tamaño de las partículas dispersantes
Para nefelometría, la intensidad de la radicación dispersada a 90° será mayor cuanto menos
sea el tamaño de las partículas. Para partículas mayores, la intensidad de la dispersión a 90°
disminuye. Cuando se usa una fuente de radicación de UV/VIS, el tamaño de partícula optimo
para nefelometría es de 0.1 a 1 µm. para turbidimetría, fenómeno menos dependiente de la λ,
en cambio el tamaño de las partículas es menos importante; en este caso la señal es la
disminución relativa de la radiación trasmitida. De hecho, las medidas turbidimetricas son
aun posibles cuando el tamaño de las partículas dispersantes producen un aumento de la
reflexión y refracción (aunque la relación lineal entre la señal y la concentración de las
partículas dispersantes no puede mantenerse mucho más).
Selección de la longitud de onda
Con esta selección se minimiza las posibles interferencias
1. Turbidimetria: como se mide la radiación trasmitida a través de la muestra, es
necesario evitar la absorción de la radiación por la muestra.
2. Nefelometría: la absorción de la radiación incidente no es un problema excepto su
induce fluorescencia en la muestra. Sin una muestra fluorescente no hay necesidad de
selección de λ, y puede usarse una fuente de luz blanca.
Preparación de la muestra
La intensidad de la radiación dispersada está influenciada por la forma y tamaño de las
partículas. Para un análisis cuantitativo es necesario, por lo tanto mantener la distribución de
las partículas uniformemente en la muestra y los patrones. La mayoría de los métodos de
turbidimetría y nefelometría depende de la formación de partículas por precipitación.
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APLICACIÓN
Imunoprecipitación
La imunoprecipitación cuantificada por turbidimetría o nefelometría se emplea hoy en ls
laboratorios de autoinmunidad para determinar el factor reumátide.
- Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una
dispersión de luz no deseada ej. lipoproteínas, quilomicrones También puede
interferir la suciedad. ·
- La intensidad de la luz dispersada. Las proteínas suelen tener un pico de absorción en
el ultravioleta y los cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele
trabajar a frecuencias que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm.
Muy frecuentemente, para cuantificar proteínas concretas, se utilizan anticuerpos que
reaccionan con dichas proteínas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetría
e inmunonefelometría.
Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos reaccionan y
forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rápidamente pero, existe
una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y, es precisamente en ésta fase en la
que aparece la dispersión de la luz. Así, en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se
mide la dispersión de la luz provocada por los complejos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a
bolitas de látex para aumentar el tamaño de los complejos (inmuno-análisis potenciados).
La inmunoprecipitacion, se utilizan partículas de látex recubiertas con IgG. Existen muchos
equipos comerciales para como analizadores automáticos de bioquímica o nefelómetros
automáticos, y sus métodos están estandarizados con calibradores que se basan en
preparaciones de referencia.
Inmunodifusión radial
En este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas.
Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas
(antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En
la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación
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Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony
Se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Sedepositan
antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en
los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno
alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y forma de
la banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños.
La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la
cantidad de antígeno presente.
Determinación de proteínas en orina y de anticuerpos en suero
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CONCLUSIÓN
Los métodos ópticos de análisis cubren un amplio campo de aplicaciones dentro de las
Técnicas basadas en la dispersión de radiación tenemos la turbidimetría y la nefelometría. Las
cueles nos regularmente utilizadas en control de calidad, pero gracias al avances de diversas
maquinarias, nos es posible poder aplicar estos métodos de análisis dentro de otras ramas
científicas, ya sean salud o investigación.
Estas dos técnicas están basadas generalmente en la formación de un precipitado, del cual se
parte para el análisis.
Ambas técnicas permiten la descripción y análisis óptico una muestra. Y el uso de estas
técnicas de investigación depende de las necesidades del investigador. Las diferencias entre
las dos técnicas son especificas y permiten le análisis desde dos campo de la óptica muy
importante dentro de los laboratorios. La turbidimetría y la nefelometría se acoplan para un
mejor enfoque del análisis.
REFERENCIAS
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Ciencia (2002)
R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los Alimentos. Editorial Acribia. S.A
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Van Holde, K. E., Physical Biochemistry, Englewood Cilffs; N. J., Preentice Hall, 1971.
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