practicas de microbiología: nefelometria y periodo y tiempo térmico mortal
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VALDIVIESO MENDEZ DAVID IRVIN. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS. U.A.B.J.O.
PRÁCTICA 1: NEFELOMETRÍA
INTRODUCCIÓN
Se trata de un método turbidimétrico, este tipo de métodos son muy usados en la
práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la
medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier
partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro
de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.
La nefelometría en sí es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:
1. La concentración: entre mayor sea el número de partículas, mayor es la dispersión.
2. Tamaño de la partícula: es afectada por factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza iónica.
3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están coloreadas, se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la absorción del medio se reduzca al mínimo.
OBJETIVOS
Conocimiento de métodos turbidimétricos así como la preparación del nefelómetro de McFarland.
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ESCALA MCFARLAND
En el caso de la microbiología, se utiliza el nefelómetro de McFarland como punto de referencia para estimar la población de M.O. presentes en una muestra.
La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido sulfúrico, y se trata de una serie de tubos que contienen en su interior cantidades distintas de cloruro de bario y ácido sulfúrico, y que se ordenan de menor a mayor concentración, por lo que al final de cuentas se obtiene una escala de referencia relativa a la turbidez.
La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón, es decir, una vez preparado el nefelómetro, se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina, en el momento en que nuestra suspensión sea visualmente igual a nuestro tubo de referencia, tendremos la concentración buscada.
La finalidad de las comparaciones entre las suspensiones microbianas y el nefelómetro, es establecer una relación entre una precipitación química y la suspensión propiamente dicha.
Las comparaciones son aproximadas, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados, etc.
MATERIALES Y REACTIVOS
H2SO4 al 1% 250 ml. BaCl2 al 1% 250 ml. 10 tubos de ensaye con tapones de rosca.
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METODOLOGÍA
CONCLUSIÓN
Esta práctica es de suma importancia para nosotros, pues el nefelómetro
preparado lo utilizaremos de aquí en lo sucesivo, como referencia para la preparación de
suspensiones microbianas en prácticas posteriores, por lo que fue de vital importancia
poner mucha atención en la preparación de los tubos.
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ANEXOS
1. ¿Cuáles son los métodos directos más utilizados en el recuento de
microorganismos?
Camara de recuento Petroff- Hauser. Consiste en un portaobjetos especial con
una graduación y medidas concretas. Se cuenta al microscopio el número de
células en las celdillas del portaobjetos.
Contadores electrónicos de partículas. Se pasa una suspensión microbiana por
un tubo capilar, entre dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que pasa
por un orificio una partícula, se interrumpe la corriente, lo que es recogido en
un sistema de registro electrónico, que detecta número y tamaño.
2. ¿Qué es lo que representa UFC y cuál es su importancia?
UFC: unidad formadora de oclonias, se entiende como una célula capaz de dar
origen a una colonia en un lapso de tiempo en condiciones favorables. Su
importancia es al hacer recuento de M.O. en placa, los resultados se dan en UFC y
no como número de M.O. Es sin embargo una medida estimada, pues no es
posible asegurar que cada colonia procede de una célula individual, es por eso que
se deben desagregar las agrupaciones de células antes del recuento.
3. ¿A qué se refiere la técnica del número más probable?
Se utiliza para estimar densidades de poblaciones de M.O. se basa en determinar
la presencia o ausencia de algún atributo particular de los M.O. en diluciones
consecutivas. El estimado de densidad se obtiene según el patrón de ocurrencia
utilizando una tabla probabilística.
4. Citar ejemplos de métodos para recuento microscópico.
Cámaras de recuento de Newbaver.
Contador electrónico de partículas.
Cámara de recuento Petroff-Hausser.
BIBLIOGRAFÍA
Atlas, R. M. Microbiología, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA
Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introducción a la microbiología I y II. Editorial
Reverte S. A.
Prescott- Harley- Klein. Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill.
Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biología de los microorganismos. 8ª
edición Prentice Hall Iberia España.
Pelczar y Col. Microbiología general. Editorial Mc. Graw Hill.
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PRÁCTICA 2: INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL
CRECIMIENTO Y MUERTE DE LOS MICROORGANISMOS (AGENTES
FÍSICOS)
INTRODUCCIÓN
Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, los microorganismos sufren los cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que los organismos eucariontas. A lo largo de miles de millones de años, las bacterias han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas.
Es importante para las personas que trabajan con microorganismos, al cual está indisolublemente ligado el trabajo experimental en laboratorio, conocer y tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que pueden:
1. modificar la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;
2. condicionar la distribuición de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats naturales;
3. permiteir a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para:
a. la mutagénesis, b. la esterilización y desinfección, c. la quimioterapia.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra.
Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:
Agentes físicos Agentes químicos
Temperatura Desinfectantes y antisépticos
Desecación Quimioterápicos de síntesis
Radiaciones Antibióticos
Ondas sonoras
Presión hidrostática
Presión osmótica
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Efecto de la temperatura.
La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales:
Temp. mínima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temp. máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento Temp. óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo).
Diferentes especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones de
temperatura óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen mejor a
temperaturas bajas (15 a 20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de 30 a 37·C, la
mayor parte de la termófilas entre 50·C y 60·C.
La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la temperatura
óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del huésped es óptima
para los simbiontes de los animales de sangre caliente.
El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona
bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie.
Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al
choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando son expuestos a una
elevación súbdita en la temperatura por arriba de la óptima para el crecimiento. Al parecer
estas proteínas son resistentes al calor y estabilizan a las proteínas de la célula sensible al
calor. Las bacterias también exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la
muerte de las células por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el
enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90% de las
células
Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se
dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las
bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destrucción o
inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN
cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos
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caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana?
He aquí algunos parámetros utilizados:
periodo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las
bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;
tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la
densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D);
punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en
un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).
2.1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS
MATERIAL
Mechero
Asa
Marcador
Termómetro
Gradilla
2 pipetas de 1.0ml
10 tubos de 16×150, con 5.0ml de sol. Salina 0.85% estériles
1 tubo de 16×150
2 cajas de petri con agar nutritivo
Baños maría a las sig. Temperaturas: 50, 60, 70, 80, y ebullición.
Cultivos de 24 hrs. De escherichia coli y stapylococcus aureus.
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DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1. Identificar cada baño maría con su temperatura
2. En una gradilla, colocar los tubos con soluciones salinas, etiquetar cada tubo,
anotando lo temperatura y el nombre del microorganismo
3. Dividir la parte extrema de las dos cajas de petri en seis partes iguales con un
marcador. Marcar los segmentos con: T (testigo), 50, 60, 70,80, y ebullición.
4. Inocular 5 tubos con E. Coli y 5 con Staphylococcus, para ello, con una pipeta
estéril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml del cultivo a cada uno de los
tubos que tienen SOLUCION SALINA AL 0.85% y homogenizar. Repetir el
procedimiento con el segundo cultivo.
5. Tomar una asada de E. Coli y en una de las cajas de siembra por estría recta en el
segmento marcado con una T, empezando por el borde extremo. Repetir el
procedimiento en la segunda caja con B Staphylococcus.
6. Colocar en baño maría un tubo de cada cultivo, introducir un tercer tubo que
contenga agua de la llave y colocar en este el termómetro.
7. Dejar calentar y esperar a que el agua del tubo alcance la temperatura de 50°C,
mantener esta temperatura durante 10 minutos
8. Sacar los tubos y sombrar cada microorganismo en la caja y segmento
correspondiente.
9. Repetir los incisos 6 y 7 con los otros tubos, a 60, 70, 80 y ebullición y sembrar los
segmentos correspondientes.
10. Incubar las cajas en posición invertida a 37°C durante 48 horas.
11. Efectuar las observaciones y registrar las observaciones en una tabla.
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CALCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS
1. Observar sus cajas e indicar a partir de que temperatura no se registro desarrollo.
2. Indicar cuál es la temperatura que corresponde al punto térmico mortal
E. Coli: S. Aureus:
3. Comparar sus resultados obtenidos con los de sus compañeros e indicar si el punto
térmico mortal es igual para los microorganismos estudiados.
Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:
E. Coli S. Aureus
CONCLUSIONES
En esta práctica determinamos la temperatura mínima que puede matar a todas
nuestras bacterias, pero no sólo eso, al trabajar con diferentes temperaturas, en los
resultados pudimos observar de cierta forma la cinética del crecimiento microbiano, pues
se observa primeramente un crecimiento gradual hasta la que tentativamente es la
temperatura óptima (que fue aquella dónde se obtuvo mayor crecimiento), y cómo
después de ese punto, el crecimiento decrece o ya no se obseva.
Fue importante pues esto nos permite tener una idea de bajo qué condiciones de
temperatura podemos manipular esas bacterias, trabajar con ellas, o al contrario, que
temperatura debemos utilizar para estar seguros que estamos libres de ellas.
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ANEXOS.
1. ¿Cómo se dividen los M.O. de acuerdo a la temperatura a la que se desarrolla?
2. ¿Explicar a que se refieren las temperaturas cardinales?
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al
tiempo de generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones
ambientales se mantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de
crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos
característicos llamados temperaturas cardinales:
Temp. mínima: por debajo de ella no hay crecimiento;
Temp. máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento
Temp. óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g
mínimo).
3. ¿Cuál es la importancia de determinar la temperatura máxima de desarrollo?
4. ¿Qué indica el término punto térmico mortal? es la temperatura mínima que mata
a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de
referencia empleado es de 10 min).
2.2. DETERMINACIÓN DEL PERIODO TÉRMICO MORTAL
EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS
Material
Mechero
Asa
Marcador
TIPO MINIMA OPTIMA MAXIMA
PSIC.OBLIGADA -5-5 10-15 20-22 PSIC.FACULTATIVA 0 20-30 35 MESOFILA 15-20 20-45 45-47 TERMOFILA 45-55 55-65 80 HIPERTERMOFILA 60-70 80-90 100-113
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Termómetro
Gradilla
2 pipetas de 1 ml. estériles
4 tubos de 16 x 150, con 5 ml. de solución salina 0.85% estériles
1 tubo de 16 x 150
4 cajas de Petri con agar nutritivo
2 baños María, uno a 60 °C y otro a ebullición
Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
MÉTODO
1. Identificar cada baño María con una temperatura y poner a calentar.
2. Colocar los tubos con solución salina estéril en una gradilla y etiquetar cada tubo,
anotar el tiempo de exposición y el nombre del microorganismo.
3. Dividir la parte inferior externa de la caja de Petri en seis partes iguales, con un
lápiz graso. Marcar los segmentos con C (control), T (testigo), 5, 10, 20 y 30
minutos.
4. Con una pipeta estéril y en condiciones de asepsia, transferir 0.1 ml. de cultivo.
Inocular dos tubos con cada microorganismo.
5. De uno de los tubos con E. coli, tomar una asada y sembrar por estría recta en la
caja correspondiente y el segmento marcado con la T, empezando por el borde
externo. El segmento marcado con una C servirá como control de esterilidad del
medio.
6. En la segunda caja repetir con Staphylococus.
7. Introducir en el baño de agua a 60 °C los dos tubos con cultivos de E. coli y
Staphylococus y con un tubo con agua de la llave, colocando en éste un
termómetro, esperar a que en el interior del tubo se alcance la temperatura
indicada y mantener los tubos sumergidos durante 5 minutos.
8. Al término de este tiempo tomar una muestra de cada cultivo y en la caja y
segmento correspondiente sembrarla por estría recta.
9. Introducir rápidamente los tubos en el baño de agua y continuar calentando y
repetir el paso 8 después de 10, 20 y 30 minutos de calentamiento.
10. Hacer lo mismo con los otros dos tubos que se calentaran a ebullición durante 5,
10, 20 y 30 minutos.
11. Incubar las cajas en posición invertida a 37 °C
12. Efectuar sus observaciones y registrar sus resultados en la tabla correspondiente.
CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS.
1. Ejemplificar una curva típica de desarrollo.
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2. Indicar el tiempo y temperatura a las cuales no se registró desarrollo microbiano.
3. Cuáles son las T° y tiempos establecidos para destruir cada uno de los M.O.
estudiados.
4. Con base a los resultados de grupo indicar que M.O. son más resistentes al calor.
Los resultados con las bacterias utilizadas fueron los siguientes:
E. Coli S. Aureus
CONCLUSIÓN
Esta práctica pudimos determinar el periodo térmico mortal, a diferencia de la
práctica anterior, aquí no varió la temperatura, sino el tiempo al que la muestra se
sometió a una sola temperatura determinada.
De esta manera pudimos observar que al pasar este tiempo de exposición, la
población de bacterias disminuye gradualmente, hasta cesar su desarrollo.
BIBLIOGRAFÍA
Atlas, R. M. Microbiología, fundamentos y aplicaciones. Editorial CECSA
Ingrham J. L. y G. A. Ingrham. Introducción a la microbiología I y II. Editorial
Reverte S. A.
Prescott- Harley- Klein. Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill.
Madigan M. T. J. M Martinko y J. Parker. Biología de los microorganismos. 8ª
edición Prentice Hall Iberia España.
Pelczar y Col. Microbiología general. Editorial Mc. Graw Hill.