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VÍA OXIDATIVA DE PRODUCCIÓN DE NITRATO

BAJO CONDICIONES DE NUTRICIÓN AMONIACAL

EXCLUSIVA EN PLANTAS CRECIDAS EN CULTIVO

AXÉNICO

Ana María Villarroel Dávila Pamplona, septiembre 2010

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PRESENTACIÓN

Título del trabajo:

“Vía oxidativa de producción de nitrato bajo condiciones de nutrición amoniacal

exclusiva en plantas crecidas en cultivo axénico”

Autor: Ana María Villarroel Dávila.

Tutores:

Dr. José Fernando Morán Juez.

Estibaliz Urarte Rodríguez

Grupo de Fisiología Vegetal y Agrobiología

Centro donde se ha realizado el trabajo:

Instituto de Agrobiotecnología

Universidad Pública de Navarra- CSIC-Gobierno de Navarra

Campus de Arrosadía s/n

31192. Mutilva. Navarra.

Palabras clave: Amonio, estrés abiótico, nitrato, nitrificación, nutrición, nutrición

nitrogenada, radicales libres, tolerancia al amonio.

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco profundamente a mis padres por todo el apoyo brindado durante toda mi vida, a mis hermanas cuñados y sobrinos que han estado siempre pendientes de mí.

Agradezco al Gobierno de la República del Ecuador y a la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología SENACYT por la beca recibida para obtener el título de Máster en Agrobiología Ambitenal.

Agradezco a mi tutor por su guía y apoyo en la realización de este trabajo y a todos mis amigos del laboratorio que con ellos fue mucho más fácil y enriquecedor éste proceso.

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RESUMEN La actividad agrícola intensiva ha generado un alto porcentaje de suelos y acuíferos

afectados por lixiviaciones de nitratos y otros compuestos provenientes de la fertilización

nitrogenada. Dada esta problemática, es importante el estudio de aspectos fisiológicos de la

planta que aporten datos relacionados con la nutrición mineral, para plantear nuevas

estrategias de fertilización por medio de las cuales se optimice la absorción de nitrógeno

por la planta, siendo así menor su impacto sobre el agroecosistema. Dentro de este

contexto, en la presente investigación se buscó estudiar las rutas de nitrificación y los

compuestos intermediarios que participan en este proceso en plantas de Arabidopsis

thaliana y Pisum sativum, bajo nutrición amoniacal exclusiva. Se estableció un medio de

cultivo axénico para el desarrollo de las plantas en condiciones de esterilidad y se realizó

un análisis morfológico de su crecimiento. Asimismo, se realizaron ensayos para identificar

compuestos intermediarios de la oxidación del amonio in vitro. Las concentraciones de

amonio (NH4+) aplicadas (1 y 5mM) provocaron una disminución en el crecimiento y

desarrollo de A. thaliana. En los tejidos de la parte aérea se identificó la presencia de nitrato

(NO3-), nitrito (NO2

-) e hidroxilamina (NH2OH), considerándose así posibles intermediarios

en el metabolismo del amonio en A. thaliana. En el cultivo de P. sativum no se observaron

diferencias en el crecimiento en los diferentes tratamientos de amonio aplicados. Los

compuestos intermediarios identificados en esta especie únicamente fueron NO3- y NO2

-.

Además, las reacciones de nitrificación in vitro realizadas indicaron que ciertos niveles de

NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no enzimático; sin embargo, parece que la

presencia de compuestos como la xantina, la xantina oxidasa, la Fe-superóxido dismutasa y

algunas hemoglobinas, induce la formación de estas especies de nitrógeno oxidadas.

En conclusión, los resultados obtenidos sugieren la existencia de una vía de

oxidación del amonio dentro de las células vegetales, hecho que hasta ahora se atribuía

exclusivamente a algunos organismos procariotas. No obstante, son necesarios estudios

complementarios para llegar a comprobar de manera fehaciente esta hipótesis.

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ABSTRACT

Intensive agricultural activity has generated the affection of a high percentage of land and

aquifers by lixiviation of nitrates and other compounds from derived from nitrogen fertilization. It is

important to study the physiological features related to mineral nutrition that would contribute to

establish new fertilization strategies to optimize nitrogen intake by plants. These findings would

help reduce the nitrogen fertilization impact on the agroecosystem. The purpose of this research

project was to find a possible nitrification pathway and the intermediate products of such

hypothetical process in plants of Arabidopsis thaliana and Pisum sativum grown under ammonium

nutrition. Axenic culture was used in order to grow the plants in sterile conditions. Furthermore, a

series of in vitro assays were developed in order to identify possible by-products of oxidation of

ammonium.

The ammonium (NH4+) concentration applied (1 and 5mM) proved to have an effect by

diminishing of the growth of A. thaliana. The presence of nitrate (NO3-), nitrite (NO2

-) and

hydroxylamine (NH2OH) were detected in the shoots; therefore, these were considered products of

the ammonium metabolism in A. thaliana. For P. sativum there was no growth difference under the

different treatments of ammonium applied. The products that were identified in this specie were

NO3- and NO2

-. Furthermore, the in vitro reactions showed that some levels of NO2- and NH2OH

could be produced by a non-enzymatic pathway. However, the presence of some compounds such

as xanthine, xanthine oxidase, Fe-superoxide dismutase and plant haemoglobins might induce the

formation of the oxidized nitrogen species.

In conclusion, the results obtained from these assays suggest the existence of an ammonium

oxidation pathway within plant cells. This route has been exclusively attributed to some prokaryote

organisms until now. Despite this, it is necessary to make complementary studies to support this

hypothesis.

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ÍNDICE

PRESENTACIÓN .............................................................................................................................. 2

RESUMEN ...................................................................................................................................... 3

ABSTRACT ...................................................................................................................................... 5

ÍNDICE ........................................................................................................................................... 6

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 9

1.1 Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados .............................................................. 10

1.2 Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de tolerancia ......................................... 13

1.3 Vía de nitrificación en plantas ........................................................................................... 16

2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 19

3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 20

3.1 Reactivos y material biológico utilizado ............................................................................ 20

3.2 Condiciones de crecimiento de las plantas ........................................................................ 20

3.2.1 Esterilización de las semillas ..................................................................................... 20

3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal ......................................................... 21

3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962) ............................................... 21

3.3 Tratamientos .................................................................................................................... 23

3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N. ....................... 23

3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM) ............................................................................. 24

3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM) ................................................ 24

3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N ..................................................................... 25

3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro ............................................. 25

3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa ......................................................................... 26

3.4 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 26

7

3.4.1 Oxidación de NH4+ ..................................................................................................... 26

3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino ................................................................................. 27

3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado ................................................................................. 28

3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1 ............................................................ 29

3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2 ............................................................ 30

3.5 Análisis de iones por cromatografía iónica ........................................................................ 31

3.5.1 Cosecha del material y extracción ............................................................................. 31

3.5.2 Cálculos y cuantificación ........................................................................................... 32

3.6 Estudio morfológico ......................................................................................................... 32

3.7 Análisis estadístico ........................................................................................................... 33

4. RESULTADOS ........................................................................................................................ 34

4.1 Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N en el metabolismo oxidativo

del amonio en plantas. ............................................................................................................. 34

4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 34

4.1.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 36


a) Nitrificación a partir de NH4+ ..................................................................................... 39

b) Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino ................................................................. 39

c) Nitrificación a partir de NH3 neutralizado .................................................................. 40

d) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1............................................. 42

e) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2............................................. 43


4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana). ................................................ 44

4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N

(A.thaliana). ......................................................................................................................... 44

4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM) (A.thaliana). ..................... 46

8

4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM) (A.thaliana). ........ 47

4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N (A.thaliana). ......................... 49

4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro sin sacarosa

(A.thaliana). ......................................................................................................................... 50

4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro con sacarosa

(A.thaliana). ......................................................................................................................... 51

4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum). ............................................................................. 53

4.4 Análisis estadístico de biomasa total ................................................................................ 54

4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 54

4.4.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 55

5. DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 57

5.1 Producción de nitrato y otras especies intermediarias del metabolismo oxidativo del

amonio en plantas ................................................................................................................... 57



6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .......................................................................................... 73

7. BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................... 75

9

1. INTRODUCCIÓN

La investigación en el área agrícola y ambiental se ha intensificado en los últimos

años por las graves condiciones medioambientales actuales y las necesidades que han

surgido en el área de seguridad alimentaria. Así, el estudio de la nutrición de las especies

vegetales tiene gran importancia y dentro de este contexto ha sido el nitrógeno por

excelencia el elemento clave para regular el desarrollo de la mayoría de las especies

agrícolas cultivadas. El nitrógeno (N) es el nutriente más limitante de la producción

primaria neta en ecosistemas terrestres (Boring et al., 1988), de ahí que el rol que juega sea

esencial dentro del ciclo de nutrientes de la Tierra.

La aplicación de fertilizantes nitrogenados para una producción agrícola óptima se

ha convertido en necesaria; sin embargo, uno de los riesgos de la agricultura intensiva es

que parte del nitrógeno aplicado se puede perder, yendo a localizarse en los acuíferos y en

la atmósfera. Del nitrógeno aplicado a los cultivos solamente un 10-50% suele ser

absorbido por las plantas, mientras que el 50-90% restante se lixivia a las aguas

subterráneas y superficiales o puede también perderse en forma gaseosa (González-Murúa

et al., 2004). En cuanto a las pérdidas por lixiviación, existe una evidente relación entre la

cantidad de nitrógeno fertilizante utilizado en la agricultura intensiva y la contaminación de

los acuíferos por nitratos. Esto ha hecho que la legislación haya obligado a la declaración

de “zonas vulnerables”, en las cuales se controla la cantidad de fertilizante aplicado a los

cultivos, con sanciones en caso de sobrepasar las dosis permitidas.

En cuanto a las pérdidas gaseosas, se calcula que la agricultura es la responsable de

aproximadamente 2/3 de la emisión total de amoniaco (NH3) a la atmósfera, de más de 1/3

de las emisiones de N2O, y de alrededor de 1/4 de las emisiones de óxido nítrico (NO).

Estos gases tienen numerosos efectos negativos sobre el medio ambiente, como la

eutrofización de ecosistemas una vez depositados en forma seca o húmeda (NH3 y NO) y el

calentamiento global de la atmósfera (N2O) (Estavillo et al., 1996).

10

Dados estos problemas medioambientales derivados de la aplicación de fertilizantes

nitrogenados, se han desarrollado nuevos estudios en búsqueda de un sistema de agricultura

sostenible en donde se utilicen nuevas alternativas para la alta productividad en cultivares

agrícolas con un mínimo impacto ambiental. Para esto es de interés el desarrollo de nuevos

fertilizantes que puedan ser aplicados en dosis razonables y que su aporte de nitrógeno sea

altamente eficiente, para lo cual es necesario conocer los procesos relacionados con la toma

de este elemento por las especies vegetales de uso agrícola.

1.1 Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados

El alarmante incremento de la contaminación de suelos, aguas subterráneas y

acuíferos por nitratos en los últimos años ha provocado que la legislación ambiental

establezca controles sobre la actividad agrícola, por ser ésta la mayor actividad

antropogénica que contribuye a este tipo de daño ambiental.

Es bien sabido que las sales de nitrato son muy solubles, y la posibilidad de que se

produzca la lixiviación del anión es elevada, más teniendo en cuenta el bajo poder de

adsorción que presentan la mayoría de los suelos para las partículas cargadas

negativamente. El problema ambiental más importante relativo al ciclo del nitrógeno es la

acumulación de nitratos en el subsuelo que, por lixiviación, pueden incorporarse a las aguas

subterráneas o bien ser arrastrados hacia los cauces y reservorios superficiales. En estos

medios los nitratos también actúan como fertilizantes de la vegetación acuática, por lo que

si se concentran puede originarse la eutrofización del medio. En estas condiciones, se

produce la proliferación de especies como algas y otras plantas verdes en áreas

superficiales. Esto trae como consecuencia un elevado consumo de oxígeno y su reducción

en el medio acuático, así mismo dificulta la incidencia de la radiación solar por debajo de la

superficie (Rodríguez y Gallardo, 2004).

La lixiviación de nitratos hacia el subsuelo puede contaminar los acuíferos

subterráneos, creando graves problemas de salud si se consume agua rica en nitratos,

11

debido a que al ingresar en el organismo puede transformarse en nitritos por bacterias

presentes en el tracto digestivo. A su vez, los nitritos pueden transformarse en compuestos

cancerígenos como las nitrosaminas que pueden causar daños al estómago e hígado.

Por estos antecedentes, la gestión del nitrógeno en la explotación agraria debe

referirse a decisiones sobre fertilización mineral y orgánica y al empleo de fiemos y purines

procedentes de explotaciones ganaderas basados en análisis y estudios que sustenten la

sostenibilidad de dicha actividad, considerando que la fertilización nitrogenada es un

problema complejo en el que intervienen aspectos técnicos, económicos y ambientales. El

ciclo del nitrógeno en las parcelas es un aspecto del ciclo del nitrógeno en la naturaleza

(Fig. 1). Depende de la técnica de fertilización y de otros aspectos agronómicos y

ambientales. Si se relacionan las variables de flujo y fondo que intervienen en el ciclo del

nitrógeno en las parcelas cultivadas, se puede observar la cantidad de variables que

intervienen y la complejidad del proceso (Wiederholt y Johnson, 2005).

Figura 1. Ciclo de nitrógeno en la atmósfera (Wiederholt y Johnson, 2005)

Dados los problemas ocasionados por la fertilización nitrogenada, se han planteado

posibles estrategias para mitigar la contaminación de las aguas por nitratos, siendo el

principal objetivo ajustar el aporte de fertilizante a la demanda del cultivo. Así, las

12

estrategias que favorezcan una mayor eficiencia en la asimilación del nitrógeno por el

cultivo reducirían la cantidad que podría ser potencialmente lixiviada a los acuíferos o

emitida a la atmósfera. En este sentido, el reto para la comunidad científica es afrontar el

problema mediante el desarrollo de prácticas agrícolas mejoradas que puedan ser adoptadas

por los agricultores.

Esto se podría conseguir, siempre que fuera factible, mediante la adopción de

prácticas de mínimo laboreo que reduzcan la tasa de mineralización de la materia orgánica

del suelo, así también la rotación de cultivos y el uso de cultivos intercalares que reciclaran

el nitrógeno más eficientemente. Otra estrategia sería la de fertilización flexible basada en

la producción estimada mediante modelos que incorporen la predicción de la precipitación

para la época de crecimiento del cultivo, el desarrollo de fertilizantes o productos accesibles

económicamente que reduzcan la nitrificación o aumenten la retención del nitrógeno en la

zona de la raíz, el desarrollo de nuevos cultivares de plantas que aumenten la captura de

agua y nutrientes, el desarrollo de sistemas de apoyo a la decisión de la fertilización

basados en información sobre el cultivo y el suelo y que pueda ser adquirida rápidamente y

de forma barata, y también la agricultura de precisión con tecnología que facilite la

aplicación de dosis variables de semillas y fertilizantes según las necesidades (González-

Murúa et al., 2004).

De esta manera, para alcanzar dichas estrategias sería necesario conocer los

procesos del ciclo del nitrógeno lo suficiente como para postular con cierta confianza que

cada una de estas prácticas probablemente reduciría la contaminación de las aguas y las

emisiones gaseosas de este elemento, por lo que se está estudiando la eficiencia en la

utilización del N desde distintos aspectos: determinando el efecto del laboreo de las

praderas en las emisiones de N2O, estudiando el efecto de la rotación de cultivos forrajeros

y de la incorporación de residuos vegetales como abono verde en la reducción de las

pérdidas de N por lixiviación y gaseosas, determinando la dosis óptima de aplicación de

fertilizante, y sobre todo profundizando en el metabolismo del nitrógeno de las plantas con

la finalidad de obtener nuevas variedades que utilicen el N de forma más eficiente. La

aplicación de todas estas estrategias no sólo influiría en la reducción de la contaminación de

13

las aguas y de la atmósfera, sino que conllevaría también un efecto sobre la producción y la

calidad de los productos vegetales obtenidos (Hart et al., 1994).

1.2 Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de

tolerancia

Dada la problemática actual del exceso de nitrógeno en el ecosistema y la búsqueda

de mejora en las herramientas agrícolas de fertilización nitrogenada, el tema de las especies

de nitrógeno que pueden ser tomadas por la planta tiene gran importancia. En este contexto

la nutrición amoniacal podría jugar un papel clave para mejorar la eficiencia de toma de

nitrógeno por las plantas.

El nitrógeno se encuentra en el suelo predominantemente como amonio (NH4+) o

nitrato (NO3-). Las condiciones químicas y físicas del suelo así como los factores bióticos

determinan cual de las dos formas predomina (Haynes y Goh, 1978; Blacquiére et al.,

1983). Las tasas de absorción relativas de NO3- y NH4

+ por las plantas superiores son

influenciadas por diversos factores tales como la proporción de NO3- y NH4

+ en la solución

de crecimiento, el pH, la temperatura, la intensidad de luz, y la concentración de

carbohidratos (Marschner, 1995). La respuesta de las especies plantas o cultivos a nitrato o

amonio tiene gran variación, algunas crecen mejor con amonio y otras especies con nitrato.

Se ha visto que algunas herbáceas y juncos miembros de la familia Ericaceae (Ellenberg,

1977) y algunos árboles de coníferas crecen más rápido bajo nutrición amoniacal (Bigg y

Daniel, 1978). En algunas especies vegetales se ha demostrado que la nutrición amoniacal

tiene gran importancia. Se ha podido determinar que la eficiencia de absorción de nitrógeno

por plantas que recibieron únicamente NH4+ fue 70% superior a la eficiencia mostrada por

plantas que recibieron exclusivamente NO3- (Cruz et al., 2006). Otras especies, en los

mismos estudios, incluyendo algunas coníferas, crecieron mejor con nitrato. La respuesta

en los experimentos de laboratorio a menudo es concordante con lo que sucede en algunas

especies en el campo, donde pueden haberse llegado a adaptar a cualquiera de las formas de

nitrógeno.

14

Al comparar el efecto de esas dos fuentes de nitrógeno, ha sido observado que el

crecimiento es mayor cuando la solución del suelo contiene una mezcla de los dos iones. Se

ha establecido también que el NH4+, cuando es administrado en grandes proporciones,

puede generar problemas de toxicidad y reducir el crecimiento, y por ende la productividad

de los cultivos (Britto y Kronzucker, 2002). Para algunos cultivos, el efecto negativo del

NH4+ sobre el crecimiento ha sido atribuido a la necesidad de utilizar los carbohidratos

producidos prioritariamente para la rápida asimilación del amonio absorbido para evitar su

acumulación y consecuentemente problemas de toxicidad, alteración del pH celular y

desequilibrio iónico (Lewis et al., 1989). Otro aspecto relacionado a la reducción del

crecimiento ha sido la asociación de ese ion con una tasa fotosintética menor en plantas, lo

cual provoca un descenso en el rendimiento del cultivo.

La forma de nitrógeno utilizado por una planta puede afectar a su morfología y su

composición química. El amonio puede provocar bajas concentraciones de K, Ca, Mg y

altas de P, S y N orgánico (Ganmore-Neumann y Kafkafi, 1980; Gashaw y Mugwira,

1981). Sin embargo, la nutrición amoniacal bien suministrada puede convertirse en una

herramienta eficaz para mejorar la toma de nitrógeno en plantas, partiendo del hecho de que

la asimilación de N por la absorción de la forma amoniacal es más rápida (Cramer y Lewis,

1993). Algunos trabajos con ciertas especies vegetales han demostrado las ventajas de la

nutrición amoniacal. Se ha observado que plantas de soja cultivadas exclusivamente con

NH4+ pueden presentar mayor actividad fotosintética como resultado del mantenimiento de

la conductancia estomática y del aumento de la concentración de enzimas relacionadas a la

bioquímica de la fotosíntesis (Raab y Terry, 1994).

Se han efectuado varios estudios de este tipo, como por ejemplo la comparación

entre espinaca (Spinacea oleracea), especie sensible, con guisante (Pisum sativum), especie

tolerante, donde los resultados demuestran que en guisante existe una mejor regulación de

la absorción del amonio en las raíces y un control de los niveles de amonio, sobre todo en

los tejidos de las hojas (Ariz, 2009). Además, se observan modificaciones de importancia

en la relación de carbono y nitrógeno (C/N) de los aminoácidos mayoritarios como la

asparragina (Asn) en el guisante y la glutamina (Gln) en la espinaca, lo que indica una

15

regulación diferente en la relación C/N (Ariz et al., 2010). Con respecto a las actividades de

las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato deshidrogenasa (GDH), principales

responsables de la asimilación del amonio, no se modifican en concentraciones moderadas

de esta sustancia en el guisante, pero sí en la espinaca. En cuanto a las principales

modificaciones metabólicas, éstas tienen lugar en la raíz en el caso del guisante, y en las

hojas en el de la espinaca. Además, en las raíces del guisante se han observado

modificaciones morfológicas, que podrían ser indicio de adaptaciones para asimilar el

amonio sin modificar sus procesos internos (Domínguez-Valdivia et al., 2008).

Varios mecanismos de tolerancia a la nutrición por amonio pueden estar

relacionados con la habilidad para regular los contenidos internos de amonio en la raíz de

las plantas. La actividad de la GS en las raíces se incrementa durante la nutrición con

nitrato o amonio, pero con particular incremento en el último. Existen dos formas distintas

de GS1 citosólicas compuestas por polipéptidos con similar tamaño, pero diferente carga.

El análisis de la secuencia de genes de GS ha establecido que son dos isoformas que

expresan productos que regulan los altos niveles de nitrógeno inorgánico por aplicación en

la raíz, y sobre todo son productos expresados en las raíces laterales (El Omari et al., 2009).

Los últimos trabajos que se han realizado mencionan la tolerancia al amonio como

un mecanismo que genera una reducción de la producción de biomasa, ya que el ciclo trans-

membrana de la toma de NH4+ y su eflujo en las células de la raíz puede acarrear un alto

coste energético, por lo que se dan los efectos de menor desarrollo de la planta (Britto et al.,

2001; Britto y Kronzucker, 2002). Sin embargo no se ha llegado a un consenso en cuanto a

los rasgos que confieren la tolerancia de NH4+ en una planta, dependiendo esto de la

especie vegetal. Así, por ejemplo, se ha establecido que el guisante muestra tolerancia a

NH4+ como fuente única de nitrógeno, sin embargo entre variedades de la misma especie

existen diversas respuesta a esta tolerancia (Domínguez-Valdivia et al., 2008).

También existen estudios recientes donde la tolerancia de NH4+ está dada en gran

medida por la disponibilidad energética la cual puede venir dada en forma de esqueletos

carbonados provenientes de la fotosíntesis (Ariz et al., 2010). También, la interacción entre

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C y N muestran diferentes niveles de complejidad en el control y la señal a través de los

compartimientos celulares donde el balance C/N juega un papel primordial, e influye a la

fisiología de los órganos de la planta determinando ratios entre hojas y raíz (Viktor y

Cramer, 2005).

De esta manera, se han establecido algunas ideas sobre los mecanismos de

tolerancia a la forma amoniacal del nitrógeno en algunas especies vegetales, así como la

identificación de otras especies sensibles y los posibles beneficios que tiene la aplicación o

asociación de técnicas de nutrición amoniacal en plantas.

1.3 Vía de nitrificación en plantas

Con los datos mencionados sobre el estudio y la importancia de la nutrición

amoniacal y los mecanismos de tolerancia por parte de las plantas, se ha profundizado más

en el estudio del metabolismo del N en plantas, específicamente en l vía de nitrificación.

Este proceso biológico tiene una gran importancia en el área ambiental y agrícola como ya

ha sido mencionado. Consiste en la oxidación de amonio a nitrito (NO2-), y de nitrito a

nitrato (NO3-). La nitrificación puede tener lugar en condiciones aerobias aunque, algunos

microorganismos anaerobios pueden contribuir a la nitrificación en condiciones de anoxia,

mediante la llamada vía Annamox. La vía de la nitrificación aerobia puede implicar la

formación de especies intermedias como son la hidroxilamina (NH2OH ó HA), el NO2- y

también, el NO, el NO3- o el N2O4 (Subbarao et al., 2007).

La presencia de una vía de nitrificación ha podido identificarse en pocas especies

vegetales de la familia de las leguminosas, todas ellas sin importancia agronómica (Hipkin

et al., 2004). No se ha descrito nitrificación en ninguna otra especie de leguminosa de

interés agronómico o en plantas no leguminosas. En varios trabajos de investigación, sin

embargo, se muestra que las células vegetales son capaces de oxidar HA añadida

exógenamente a NO o NO2- en presencia de oxígeno (Rümer et al., 2009). Asimismo, se ha

visto también que ciertas hemoglobinas vegetales están involucradas en el proceso

participando en la eliminación de NO, produciendo NO3- (Dordas et al., 2003). Sin

17

embargo, aún es necesario elucidar el sentido fisiológico de dicha vía oxidativa y si la

ciertamente la oxidación completa desde amonio a nitrato tiene lugar en las células

vegetales o si hay participación bacteriana en el proceso.

En animales y bacterias existen hasta 3 formas de NO sintasa (NOS), enzima que

produce NO a partir del aminoácido L-arginina. Existe numerosa bibliografía sobre la NOS

en plantas, y varios artículos llegan a presentar su descubrimiento. Sin embargo, todavía no

existe constancia concluyente de una NO sintasa en plantas. En la actualidad, se conocen

varios sistemas de síntesis de NO en plantas (Planchet et al., 2005). Según algunos estudios

basados en la identificación como subproducto de la NOS a partir de L-arginina, no se ha

podido rechazar la evidencia de la presencia de este compuesto en plantas. La identificación

de la NOS en peroxisomas aislados de hojas de guisante brinda también un gran adelanto

para entender cuáles pueden ser los orgánulos celulares implicados en procesos de

señalización. Sin embargo, aún es necesario ampliar los estudios en cuanto la identificación

y caracterización molecular de la enzima responsable de esta actividad para demostrar

finalmente su presencia y funcionamiento en plantas (Corpas et al., 2009).

Por otro lado, se ha considerado que las concentraciones de NO en plantas siempre

son más bajas que las producidas por las bacterias circundantes en condiciones de campo

(Meyer et al., 2005). También sería muy interesante conocer el sentido fisiológico de la

ausencia o las muy bajas concentraciones de enzimas del tipo NOS en vegetales, así como

conocer en qué momento evolutivo las plantas perdieron los genes codificantes y la

significación biológica de ese hecho.

Actualmente, en nuestro grupo de investigación se han realizado estudios con varias

especies vegetales como alfalfa (Medicago sativa) o guisante (Pisum sativum), donde se ha

probado la producción NO2- y NO3

- a partir de amonio, y se han determinado compuestos

intermediarios (comunicación personal). Sin embargo, sería muy interesante obtener

información sobre otros sistemas de cultivo donde se compruebe la única intervención de la

plantas en estos procesos eliminando la contaminación por bacterias, como es el caso del

cultivo in vitro de tejidos, mediante el cual se realiza el crecimiento del vegetal en

18

condiciones de asepsia. Es fundamental el uso de actuales herramientas de la biología

molecular de las que se dispone, así como las bases de datos genómicas, por lo que la

selección del tipo de organismo de estudio debe ser seleccionado en función de un criterio

de fácil estudio a nivel molecular.

De esta manera el estudio sobre las vías de nitrificación en plantas entendido desde

el punto de vista fisiológico y sus mecanismos en las plantas es una herramienta importante

para diseñar nuevos planes para mejorar la utilización de N como elemento nutritivo en

suelos. Así, se podrán diseñar nuevas estrategias de nutrición amoniacal que compensen los

requerimientos de este importante elemento en los tejidos vegetales contribuyendo a la

disminución de fertilizantes nitrogenados que han causado grave daño ambiental en

agrosistemas como ya se ha mencionado a detalle en la exposición del impacto ambiental.

Dentro de este contexto, el estudio sobre vías de nitrificación en plantas de

Arabidopsis thaliana en cultivo axénico con aplicación de amonio como única fuente de

nitrógeno, como se propone en el siguiente trabajo de investigación, aportaría gran

información para el estudio del ciclo del nitrógeno en plantas, y podría servir para encontrar

nuevas técnicas de nutrición vegetal sostenibles, el cual es el objetivo primordial de la

problemática de contaminación por nitrógeno planteada.

19

2. OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo de investigación es el estudio de la vía oxidativa de

producción de nitrato en plantas de Arabidopsis thaliana L. y Pisum sativum L. cultivadas

in vitro bajo nutrición amoniacal exclusiva.

Este objetivo general será abordado a través de los siguientes objetivos específicos:

- Estudio de la producción de nitrato y otros compuestos intermediarios del

metabolismo oxidativo del amonio en plantas.

- Estudio bioquímico de la vía no-enzimática de oxidación de amonio mediante

reacciones in vitro.

- Establecimiento del cultivo in vitro bajo nutrición amoniacal para Arabidopsis

thaliana y Pisum sativum.

- Análisis morfológico de Arabidopsis thaliana y Pisum sativum crecidos con amonio

como única fuente de nitrógeno.

20

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Reactivos y material biológico utilizado

Los reactivos utilizados en los ensayos fueron suministrados por Sigma Chemical

Co. (St. Louis, MO, USA). El agua empleada fue en todos los casos destilada ultrapura, y

se obtuvo a través de un sistema Milli-Q (Wasserlab). Las columnas de cromatografía de

5ml (His Trap Chelating) fueron suministradas por GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Las

especies vegetales utilizadas fueron Arabidopsis thaliana L. (cv. Columbia, silvestre–col) y

Pisum sativum L. (cv Sugar Snap).

3.2 Condiciones de crecimiento de las plantas

3.2.1 Esterilización de las semillas

Las semillas de A. thaliana se esterilizaron mediante el protocolo de desinfección de

material para cultivo in vitro en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se

colocaron las semillas durante 2 min en una solución de etanol al 70%, posteriormente se

retiró el etanol y se añadió hipoclorito sódico al 1% con tres gotas de tween durante 8 min.

Finalizado el tiempo, se retiró la solución de hipoclorito sódico y se realizaron tres lavados

con agua milli-Q estéril. Posterior al proceso de esterilización se almacenaron las semillas

en agua estéril durante 2 ó 3 días en cámara fría oscura para sincronizar el proceso de

germinación.

La desinfección de las semillas de guisante se realizó siguiendo del protocolo de

Labhilili et al. (1995), en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se colocaron las

semillas en una solución de 1% de hipoclorito de sodio con 0,01% de SDS durante 40 min.

Transcurrido el tiempo se lavaron las semillas con agua destilada estéril, posteriormente se

colocó una solución de ácido clorhídrico 0,01N durante 10 min. Se realizó un lavado de las

21

semillas con agua destilada estéril y finalmente se mantuvieron en agua destilada durante

45 min para posteriormente proceder a la siembra.

3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal

La siembra del material vegetal se realizó en cabina de flujo laminar con

micropipeta automática de 10 µl. Las puntas se cortaron a 5 mm de la base para que las

semillas pudieran ser tomadas y dispensadas con facilidad. Una vez cortadas se pulverizó

con abundante alcohol para esterilizarlas y se dejó evaporar por unos minutos.

Se tomaron las semillas con la micropipeta con un volumen de 10 µl del tubo

eppendorf previamente estériles. Se dispensó cuidadosamente las semillas, una por una,

sobre la placa petri o el frasco, colocándolas a un centímetro de distancia en un total de 10 a

12 semillas por placa. Finalmente se sello las placas con cinta leucopore y se colocó en la

cámara de crecimiento a una intensidad de luz de aproximadamente 80 µmol fotones m-2s-1.

Las plantas se crecieron durante un período de tres semanas, observando con períodos de

cuatro días su desarrollo.

3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962)

Se elaboró el medio Murashige y Skoog o MS (1962) como cultivo base para el

crecimiento de A. thaliana. Se realizaron varias soluciones stock de 10x de macroelementos

y una de 500x de micronutrientes individuales como se muestran en las siguientes tablas:

Tabla 1. Contenido de macronutrientes de la solución stock 10x para la preparación del medio Murashigue y Skoog.

Sales Cantidad para 1L de stock 10x (g)

Concentración final 1x (mM)

NH4NO3 16,5 20,61 KNO3 19 18,79 MgSO4 7H2O 3,7 1,50 KH2PO4 1,7 1,25

22

Tabla 2. Contenido de micronutrientes de la solución stock 500x para la preparación del medio Murashigue y Skoog.



MnSO4H2O 0,845 0,10 HBO3 0,310 0,10 ZnSO4 7H2O 0,430 29,91 KI 0,0415 5,01 Na2MoO42H2O 0,0125 1,03 CoCl26H2O 0,0012 0,11 CuSO45H2O 0,0012 0,10

-Solución de cloruro de calcio (Cl2Ca2H2O):

Para la solución de Cl2Ca2H2O se preparó una solución stock de 100x (6,55 g L-1)

para alcanzar una concentración final de 2,99 mM.

- Solución de Fe2Na-EDTA:

Para la solución de Fe2Na-EDTA se preparó una solución stock de 100x (3,67g L-1).

En el medio final la concentración final fue de 0,1mM

Finalmente para preparar el medio MS se siguió el siguiente protocolo ajustando el

pH a 5,8 antes de añadir el agar:

Tabla 3. Contenido final de los compuestos para el medio Murashigue y Skoog (1962)

Compuesto Cantidad para 1L de medio

Microelementos (10x) 0,845 Oligoelementos (500x) 0,310 Fe2Na-EDTA (100x) 0,430 Cl2Ca2H2O (100x) 0,0415 Vitaminas (100x) 0,0125 Sacarosa 3% (m/v) 0,0012 Agar 0,8% (m/v) 0,0012

23

3.3 Tratamientos

Se realizaron seis tratamientos variando la composición del medio de cultivo base,

las cuales se presentan a continuación, conteniendo en cada tratamiento dos

concentraciones de sulfato de amonio (NH4)2SO4 como única fuente de nitrógeno. Los

medios de cultivo se autoclavaron durante 20 min a 120°C a 1 atm de presión y se

dispensaron en frascos y cajas estériles para asegurar las condiciones de asepsia de la

experimentación.

Tabla 4. Concentraciones de NH4

+ como única fuente de N en cada tratamiento, aplicado como sulfato de de amonio (NH4)2SO4.

Tratamiento Cantidad para 1L de medio

1 mM 0,066 5 mM 0,33

3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N.

Se efectuó un cambio en la solución stock de macronutrientes sustituyendo las sales

que contenían nitrógeno en forma de nitrato para garantizar que la única fuente de

nitrógeno sea la añadida en forma de amonio. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se

ajustó el pH del medio final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar para gelificar.

Tabla 5. Contenido de la solución stock 10x de macronutrientes sustituidas las sales de nitrato, siendo reemplazado el KNO3 por KCl.



KCl 2,8 3,7 MgSO4 7H2O 3,7 1,50 KH2PO4 1,7 1,25

24

3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM)

Se incrementó la cantidad de potasio en la solución de macronutrientes del medio

base MS, añadiendo K2SO4 a la solución stock hasta alcanzar una concentración de 40 mM

en el medio final. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se ajustó el pH del medio

final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar.

Tabla 6. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de K+. Se aumentó la concentración de KCl y se añadió K2SO4 hasta alcanzar 50 mM.



KCl 1,86 2,5 MgSO4 7H2O 2,46 1 KH2PO4 3,4 2,5 K2SO4 15,25 17,5

3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM)

La solución stock de macronutrientes fue preparada como la del tratamiento 2

(apartado 3.3.2) pero con incremento en la cantidad de MgSO4 7H2O hasta alcanzar una

concentración de 5 mM. Se añadieron 30 g de sacarosa, se ajustó el pH del medio final a

5,8 y finalmente se añadieron 8 g de agar.

Tabla 7. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de iones K+ e iones Mg2+, aumentando la concentración de MgSO4 7H2O.



KCl 1,86 2,5 MgSO4 7H2O 12,32 5 KH2PO4 3,4 2,5 K2SO4 15,25 17,5

25

3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N

Se realizó una solución stock de micronutrientes sustituyendo las sales a igual que el

tratamiento 1 (apartado 3.3.1) y se colocó L-glutamina como fuente de nitrógeno

sustituyendo al (NH4)2SO4. Se añadieron 30 g de sacarosa, a continuación se ajustó el pH

del medio a 5, 8 y finalmente se añadió 8 g de agar.

Tabla 8. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes del medio base para la aplicación de L-glutamina



KCl 2,8 3,7 MgSO4 7H2O 3,7 1,50 KH2PO4 1,7 1,25

En la solución final de 1x se añadieron 0,36 g de L-glutamina para alcanzar una

concentración final de 10 mM.

3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro

Se utilizó como tratamiento el medio Rigaud y Puppo (1975), utilizado para riego

en cultivo hidropónico, pero con modificaciones para ser utilizado en cultivo in vitro. Se

prepararon las sales como en el protocolo original y a la solución final se añadió 8 g de agar

para gelificar el medio. En este tratamiento no se añadió sacarosa y finalmente se ajustó el

pH final a 7.

Tabla 9. Contenido y concentración final de macronutrientes 1x para la preparación del medio Rigaud y Puppo (1975).

Sales Cantidad para 1L final 1x (g)


K2HPO4 0,2 1,15 MgSO4 7H2O 0,2 0,812 KCl 0,2 2,68 CaSO4 2H2O 0,12 0,69 Na2Fe EDTA 0,025 0,053

26

Tabla 10. Contenido y concentración final de micronutrientes para la preparación del medio Rigaud y Puppo (1975).

Sales Cantidad para 1L final 1x (g)


Na2MoO42H2O 4 0,016 FeCl3 6H2O 1 0,0036 ZnSO47H2O 1 0,0034 H3 BO3 1 0,016 MnSO4 H2O 0,08 0,00047 CuSO4 5H2O 0,03 0,00012 AlCl3 6H2O 0,05 0,00021 NiCl2 6H2O 0,03 0,00012 KI 0,01 0,00006

3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa

Se efectuaron medios con la misma composición que los del tratamiento 5 (apartado

3.3.5), gelificando la solución nutritiva Rigaud y Puppo. En este tratamiento se añadieron

30 g de sacarosa al medio y se ajustó el pH a 7.

3.4 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática

Se realizaron varios ensayos in vitro para determinar la producción de nitrato, nitrito

e hidroxilamina en el laboratorio, mediante reacciones químicas, en los cuales se probaron

los siguientes procedimientos:

3.4.1 Oxidación de NH4+

Los ensayos realizados fueron a partir de NH4+ añadido en forma de NH4Cl, con

diferentes reactivos como se muestra en la Tabla 1. Fue utilizado el buffer que contiene

KH2PO4 y K2HPO4 ajustado a un pH de 5,8 por lo que las reacciones se llevaron a cabo en

medio ligeramente ácido. Cada tubo fue incubado por el período de 2 h a 37°C y

posteriormente fueron medidos en el cromatógrafo iónico para determinar el contenido de

NH2OH, NO2- y NO3

-.

27

Se realizó también los mismos ensayos mencionados pero sustituyéndose la fuente

de NH4+ añadido esta vez como (NH4)2SO4. El tiempo y temperatura de incubación fue la

misma y la medición final para determinar si existen compuestos intermediarios del proceso

de nitrificación también fue realizada por cromatografía iónica.

Tabla 11. Ensayos in vitro con NH4+ como sustrato, conteniendo XOD: xantina oxidasa, FeSOD:

Fe-superoxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).

Reactivo

Concentración

final

Ensayo

1

(µl)

2 (µl)

3

(µl)

4 (µl)

5

(µl)

6 (µl)

7

(µl)

Buffer 200 mM 500 500 500 500 500 500 500 NH4

+ 50 mM 200 200 200 200 200 200 200 H2O2 10 mM 100 100 100 100 100 100 100 Fe 3+

1 mM 100 100 100 - 100 100 - Fe 2+

10 µM - - - 100 - - 100 FeSOD 50 µM - - - - 50 50 50 ASC 10 µM - 100 - - 100 - - PQ 10 µM - - 100 - - 100 - H2O 1100 1000 1000 1000 950 950 1050

-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------

3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino

Se efectuaron reacciones mezclando varios compuestos que pueden intervenir en el

proceso de nitrificación, y se partió del amoniaco sin neutralizar como sustrato para

identificar su transformación hasta obtener NO3-. Posteriormente, para cada ensayo se

midió por cromatografía iónica el contenido de NH2OH, NO2- y NO3

-.

Cada reacción se llevó a un volumen final de 2 mL de solución complementado con

agua destilada para cromatografía. Las reacciones realizadas fueron incubadas durante 2 h a

37°C y posteriormente se realizaron las medidas en el cromatógrafo. Cada uno de los

28

ensayos realizados se especifica a continuación, y se indican los reactivos utilizados con su

concentración final en la solución y los volúmenes adicionados por cada uno de estos:

Tabla 12. Ensayos in vitro con NH3 como sustrato sin neutralización conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).

Reactivo

Concentración

final

Ensayo

0

(µl)

1 (µl)

2

(µl)

3 (µl)

4

(µl)

5 (µl)

6

(µl)

Buffer 100 µM 500 500 500 500 500 500 500 NH3 50 mM 15 15 15 15 15 15 15 XOD 0,5 U - 50 50 - - - -

Xantina 1 mM - 40 40 - - - - Riboflavina 10 µM - - - 20 20 20 20

FeSOD 50 µM - - 714 - - 714 714 Lb II 10 µM - - - 65 - - 65 Hb I 10 µM - - - - 159 159 -

NADH 10 mM - - - 400 400 400 400 H2O 1485 1395 681 1000 906 192 286

-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------

3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado

Se efectuaron reacciones similares a las del apartado 3.4.2 pero partiendo como

sustrato de amoniaco previamente neutralizado con H3PO4 hasta alcanzar un pH de 5,8.

Cada tubo se llevó a un volumen final de 2 mL y fueron incubados por 2 h a 37°C. Los

ensayos realizados se muestran en la tabla 3, en donde se indican los reactivos utilizados, su

concentración en la solución final y los volúmenes colocados en cada tubo de reacción:

29

Tabla 13. Ensayos in vitro con NH3 previamente neutralizado conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).

Reactivo

Concentración

final

Ensayo

0

(µl)

1 (µl)

2

(µl)

3 (µl)

4

(µl)

5 (µl)

6

(µl)

Buffer 50 mM 500 500 500 500 500 500 500

NH3 50 mM 200 200 200 200 200 200 200

XOD 0,5 U - 50 50 - - - -

Xantina 1 mM - 40 40 - - - - Riboflavina 10 µM - - - 20 20 20 20

FeSOD 1 µM - - 14 - - 14 14

Lb II 10 µM - - - 25 - - 25

Hb I 10 µM - - - - 15 15 -

NADH 10 mM - - - 400 400 400 400

H2O 1300 1210 1196 85 865 851 841

-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------

3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1

Se realizaron siete reacciones a partir de NH2OH combinando diferentes

compuestos como se describe en la tabla 4. En donde se indica los reactivos usados para

cada ensayo y su concentración final en el medio, la cual fue mayor en algunos reactivos

con respecto a otra experimentación similar que se describirá en el apartado siguiente 3.4.5.

Cada ensayo se llevó a un volumen de 2 mL completado con agua destilada e incubados por

2 h a 37°C:

30

Tabla 14. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).

Reactivo

Concentración

final

Ensayo

0

(µl)

1 (µl)

2

(µl)

3 (µl)

4

(µl)

5 (µl)

6

(µl)

Buffer 100 µM 500 500 500 500 500 500 500

NH2OH 50 mM 200 200 200 200 200 200 200

XOD 0,5 U - 50 50 - - - -

Xantina 1 mM - 40 40 - - - -

Riboflavina 10 µM - - - 20 20 20 20

FeSOD 50 µM - - 714 - - 714 714

Lb II 10 µM - - - 252 - - 252

Hb I 10 µM - - - - 158 158 -

NADH 10 mM - - - 400 400 400 400

H2OH 1300 1210 496 628 722 8 -

-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------

3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2

Se realizaron reacciones similares a las llevadas a cabo en el apartado anterior con

NH2OH como sustrato, pero con concentraciones menores de Fe-proteínas como se

describe en la Tabla 5. Los tubos de reacción también se llevaron a un volumen final de 2

mL completados con agua destilada y e incubados durante 2 h a 37°C. Posteriormente las

muestras fueron medidas en el cromatógrafo:

Todos los ensayos in vitro descritos fueron finalmente sometidos a cromatografía

iónica como se explica en el apartado 3.5.2, para identificar la producción de compuestos

intermediarios y finales del proceso de nitrificación a partir de amoniaco e hidroxilamina.

31

Tabla 15. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato con menor concentración de reactivos conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3).

Reactivo Concent

final

Ensayo

0 (µl)

1

(µl)

2 (µl)

3

(µl)

4 (µl)

5

(µl)

6 (µl)

7

(µl)

8 (µl)

9

(µl)

Buffer 50 mM 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500

NH3 50 mM 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

XOD 0,5 U - 50 50 - - - - - 50 50

Xantina 1 mM - 40 40 - - - - - 40 40

Riboflavina 10 µM - - - 20 20 20 20 20 - -

FeSOD 1 µM - - 14 - - 14 14 - - -

Lb II 1 µM - - - 25 - - 25 - 25 -

Hb I 1 µM - - - - 15 15 - - - 15

NADH 1 mM - - - 400 400 400 400 400 400 400

H2O 1300 1210 1196 855 865 851 841 880 785 795

-----------------------------------------------Vol. final 2mL---------------------------------------------

3.5 Análisis de iones por cromatografía iónica

3.5.1 Cosecha del material y extracción

Transcurridas tres semanas las plantas fueron cosechadas. Se recolectaron todas las

plantas para cada tratamiento, fueron cortadas con pinzas y bisturí estériles, y la raíz fue

separada de la parte aérea. El material se colocó en tubos para cromatografía en los que se

rotuló correctamente el peso y el número de muestra correspondiente. Finalmente, las

muestras fueron sumergidas en nitrógeno líquido inmediatamente después de su recolección

y se mantuvieron en refrigeración a -80°C hasta su extracción.

En cuanto a la extracción del material vegetal para cromatografía iónica, se

separaron las muestras correspondientes para la medición de aniones y cationes. La

extracción de las muestras a medirse hidroxilamina se realizó con ácido sulfúrico 150mM,

mientras que las de nitrato y nitrito se extrajeron con agua milli-Q estéril. Se cortó la tapa

32

de varios tubos eppendorf, los cuales fueron debidamente etiquetados y se anotó el peso de

cada tubo vacío. A continuación, se añadió 1 mL de agua o ácido según la medida que se

fuera a realizar y se incubaron durante 5 min al baño maría (80°C). Transcurrido el tiempo

de incubación se procedió a realizar un agujero con un punzón caliente en la base del tubo

que contenía el material y el sobrenadante extraído. Se colocó el tubo eppendorf cortado

bajo el tubo con el agujero encajándolo cuidadosamente con parafilm. Una vez encajado los

dos tubos se centrifugó a máxima velocidad durante 30 min. Transcurrido el tiempo se

retiró el tubo con el material vegetal, se conservó el tubo inferior con el líquido de

extracción y se anotó el peso del eppendorf cortado lleno. Finalmente se almacenó la

solución extraída en nuevos tubos rotulados adecuadamente a -20°C hasta su medición en

el cromatógrafo iónico.

3.5.2 Cálculos y cuantificación

Las mediciones de hidroxilamina, nitrito y nitrato y se realizaron en cromatógrafo

iónico, con una columna para aniones y otra para cationes. Se hicieron diluciones 1:10

(v/w) de los extractos para su medición. Una vez establecida la línea base y con los

estándares adecuados, se procedió a pinchar las muestras para ser medidas. Finalmente con

los datos emitidos por el equipo de los contenidos de nitrato, nitrito e hidroxilamina, se

realizaron los cálculos a partir de la siguiente fórmula:

µmol/gPF= [ppm x (peso t.lleno – peso t.vacío)/PM ion]/gPF

3.6 Estudio morfológico

El estudio morfológico se realizó tomando un registro del crecimiento de las plantas

para cada tratamiento realizado. Se tomaron fotografías a las tres semanas de crecimiento

para identificar el crecimiento radical y de altura de las plantas. Con la información

33

obtenida se realizaron comparaciones del crecimiento foliar (biomasa), la dimensión y el

número de hojas, y se observaron las diferencias en el crecimiento de la raíz.

3.7 Análisis estadístico

Los resultados obtenidos en este trabajo fueron examinados mediante el programa

“SPSS versión 17.0” para Windows. Se calculó la media como estadístico de tendencia

central y el error estándar como estadístico de dispersión. Los cálculos estadísticos

referidos a la comparación entre tratamientos de cultivo fueron realizados bajo la asunción

de que los datos tratados seguían una distribución normal. Para este tipo de comparación

estadística se realizaron Análisis de Varianza (ANOVA). Los estadísticos seleccionados

según el cumplimiento o no del principio de homoscedasticidad u homogeneidad de

varianzas (test de Levene) fueron: mínima diferencia significativa (MDS) para las variables

con homogeneidad de varianzas y T3 de Dunnett para los casos de no homoscedasticidad.

Los cálculos estadísticos referidos a la comparación entre tratamientos para cada

concentración de NH4+ fueron realizados bajo la asunción de que los datos tratados seguían

una distribución normal. Este análisis se realizó mediante el test de comparación de medias

t de Student, teniendo en cuenta si cumplía o no el principio de homoscedasticidad

mediante el test de Levene. Todos los análisis estadísticos se realizaron a un nivel de

significación del 5% (P ≤ 0,05).

34

4. RESULTADOS

4.1 Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N

en el metabolismo oxidativo del amonio en plantas.

4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana

Se crecieron plantas de A. thaliana en cultivo axénico con medio Rigaud y Puppo

con varias concentraciones y formas de N en el medio. Las plantas de A. thaliana crecidas

con 1 y 5 mM de NH4+, así como un control crecido con NO3

- (40 mM NO3- + 20 mM de

NH4+), presentaron NO2

-, NO3- y NH2OH. En los siguientes gráficos (Figs. 6 y 7) se

muestran las diferencias existentes en los contenidos de estos iones en la parte aérea y en la

raíz de las plantas según los tratamientos aplicados.

La concentración de NO3- es muchísimo mayor en las plantas control, ya que son las

que fueron crecidas bajo nutrición nítrica. Sin embargo muestran la menor concentración de

NH2OH en la parte aérea, que es casi nula. El tratamiento de 1 mM de NH4+ presenta

mayor concentración con respecto al de 5 mM de NH4+.

Las hojas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+ contienen NO2

-, NO3-

e NH2OH. Es importante también señalar que todos los iones analizados (NO2-, NO3

- e

NH2OH) mostraron contenidos superiores en el tratamiento de 1 mM de NH4+ con respecto

al tratamiento de 5 mM de NH4+. Los valores de NO2

- obtenidos en la pare aérea de las

plantas pertenecientes al tratamiento de 1 mM de NH4+ son muy similares a los valores de

las plantas control crecidas con NO3-. No obstante, es muy significativa la disminución a

casi la mitad del contenido en NO2- en plantas crecidas con 5 mM de NH4

+.

35

Figura 2. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3

-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4

+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N.

También las raíces de plantas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+

contienen NO2-, NO3

- e NH2OH. Con respecto a los valores obtenidos en la raíz, se observa

que las plantas crecidas con 1 mM y 5 mM de NH4+ presentan concentraciones similares de

NH2OH y de NO2-. El control crecido con NO3

- tiene también similares contenidos en NO2-,

sin embargo, al igual que en hojas, no se detecta NH2OH.

NH2OH NO2- NO3

-

µµ µµmol

ion

g-1 P

F

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Control

1 mM NH4+

5 mM NH4+

36


-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4


4.1.2 Cultivo de Pisum sativum

También se han realizado pruebas de crecimiento en plantas de guisante con amonio

en medio axénico para ver la producción de la vía oxidativa del amonio. Los resultados

obtenidos mostraron que en la parte aérea no se dan concentraciones de NH2OH en ninguno

de los tratamientos. Sin embargo, se detecta NO2- en el tratamiento de 1 mM de NH4

+ el

cual muestra una mayor concentración que el tratamiento control (crecido con NO3-) y que

el de 5 mM de amonio. En el caso de las determinaciones de NO3-, las plantas control y las

crecidas con 1 mM de amonio tienen similar concentración, no así en el tratamiento de 5

mM donde no se halló ningún contenido de nitrato como se muestra en la siguiente figura:

NH2OH NO2- NO3

-

µµ µµmol

ion

g-1

PF

0,0

0,5

1,0

1,580,0

85,0

90,0

95,0

100,0 Control1 mM NH4

+

5 mM NH4+

37


-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de plantas de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4


La parte radical tampoco mostró concentración de NH2OH, sin embargo, se observó

que el control es el tratamiento con mayor cantidad de NO2- con respecto a los otros dos

tratamientos, y en el caso del NO3-, como era de esperar, las plantas control crecidas con

NO3- superaban en NO3

- en gran medida al tratamiento de 1mM de NH4+, existiendo

ausencia de NO3- en el tratamiento de 5 mM de NH4

+ como se mostraba también en la parte

aérea (Fig. 9).

Se observó diferencia con los datos obtenidos de las hojas donde el tratamiento

correspondiente a la aplicación de 1 mM de NH4+ presentó mayor concentración de nitrato

y nitrito. En este caso la presencia de estos iones es mayor en las raíces de las plantas

control.

NH2OH NO2- NO3

-

µµ µµmol

ion

g-1

PF

0

1

2

3

4Control 1 mM NH4

+

5 mM NH4+

38


-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de plantas de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4



Para conocer la ruta de nitrificación en plantas, en la experimentación se estableció

una primera parte en la cual de modo preliminar se buscó simular las reacciones químicas

que podrían tener lugar en la transformación de especies intermediarias del metabolismo

del nitrógeno hasta la producción de nitrato y nitrito. Estos ensayos se realizaron partiendo

de dos diferentes sustratos; el primero fue amoniaco (NH3) y el segundo hidroxilamina

(NH2OH) con diferentes tratamientos para analizar finalmente la transformación de estos

compuestos en nitrato y nitrito. El mecanismo de reacción podía estar mediado por radical

superóxido como sería en el sistema xantina oxidasa (XOD)+ xantina; por un sistema

reductor no mediado por superóxido que sería riboflavina+NADH (Becana y Klucas.,

1990) o por radical hidroxilo bien usando Fe2+ (FeSO4) o Fe3+ más ascorbato.

Además, se incluyeron proteínas como la superóxido dismutasa de hierro (FeSOD),

que se conoce puede tener efectos diferentes en la conversión reversible del anión nitroxilo

NH2OH NO2- NO3

-

µµ µµmol

ion

g-1

PF

0,0

0,5

1,0

1,5

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0 Control 1 mM NH4

+

5 mM NH4+

39

(NO-) a NO (Murphy y Sies, 1991) o en la síntesis de hidroxilamina (Rümer et al., 2009).

Además, no debemos olvidar que la FeSOD tiene como producto final de su reacción de

dismutación el H2O2. También se incluyeron en algunos tubos alícuotas de hemoglobinas

(Hbs) vegetales como la Hb I de arroz, que es una hemoglobina hexacoordinada que une

NO con alta afinidad, y la Lb II de cowpea que es una hemoglobina pentacoordinada con

menor afinidad por los ligandos como NO y O2 (Moran et al., 1997).

Además, se ha propuesto que en plantas las Hbs (sobre todo las hexacoordinadas, en

este caso la Hb I) participarían en la eliminación de NO produciendo nitrito o nitrato

(Dordas et al., 2003). Finalmente, dado que el proceso de eliminación de NO por las Hbs

precisaría de un reductor, se añadió NADH, que se conoce que es capaz de funcionar como

molécula reductora en presencia de Hbs a pH neutro y ligeramente ácido (Becana y Klucas,

1990).

a) Nitrificación a partir de NH4+

Se realizaron ensayos con amonio como sustrato a pH 5.8. En estos ensayos se

incluyeron Fe, ascorbato, Fe3+ y peróxido de hidrógeno (H2O2). Esencialmente, se

consideraba que el mediador de las reacciones sería el radical hidroxilo (OH-). Los tubos de

reacción después de 2 horas de incubación no presentaron contenidos en NH2OH, NO2- ni

NO3-. Se estudiaron dos fuentes de amonio y con ninguna de las dos, ya fuese NH4Cl o con

(NH4)2SO4 evidenció presencia de los intermediaros de la nitrificación.

b) Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino

Las reacciones in vitro realizadas utilizando NH3 como sustrato sin neutralizar a pH

9,0 fueron medidas de acuerdo al ensayo aplicado, lo cual se explica en la siguiente gráfica

donde se detallan los compuestos adicionados. No hubo ninguna evidencia de NO3- ni

NH2OH como productos de la oxidación del amoniaco. Sin embargo, se encontró NO2- en

algunos tratamientos. El ensayo control, que únicamente contenía NH3 y la solución buffer,

40

presentó producción de NO2-, con un valor de 5 µmol en los 2 mL del tubo de ensayo. Los

tubos de reacción 1 y 2 que contenían el radical superóxido producido por el sistema

XOD/xantina, mostraron valores semejantes al control. El ensayo 5 con FeSOD,

riboflavina, HbI y NADH fue el que demostró tener mayor concentración de NO2- respecto

al control y al 1 y 2 con un valor de 15 µmol.

Figura 6. Contenido de nitrito (NO2-) a partir de amoniaco a pH 9,0 en mezclas in vitro conteniendo

XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II (leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37°C y se midieron los contenidos por cromatografía iónica.

c) Nitrificación a partir de NH3 neutralizado

Los resultados de los ensayos efectuados a partir de NH3 neutralizado previamente

con ácido fosfórico (pH 5,8) muestran gran variación con respecto a los obtenidos en la

0 1 2 3 4 5 6

Con

teni

do d

e ni

trito

(µµ µµm

ol)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

XOD + +

Xantina + + Riboflavina + + + +

FeSOD + + + Lb II + + Hb I + +

NADH + + + +

41

primera serie de tubos con NH3 a pH alcalino. En la gráfica se puede observar que existe

NH2OH en la mayoría de ensayos, lo cual no se obtuvo en la serie de reacciones anteriores.

Se obtuvo NH2OH en el tubo control. No se detectó presencia de NO3- en ninguno de los

tubos, y sólo uno de los tubos correspondiente al ensayo 2, el que contenía XOD, xantina y

FeSOD, presentaba contenidos de NO2-. En concreto, de los tubos que muestran NH2OH

sólo los tubos 2, 3 y 4 tienen concentraciones superiores al control. El tubo 2 de nuevo es el

que contiene la mayor concentración de NH2OH con respecto a los demás tubos. Los tubos

5 y 6 correspondiente a ensayos con presencia de riboflavina, FeSOD, NADH, y LbII o HbI

no presentaron NH2OH, NO2- ni NO3

-.

Figura 7. Producción de nitrito (NO2

-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de amoniaco a pH 5,8, en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superoxido dismutasa), Lb II (leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía.

XOD + + Xantina + +

Riboflavina + + + + FeSOD + + + Lb II + + Hb I + +

NADH + + + +

0 1 2 3 4 5 6

Con

teni

do ió

nico

(µµ µµm

ol)

0,0

2,5

5,0

10,0

15,0

20,0

NO2-1

NH2OH

42

d) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1

Las reacciones efectuadas a partir de NH2OH como sustrato fueron realizadas a pH

5.8. Los resultados no detectaron la presencia de NO3-. Sin embargo, en algunos

tratamientos se encuentró producción de NO2-. Adicionalmente, se midió la concentración

de NH2OH observándose la desaparición de este compuesto de N desde el tubo control, por

lo que se identificó la mayor concentración en el ensayo 0. En este caso, se observó que los

tubos en los que existe reacción con FeSOD, NADH y las hemoglobinas son los que

presentaron producción de nitrito, así como sucede en el tubo control. Por ello, no

descartamos que se estén produciendo otros intermediarios como el óxido nítrico (NO).

Figura 8. Producción de nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de hidroxilamina en

medio neutro en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superoxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía.

XOD + + Xantina + +

Riboflavina + + + + FeSOD + + + Lb II + + Hb I + +

NADH + + + +

0 1 2 3 4 5 6

Con

teni

do ió

nico

(µµ µµm

ol)

0

40

80

120

400

NO2-

NH2OH

43

e) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2

Se repitió el experimento descrito en d) usando concentraciones menores de Fe-

proteínas (apartado 3.4.5). De este modo, FeSOD, Hb I y Lb II se utilizaron en este

segundo ensayo de oxidación de NH2OH a una concentración 1µM cada uno de estos

compuestos, mientras que el pH (5,8) y el resto de los reactivos se mantuvieron en idéntica

concentración. Tampoco existió la producción de NO3- como en las pruebas efectuadas

anteriormente, sin embargo, sí encontramos NO2- a excepción de en los ensayos 2 y 6. Es

importante identificar que en los ensayos donde existió producción de NO2- no se identificó

presencia de NH2OH salvo en el correspondiente al número 7.

Figura 9. Producción de nitrito (NO2

-) a partir de hidroxilamina (NH2OH) a pH 5.8 en mezclas in vitro con menores concentraciones de FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz) según se indica en la tabla adjunta. Los viales con la mezclas de reacción se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía.

XOD + + + + Xantina + + + +

Riboflavina + + + + + FeSOD + + + Lb II + + + Hb I + + +

NADH + + + + + + +

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Con

teni

do ió

nico

(µµ µµm

ol)

0

5

10

300

400

NO2-

NH2OH

44


Se establecieron varios tratamientos para el crecimiento de Arabidopsis thaliana y

Pisum sativum buscando establecer un medio de cultivo axénico en nutrición estrictamente

amoniacal para las plantas. Una vez crecidas, se estableció el análisis morfológico que se

presenta a continuación, donde se observa el crecimiento de la parte aérea y la raíz de las

plantas, así como su biomasa.

4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana).

El tratamiento control de plantas crecidas con NO3- correspondía al crecimiento de

plantas en condiciones óptimas establecidas para el desarrollo de A. thaliana en medio MS

(Murashigue y Skoog, 1962). Estas plantas crecidas bajo nutrición nítrica mostraron hojas

largas y estrechas, y se identificó una roseta con un número aproximado de 6 o 7 hojas para

cada planta. Se pudo observar también la emisión de la inflorescencia con pequeñas flores

en su parte terminal. El peso medio de planta fue de 0.22 g por planta. El crecimiento de la

raíz fue proporcional a la parte aérea (Fig. 10), presentando también raicillas secundarias.

El desarrollo y crecimiento se dio con normalidad, las hojas no presentaron clorosis o

manchas de marchitez, el desarrollo de sus raíces fue radial y el crecimiento final de las

plantas fue el óptimo correspondiente a las tres semanas de cultivo durante las cuales

fueron mantenidas las plantas.

4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N (A.thaliana).

El primer tratamiento aplicado se preparó sustituyendo las sales del medio MS

normal. Las plantas germinaron en su mayoría, sin embargo, como se puede observar en la

figura 10, no tuvieron un desarrollo normal y la coloración de sus hojas cambió tomando un

tono rojizo. En el tratamiento con una concentración de 1 mM de NH4+ se observó mayor

desarrollo de la parte aérea y de la raíz en comparación con el de 5 mM de NH4+, así

también con respecto al porcentaje de biomasa calculado. Se identificó un mayor

45

Bio

mas

a (g

PS

)

0,0000

0,0015

0,0030

0,1000

0,1200

0,1400 Parte aérea Raíz

Control 1mM NH 4+ 5mM NH4

+

D

incremento de biomasa en la parte radical en el tratamiento de 1 mM de NH4+ a diferencia

con la parte aérea. Sin embargo, en el tratamiento con 5 mM de NH4+, el incremento de la

biomasa de la parte aérea fue mínimo, no mostrando mayor desarrollo de la raíz. En el

tratamiento control que cuenta con todas las sales de un MS normal con nitrato como fuente

de nitrógeno, se pudo observar la diferencia en la biomasa con respecto a los tratamientos

con nutrición amoniacal, y también se observó que el crecimiento de la parte aérea y la raíz

fueron casi iguales siguiendo la misma proporción.

Figura 10. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con las modificadas. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4

+ (medio MS modificado con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4

+ (medio MS modificado con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos: Control, 1mM de NH4

+ y 5mM de NH4+ crecidas en medio MS modificadas las sales.

A1

A2

B1

B2

C1

C2

46

4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM) (A.thaliana).

La adición de potasio ha sido descrito recientemente como un medio para reducir el

estrés por nutrición amoniacal (Sczerba et al., 2008). En el tratamiento con aumento de K

hasta una concentración de 40 mM se observó un mejor desarrollo en las plantas con

respecto al tratamiento 1 tal y como indican los datos de biomasa (Fig. 11D). El aumento en

la disponibilidad de K en el medio permitió que las hojas de las plantas mostrasen mayor

apertura y dimensión, sin embargo el desarrollo aún fue muy limitado y la coloración de las

hojas era rojiza. El tratamiento de 1 mM de amonio presentó mayor desarrollo de biomasa

en la raíz que en la parte aérea. Este comportamiento se repitió también en el tratamiento 1

pero con aumento de K la biomasa total de la planta aumenta. El tratamiento de 5 mM

presentó un menor desarrollo de las plantas, con un porcentaje de biomasa muy similar

entre la parte aérea y la parte radical. La diferencia entre el valor de biomasa con el

tratamiento control seguía siendo muchísimo mayor tanto para la parte aérea como para la

raíz.

A1

A2

B1

B2

C1

C2

A1

A2

B1

B2

C1

C2

47

Figura 11. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado con K+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4

+ (medio MS + suplemento K+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4

+ (medio MS + suplemento K+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1 mM de NH4

+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con suplemento de

K+.

4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM) (A.thaliana).

El suplemento de potasio y magnesio conjunto generó una variación en los

resultados respecto a los tratamientos 1 (MS sustituidas las sales) y 2 (MS + aporte de K+)

los cuales fueron similares entre sí en lo que concierne a la distribución de biomasa entre

parte aérea y raíz. En este caso, la biomasa de la parte aérea superó a la de la raíz en las dos

concentraciones de NH4+ aplicadas, pero se diferenciaban entre ellas en que en las plantas

crecidas con 5 mM de amonio el desarrollo de las plantas fue mayor.

Las hojas de Arabidopsis crecidas bajo este tratamiento fueron de mayor tamaño y

número, y las dimensiones de la raíz también aumentaron, mientras que las plantas del

tratamiento 1 mM de NH4+ fueron muy pequeñas y su desarrollo era difícilmente visible.


+

Bio

mas

a (g

PS

)

0,00

0,01

0,10

0,12

0,14Parte aérea Raíz

D

48

Figura 12. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado con K+ y Mg2+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4

+ (medio MS + suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5 mM de NH4

+ (medio MS + suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1 mM de NH4

+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con

suplemento de K+ y Mg2+.

Bio

mas

a (g

PS

)

0,000

0,003

0,100

0,120

Parte aérea Raíz


+

D

A1

A2

B1

B2

C1

C2

49

4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N (A.thaliana).

En el tratamiento suplementado con L-glutamina como fuente de nitrógeno se

obtuvieron mejores resultados de crecimiento, siendo el desarrollo de la raíz y de la parte

aérea visiblemente mayor. Las hojas presentaron una coloración más verdosa, aunque

existían algunas plantas que aún presentaban coloración rojiza. A diferencia de los

tratamientos anteriores, la disposición de las hojas y su apertura se dan de mejor manera, y

su tamaño aumenta.

Se aplicó únicamente un tratamiento, ya que se realizó una experimentación anterior

aplicando varias concentraciones de L-glutamina, donde la única que daba buen

crecimiento fue la de 10 mM, que es la que se añadió en este tratamiento. En este caso la

biomasa radical fue mayor que la de la parte aérea, siendo la distribución y extensión de las

raíces visiblemente mayor que en el resto de tratamientos, y se observaron gran cantidad de

raicillas.

A1

A2

B1

B2

C1

C2

50

Figura 13. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con L-glutamina como fuente de N. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B y C10mM de L-glutamina (medio MS + L-Gln); D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control y 10mM de L-glutamina.

4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in

vitro sin sacarosa (A.thaliana).

La utilización del medio Rigaud y Puppo mostró mejores resultados en el desarrollo

de las plantas de Arabidopsis, obteniendo plantas verdes con diferente número de hojas y

también la emisión del pequeño tallo de florescencia con la producción de pequeñas flores,

llegando así a realizar todo su ciclo vital.

Se pudo observar el mayor desarrollo de la parte aérea a diferencia de la raíz en los

dos tratamientos, sin embargo el de 1 mM de NH4+ presentó mayor biomasa total de la

planta que el de 5 mM de NH4+.

Control 10 mM

Bio

mas

a (g

PS

)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12


D

51

Figura 14. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y Puppo (R y P) sin sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4

+ (medio R y P sin sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio R y P sin sacarosa). D:

Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y

5mM de NH4+ crecidas en medio R y P sin aplicación de sacarosa.

4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in

vitro con sacarosa (A.thaliana).

El último tratamiento tuvo similares resultados que el anterior, aunque existió

diferencia en la cantidad de biomasa producida, que en este caso fue menor. Se puede

observar que existe mayor desarrollo en la parte aérea que en la raíz en los dos tratamientos

Bio

mas

a (g

PS

)

0,00

0,01

0,10

0,12



+

D

A1

A2

B1

B2

C1

C2

52

Control 1 mM NH4 5 mM NH4

Bio

msa

(g

PS

)

0,000

0,006

0,100

0,120

Parte aérea Raíz

D

de 1 y 5 mM de NH4+ y que el primero tuvo mayor cantidad de biomasa total que el

segundo. Se obtuvieron plantas con numerosas hojas y raíces con la producción de

pequeñas flores como se obtuvo en el tratamiento 5. Sin embargo, en este caso las hojas no

mantuvieron por tanto tiempo su color verde y su vitalidad. Asimismo, se identificó un

desarrollo completo de la planta, es decir, se vio que alcanzó la floración. Sin embargo, el

tamaño de las flores fue muy pequeño en comparación con las plantas desarrolladas en el

tratamiento control.

Figura 15. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y Puppo (R y P) con sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4

+ (medio R y P con sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio RyP con sacarosa). D:

Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y

5mM de NH4+ crecidas en medio Rigaud y Puppo con aplicación de sacarosa.

A1

A2

B1

B2

C1

C2

53

4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum).

Las plantas de guisante sometidas a los mismos tratamientos que Arabidopsis no

mostraron diferencias en su crecimiento (el desarrollo de su parte aérea y raíz fueron

similares), razón por la cual se ha obviado la descripción detallada de todos los

tratamientos. Las hojas de guisante se desarrollaron con normalidad presentando pares de

foliolos que terminan en zarcillos característicos de esta especie. El desarrollo de la raíz fue

también normal presentando raíz pivotante, siendo bastante robustas tanto la raíz principal

como las secundarias. El desarrollo de esta especie durante el período de experimentación

no completó su ciclo por lo que no existió la presencia de flores ni fruto. Las características

morfológicas de esta especie se identificaron claramente en todos los tratamientos aplicados

(Figura 16).

Control MS sust MS K+

MS K+ + Mg2+ L-Gln R y P

A

E

C

D

B

F

54

Figura 16. Crecimiento de P.sativum en cultivo axénico bajo los tratamientos aplicados. A: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B: medio MS sustituidas las sales (nutrición amoniacal); C: medio MS con aporte de K+; D: medio MS con aporte de K+ y Mg2+; E: medio con L-Gln como fuente de N; F: Medio Rigaud y Puppo; G: Gráfico de biomasa total de P.sativum correspondiente a los tratamientos de medio de cultivo aplicados a 1 y 5 mM de NH4

+.

4.4 Análisis estadístico de biomasa total

4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana

Los distintos tratamiento aplicados (medio de cultivo, presencia de cationes y

sacarosa) tuvieron un efecto sobre la producción de biomasa total de A. thaliana en ambas

concentraciones de NH4+ (1 y 5 mM, Figura 17). Los tratamientos con el medio de cultivo

Rigaud y Puppo (RyP) mostraron mayor biomasa que los de medio MS. Además dentro del

medio Rigaud y Puppo el tratamiento que mayor rendimiento en biomasa presentó fue el

Ry P sin sacarosa (Figura 17).

El factor concentración de NH4+ mostró también un efecto sobre la variable biomasa

total de A. thaliana en los tratamientos de cultivo. En los casos de MS sustituidas las sales,

con tro l M S sus t M S K M S K + M g L-G ln R yP s in R yP con

Bio

mas

a (g

PS

)

0 ,00

0 ,05

0 ,10

0 ,15

0 ,20

0 ,25

0 ,30

1m M N H 4+

5m M N H 4+

G

55

MS con suplemento de K+ y Rigaud y Puppo sin sacarosa, al aumentar la concentración de

NH4+ se observó una disminución de la biomasa total (Figura 16).

Figura 17. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa de las plantas de A. thaliana crecidas bajo 1mM de NH4

+ (●) y 5mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio ± el

error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4

+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05).

4.4.2 Cultivo de Pisum sativum

El análisis estadístico efectuado para los datos obtenidos de Pisum sativum mostró

diferencias significativas entre el tratamiento de cultivo Rigaud y Puppo con respecto a los

demás medios de cultivo, sobre la producción de biomasa total. La concentración de 1 y 5

mM de NH4+ no tuvo efecto alguno sobre el crecimiento de guisante (Figura 18).

MS sust MS K MS K + Mg RyP sin RyP con

Pro

ducc

ión

de B

iom

asa

(g P

S)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,0251mM NH

4+

5mM NH4

+

a

ab

a

b

ab

a

b b

b

b

* * *

56

Figura 18. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa total de las plantas de Pisum sativum crecidas bajo 1 mM de NH4

+ (●) y 5 mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio

± el error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4

+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05).

MS sust MS K MS K + Mg RyP sin RyP con

Pro

ducc

ión

de B

iom

asa

(gP

S)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,301mM NH

4+

5mM NH4

+

a

a

a

b

a

a

b

a

aa

57

5. DISCUSIÓN

5.1 Producción de nitrato y otras especies intermediarias del

metabolismo oxidativo del amonio en plantas

Hasta ahora apenas se ha prestado atención a los contenidos de nitrato en las plantas

crecidas con amonio, y se consideraba que el NO2- podría producirse en la solución

nutritiva debido a contaminación de bacterias nitrificantes como pueden ser las

pertenecientes a los géneros Nitrosomonas y Nitrobacter. Para descartar este hecho se han

utilizado medios axénicos para crecer todas las plantas usadas en el estudio. Se midió el

contenido de iones intermediarios del metabolismo del amonio en la parte aérea de las

plantas de A. thaliana, y se pudo comprobar la presencia de NH2OH, NO2- y NO3

- en todos

los tratamientos con aplicación de 1 y 5 mM de (NH4)2SO4, lo cual confirma la existencia

de una vía de oxidación de amonio en plantas. Rümer y colaboradores (2009) ya sugirieron

la existencia de esta vía pero no demostraron la existencia in vivo del primer paso de

oxidación de amonio a NH2OH (Ec. 1).

Nuestros resultados proceden de varias plantas originarias de diferentes frascos de

cultivo. El crecimiento de las plantas se llevó a cabo en dos series independientes con un

desfase temporal de una semana, por lo que es necesario considerar que tanto la

variabilidad biológica como el factor temporal pueden influir en la variabilidad de los datos

obtenidos. Todo ello explicaría la considerable dimensión de los errores mostrados en los

resultados de A. thaliana (Fig. 2 y 3) y quizás fuese necesario aumentar el número de

réplicas para mejorar la estadística. Con respecto al contenido de NH2OH en la parte aérea

para las dos concentraciones de amonio aplicadas, se demuestra que es un compuesto que

interviene en el proceso oxidativo que se da en la planta para metabolizar el amonio

absorbido. Algunos estudios en células de Nicotiana tabacum se basan en la identificación

del contenido de óxido nítrico, mostrando que la producción de este compuesto puede

ocurrir a partir de la oxidación de hidroxilamina (HA), tal y como indican los resultados in

vitro (Rümer et al., 2009; Sthör et al., 2001). Sin embargo, su relevancia fisiológica no ha

58

sido esclarecida en su totalidad. Originalmente, la HA fue considerada un intermediario en

la reducción del nitrito a amonio, pero esta posibilidad fue descartada posteriormente

(Cresswell et al., 1964), aunque en recientemente se ha mostrado que la HA si puede ser un

intermediario en la reacción de la NiR fotosintética (Hirasawa et al., 2010). Así, también se

ha mencionado que la HA puede ser un supuesto intermediario en la reacción de la óxido

nítrico sintasa (NOS, DeMaster et al., 1989), y también se consideró que podía ser un

producto de la reacción catalizada por la nitroso-glutatión reductasa (GSNOR, Jensen et al.,

1998). Existen también algunos trabajos en los que se propone otras fuentes potenciales

para la producción de HA, como por ejemplo el proceso de oxidación del amoniaco,

catalizada por una de amonio mono-oxigenasa (AMO) como sucede en el caso de algunas

bacterias (Hooper et al., 1997). Dentro de este contexto, es evidente que son necesarias más

experimentaciones para dilucidar si la producción de HA sucede bajo condiciones

específicas para servir como sustrato de formación de otras especies del metabolismo del N

en plantas.

A pesar de este hecho, los resultados obtenidos en la experimentación son

interesantes desde el punto de vista del entendimiento de los procesos ocurridos en la

nutrición amoniacal exclusiva en plantas de A. thaliana, donde se comprueba que la

molécula está presente en parte aérea así como también en la parte radical, en menor

medida, y se determina que la molécula es producida por la planta (Fig.2). Esta molécula

podría ser parte de la transformación del amonio hasta la formación de nitrito basándose en

procesos identificados en algunas especies de bacterias (Fig. 19) (McCarty, 1999).

Figura 19. Reacciones enzimáticas catalizadas por la amonio-monooxigenasa (AMO) y la hidroxilamina-oxidorreductasa en Nitrosomonas europaea (McCarty, 1999)

59

Así como se ha demostrado la presencia de HA en los tratamientos con nutrición

amoniacal de 1 y 5 mM mencionados, es interesante también el análisis de los resultados

encontrados en el tratamiento control, cuya nutrición es a base de nitrato como fuente de N.

Se observó que tanto en parte aérea como en raíz de A. thaliana no se dio producción de

NH2OH. Esto puede explicarse precisamente por la diferencia entre los mecanismos de

absorción y transformación de nitrato y amonio en la planta. El tratamiento control presenta

una concentración de 20 mM de nitrato de amonio (NH4NO3) en el medio final y de 18,79

mM de nitrato de potasio (KNO3), por lo cual la producción de HA se vería muy reducida

al no propiciarse una reducción del nitrato, lo que concuerda con la acumulación en forma

de nitrato y nitrito (Fig.2). Aunque han sido pocos los estudios en los que se ha

comprobado la producción de HA en plantas, en algunos estudios con suspensiones

celulares de Nicotiana tabacum se ha demostrado que existe producción de NO a partir de

NH2OH (Rümer et al., 2009).

A diferencia de lo que ocurre en A. thaliana, no se detectó HA en Pisum sativum en

parte aérea o en raíz. Algunos trabajos realizados en guisante han demostrado que es una

especie que muestra tolerancia al amonio cuando es la única fuente de N (Domínguez-

Valdivia et al., 2008). Se estableció también que bajo nutrición nítrica, el nitrato se

acumula en hojas y raíces lo cual sustenta lo obtenido en la presente investigación para P.

sativum (Fig.4 y 5).

Se ha encontrado también que las diferencias entre la nutrición con amonio o con

nitrato son claramente significativas, puesto que los tejidos de las plantas crecidas con

amonio no presentaron acumulación de nitrato en sus tejidos, y que el tratamiento de 5 mM

de NH4+ no mostró valores de nitrato en la parte aérea ni en la raíz. Sin embargo, se pudo

diferenciar que en el tratamiento con 1 mM de NH4+ si aparecieron pequeñas

concentraciones de NO3-, por lo que no se podría afirmar que la ausencia de este anión sea

total en los tejidos de plantas crecidas con amonio, ya que su presencia fue claramente

detectable, hecho que también ha ocurrido con algunas variedades de guisante (Domínguez-

Valdivia et al., 2008). Por ello, aunque no se haya detectado HA, nuestros resultados

60

sugieren que se debe a que la NH2OH es oxidada a NO2- y NO3

- y que la vía oxidativa de

NH4+ también está presente en esta leguminosa.

Es importante también señalar que algunos autores aseguran que la especie Pisum

sativum L. es sensible a la nutrición amoniacal (Britto y Kronzucker, 2002) por lo que la

tolerancia a este tipo de nutrición, puede estar restringida a ciertas variedades de las

especies denominadas tolerantes, así como depender de las concentraciones de amonio

aportadas y de las condiciones de crecimiento de cada estudio. Sin embargo, en este estudio

se ha comprobado que las plantas de guisante tuvieron un buen desarrollo foliar y radical en

los tratamientos con amonio, a diferencia por ejemplo de A. thaliana, donde fue evidente la

disminución de su crecimiento (esto se detallará en el apartado de análisis morfológico).

En cuanto al contenido de nitrato y nitrito en las muestras de A. thaliana, se

detectaron mayor concentraciones en el tratamiento control que corresponde a la nutrición

con nitrato que en los tratamientos con 1 y 5 mM de NH4 (Fig. 2 y 3), lo cual puede

explicarse debido a que, como es sabido, la absorción de nitrato en la planta permite

almacenar mayor cantidad de este compuesto en sus tejidos (así como de nitrito) con

respecto a la nutrición amoniacal, siendo en este caso preciso que después de la absorción

se generen ciertas oxidaciones para obtener nitrato y nitrito. Algunos autores han descrito

que el ion nitrato puede acumularse en las vacuolas por lo que existe una tolerancia a

concentraciones muy altas de este compuesto por parte de las plantas sin evidencias de

toxicidad (Barker et al., 1966).

Como se puede observar en el tratamiento sobre las plantas de guisante en el que se

aplica una mayor concentración de NH4+, se da un mayor contenido de NO2

- y NO3- en la

raíz que en la parte aérea (Fig. 3), lo cual se explica por la capacidad de algunas plantas de

metabolizar el nitrato en las hojas a diferencia del amonio, que es habitualmente asimilado

en las raíces, teniendo mayor actividad de la enzima nitrato reductasa (NR) en la parte aérea

(Lasa et al., 2001). Esto se da para evitar la acumulación de iones de amonio en las hojas

que puede resultar tóxico (Bloom et al., 1992).

61


La presencia de compuestos intermediarios del proceso de nitrificación fue

detectada en los ensayos realizados a partir de NH3 y de NH2OH. En los resultados

obtenidos a partir de NH3 como sustrato a pH 9.0 (Fig. 6), se obtuvieron pequeñas

concentraciones de NO2-, muy similares en el ensayo 1 y 2 correspondientes a la adición de

XOD/xantina y XOD/xantina/FeSOD respectivamente. Como se conoce, el complejo

XOD/xantina genera especies reactivas de oxígeno (ROS), generando principalmente en

este caso radical superóxido (O2-), habiendo sido descritos recientemente como un medio

de inducción de la oxidación del NH3 a NO2-, aunque en condiciones de pH ligeramente

ácido (Rümer et al., 2009).

El sistema en el cual se observó una mayor producción de NO2- fue el generado por

riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH. La enzima SOD actúa como un antioxidante, dismutando

el O2- para convertirlo en oxígeno (O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Se sabe que la

riboflavina es el componente principal de los cofactores FAD y FMN y es un agente

reductor eficiente que tomaría en este caso electrones del NADH y los cedería a las

hemoglobinas (Hbs). Estas, una vez reducidas, podrían tomar el NO generado a partir de la

NH2OH (por medio del H2O2 producto de la reacción de la FeSOD) y convertirlo en nitrito

(Kim-Shapiro et al., 2004). Podría pensarse el H2O2 es capaz de oxidar el amonio y la

NH2OH de modo directo convirtiéndolos en una siguiente especie de la vía, el NO2-,

aunque esto parece improbable dado que nuestros experimentos in vitro con H2O2 no

produjeron oxidación de amonio detectable (apartado 4.2. a.) Por eso, no es descartable que

el efecto se deba a una acción catalítica de la hemoglobina I de arroz, la cual recientemente

ha demostrado tener actividad peroxidasa (Violante-Mota et al., 2010). Aunque se ha

indicado que la función peroxidasa de la Hb I no es de importancia fisiológica, es posible

que esta pseudo-actividad le permita catalizar la oxidación de amonio usando H2O2 y un

reductor como pueda ser el NADH.

62

Se ha establecido que las hemoglobinas pueden estar involucradas en la

transformación de NO. Algunos resultados han sugerido que las hemoglobinas inducidas

por estrés pueden funcionar como dioxigenasas desintoxicando el NO producido durante la

hipoxia en plantas mediante algunas rutas metabólicas como se muestra en la figura 18.

Dentro de este contexto se sustenta la importancia del rol de las hemoglobinas en la

producción de NO2- (Dordas et al., 2003).

También se ha visto que algunos estudios han reportado la compatibilidad de la

SOD con la reducción reversible de NO a NO-, usando cianamida y catalasa para generar

NO- en presencia de SODs, midiéndose el NO por la conversión de HbO2 a MetHb

(Murphy y Sies, 1991). Esta información sustentaría la presencia de NO2- en ensayos con

FeSOD, ya que al ser mediadas estas reacciones por esta SOD, se propiciaría la producción

de NO que sería captado por la HbI y podría oxidar este NO. Esto explicaría que la LbII no

de reacción ya que LbII muestra menores afinidades por el NO (Fig. 20).

Figura 20. Posibles vías de formación de óxido nítrico e interacción con hemoglobinas, que pueden estar involucradas en la adaptación a estrés por hipoxia (Dordas et al., 2003)

En los ensayos a partir de NH3 neutralizado a pH 5.8 se obtuvo una pequeña

cantidad de producción de NH2OH en la mayoría de los tubos y sólo en uno de ellos

(XOD/xantina/FeSOD) se obtuvo NO2- (Fig. 7), lo cual sugiere que el factor pH puede estar

teniendo importancia. Debemos recordar que de las reacciones químicas que se dan en el

proceso de nitrificación. La reacción primera de oxidación del amonio (Ec. 1) es

63

endergónica, es decir, no espontánea. Esta reacción, sin embargo podría verse favorecida a

pH ácido (Ec. 1), lo que se corresponde con los resultados a partir de NH3 a pH

ligeramente ácido (Fig. 7), en donde en la mayoría de ensayos se obtuvieron pequeñas

cantidades de hidroxilamina.

NH4+ + H2O� NH2OH + 3H+ + 2e-

1/2O2 + 2e- + 2H+ � H2O

NH4+ + 1/2O2 �� NH2OH + H+ ∆G’º(pH 7)= +16 Kj/mol (Ec. 1)

Por el contrario, a pH alcalino, esta reacción endergónica no es posible, y se debe

acoplar a un proceso exergónico como es la oxidación de NH2OH a NO2- según la Ec. 2.

También, a partir de NH2OH y usando un pH ligeramente ácido (5.8), ya sea con mayor o

menor concentración de Fe-proteínas, se puede ver cómo la NH2OH se va consumiendo, y

solamente en tres de los tubos se detecta NO2- (Riboflavina/Lb II/NADH; riboflavina/Hb

I/NADH; y riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH), lo cual sugiere que bajo estas condiciones se

propiciaría el paso este siguiente compuesto de la hipotética vía de nitrificación, que es el

NO2-, como se ve en la Ec. 2.

NH2OH + H2O � NO2- + 5H+ + 4e-

O2 + 4H+ + 4e- � 2H2O

NH2OH + O2 �� NO2- + H2O + H+ ∆G’º= -228 Kj/mol (Ec. 2)

Paradójicamente, se ha detectado la presencia de NO2- en algunos de los blancos de

las experimentaciones in vitro realizadas (Fig. 6 y 9). Estos resultados pueden sustentarse

con la hipótesis de que hay posibilidad de que se dé una autooxidación del amonio,

siguiendo la Ec. 1 y/o Ec. 2.

La NH2OH en presencia de O2 produce NO2-, siendo una reacción fácilmente

propiciada por el pH ligeramente ácido del medio y porque la energía libre de Gibbs (∆G’º)

64

es negativa, lo que le da características de ser una reacción altamente exergónica y con la

premisa de que las reacciones exergónicas transcurren espontáneamente, se sustenta que se

dé una oxidación espontánea en los ensayos control (Anderson, 1964).

Ha sido demostrado que en microorganimos nitrificantes la oxidación de amonio a

nitrito transcurre con la formación de NH2=H como intermediario, en una reacción

catalizada por la monoamino oxidasa (Hollocher et al., 1981). También se ha propuesto que

el cobre puede tener una función en la oxidación del amonio (Anderson, 1965), lo que

sustenta el papel de la Cu/ZnSOD en la oxidación del amonio (Rümer et al., 2009). Sin

duda nuevos experimentos deberían ser realizados para confirmar los datos preliminares

aquí presentados con el objeto de certificar su significación, así como para estudiar con más

detalle la función de las Hbs en la oxidación de amonio.


El efecto de los medios de cultivo con las concentraciones de NH4+ de 1 y 5 mM se

observó sobre todo en el crecimiento y desarrollo del vegetal. En A. thaliana fue obvia la

disminución de crecimiento, siendo esto uno de los efectos de la nutrición amoniacal

ampliamente descritos en la literatura. La reducción del crecimiento es un factor claramente

identificable en una gran variedad de especies con respecto a las crecidas con nutrición

nítrica (Cramer y Lewis, 1993; Miller y Cramer, 2004; Domínguez-Valdivia et al., 2008).

Al aumentar la concentración de NH4+, las plantas redujeron su crecimiento con

respecto al tratamiento de 1 mM de lo que se deduce que la concentración de 5 mM de

NH4+ podría provocar una situación de estrés a las plantas de A. thaliana, concentración a

la cual, este cultivar superaría su umbral de tolerancia al catión (Fig. 10-15).

Los síntomas reportados de toxicidad por NH4+ en plantas son ampliamente

conocidos, y por lo general aparecen con concentraciones externas de NH4+ por encima de

0,1 a 0,5 mmol . L-1 (Peckol y Rivers, 1995; van Katwijk et al., 1997). En algunas especies

65

sensibles, los síntomas más notables son la clorosis en las hojas y la supresión total de

crecimiento. Algunos cambios químicos en la planta inducidos por la exposición a NH4+

incluyen también la baja concentración de cationes esenciales como el K+, el Ca2+, y el

Mg2+ en la célula vegetal. Esta disminución está acompañada por el incremento de los

niveles de aniones inorgánicos como el Cl-, el sulfato y el fosfato (Troelstra et al., 1995;

Gloser y Gloser, 2000).

En el caso de las plantas de Arabidopsis es muy acusado el efecto de enrojecimiento

de las hojas. Se ha descrito en varios cultivares de maíz, trigo y alubias que la deficiencia

de nutrientes esenciales como el K+ causa atrofia y que se da un color amarillo en los

bordes exteriores de la hoja. En algunos casos se da una coloración roja y la deficiencia

severa puede acelerar la necrosis. Sin embargo, puede estar más relacionado con el efecto

desacoplante descrito para el amonio sobre los cloroplastos (Bloom et al., 1997), lo cual

induce una degeneración de moléculas antena y su degradación. No es descartable, que se

esté produciendo también deficiencia de N lo cual da como síntomas la disminución de

clorofila, por lo que también disminuye la coloración verde en las hojas (Wong, 2005), lo

cual puede sustentar los efectos visuales mostrados en las plantas de A. thaliana bajo

nutrición amoniacal (Fig.10-15), y más experimentos serían necesarios para elucidar este

síntoma.

Al mismo tiempo, es importante mencionar que la nutrición en plantas con NH4+

normalmente acidifica el medio externo (Goodchild y Givan, 1990; Schubert y Yan, 1997),

por lo que el eflujo de protones de la planta es un medio para compensar el desequilibrio de

carga y la absorción de aniones se da en exceso en relación a los cationes. No obstante, las

diferencias en la captación de protones y extrusión a lo largo del eje longitudinal de la raíz

entre los dos tipos de nutrición amoniacal y nítrica es un hecho mucho más complicado de

explicar, por lo que aún es necesario realizar más estudios al respecto (Henriksen et al.,

1992; Taylor y Bloom 1998).

En general, se puede decir que como respuesta a la nutrición amoniacal el resultado

es la acidificación del medio, la deficiencia de cationes importantes y por consecuencia el

66

desequilibrio iónico en las células vegetales, y estos se consideran como las causas

principales de la toxicidad de este compuesto. En los resultados de la presente

experimentación son evidentes los efectos de toxicidad descritos en las plantas de A.

thaliana, donde se obtuvieron plantas con disminución del crecimiento y desarrollo,

clorosis y aumento en la producción radical.

Tratamiento 1: MS con sales sustituidas

En el tratamiento 1 se realizó una sustitución de sales del medio MS control para

cambiar las sales que contenían nitrato y garantizar que la única fuente de N fuese amonio

(Tabla 10). En los resultados obtenidos (Fig. 10) se observó un escaso crecimiento de las

plantas de A. thaliana, a diferencia de las del tratamiento control. Como se ha mencionado

anteriormente, se ha descrito que una de los principales respuestas a la nutrición amoniacal

es la disminución en el crecimiento, y adicionalmente, se sabe que el amonio induce

cambios en el desarrollo por causar alteraciones en el balance hormonal (Lasa et al., 2000).

Se pudo observar diferencias en la biomasa de las raíces de las plantas crecidas con

amonio con respecto a las crecidas con nitrato, donde las primeras presentaron un mayor

crecimiento radical principalmente en el tratamiento de 1mM de NH4+. Referente a esto,

algunos estudios han sugerido que las ramificaciones de la raíz proliferan por la mayor

resistencia del tejido como un sumidero de carbono, facilitando concentraciones de auxinas

en la raíz (Gerendás et al. 1997).

Asimismo, se observó un cambio de coloración en las hojas, dando un color café-

rojizo. Se ha descrito que la toxicidad por amonio se caracteriza por una restricción

inmediata de la tasa de crecimiento, marchitez, necrosis y clorosis marginal intervenal de

las hojas terminales, y finalmente la muerte de la planta entera (Cox y Reisenauer, 1973).

Algunos estudios sostienen que la necrosis y clorosis en hojas se da debido al desequilibrio

de pH en la planta, ya que el amonio reduce la absorción de otros cationes, lo que

disminuye el pH del tejido (Fig. 21). Así, el cambio en el factor pH puede causar la

inactivación del Fe en la planta (Haynes y Gho, 1978), y también afectar al proceso de

67

fotosíntesis, desacoplando electrones y disminuyéndose la tasa fotosintética (Bloom et al.,

1997; Claussen y Lenz, 1999).

Figura 21. Diagrama de la disipación de los gradientes de pH. El lado izquierdo representa el estroma, matriz o citoplasma en donde el pH es alto; el lado derecho representa el lúmen, espacio intermembranoso, o vacuola en donde el pH es alto y la membrana representa el tilacoide, el interior mitocondrial, o la membrana de tonoplasto al cloroplasto, o la célula de la raíz, respectivamente. La red resulta de la reacción mostrada, entre la concentración de OH- en el lado izquierdo y la concentración de H+ en el lado derecho que se ha visto disminuida; esto provoca que el gradiente de pH se disipe (Bloom, 1997).

Tratamiento 2: MS suplementado con K+ (40 mM).

Las plantas a las que se aplicó el tratamiento con mayor concentración de K+ (40

mM), presentaron un crecimiento superior a las del tratamiento 1 (Fig.11). Sin embargo,

tampoco se obtuvo un desarrollo óptimo para que la planta sobreviviera. La producción de

biomasa siguió el mismo patrón que el tratamiento anterior con un mayor desarrollo de la

raíz que de la parte aérea, aunque con un mayor peso seco de la planta.

Es sabido que el proceso de fijación de amonio se da cuando algunos cationes como

Ca2+, K+, Mg2+ y Na+ son reemplazados por iones de NH4+, y la descompensación de este

tipo de cationes provoca daños en el sistema vegetal causando síntomas de toxicidad

(Santa-María et al., 2000). Así, también es importante el hecho de que la cinética de

absorción de NH4+ y de K+ son muy similares, por lo cual se ha deducido que la

concentración de K+ limita la absorción de amonio, permitiendo a la planta dosificar los

68

niveles de NH4+ y proporcionando mejor capacidad para el desarrollo en la planta

(Szczerba et al., 2008). Dentro de este contexto, se sustentan los resultados de mayor

cantidad de biomasa en el tratamiento con aplicación de K+, a diferencia del tratamiento

con sustitución de sales.

Tratamiento 3: MS suplementado con K (40 mM) y Mg (5 mM)

El desarrollo de la parte aérea y raíz de las plantas crecidas bajo en este tratamiento

presentó mejoras con respecto al tratamiento en el que únicamente fueron sustituidas las

sales, muy similar al tratamiento 2, pero con la diferencia de que en este caso se dio mayor

crecimiento en la parte aérea que en la raíz en la planta (Fig.12). Seguía existiendo necrosis

y cambio de color, y las plantas no lograron completar su desarrollo y murieron. Se sugiere

que la contribución que presenta la aplicación de magnesio al mayor desarrollo de la

biomasa de la parte aérea viene dado precisamente por la mejora que se da en el proceso

principal en las hojas de la planta: la fotosíntesis. Es conocido que el Mg2+ tiene muchas

funciones dentro del proceso fotosintético, ya que está relacionado con el control del

apilamiento de los tilacoides, formando parte además de las clorofilas. El bombeo de Mg2+

de los tilacoides hacia el estroma en presencia de luz sirve para activar la ribulosa-1,5-

bisfosfato carboxilasa (RuBisCO). También se conoce que muchas reacciones enzimáticas

requieren este catión como promotor (Portis y Heldt, 1976).

Dadas estas implicaciones en el proceso fotosintético, se podría explicar los

resultados obtenidos en la parte aérea (Fig.12). Algunos estudios también sustentan

resultados similares en ensayos con girasol, donde se estudian los efectos de las fuentes de

N nítrica y amoniacal y las interacciones del magnesio en varios procesos fisiológicos. Se

determinó una baja tasa fotosintética en plantas crecidas con NH4+ sin adición de Mg2+, no

así en plantas con suministro de este catión en donde se determinó una importante mejora

en el proceso fotosintético de la planta (Lasa et al., 2000).

69

Tratamiento 4: MS con L-Glutamina

Las plantas de A. thaliana crecidas con L-glutamina como fuente de N presentaron

gran desarrollo radical y aparentemente un mejor desarrollo general, y a pesar de presentar

clorosis en sus hojas, siendo varias de color amarillento, se disminuyó el número de hojas

rojizas y aumentó el número de hojas verdes (Fig.13).

La mayor producción de biomasa se explica por el hecho mencionado

anteriormente: se da como respuesta al estrés al que se encuentra sometida la planta por

tener otra fuente de N, lo que hace que exista mayor desarrollo radical como sumidero de

carbohidratos y generación de esqueletos carbonados para disponer el N absorbido

(Gerendás et al. 1997).

La contribución en el desarrollo de las plantas por parte de la L-glutamina viene

dada por el papel fundamental que juegan los aminoácidos en la absorción y metabolismo

del N. Como es conocido, la asimilación de N inorgánico en esqueletos carbonados

representa un proceso fisiológico de mucha importancia para el crecimiento vegetal y su

desarrollo. Esta asimilación se da mediante la formación de aminoácidos como la glutamina

(Gln) y la asparragina (Asn), que desempeñan un papel fundamental en el transporte de N

en la planta.

Se ha establecido que la asimilación primaria de NH4+ en aminoácidos se produce a

través de la acción de la glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (2-aminotransferasa

oxoglutarato, GOGAT). El paso inicial consiste en la aminación del glutamato a glutamina

por la GS, con la hidrólisis de ATP. La glutamina formada transfiere el grupo amido al 2-

oxoglutarato, dando lugar a dos moléculas de glutamato en una reacción catalizada por la

GOGAT. Las reacciones que catalizan estas enzimas se conocen como “ciclo GS-

GOGAT”, el cual es fundamental en el metabolismo del N en plantas (Lea y Miflin, 1980;

Esposito et al., 2005).

70

Como se puede ver en la figura 22 ya sea como nitrato o como amonio, mediante

varias reacciones enzimáticas dentro del ciclo GS-GOGAT, se da la incorporación de N a

compuestos carbonados generando aminoácidos lo cuales están disponibles dentro de la

planta.

Figura 22. Representación esquemática de la asimilación de nitrógeno. Los sistema enzimáticos son: a, nitrato reductasa; b, nitrito reductasa; c, glutamina sintetasa; d, glutamato sintetasa; e, transaminasa (Lea y Miflin, 1974).

De esta manera, se corrobora la mejora en la tasa de supervivencia (datos no

mostrados) de plantas con L-glutamina, ya que estaría actuando como una fuente de N de

fácil asimilación en la planta, donde el gasto de energía por ende sería menor y la planta

contaría con una fuente de N de absorción rápida. Se evitarían también los efectos tóxicos

ya mencionados generados por el NH4+ en la planta. Sin embargo, es necesario considerar

que tampoco se da un crecimiento normal y aún existe clorosis, lo cual descartando los

efectos de descenso de pH y desequilibrio iónico por el NH4+, podría ser un efecto generado

por deficiencia de N, ya que con la concentración aplicada no se alcanzarían los altos

niveles que A. thaliana requiere de este compuesto (10 mM respecto a 60 mM que es la

concentración total de N en el control MS en el cual se ha comprobado que su crecimiento

es óptimo).

71

Esto parece indicar que las plantas de A. thaliana requieren elevadas

concentraciones de NO3- para su crecimiento efectivo y las dosis de 1 y 5 mM amonio

podría resultar deficitarias. No está claro si también existe deficiencia en condiciones de

nutrición con Gln. En este sentido se realizó un experimento con la aplicación de 5, 10, 15

y 60 mM de Gln, en donde se determinó que la concentración con mejor respuesta en la

planta fue la de 10mM, sugiriendo que la concentración aplicada tiene efecto sobre el

crecimiento de las plantas.

Tratamiento 5y 6: Rigaud y Puppo (R y P) con sacarosa y sin sacarosa

Los tratamientos 5 y 6 son los que dentro del grupo de pruebas realizadas para

obtener un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de A. thaliana contienen una

composición diferente, como se puede observar en el apartado 4.5 de materiales y métodos;

y es precisamente según los resultados de biomasa y de morfología el que mejor resultados

presentó, ya fuese con o sin fuente de sacarosa. En el caso del tratamiento 5 correspondió a

medio Rigaud y Puppo sin aplicación de sacarosa y el tratamiento 6 el mismo medio pero

con suplemento de sacarosa (Fig. 14 y 15)

La comparación de los componentes de este medio de cultivo y el medio MS no

mostró mayores diferencias en cuanto a macro y micronutrientes. Sin embargo, la principal

particularidad del medio RyP es la sustitución del CaCl22H2O del medio MS por

CaSO4.2H2O, y con esta variante la concentración del Cl- en el medio es aproximadamente

del orden de tres veces menor, lo cual sugeriría que la contribución de este medio al

desarrollo, crecimiento y estado general de la planta viene dado por la menor concentración

de este compuesto, que se ha registrado puede ser perjudicial para las plantas generando un

estrés abiótico.

Se ha registrado que el cloro como tal tiene una serie de funciones no específicas en

la plantas en pequeñas cantidades, sin embargo, su aumento puede causar varios problemas

en los tejidos vegetales. Está estrechamente relacionado con el metabolismo del N ya que

72

se ha visto que los iones de Cl- pueden sustituir a los de NO3-, por lo tanto puede descender

la absorción de NO3- por la competencia de estos dos iones (Van der Boom et al., 1990).

La diferencia de componentes del medio de R y P basado en los efectos dañinos del

Cl- sugiere ser la razón por la que este medio contribuye a un mejor crecimiento y

desarrollo de A. thaliana.

El tratamiento 5 generó una mayor biomasa, siendo éste el que no contenía sacarosa.

No obstante, se escogió el medio que contenía sacarosa como óptimo, basado en el criterio

que ya se ha mencionado sobre la importancia de contar con un suministro importante de

compuestos carbonados que sirvan como esqueletos para facilitar el proceso de asimilación

de N en condiciones de nutrición amoniacal y adicionalmente porque en este tratamiento

las plantas pudieron completar su ciclo hasta la floración.

73

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

1.- Las plantas de Pisum sativum) y Arabidopsis thaliana crecidas en cultivo axénico

con NH4+ como única fuente de N muestran contenidos NO3

-, NO2-, y en su caso NH2OH

tanto en la parte aérea como en la raíz, lo cual demuestra la existencia de una vía oxidativa

de amonio hasta NO3-.

2.- Los datos de las reacciones químicas in vitro a partir de NH3- y de NH2OH

indican que ciertos niveles de NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no

enzimático aunque este efecto parece residual. Sin embargo, parece que la presencia de Fe-

proteínas induce la formación de estas especies de N oxidado, especialmente las mediadas

por compuestos como la xantina, la XOD y la FeSOD.

3.- El importante papel de la Hb I en la movilización y suministro eficiente de

oxígeno se evidenció al propiciar en reacciones in vitro junto con riboflavina la obtención

de NO2- a partir de NH2OH. También parece esencial la función de la FeSOD en esta

reacción.

4.- Las plantas de A. thaliana presentaron signos de sensibilidad al crecimiento con

NH4+ como clorosis, enrojecimiento, disminución del crecimiento y desarrollo. Sus hojas

fueron más pequeñas y su número disminuyó en la roseta formada por este tipo de especie y

la formación de raíz se vio aumentada con respecto al de la parte aérea, lo que sugiere que

esta especie no presenta tolerancia al NH4+.

5.- De los diferentes medios de cultivo testados se determinó que el medio Rigaud y

Puppo con sacarosa es el que mejor crecimiento reportó a la planta, sin embargo por la

sensibilidad de esta especie al NH4+ el desarrollo siempre se vio disminuido. Se dio una

mayor biomasa con 1mM de amonio por lo que se puede decir que la concentración de

5mM presenta mayor nivel de toxicidad en esta especie.

74

6.- Las plantas de Pisum sativum no presentaron dificultad para crecer en un medio

con presencia de NH4+ como única fuente de N en las condiciones ensayadas,

estableciéndose así exitosamente el cultivo in vitro sin que se afecte a su crecimiento y

desarrollo. No existieron diferencias entre el las concentraciones de 1 y 5 mM de amonio.

75

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