Informe de Laboratorio No. 3_______________________________________________________________________Informe de Laboratorio No. 3

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Estudio de la actividad estersica presentada por extractos animaleslvarez, David; Caicedo, Michelle;Chamorro, Andrea; Marn, Freddy; Merizalde, Wendy; Orcs Estefania.Estudiantes de la asignatura IBT411-2 Bioqumica 1, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, Universidad de las Amricas, Quito-EcuadorRESUMEN

En esta prctica se cuantific la actividad estersica de tres extractos, cada uno pertenecientes a las vsceras de una animal diferente (pollo, res o cerdo). Para cuantificar esta actividad enzimtica se necesit construir diagramas de dispersin (adsorcin vs tiempo) para cada uno de los extractos a evaluar con la ayuda del espectrofotmetro. Los valores de las pendientes obtenidas fueron 0.0033 en vsceras de pollo, 0.0016 en vsceras de res y 0.0011 en vsceras de cerdo. Los valores de actividad enzimtica se obtuvieron con la frmula AE y dieron 0.0484 L en vsceras de pollo, 0.0236 L en vsceras de res y 0.0162 en vsceras de cerdo. Por tanto como la pendiente en vsceras de pollo fue mayor en la actividad enzimtica tambin ser mayor en comparacin a los extractos obtenidos de las otras vsceras. Adems se realiz un balance de masas del procedimiento realizado y se dedujo que a medida que el proceso avanza se purifica gradualmente la concentracin enzimtica de los extractos obtenidos, gracias a la centrifugacin de los extractos.Palabras clave: Actividad estersica, Extracto, Balance de masas, Centrifugacin.ABSTRACT

In this practice was quantified the esterase activity of three extracts, each one belonging to a different animal vicera (chicken, beef or pork). To quantify this enzymatic activity is needed to build scatter diagrams (adsorption vs time) for each one of the extracts that were evaluated, with the help of the spectrophotometer. The values of the slopes obtained were 0.0033 in chicken viscera, 0.0016 in beef vicera and 0.0011 in pork vicera. Values of enzymatic activity were obtained with the formula AE and gave 0.0484 L in chicken vicera, 0.0236 L in beef vicera and 0.0162 in pork vicera. Therefore as the slope in chicken viscera was higher in the enzymatic activity, also will be greater in comparison to the extracts obtained from the other vicera. Furthermore, a mass balance of the procedure performed was realized and with that was deducted that meanwhile the process moves the purity of enzymes concentration increses, this happensa, thanks to the centrifugation of the extracts.Keyword: Esterase activity, Extract, Mass balance, Centrifugation.1. INTRODUCCIN

Las enzimas son biomolculas pertenecientes al grupo de las protenas, cuya funcin es catalizar reacciones biolgicas. A pesar que se desconoce el porqu de su excelente especificidad, las mismas son agentes catalticos mucho mejores que los agentes catalticos qumicos. (Lehninger, Nelson, & Cox, 2009, p.189)La actividad estersica mide los niveles de actividad de enzimas que estn ligadas a procesos hidrolticos, debido a que son estas enzimas las que estos procesos se lleven a cabo de forma rpida y segura. Esta medida se obtiene de forma experimental y bajo condiciones que son importantes de establecer. Adems la actividad estersica expresa cunto sustrato se convierte en producto por unidad de tiempo. (Sinche, 2009, p.16)Para poder medir la actividad enzimtica es muy importante tomar en cuenta las condiciones con las cuales se est trabajando porque las enzimas al ser protenas tambin pueden desnaturalizarse y por ende inactivarse con lo cual ya no sera posible medir su actividad. Es por esto que la temperatura a la que debe ser sometida dentro del laboratorio no debe exceder de los 60 C. Adems es importante tomar en cuenta el pH al momento medir la actividad estersica, debido a que las enzimas son muy sensibles a los cambios del pH se debe colocar una solucin tampn en la muestra donde se encuentren las mismas para que no se vean afectadas. (Gonzalez, 2004)Para poder medir la actividad estersica es importante tener en cuenta la ecuacin de Michaelis-Menten, donde se relaciona la VO (velocidad inicial) con Vm (velocidad mxima) y con [S]O (concentracin inicial del sustrato) a travs de KM (constante de Michaelis). Al tener esta ecuacin, la misma debe ser graficada razn de una hiprbola rectangular (grfico ms preciso) o a razn de una lnea recta para de esta manera obtener una ecuacin y sacar su pendiente para el futuro clculo de la actividad estersica. (Lehninger, Nelson, & Cox, 2009, p.198)La actividad estersica se mide con la ayuda del espectrofotmetro, pues la adsorbancia que posea la muestra antes trabajada corresponder al a actividad estersica en una muestra. Para esto se deben tomar en cuenta parmetros como a (pendiente de la curva obtenida de la adsorbancia en relacin al tiempo) Vc (volumen de la mezcla de reaccin en L), Ve (volumen del extracto presente en la mezcla de reaccin en L), L (longitud del paso de luz en la celda en cm) y = 5150 M-1 cm-1 (coeficiente de extincin del p-nitro fenol a 348nm). Es as que la frmula utilizada para determinar la actividad estersica es la siguiente (Sinche, 2009, p. 46):AE = a * 1000 * Vc * L * Ve2. OBJETIVOS 2.1Objetivo generalCuantificar la actividad estersica presente en extracto de vsceras de pollo, vsceras de res y vsceras de cerdo.2.2Objetivos especficos Establecer condiciones adecuadas de temperatura y pH para los extractos.

Construir el grfico de dispersin de la adsorbancia en relacin al tiempo para cada uno de los extractos trabajados.

Elaborar el respectivo balance de masas que se realiz en los extractos de la prctica.

Calcular la actividad estersica de cada uno de los extractos con la ayuda de la pendiente obtenida en la ecuacin del diagrama de dispersin de la adsorbancia con respecto al tiempo.

Comparar la actividad estersica entre los extractos de vsceras de pollo, res y cerdo.3. MATERIALES Y MTODOS3.1 Materiales y reactivos

Gradilla.

Tubos de ensayo. (12)

Vaso de precipitacin 250 ml. GLASSCO (2)

Balanza.

Plancha de calentamiento con agitador.

Agitador magntico.

Gotero Cuchillo

Licuadora

Termmetro

Espectrofotmetro

Centrifugadora

Micro pipetas (3)

Vsceras de res (20g)

Vsceras de pollo (20g)

Vsceras de cerdo (20g)

Tampn fosfato (120ml)

Extracto (90 L)

Etanol absoluto (90ml)

Agua

3.2Procedimiento experimental

En la figura 1 que se expone a continuacin se expone el procedimiento experimental a manera de un diagrama de flujo, esto porque en resultados se utilizar este diagrama de flujos para la obtencin del balance de masas.

Figura 1: Procedimiento experimental realizado en la prctica mediante un diagrama de flujo

4. RESULTADOSA continuacin, en la figura 2 se expondr el balance de masas que se obtuvo del procedimiento experimental de la prctica.

Figura 2: Balance de masas de los diferentes extractos obtenidos en la prcticaLa actividad estersica se mide mediante la adsorbancia de luz que presenta la muestra en el espectrofotmetro, gracias a esto se expondr en la tabla 1 y figura 3 la adsorbancia de luz con respecto al tiempo del extracto 2 de vsceras de pollo, de esta manera con la pendiente obtenida del diagrama de dispersin se calcule la actividad estersica del extracto. Lo mismo se realizar para el extracto 2 de las vsceras de res y cerdo; solo que el de las vsceras de res ser expresado en la tabla 2 y figura 4 mientras que el de cerdo ser expresado en la tabla 3 y figura 5.Para los clculos de la actividad enzimtica los valores de Vc y Ve son los siguientes:

Vc = 2250 L (volumen muestra inicial) +

30 L (extracto)

Vc = 2280 L

Ve = 30 L (extracto)

Tabla 1: Adsorbancia del extracto 2 de vsceras de pollo en relacin al tiempo utilizando un espectrofotmetro a 380nm.

Tiempo (s)Adsorbancia (348nm)

01,01

151,074

301,131

451,187

601,227

751,278

901,331

1051,378

1201,425

1351,476

1501,521

1651,575

1801,621

Figura 3: Diagrama de dispersin linealizado de la adsorbancia vs tiempo del extracto 2 de vsceras de polloAE =a * 1000 * Vc

* L * Ve

AE =0,00331000 * 2280 L

5150 M-1 cm-1 * 1 cm* 30L

AE =0,0487u/L

Tabla 2: Adsorbancia del extracto 2 de vsceras de res en relacin al tiempo utilizando un espectrofotmetro a 380nm.

Tiempo (s)Adsorbancia (348nm)

00,815

150,848

300,869

450,896

600,919

750,942

900,967

1050,993

1201,015

1351,039

1501,061

1651,084

1801,108

Figura 4: Diagrama de dispersin linealizado de la adsorbancia vs tiempo del extracto 2 de vsceras de res

AE =a * 1000 * Vc

* L * Ve

AE =0,00161000 * 2280 L

5150 M-1 cm-1 * 1cm * 30L

AE=0,0236u/L

Tabla 3: Adsorbancia del extracto 2 de vsceras de cerdo en relacin al tiempo utilizando un espectrofotmetro a 380nm.

Tiempo (s)Adsorbancia (348nm)

01,057

151,074

301,078

451,094

601,111

751,131

901,154

1051,164

1201,181

1351,201

1501,215

1651,227

1801,243

Figura 5: Diagrama de dispersin linealizado de la adsorbancia vs tiempo del extracto 2 de vsceras de cerdo

AE =a * 1000 * Vc

* L * Ve

AE =0,00111000 * 2280 L

5150 M-1 cm-1 * 1cm * 30L

AE =0,0162u/L

5. DISCUSIN

Es importante informar que tanto la figura 1 que contiene el procedimiento experimental con la figura 2 que contiene el balance de masas se encuentran ubicadas tambin en la parte de anexos para que se puedan visualizar estas figuras de manera ms clara que en procedimiento experimental y resultados.

Comenzando con la discusin del balance de masas se puede observar en la figura 2 que a medida que el procedimiento avanza la muestra se purifica la concentracin enzimtica gradualmente. Esto se debe a los procedimientos de centrifugacin que se realizaron porque cada vez que se obtena un extracto el precipitado o el sobrenadante eran despreciados para el paso siguiente. No se puede discutir la diferencia de cada extracto obtenido en el balance de masas con la actividad estersica de los mismos porque solo se cuantific esta actividad en el extracto 2 de cada una de las vsceras (pollo, res y cerdo).Las condiciones de temperatura y pH fueron adecuadas en los tres extractos con los que se cuantific la actividad estersica pues aunque pequeos, los tres presentaron actividad enzimtica. Esto quiere decir que las protenas no se desnaturalizaron conforme avanz el procedimiento.En el caso de la actividad estersica del extracto 2 de las vsceras de pollo se observa en la figura 3 que su pendiente es de 0.0033 relativamente pequea y por tanto su actividad estersica tambin ser pequea, 0.0487 u/L. Sin embargo si se compara este resultado con los resultados de la actividad enzimtica del extracto 2 de las vsceras de res (0.0236 u/L) y cerdo (0.0162 u/L), se determina que la mejor actividad estersica se present en el pollo porque tanto la figura 4 como la figura 5 presentaron pendientes ms pequeas que en la figura 3 y como se expuso en la introduccin la actividad estersica ser mayor a medida que el valor de la pendiente de su diagrama de dispersin adsorbancia vs tiempo incremente. La segunda mejor actividad enzimtica la presenta las vsceras de res con un valor de 0.0236 u/L, esto se debe a que el valor de su pendiente fue de 0.0016; no como la pendiente obtenida en la figura 5 perteneciente al diagrama de dispersin de adsorbancia vs tiempo de las vsceras de cerdo que presenta un valor de 0.0011 que da una activada estersica de apenas 0.0162 u/L, siendo este ltimo extracto el que present menor actividad estersica.La discusin sobre que vscera present mejor actividad enzimtica redactado en el prrafo anterior puede deberse al origen de cada uno de los animales de los cuales se extrajeron las vsceras; sin embargo como las vsceras de los mismos fueron adquiridas en el mercado no se posible conocer las variables ambientales y alimenticias de cada animal. Otra posible razn puede ser que las vsceras de pollo fueron mejor lavadas que las vsceras de res y cerdo o la concentracin de tampn fosfato, condiciones de temperatura y pH fueron ms adecuadas en las vsceras de pollo que en las vsceras de res y cerdo, aunque se intent dar las mismas condiciones a todas las muestras de vsceras. A pesar de que se han buscado razones especficas para explicar esta diferencia en la actividad estersica de las vsceras de pollo, res y cerdo con una explicacin a nivel de cada animal, ha sido muy complicada encontrarla; es por esta razn que en base a discusiones con compaeros de otros grupos de trabajo y el profesor de la materia se han intentado dar posibles explicaciones de estas diferencias.

A pesar de que existe error en el clculo de la actividad estersica (debido a la humedad espontnea que absorben las muestras del ambiente antes de ingresar al espectrofotmetro) de vsceras pertenecientes a los diferentes animales, el mismo es despreciado porque el error se aplicara a los tres clculos y adems repercute en la cuarta cifra significativa del resultado. Sin embargo si en futuras prcticas se quiere cuantificar el valor exacto de este error se debe realizar un blanco para obtenerlo.6. CONCLUSIONES Las condiciones de temperatura y pH que se utilizaron para los extractos fueron adecuados, pues todas las muestras viscerales presentaron actividad enzimtica, es decir no existi desnaturalizacin de las enzimas. Sin embargo influyeron de manera ms adecuada en la muestra de vsceras de pollo pues present ms actividad enzimtica Al construir los grficos de dispersin de adsorbancia vs tiempo del extracto de cada animal se obtuvo que la pendiente ms alta la tuvieron las vsceras de pollo con un valor de 0.0033, les siguieron las vsceras de res con un valor de 0.0016 y por ltimo las vsceras de pollo con un valor de 0.0011 en su pendiente. Estos resultados ayudaron a cuantificar la actividad estersica en cada extracto. En el balance de masa se determin que a medida que se desarrolla el proceso se purifica la concentracin enzimtica de la muestra en los diferentes extractos. Sin embargo no se pueden hacer comparaciones entre la purificacin de concentracin enzimtica de los extractos con la actividad estersica de los mismos porque solo se obtuvo la actividad enzimtica del extracto 2 de cada muestra de vsceras. La actividad estersica que se obtuvo en el caso de las vsceras de pollo fue 0.0487 u/L; 0.0236 en el caso de las vsceras de res y 0.0162 en el caso de las vsceras de pollo.

Las vsceras de pollo tuvieron mayor actividad estersica debido a que la pendiente obtenida en su diagrama de dispersin tuvo un mayor valor, esto pudo deberse a las condiciones de concentracin de tampn fosfato, a las condiciones de temperatura y pH a las que fue sometida la muestra reaccionaron de mejor manera en este caso particular o incluso al comportamiento individual de las enzimas en cada uno de los animales de los que se extrajeron las vsceras.7. RECOMENDACIONES

Se recomienda realizar el blanco para poder obtener la actividad estersica precisa de cada una de las muestras. Se recomienda manipular con ms cuidado materiales que no sean muy familiares como las micro pipetas para no daarlas.BIBLIOGRAFAGonzalez, J. (2004). Tema 11: Enzimas. Recuperado el 2 de Diciembre de 2013, de Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular de la Universidad del pas Vasco: http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/tema11.htm

Lehninger, A., Nelson, D., & Cox, M. (2009). Enzimas: cintica e nhibicin. En A. Lehninger, D. Nelson, & M. Cox, Principios de bioqumica (pg. 189). Espaa: Ediciones Omega.

Sinche, M. (Junio de 2009). bibdigital.epn.edu.ec. Recuperado el 02 de Diciembre de 2013, de http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/1661/1/CD-2218.pdf

ANEXOS

Figura 1: Procedimiento experimental realizado en la prctica mediante un diagrama de flujo.

Figura 2: Balance de masas de los diferentes extractos obtenidos en la prctica7

_1447620313.vsd

Homogenizacin

Calentamiento

Enfriamiento

Centrifugacin

Precipitacin diferenciada

Actividad enzimtica

Centrifugacin

Actividad enzimtica

40ml tampon

homogenizadoextracto1

60 oC/ 10 min

homogenizado

homogenizado

precipitado

sobrenadante

extracto 2

Extracto 3

sobrenadante

_1447609134.vsd