NEFELOMETRIA I TURBIDIMETRIA

Principis bàsics• Espectroscòpies d’absorció molecular en la zona

d’espectre visible• Comportament de la matèria al incidir una radiació

electromagnètica (fenòmens de reflexió, dispersió, bloqueig i transmissió de la resta de radiació fins el detector)

• Característiques de la mostra: són partícules no transparents en un líquid (precipitats, suspensions col·loïdals,..)

• La nefelometria estudia la radiació dispersada per la mostra en angles diferents al d’incidència de la radiació

• La turbidimetria estudia la radiació no dispersada• Mètodes analítics qualitatius i quantitatius

Nefelometria• La dispersió de la radiació és un fenomen

físic resultant de la interacció entre aquesta i les partícules en suspensió en un medi adequat.

• Els angles de mesura de la radiació dispersada oscil·len entre 15 i 90

• Aquesta dispersió està influïda per:– La concentració de l’analit– Volum, mida, pes i nombre de partícules– Longitud de l’ona de la radiació incident– Distància del detector a la cubeta

Nefelometria (II)El grau d’influència d’aquests factors està

reflectit en la teoria de Rayleigh:

1. La intensitat de llum dispersada és:- Directament proporcional a la concentració

de les partícules en la mostra- Directament proporcional al pes molecular

de les …- Inversament proporcional al quadrat de la

distància entre el detector i la cubeta- Inversament proporcional a la quarta

potència de la λ

Nefelometria (III)2. La distància entre el detector i la cubeta

és relacionen directament amb la sensibilitat dels mètodes aplicats

3. El model de dispersió depèn de la relació entre la mesura de la partícula i la longitud d’ona de la radiació incident. Quan són del mateix ordre, es produeix una dispersió de la radiació en diferents angles, fet que facilita la seva mesura.

Nefelometria (IV)L’equip de mesura és específic per a

aquestes determinacions i està dissenyat de manera quel detector pot variar de posició respecte a la direcció de la radiació incident en uns angles preestablerts

Nefelometria (V)Si en un principi la mostra és transparent i

al aplicar els reactius apareixen les partícules en suspensió, per a ajustar l’espectrofotòmetre utilitzarem un blanc-mostra, que elimina el bloqueig de la radiació incident per causes alienes a l’analit i degudes a la mostra.

Tipus de dispersionsEs mostren per a tres mides de partícula, corresponents a les dispersions de Rayleigh, Rayleigh-Debye i Mie.L’angle de dispersió és el que existeix entre els rajos incident i dispersat. Així, és 0° per a la dispersió directa i 180° per a la dispersió que es dirigeix cap a enrere.

D. Rayleigh D. R-Debye D. Mie

7000-40000 nm

Dispersió de la llum per diverses molècules i cèl·lules a 340 i 630nm

Al augmentar la mida de les partícules respecte a la λ del raig incident, la radiació dispersada es distribueix asimètricament

Partícules Mida (nm)

λ (nm) Dispersió

IgG 8 340 - 630 Rayleigh / R

IgM 35 340 - 630 R-Debye / R

Immunocomplexos

20-100 340 - 630 R-Debye / R

-Lipoproteïna 5-15 340 - 630 Rayleigh / R

-Lipoproteïna 15-30 340 - 630 R / R-Debye

Quilomicrons 200-450 340 - 630 R-D / R-D

E. Coli 500 340 - 630 Mie / R-Debye

Eritròcits 7500 340 - 630 Mie / Mie

TurbidimetriaMesura la radiació bloquejada per part de

la mostra, relacionant la intensitat del feix incident i del resultant d’atravessar la cubeta

La detecció de la radiació transmesa es realitza en la mateixa direcció quel feix incident (θ = 0⁰) i el senyal pot expressarse com absorbància o com transmitància

Turbidimetria(II)

Turbidimetria (III)Aquest fenomen es regeix per la llei de

Lambert-Beer: la intensitat de radiació bloquejada per la mostra és directament proporcional a la concentració de l’analit

L’equip de mesura en general és el mateix que en espectroscopia d’absorció molecular en el rang del visible

Nefelometria i TurbidimetriaEstudi comparatiu (diferències i similituds)

Turbidimetria NefelometriaMesura Radiació no dispersada Rad. Dispersada Equip Espectrofotòmetre Aparell específic Sensibilitat Depèn de l’equip Depèn del blanc Límit detecció Depèn de l’equip Depèn del blanc Interferències Existeixen de matriu λ 320-380 nm i des de 500 a 600nm Mètodes A punt final Quantitatius Cinètics Qualitatius Recta patró Aplicacions Determinació de proteïnes: Det. del calci (mètode del ATCA) (precipitació amb sals de P i S)Cost Menor Major (cal aparell) Angle feix incident 0⁰ 15-90⁰