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INSTITUTO TECNOLGICO DE CONKAL, YUCATN.CARACTERIZACIN FISIOLGICA Y MOLECULAR DE Paecilomyces fumosoroseus (WIZE) BROWN & SMITH Y SU PATOGENICIDAD EN ESTADIOS INMADUROS DE Bemisia tabaci (GENNADIUS)

Tesis que presenta:

Ing. WILBERTH CHAN CUPUL

Como requisito parcial para obtener el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS EN HORTICULTURA TROPICAL

Conkal, Yucatn, Mxico Agosto 2009

2 CONTENIDO Pgina I II II IV 1 2 3 5 5 6 7 7 8 9 9 10 11 12 14 16 17 20 23 24 24 24 25 25 25 26 26 28 28 29 29 30 31 31 31 32 32

NDICE DE CUADROS NDICE DE FIGURAS NDICE DE CUADROS DEL APNDICE INDICE DE FIGURAS DEL APNDICE RESUMEN SUMMARY I. INTRODUCCIN II. REVISIN DE LITERATURA 2.1. Generalidades de Bemisia tabaci 2.1.1. Clasificacin taxonmica 2.1.2. Distribucin geogrfica 2.1.3. Ciclo de vida 2.1.4. Daos ocasionados 2.1.5. Mtodos de control 2.1.5.1. Resistencia vegetal 2.1.5.2. Control cultural 2.1.5.3. Control qumico 2.1.5.4. Control biolgico 2.2. Mecanismo de accin de los hongos entomopatgenos 2.2.1. Caractersticas de Paecilomyces fumosoroseus 2.2.2. Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci Antecedentes de la caracterizacin molecular de P. 2.3 fumosoroseus III. HIPTESIS IV. OBJETIVOS 4.1 General 4.2 Especficos V. MATERIALES Y METODOS 5.1. Localizacin 5.2. Cra de B. tabaci 5.3. Plantas hospederas de para bioensayos 5.4. Reactivacin de los aislamientos 5.5. Obtencin de cultivos monospricos 5.6. Bioensayos de patogenicidad 5.6.1 Obtencin de estados inmaduros de B. tabaci 5.6.2 Obtencin de la suspensin de esporas 5.6.3. Bioensayos de patogenicidad en inmaduros de B. tabaci 5.6.4. Diseo experimental y anlisis de datos 5.7. Caracterizacin fisiolgica 5.7.1. Crecimiento diametral 5.7.2. Esporulacin 5.7.3. Porcentaje de germinacin

3 5.7.4. Diseo experimental y anlisis de datos Caracterizacin molecular mediante RAPD-PCR 5.8.1. Obtencin del micelio 5.8.2. Extraccin de ADN 5.8.3. Cuantificacin de ADN 5.8.4. Aplicacin de la tcnica RAPD-PCR 5.8.5. Anlisis estadstico VI. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Patogenicidad en huevos de B. tabaci 6.2. Patogenicidad en ninfas de B. tabaci 6.2.1. Tiempo letal medio (TL50) 6.2.2. Concentracin letal media (CL50) 6.3. Caracterizacin fisiolgica 6.3.1. Crecimiento diametral 6.3.2. Esporulacin 6.3.3. Tasa de germinacin 6.4 Caracterizacin molecular 6.4.1. Extraccin y cuantificacin del ADN 6.4.2. Seleccin de iniciadores RAPD 6.4.3. Anlisis RAPD-PCR VII. CONCLUSIONES VIII. LITERATURA CITADA IX. APNDICE 5.8. 33 33 34 34 35 36 37 38 38 40 42 43 45 45 46 47 49 49 50 51 56 58 67

4 NDICE DE CUADROS Pgina Cuadro 1. Nomenclatura de los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus. Tiempo letal medio en ninfas de B. tabaci por efecto del hongo P. fumosoroseus al aplicar una suspensin de 1x107 esporas ml-1. Concentracin letal media (CL50) de los aislamientos de P. fumosoroseus. Medias error estndar del desarrollo in vitro de los aislamientos P. fumosoroseus. Secuencia y nmero de fragmentos amplificados por los iniciadores evaluados. Matriz de similaridad gentica construida a partir de los perfiles RAPD a travs del coeficiente Jaccard. 27

Cuadro 2.

43

Cuadro 3.

45

Cuadro 4

48

Cuadro 5

50

Cuadro 6

54

I

5 NDICE DE FIGURAS Pgina Figura 1. Mortalidad en huevos de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1 del hongo Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Mortalidad en ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x10 7 esporas ml-1 de Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Cuantificacin de ADN genmico de aislamientos polispricos de Paecilomyces fumosoroseus. Carriles 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Seleccin de iniciadores empleando el aislamiento Pf-Tim (Monosprico M1) de Paecilomyces fumosoroseus. 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) OPB 01, 3) OPB 02, 4) OPB 03, 5) OPB 04, 6) OPB 05 7) OPB 06, 8) OPB 07, 9) OPB 08, 10) OPB 09, 11) OPB 10. Perfil RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus obtenido con el primer OPB 10. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Dendrograma obtenido a partir de los perfiles RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus y dos de Beauveria bassiana. 39

Figura 2.

41

Figura 3.

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Figura 4.

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Figura 5

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Figura 6

55

II

6 NDICE DE CUADROS DEL APNDICE Pgina Cuadro 1A. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en huevos de B. tabaci a los 7 das despus de la inoculacin de una suspensin de de 1x10 -7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en ninfas del primer instar de B. tabaci a los 12 das despus de la inoculacin de una suspensin de 1x10 7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la tasa de crecimiento diario de la colonia de los aislamientos de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la esporulacin de los aislamientos de P. fumosoroseus Anlisis de varianza del porcentaje de germinacin por hora de los aislamientos de P. fumosoroseus. 67

Cuadro 2A.

67

Cuadro 3A.

67

Cuadro 4A.

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Cuadro 5A.

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III

7 NDICE DE FIGURAS DEL APNDICE Pgina Figura 1A. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 02. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal, 6) Paesin, 7) HBb5 y 8) HBb22. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 06. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 07. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 09. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. 68

Figura 2A.

69

Figura 3A.

69

Figura 4A.

70

IV

8 RESUMEN

El uso de insecticidas qumicos en el manejo de Bemisia tabaci ocasiona serios daos al ambiente y la seleccin de poblaciones resistentes. Una alternativa promisoria es el biocontrol mediante hongos entomopatgenos. En el presente estudio se evalu la patogenicidad de Paecilomyces fumosoroseus en huevos y ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci y se caracterizaron fisiolgica y molecularmente los aislamientos evaluados. La patogenicidad se evalu por inmersin de hojas que contenan inmaduros de B. tabaci en soluciones de 1x104 a 1x107 esporas ml-1. La caracterizacin fisiolgica se evalu mediante la tasa de crecimiento diario del dimetro de la colonia (TCD), esporulacin y la tasa de germinacin de esporas (TGE). La caracterizacin molecular se realiz mediante el uso de marcadores moleculares RAPDs. La mortalidad en huevos por efecto del hongo oscil entre 21.2 y 61.9%. Los aislamientos ms patognicos en ninfas con menor concentracin letal media (CL50) fueron Paesin y Pf-Tim con 2.6x104 y 5.5x104 E. ml-1. El Tiempo letal medio (TL50) ms bajo lo obtuvo Paesin con 3.7 das. El aislamiento Pf-Rg mostr la mayor TCD con 0.25 cm da-1, Paesin present la esporulacin ms alta con 4.5x10 6 E. ml-1. La TGE fue mayor en Pf-Tiz con 33.1% hora-1. Las huellas genticas y el rbol filogentico evidenciaron la agrupacin de los aislamientos de P. fumosoroseus en un solo grupo, fuera del grupo de los empleado (Beauveria bassiana) con un promedio se similaridad interna de 68.2%, lo que demuestra una baja variabilidad gentica entre los aislamientos evaluados.

9 SUMARY

The use of chemical insecticides for the control of Bemisia tabaci has caused several damage at environmental and selection of resistant populations. A promising alternative is the biocontrol by entomopathogenic fungi. In the present study was evaluated the pathogenicity of Paecilomyces fumosoroseus on eggs and first nstar nymphs of Bemisia tabaci and the physiology and molecular characterization of the isolates tested. The bioassay of pathogenicity was realized by leaves immersion that contained the inmatures whiteflies inside of four solutions of spores (1x104-1x107 spores per ml). The physiology characterization was tested by means the rate of daily grow of colony diameter (RGCD), sporulation and the rate of spore germination (RSG). The molecular characterization was realized using molecular markers RAPDs. The mortality eggs by fungis effect oscillated between 21.2 to 61.9 percent. The isolates highest pathogenic in nymphs with less lethal concentration (LC50) were Paesin and Pf-Tim with 2.6x104 y 5.5x104 spores per ml. Paesin obtained the less lethal time (LT50) with 3.7 days. In the physiology characterization, Pf-Rg showed the highest RGCD with 0.25 centimeters per day, Paesin presented the highest sporulation with 4.5x106 spores per ml. The RSG was highest in Pf-Tiz with 33.1% per hour. The fingerprinting and the phylogenetic tree showed to grouping of P. fumosoroseus isolates outside of control group used (Beauveria bassiana) with an internal similarity average of 68.2 percent, this study showed a low genetic variability between the isolates tested.

10 I. INTRODUCCIN

La mosquita blanca Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polfaga que afecta el desarrollo de numerosos cultivos en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Gmez et al., 2007). En Mxico es la especie ms comn e importante en trminos econmicos que limita la produccin de cultivos hortcolas y ornamentales (Sotero et al., 2007), debido a los daos que ocasiona de manera directa con la extraccin de savia y debilitamiento de las plantas e indirectas como las fumaginas, alteraciones fitotxicas y transmisin de enfermedades de etiologa viral (Brown, 1994; Perring, 1996; Marcano, 2001).

Actualmente los insecticidas qumicos son el mtodo de control ms utilizado en el combate de esta plaga, cuyo costo vara de acuerdo al nivel de toxicidad, siendo los ms baratos los ms utilizados por los agricultores. Esta actividad ejerce efectos adversos en la salud del hombre, el medio ambiente y genera poblaciones de insectos altamente resistentes a estos insecticidas (Palumbo et al., 2001). Por lo tanto, en la ltima dcada se ha incrementado el inters por el uso de mtodos alternativos de control compatibles con el hombre y el ambiente.

El uso de hongos entomopatgenos para el control biolgico de Bemisia tabaci constituye una alternativa promisoria debido a que estos microorganismos causan epizootias que juegan un papel importante en la regulacin de poblaciones de insectos y no son nocivos hacia organismos benficos (Torres et al., 1993; Vargas, 2003).

11 Al menos 20 especies de hongos entomopatgenos parasitan a mosquitas blancas, entre ellos destacan los gneros Beauveria, Verticillium, Aschersonia y Paecilomyces. Sin embargo, Paecilomyces sp. es el genero de mayor importancia de estudio para insectos hompteros como lo es Bemisia tabaci, destacando dentro de este genero la especie Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith (Dos Santos y Pozo, 2003; Pucheta et al., 2006).

Debido a su diversidad gentica el hongo Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) esta ampliamente distribuido por todo el mundo, puede encontrarse en el suelo e infectando a diversos insectos de numerosos ordenes (Smith, 1993). Se han reportado variaciones entre los diferentes aislamientos de P. fumosoroseus ya que algunos presentan mayor especificidad y eficiencia a ciertas especies de insectos por lo que es importante evaluar los diferentes aislamientos basndose en criterios moleculares (Tigano-Milani et al., 1995; Azevedo et al., 2000; Obornk et al., 2000; Fargues et al., 2002; Delleau-Cloudet et al., 2005; Gauthier et al., 2007).

Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la patogenicidad de aislamientos del hongo entomopatgeno Paecilomyces fumosoroseus sobre estados inmaduros de Bemisia tabaci, as como caracterizar fisiolgica y molecularmente los aislamientos con la perspectiva a largo plazo de establecer una alternativa ms para el control biolgico de esta plaga en regiones tropicales.

12 II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Generalidades de Bemisia tabaci

Las mosquitas blancas son insectos diminutos, raramente de ms de 2-3 mm de longitud, los adultos de ambos sexos son alados, pertenecen a la familia Aleyrodidae, que se divide en 2 subfamilias: Aleurodicinae y Aleyrodinae (Alean, 2003). La subfamilia Aleurodicinae es considerada la ms primitiva, sus individuos se caracterizan por la presencia de secreciones de cera en forma de filamentos dorsales o algodonosas. La subfamilia Aleyrodinae es la ms evolucionada, sus ninfas se caracterizan por presentar secreciones largas y dorsales; de color transparente, amarillo o negro y se alimentan principalmente de plantas herbceas, comprende ms de 1,000 especies descritas y es la ms ampliamente distribuida con diecisiete gneros destacando los siguientes tres: Bemisia, Aleurocanthus y Aleurotrachelus (Caballero, 1992; Castillo 1996).

El genero Bemisia comprende 37 especies reconocidas entre las cuales la ms destacada es Bemisia tabaci por ser cosmopolita y polfaga, capas de atacar a ms de 500 especies y variedades de cultivos (Callejas y Ochando, 2005). Su distribucin mundial parece estar relacionada con la implementacin de los monocultivos, sus diferentes prcticas agrcolas y por tener una amplia plasticidad en diferentes hospedantes (Horowitz et al., 2003). Se conocen aproximadamente 24 biotipos relacionadas principalmente con hospedantes y regiones geogrficas especificas, los cuales se han identificado y caracterizado de diferente manera (Zhang et al., 2005), por lo que muchos autores coinciden en que Bemisia tabaci representa un complejo de biotipos dentro del genero Bemisia (Muiz, 2000; Perring, 2001).

13 2.1.1 Clasificacin taxonmica

La clasificacin de la familia Aleyrodidae est basada en la estructura de la exuvia pupal del cuarto nstar ninfal y no de las estructuras morfolgicas de los adultos (Mound y Halsey, 1978; Byrne y Bellows, 1991; Arcos, 2005).

Reino: Animal Divisin: Exopterygota Clase: Insecta Orden: Hemptera Suborden: Homptera Familia: Aleyrodidae Gnero: Bemisia Especie: tabaci (Gennadius)

Sinonimias: Aleurodes tabaci (Gennadius), Bemisia goldingi (Corbertt), Bemisia gossypiperda (Masra Lamba), B. longispina (Priesner Hosny); B. nigeriensis (Corbertt) (Arcos, 2005)

2.1.2 Distribucin geogrfica

El Oriente y la India se han considerado como el centro de origen de Bemisia tabaci, de donde fue dispersada por el hombre hacia al continente Americano y Africano. Actualmente se encuentra afectando diversos cultivos en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo. No obstante en las ltimas dos

14 dcadas, Bemisia tabaci ha invadido todos los continentes con excepcin de la Antrtica (Naranjo et al., 2002). En Mxico se ha reportado como plaga de importancia econmica en Guanajuato, Veracruz, Baja California Sur, Sonora, Michoacn, Chiapas, Durango, Coahuila, Oaxaca, Sinaloa, San Lus Potos, Tamaulipas y Yucatn, (Daz y Ramrez, 1993; Soria et al., 1996).

2.1.3 Ciclo de vida

Es un insecto chupador que se localizan en el envs de las hojas de sus hospedantes, presentan metamorfosis incompleta; es decir su ciclo biolgico incluye una etapa de huevo, cuatro estados ninfales y el adulto (Bautista et al., 2002; Bautista, 2006). Segn Saunders et al., (1998) los huevos de B. tabaci comprenden un periodo de 5 a 10 das para pasar al estado ninfal y son depositados en forma individual o en grupos. El nmero mximo de huevos que puede ovipositar una hembra vara de 48 a 500 segn la especie, las condiciones ambientales y la planta hospedante.

El estado ninfal presenta cuatro instares de los cuales solo el primero es mvil gracias a la presencia de patas bien desarrolladas, el cual es conocido como gateador (Carabali, 2004). Posteriormente pasa por otras tres instares de desarrollo, en cada caso de mayor tamao, hasta transformarse en adulto o mosquita este periodo comprende de 12 a 28 das, dependiendo de las condiciones y planta hospedera en donde se desarrolle (Saunders et al., 1998; Bautista, 2006). El adulto, recin emergido, es de color amarillo plido y sus alas son ligeramente transparentes, aunque luego adquieren un color blanco debido al polvo ceroso que las cubre. Diez horas despus de la emergencia, los machos adultos estn aptos para iniciar el cortejo. Copulan varias veces y las hembras presentan mayor longevidad que los machos (Bautista et al., 2002).

15 2.1.4 Daos ocasionados

El tipo de dao varia segn la raza o biotipo, cuando el nmero de ninfas y adultos son altos causan dao directo, por su alimentacin mediante la extraccin de savia provocando el debilitamiento de las plantas, a su vez causan daos indirectos secretando sustancias azucaradas que favorecen el desarrollo de hongos como Capnodium spp. causantes de fumaginas, los cuales tienen un efecto adverso en la fotosntesis, al impedir la llegada de luz a la superficie foliar (CIAT, 1986; Marcano, 2001). Otro de los daos poco conocidos de Bemisia tabaci son las alteraciones fitotxicas o sndromes en cucurbitceas, como el tomate, brcoli y lechuga (Perring, 1996).

Sin embargo, en la actualidad el mayor dao indirecto de Bemisia tabaci es ser el vector transmisor de por lo menos 100 virus de tipo geminivirus carlavirus, luteovirus, nepovirus, potyvirus y closterovirus (Brown, 1994). Por la vasta gama de cultivos hortcolas que afecta y al dao que ocasiona de forma directa como indirecta, siendo la causante de grandes perdidas econmicas es considerando como unas de las principales plagas del siglo XXI (Antonio et al., 2001).

2.1.5 Mtodos de control

Un buen control de las poblaciones de Bemisia tabaci se logra con un programa adecuado de manejo integrado, que implica la aplicacin oportuna de diversos mtodos de control, entre las tcticas ms empleadas se encuentran la resistencia vegetal, control cultural, control qumico, control biolgico y el control microbiano.

16 2.1.5.1 Resistencia vegetal. Es un mtodo que puede ser explotado por presentar un gran potencial como estrategia de manejo en un programa integrado (McAuslane, 1996). La resistencia de las plantas a insectos puede utilizarse en diversos cultivos. Varias caractersticas de las plantas pueden conferirle resistencia, tales como composicin nutrimental del follaje, forma de las hojas, el nmero y distribucin espacial de tricomas, pH, concentracin de taninos y fenoles (Castro, 2006).

Uno de los casos mas exitosos de resistencia vegetal a moscas blancas son los estudios realizados por el CIAT en el cultivo de yuca evaluando por ms de dos dcadas la resistencia a la mosquita blanca Aleurotrachelus socialis Bondar en ms de 6,000 variedades de Yuca. Demostrado que los clones MECU 72, MECU 64, MPER 335 y MPER 317 han manifestado de manera consistente un alto nivel de resistencia (Vargas et al., 2002).

Con respecto a B. tabaci se ha encontrado resistencia vegetal en cultivares de algodn como el BRS Aroeira, BRS Verde, BRS Ita 90-2 y BRS Ipe (Castro, 2006). En otro trabajo de resistencia vegetal Toscano et al., (2002) evaluaron genotipos silvestres de Lycopersicon spp encontrando un alto nivel de antibiosis en los genotipos L y c o p e r s i c o n pennellii (LA 716) y Lycopersicon

hirsutum f. glabratum (PI 134417). Sin embargo para llegar a obtener resultados como estos es necesario de una estricta disciplina y un largo periodo de estudios cientficos para obtener resultados similares para cada cultivo susceptible.

2.1.5.2 Control cultural. El uso de plantas o cultivos secundarios asociados a uno o ms cultivos primarios como barrera o trampa y las coberturas vivas para el combate de una plaga en del marco del manejo integrado de plagas (MIP) se ubican dentro del combate ejercido como prcticas culturales (Salas, 2004). El

17 cual consiste en la manipulacin deliberada del ambiente para hacerlo menos favorable a las plagas, con el fin de interrumpir sus ciclos reproductivos, reducir la disponibilidad de alimentos y favorecer la multiplicacin de sus enemigos naturales (Metcalf y Luckmann 1975).

El uso de plantas o cultivos en varias modalidades (asociado, barrera, intercalado y trampa, entre otros) como prcticas agrcolas para combatir diferentes plagas ha sido informado por varios investigadores (Gutirrez 1999, Smith y McSorley 2000). Sin embargo, hasta ahora las evaluadas han incluido fechas de siembra y veda, eliminacin de malezas, destruccin de residuos de cultivos, semilleros protegidos, cubiertas flotantes, alta densidad de siembra, barreras vivas, coberturas al suelo, cultivos asociados y riego por aspersin (Hilje 2000, Hilje et al. 2001).

2.1.5.3 Control qumico. Durante las dos ltimas dcadas nuevos insecticidas qumicos han sido introducidos ofreciendo una diversidad de modos de accin y rutas de actividad. Entre estos productos los ms empleados son los nicotinoides como el imidacloprid, tiamethoxan, thiacloprid y pymetrozine. En lo que se refiere a las reguladores de crecimiento los ms concurridos son el pyriproxyfen y buprofezin (Gutirrez et al., 2007; Sotero et al., 2007). Aunque los nuevos atributos bioqumicos y las actividades biolgicas de estos insecticidas los han hecho efectivos, su uso intensivo ha ocasionado prdida de la susceptibilidad sobre este insecto (Palumbo et al., 2001), como la ha documentado Erdogan et al. (2008) quienes encontraron altos niveles de resistencia en B. tabaci a insecticidas Piretroides, organoclorados y reguladores de crecimiento.

18 2.1.5.4 Control biolgico. Se han identificado diversas especies de parasitoides, depredadores y hongos entomopatgenos para B. tabaci. Los parasitoides estn representados por dos gneros de la familia Aphelinidae (Encarsia y Eretmocerus) y uno de la familia Platygasteridae (Amitus) (Vzquez, 2002). Aunque la mayoria de las referencias sobre la actividad de los parasitoides no atribuyen la capacidad de regular satisfactoriamente las poblaciones de B. tabaci, varios informes reflejan su potencial en programas donde se combinen la conservacin y otras tcticas de manejo. As, Serrano et al. (1996) observaron en reas de policultivos en el salvador tasas de reduccin poblacional de B. tabaci de hasta el 80% en frjol y el 60% en tomate, bsicamente por Encarsia y Eretmocerus.

Los depredadores son ms diversos, ubicados bsicamente en los rdenes Neuroptera, Coleoptera, Hemiptera y Diptera de la clase insecta (Vzquez, 2002). Los cuatro agentes mas comunes y comercialmente producidos para el control biolgico de moscas blancas son Macrolophus caliginosus Wagner (Hemiptera: Miridae), Dicyphus tamaninii Wagner (Hemiptera: Miridae), Delphastus pusillus (LeConde) (Coleoptera: Coccinellidae) y Delphastus hesperus (Coleoptera: Coccinellidae) (Coollen, 2005) Los adultos y ninfas de M. caliginosus son efectivos para suprimir las poblaciones de B. tabaci (Jakobsen et al., 2002).

Los hongos entomopatgenos son considerados como los patgenos ms promisorios contra B. tabaci, ya que pueden infectar a los insectos directamente a travs de la penetracin de su cutcula. As como sus mltiples mecanismos de accin que les confiere una alta capacidad para evitar que el hospedero desarrolle resistencia (Alean, 2003). Las especies ms comunes como controladores de las mosquitas blancas son los hongos Deureromycetes: Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith, Verticillium lecanii (Zmm.)

19 Viegas, Aschersonia aleyrodis Webber y Beauveria bassiana (Blsamo) Vuillemin (Fransen, 1990; Lacey et al., 1999; Ayhan y Kubilay, 2005).

Por ejemplo en Dominicana McGuirre (1995) inform de un hongo que controla a la mosquita blanca B. tabaci durante la estacin de lluvia. Mendoza et al. (1995) refirieron que en la zona central del litoral ecuatoriano colectaron dos especies de hongos entomopatgenos y se han registrado hasta un 95% de mortalidad en adultos de B. tabaci por efecto de estos microorganismos. Igualmente Serrano et al., (1995) hallaron en el Salvador una epizootia intensa de Paecilomyces spp., que consideraron muy agresiva sobre poblaciones de B. tabaci, especialmente en adultos. Serra et al. (1996) evalu la eficacia de aislamientos importantes y nativos de hongos entomopatgenos en

ornamentales y cultivos hortcolas severamente afectados por B. tabaci, encontrando porcentajes de control superiores al 50% con el hongo P. fumosoroseus.

2.2 Mecanismo de accin de los hongos entomopatgenos.

Los hongos entomopatgenos inician su proceso infectivo en los insectos hospederos cuando las esporas viables son retenidas por contacto en la superficie cuticular del insecto, mientras encuentran un espacio propicio para establecer la asociacin patgeno-hospedero y formar los tmulos germinales y el apresorio, que facilitarn la invasin del hongo. Se ha sugerido que iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 reducen las fuerzas de repulsin electrosttica de la superficie cuticular del insecto, por lo que pueden afectar su hidrofobicidad y promover la adhesin pared celular fngica-cutcula, creando condiciones favorables para el establecimiento de la espora y la subsecuente invasin del hospedero (Tanada y Kaya, 1993; Pucheta et al., 2006).

20 La germinacin de la espora se inicia con el hinchamiento de la misma, que es favorecido por una humedad alta alrededor del 70% durante aproximadamente 14 horas. La germinacin es disparada por mensajeros que generalmente son carbohidratos presentes en las protenas cuticulares del insecto. La hidratacin de la espora es favorecida por la accin antidesecante de su cubierta mucilaginosa, que adems funciona como protector ante la presencia de polifenoles txicos y enzimas, secretadas por sistema inmune del insecto (Pucheta et al., 2006).

Al germinar la espora da lugar a la formacin de un tubo germinativo mediante el proceso de polarizacin tpico del crecimiento apical de los hongos produciendo un apresorio (Tanada y Kaya 1993). El tubo germinativo rastrea y reconoce la superficie del insecto para la localizacin de sitios receptores, habilitando a la hifa para la penetracin de la cutcula (Wessels, 1999). El apresorio sirve para el anclaje de la espora y ejerce una presin hacia el interior del insecto. Paralelamente, el hongo excreta una gran cantidad de enzimas entre las que se incluyen proteasas, quitinasas, quitobiasas, lipasas, lipooxigenasas y otras enzimas hidrolticas, que van degradando la cutcula y proporcionan a su vez nutrientes al hongo (Monzn, 2001).

Una vez dentro del insecto, el hongo prolifera formando cuerpos hifales secundarios, que se ramifican en la procutcula conformada principalmente de fibrillas lameladas. Posteriormente, los cuerpos hifales se encuentran con la capa epidrmica y con su respectiva membrana basal y se diseminan a travs del hemocele (Deshpande, 1999). As invaden diversas estructuras como tejidos musculares, cuerpos grasos, tubos de Malpighi, mitocondrias, retculo endoplsmico y membrana nuclear agotando los nutrientes debido al crecimiento del hongo de tal modo que el hospedero muere por inanicin, destruccin de rganos internos y liberacin de toxinas. Finalmente la hifas

21 penetran de adentro hacia fuera y emergen a la superficie iniciando la formacin de esporas cuando las condiciones ambientales son adecuadas (Gillespie y Claydon, 1989; Pucheta et al., 2006).

2.2.1 Caractersticas de Paecilomyces fumosoroseus

El gnero Paecilomyces spp presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayora presenta ramificaciones verticiladas o

irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama grupos de filides, las cuales pueden ser solitarias. Las filides constan de una porcin basal cilndrica o hinchada, adelgazndose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio. Los conidiforos llevan cadenas de conidias; stas son hialinas, unicelulares y de forma ovoide (Bustillo, 2001).

Este gnero tiene dos subdivisiones Paecilomyces e Isarioidea. La primera divisin se caracterizan por no ser entomopatgenos y telmrficos, mientras que la divisin Isarioidea se caracterizada por ser entomopatgenos y telmrficos. Dentro de la divisin Isarioidea existen cinco especies con potencial biocontrolador de plagas, estas son: P. fumosoroseus, P. lilacinus, P. farinosus, P. amoenoroseus y P. javanicus. (Humber, 1998). El hongo Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith es un entomopatgeno de un amplio rango de hospederos y distribucin geogrfica, ha sido aislado del suelo y de insectos de diversas familias (Dos santos y Poso, 2003). Crece con micelio blanco, las conidias son menores a 3.5 m, el color de la colonia puede ser rosado-gris, rosado-oscuro, gris y el reverso de la colonia cultivada in vitro es amarilla (Humber, 1998). Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado plido (Bustillo, 2001).

22 2.2.2 Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci

En la seleccin de aislamientos con mayor actividad biocontroladora de Bemisia tabaci el CATIE (2003) realizo evaluaciones en Colombia y Costa Rica de diversos hongos entomopatgenos. Las evaluaciones a los 6 das despus de la inoculacin arrojaron porcentajes bajos de control (