11

Dominguezia - Vol. 28(2) - 2012Fecha de recepción: 25 de octubre de 2012Fecha de aceptación: 22 de noviembre de 2012

Variación en la composición de polifenoles en Schinus longifolius (Lindl.)Speg. (Anacardiaceae) en respuesta a la infestación

por Cecidoses eremita Curtis (Lepidoptera-Cecidosidae)

Ignacio J. Agudelo y Rafael A. Ricco*

Cátedra de Farmacobotánica. Departamento de Farmacología.Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad deBuenos Aires. Junín 956 (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires. República Argentina.

*Autor a quien dirigir la correspondencia: raricco@ffyb.uba.ar.

Resumen

Schinus longifolius (Lindl.) Speg. (Anacardiaceae) es una especie empleada como expectorante y purganteen la medicina popular argentina. Es infectada por diversos insectos, como Calophya mammifex(Hemiptera:Psyllidae) y Cecidoses eremita Curtis (Lepidoptera - Cecidosidae), al promover la formación deagallas foliares y caulinares dentro de las cuales el insecto desarrolla su ciclo vital. El objetivo del trabajoabarca el estudio de las posibles variaciones del perfil de polifenoles asociados a la infestación por Cecidoseseremita de los tallos de Schinus longifolius. Se analizaron los fenoles totales, los taninos totales, lasproantocianidinas, los flavonoides totales y los ácidos hidroxicinámicos totales de los tallos sanos y de lasagallas caulinares de Schinus longifolius (Lindl.) Speg. (Anacardiaceae) infectado por Cecidoses eremitaCurtis (Lepidoptera–Cecidosidae). La agalla presenta una variación cuali-cuantitativa del perfil de polifenolesrespecto del tallo sano, y se determina aumento de los fenoles, taninos, flavonoides y ácidos hidroxicinámicos,y disminución en el contenido de las proantocianidinas respecto del tallo sano. Estos resultados tomanrelevancia cuando son analizados desde el punto de vista del control de calidad de una droga vegetal. Lapresencia de agallas produciría cambios en el perfil de los polifenoles, que se podrían ver acompañados deuna modificación en la actividad farmacológica esperada.

Variation in the polyphenols composition in Schinus longifolius (Lindl.) Speg.(Anacardiaceae) in response to infestation by Cecidoses eremita Curtis

(Lepidoptera-Cecidosidae)

Summary

Schinus longifolius (Lindl.) Speg. (Anacardiaceae) is a species used as expectorant and purgative in theArgentinian folk medicine. It is infected by various insects, as Calophya mammifex (Hemiptera: Psyllidae)and Cecidoses heremita Curtis (Lepidoptera - Cecidosidae), leading to the formation of leaf and stem gallswithin these the insect carries out its life cycle. The aim of this work includes the study of possible variationsin the polyphenol profile associated with infestation of Schinus longifolius stems by Cecidoses eremita.Total phenols, total tannins, proanthocyanidins, total flavonoids and total hydroxycinnamic acids of healthystems and galls of Schinus longifolius (Lindl.) Speg. (Anacardiaceae) infected by Cecidoses eremita Curtis

Palabras clave: agallas - Cecidoses eremita - polifenoles - Schinus longifolius.Key words: aalls - Cecidoses eremita - polyphenols - Schinus longifolius.

12

Agudelo y Ricco

(Lepidoptera–Cecidosidae) were analized. The galls present qualitative and quantitative changes in the pro-file of the polyphenolic compounds analysed regarding the healthy stem, with a higher content of totalphenols, tannins, flavonoids and hydroxycinnamic acids and a lower content of proanthocyanidins. Theseresults become significant when they are analyzed from the point of view of the quality control of a plantdrug. The presence of galls produce changes in the profile of polyphenols, which may be accompanied by achange in the expected pharmacological activity.

Introducción

Schinus longifolius (Lindl.) Speg. (Anacardiaceae)es un árbol originario de Sudamérica, muy comúnen la zona de las barrancas del delta del Paraná, yha sido mencionado como expectorante y purganteen la medicina popular argentina (Cabrera y Zardini,1978; Lahitte y col., 1998). El árbol es infectadopor diversos insectos galígenos, como Calophyamammifex (Hemiptera: Psyllidae) (Agudelo y col.,2013) y Cecidoses eremita Curtis (Lepidoptera -Cecidosidae).

Las agallas o cecidias son estructuras generadaspor un organismo inductor sobre un vegetal (Meyer,1987), que induce un crecimiento anómalo de laplanta. Esta formación le permite al insecto nutrirsey cumplir su ciclo vital. Se producen así fenómenosde hipertrofia e hiperplasia celular, que generan nosolo la estructura anómala antes mencionada, sinotambién cambios en la producción de metabolitossecundarios (Bronner, 1977; Shorthouse, 1986;Hartley y Lawton, 1992; Hartley, 1998; Stone ySchönrogge, 2003).

Las agallas se han utilizado desde tiemposancestrales como droga vegetal con propiedades as-tringentes, cicatrizantes, antidiarreicas, en el trata-miento de la disentería, en procesos inflamatorios yheridas, en enfermedades de la cavidad oral, gargan-ta y en el tratamiento de la hemorroide, entre otros(Khare, 2007). Los compuestos polifenólicos sonimportantes mediadores en las interacciones bióticasy abióticas de las plantas (Waterman y Mole, 1994),y tienen una especial importancia en la relación conlos insectos fitófagos, donde cumplen una funcióndefensiva (Waterman y Mole, 1994; Matsuki, 1996;Harborne y Williams, 2000; Simmonds, 2001, 2003).Dentro de los compuestos polifenólicos podemoscontar los taninos hidrolizables y condensados, losflavonoides y los ácidos hidroxicinámicos, deriva-dos del ácido cafeico (Quideau y col., 2011).

Se ha informado la presencia de fenoles tóxicosen la familia Anacardiaceae, los cuales serían unadefensa de la planta frente al ataque de insectos her-bívoros y hongos (Joel, 1980; Cojocaru y col., 1986;Mitchell, 1990).

Respecto de los estudios fitoquímicos previos alrealizado en este trabajo la información sobre loscompuestos polifenólicos de S. longifolius es muyescasa (Frontera y Tomas, 1994).

El objetivo del trabajo abarca el estudio de lasposibles variaciones del perfil de polifenoles aso-ciados a la infestación por Cecidoses eremita de lostallos de Schinus longifolius.

Materiales y métodos

Material vegetal

Se analizaron los tallos sanos y las agallascaulinares de seis ejemplares de Schinus longifoliusinfestados por Cecidoses eremita (Lepidoptera-Cecidosidae), recolectados en el barrio La Flori-da, Zárate, Provincia de Buenos Aires (febrero2011). Todos los ejemplares se encontraban en elmismo estado fenológico. Tanto los insectos comolas plantas fueron identificados por clavestaxonómicas (Cabrera y Zardini, 1978; Burckhardy Basset, 2000).

Los ejemplares de referencia (Serie 2012 / Nº 9;Serie 2012 / Nº 10) se encuentran depositados en elherbario del Museo de Farmacobotánica “JuanAníbal Domínguez” FFyB-UBA.

Obtención del extracto original metanólico (EOM)

Se partió de 200 mg de material seco y molido. Laextracción se llevó a cabo con 10 mL de metanolacuoso al 80 %, a temperatura ambiente, durante24 horas. Posteriormente se filtró y se descartó el

13

Dominguezia - Vol. 28(2) - 2012

marco. El extracto así obtenido (EOM) fue utiliza-do en todos los ensayos.

Análisis cualitativo de los polifenoles (fingerprintde polifenoles)

Fue realizado por medio de cromatografíasbidimensionales en capa delgada de celulosa (TLCy HPTLC), según la metodología estándar (Mabryy col., 1970, Markham, 1982).

Para el análisis bidimensional de los flavonoidesy los ácidos hidroxicinámicos se empleó el sistemade solventes TBA (terbutanol-ácido acético-agua,3:1:1) para la primera dimensión y ácido acético al15 % para la segunda dimensión. Los cromato-gramas se observaron a la luz ultravioleta (λ = 366nm) antes y después de ser expuestos a vapores deamoníaco. Posteriormente fueron revelados con elreactivo de productos naturales (NPR) (Wagner yBladt, 1996) y luego observados nuevamente a laluz ultravioleta de 366 nm.

Se obtuvo así el patrón de distribución de loscompuestos para el material en estudio que orienta-rá acerca de su composición cualitativa.

Cuantificación de los fenoles totales

Fueron determinados mediante el método de Folin-Ciocalteu de acuerdo con Makkar y col. (1993).

Alícuotas (50 µL) de los extractos fueron trans-feridas a tubos de ensayos y el volumen llevado a500 µL con agua desionizada. Se adicionaron a con-tinuación 250 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu y1,25 mL de solución acuosa de carbonato de sodioal 20 %. Luego de 40 minutos la absorbancia fuemedida a 725 nm. Se realizó una curva de calibra-ción con ácido tánico. Se empleó una solución ma-dre de concentración 0,1 mg/mL, abarcando un ran-go de 2-10 µg de ácido tánico en el volumen finalde reacción. El contenido de los fenoles totales fueexpresado como equivalentes de ácido tánico (mgácido tánico/g material seco). Todas las medicionesse efectuaron por triplicado.

Cuantificación de los taninos totales

El contenido de los taninos totales fue determina-do por el procedimiento de Folin-Ciocalteu, luegode remover los taninos mediante su precipitacióncon solución de seroalbúmina bovina (BSA) (bu-

ffer acetato 0,2 M pH 5,0; cloruro de sodio 0,17 My 1,0 mg/mL de fracción V de BSA. (Ricco y col.,2011): 1 mL de solución de BSA fue adicionado a1 mL de extracto. Luego de 15 minutos a tempera-tura ambiente, los tubos fueron centrifugados a5.000 rpm. Alícuotas del sobrenadante (50 µL) fue-ron analizadas según el procedimiento detalladopara los fenoles totales. Los valores obtenidos fue-ron restados de los correspondientes a los fenolestotales y se obtuvo el total de fenoles que se com-portan como taninos (taninos totales). El conteni-do de los taninos totales fue expresado como equi-valentes de ácido tánico (mg ácido tánico/g mate-rial seco). Todas las mediciones se efectuaron portriplicado.

Cuantificación de los taninos condensados (proan-tocianidinas, PA)

Los taninos condensados fueron determinadosmediante la reacción de la proantocianidina, se-gún el método descripto por Ricco y col., 2011.Alícuotas de 0,50 mL de los extractos fuerontransferidas a tubos de ensayos y se agregaron 3,0mL del reactivo butanol-HCl (butanol:HCl, 95:5V/V) y 0,1 mL de reactivo férrico al 2 % (2 %sulfato férrico-amónico en HCl 2 M). Los tubosfueron agitados y puestos en ebullición a bañoMaría durante 60 minutos. Luego de enfriarlos,se midieron las absorbancias a 550 nm contra unblanco. Las proantocianidinas se expresaron comoabsorbancia a 550 nm. Todas las mediciones seefectuaron por triplicado.

Cuantificación de los flavonoides totales

Alícuotas de 0,1 mL de cada extracto fueron adi-cionadas a 1,4 mL de agua desionizada y 0,50 mLdel reactivo de flavonoides (133 mg tricloruro dealuminio, 400 mg acetato de sodio en 100 mL desolvente constituido por 140 mL de metanol, 50mL agua, 10 mL de ácido acético). Luego de 30minutos a temperatura ambiente, la absorbancia fuemedida a 430 nm (Maksimovic y col., 2005). Serealizó una curva de calibración con rutina, quecubrió un rango de concentración entre 10 y 50µg/mL. El contenido de los flavonoides fue expre-sado como equivalentes de rutina (mg rutina/gmaterial seco). Todas las mediciones se efectua-ron por triplicado.

14

Agudelo y Ricco

Cuantificación de los ácidos hidroxicinámicos to-tales

Se determinó mediante una modificación de la me-todología descripta por Dao y Friedman (1992).Alícuotas de 50 µL de cada extracto fueron lleva-das a volumen (2 mL) con etanol absoluto. Se de-terminó la absorbancia a 328 nm. Se realizó unacurva de calibración con ácido clorogénico (solu-ción madre 1 mg/mL), que abarcó un rango de 5 -40 µg de ácido clorogénico en el volumen final dereacción. Los valores se expresaron como equiva-lentes de ácido clorogénico (mg de ácido cloro-génico/g material seco). Los ensayos se realizaronpor triplicado.

Análisis microscópico

Con el objeto de realizar una determinación preli-minar de la estructura de las agallas se realizarondisociados del material vegetal.

Partiendo de material fresco se realizarondisociaciones leves (NaOH 5 %) y fuertes (KOH 10% y ácido crómico 25 %). El método de disociadoleve consistió en someter el material vegetal a laacción de una solución acuosa de hidróxido de sodioal 5 %, durante 5 min, a ebullición. Luego se enfrióy se lavó el material disociado con agua destilada yse observó con el microscopio. El disociado fuerteconsistió en someter el material vegetal a la acciónde una solución acuosa de hidróxido de potasio,

durante 10 min, a ebullición. Se enfrió y se lavó conagua hasta la eliminación del hidróxido. Luego seagregó la solución de ácido crómico y se dejó ac-tuar por una hora. Se lavó posteriormente con abun-dante agua y se observó con el microscopio.

El disociado fue analizado mediante el empleode microscopía de campo claro. Se empleó un mi-croscopio Leitz-Wetzlar provisto de una cámaradigital Canon EOS Rebel.

Resultados

En el análisis del perfil cromatográfico bidimen-sional de los polifenoles se observa una variacióncuali-cuantitativa, determinada por un aumento deestos metabolitos en los extractos provenientes delas agallas jóvenes, cuando se los compara con losprovenientes de los tallos sanos. Puede observarsela presencia de dos grupos de compuestos principa-les: los flavonoides (compuestos amarillos y ana-ranjados) y los ácidos hidroxicinámicos (compues-tos celestes) (revelador: NPR y UV 366 nm) (Figu-ras 1A, 1B y 1C).

Estos resultados son concordantes con los pro-venientes del análisis cuantitativo, donde las con-centraciones de los fenoles totales, los taninos tota-les, los flavonoides totales y los ácidos hidroxi-cinámicos totales se ven aumentadas en los extrac-tos derivados de las agallas jóvenes respecto de lostallos sanos.

A: Perfil cromatográfico bidimensional de polifenoles para el tallo sano. Revelador: NPR - UV 366 nm (Foto digital,procesada); B: Perfil cromatográfico bidimensional de polifenoles para la agalla lignificada. Revelador: NPR - UV366 nm (Foto digital, procesada); C: Perfil cromatográfico bidimensional de polifenoles para la agalla verde. Revelador:NPR - UV 366 nm (Foto digital, procesada).

Figura 1.- Perfiles cromatográficos bidimensionales de polifenoles

A B C

15

Dominguezia - Vol. 28(2) - 2012

Una situación opuesta se presenta en el análi-sis de los taninos condensados (proantocia-nidinas), donde las agallas jóvenes presentan con-centraciones menores respecto de los tallos sa-

Figura 2.- Cuantificación de compuestos polifenólicos

nos. En el análisis de las agallas lignificadas sedeterminaron los niveles más bajos de todos loscompuestos polifenólicos analizados (Figuras 2A,2B, 2C, 2D y 2E).

A: Cuantificación de fenoles totales; B: Cuantificación de taninos totales; C: Cuantificación de proantocianidinas; D:Cuantificación de flavonoides totales; E: Cuantificación de ácidos hidroxicinámicos totales. Los resultados se expresancomo media ± desvío estándar.

A B

C D

E

16

Agudelo y Ricco

En lo que respecta a la estructura de la agalla,presenta una estructura formada principalmente poresclereidas isodiamétricas (Figuras 3A y 3B), teji-do parenquimático y tejido conductor, y no se ob-servó la presencia de tricomas en su epidermis, ele-mentos que sí se encuentran presentes en el tallosano (Figura 4).

Discusión

Si se realiza un análisis cuali-cuantitativo entre laagalla y el tallo sano, puede observarse que la aga-lla joven presenta mayor diversidad de compuestos(Figuras 1A y 1C) y mayores concentraciones defenoles, taninos totales, flavonoides y ácidoshidroxicinámicos respecto del tallo sano (Figuras2A, 2B, 2D y 2E).

Una situación antagónica se presenta al analizarlas proantocianidinas (taninos condensados), don-de la agalla presenta niveles inferiores respecto deltallo sano (Figura 2C).

Cuando se analizó la agalla caulinar lignificada,presentó los valores más bajos de fenoles totales yno se detectaron proantocianidinas, flavonoides niácidos hidroxicinámicos, y correspondió a una es-tructura fuertemente lignificada que ya ha cumpli-do su ciclo en el desarrollo del insecto (Figuras 1B,2A, 2B, 2C, 2D y 2E).

En el examen micrográfico la agalla presentaen su estructura un predominio de esclereidas (Fi-guras 3A y 3B), células de paredes gruesas y ligni-ficadas, que actuarían protegiendo al insecto decondiciones abióticas desfavorables (hipótesismicroambiental) (Cornell, 1983; Price y col.,1987; Blanche, 2000), como así también consti-tuiría una estructura de protección contra los ata-ques de los enemigos naturales (hipótesis del ene-migo) (Rossi y col., 1992; Zwölfer y Arnold-Rinehart, 1994; Abrahamson y Weis, 1997; Weis,1982; Stone y col., 2002). Se sumaría además elaumento de metabolitos polifenólicos en la aga-lla, compuestos frecuentemente involucrados enlos mecanismos de defensa química.

Si se comparan estos resultados con los obte-nidos para Calophya mammifex (Hemiptera-Psylloidea), puede determinarse un comporta-miento opuesto, donde la agalla producida porC. mammifex presenta menores concentracionesde fenoles, taninos, flavonoides y ácidos hi-droxicinámicos y mayor concentración de

Figura 4.- Tallo sano

Disociado leve. Tricomas tectores unicelulares yglandulares de pie uni-bicelular y cabeza pluricelular.(100x).

Figura 3.- Agalla

A: Disociado leve. Esclereidas. (100x); B: Agalla.Disociado fuerte. Esclereidas. (400x).

A

B

17

Dominguezia - Vol. 28(2) - 2012

proantocianidinas respecto de las hojas sanas(Agudelo y col., 2013). Si bien la agalla muestramenores concentraciones de taninos totales res-pecto de las hojas sanas, una gran parte de esostaninos corresponden a taninos condensados(proantocianidinas). La presencia de polifenolesde alto peso molecular en los tejidos de la agallaconstituiría una importante barrera de protecciónpara el insecto.

En el caso aquí analizado, la agalla inducidapor C. eremita carece de esta característica defen-siva en particular, donde esa función estaría me-diada por la alta concentración de los demásmetabolitos analizados.

Como se puede observar, los resultados obteni-dos difieren claramente según el insecto in-volucrado, evidencia experimental que muestra queesa interacción no es de tipo inespecífica, ya quela expresión de los polifenoles es diferente en cadacaso.

Por otro lado, es importante mencionar que dis-tintos insectos inducen a menudo agallas morfo-lógicamente diferentes en la misma planta y al mis-mo tiempo (Nyman y col., 2000; Stone y col.,2002).

Conclusión

La infestación de los tallos de Schinus longifoliuspor Cecidoses eremita produce importantes cambiosen el perfil de los polifenoles.

La dinámica de polifenoles de las agallas deSchinus longifolius no sería una respuesta general einespecífica de la planta a la infección por insectosgalígenos, dado que diferentes insectos originan di-ferentes respuestas.

Estos resultados toman relevancia cuando sonanalizados desde el punto de vista del control decalidad de una droga vegetal. Dado el empleo deesta especie como expectorante y purgante, las va-riaciones fitoquímicas observadas podrían traducirseen una modificación de la actividad farmacológicaesperada.

Agradecimientos

Este trabajo fue subvencionado por el proyectoUBACYT-20020100100459 (2011-2014).

Referencias bibliográficas

Abrahamson, W.G.; Weis, A.E. (1997). “Evolution-ary ecology across three trophic levels:goldenrod, gall makers and natural enemies” enMonographs in population biology. PrincetonUniversity Press: 3-13.

Agudelo, I.; Wagner, M.L.; Gurni, A.A.; Ricco, R.A.(2013). “Dinámica de polifenoles y estudioanatomo-histoquímico en Schinus longifolius(Lindl.) Speg. (Anacardiaceae) en respuesta a lainfección por Calophya mammifex (Hemiptera–Calophyidae)”. Boletín Latinoamericano y delCaribe de Plantas Medicinales y Aromáticas12(2): 162-175.

Blanche, K.R. (2000). “Diversity of insect-inducedgalls along a temperature-rainfall gradient in thetropical savannah region of the Northern territory,Australia”. Australian Ecology 25: 311–318.

Bronner, R. (1977). “Contribution à l’étudehistochimique des tissues nourriciers deszoocecidies”. Marcellia 40: 1-134.

Burckhard, D.; Basset, Y. (2000). “The jumpingplant-lice (Hemiptera, Psylloidea) associatedwith Schinus (Anacardiaceae): systematics,biogeography and host plant relationships”.Journal of Natural History 34: 57-15.

Cabrera, A.L.; Zardini, E.M. (1978). Manual de lasplantas de los alrededores de Buenos Aires. Edi-torial Acme. Buenos Aires: 1-755.

Cornell, H.V. (1983). “The secondary chemistry andcomplex morphology of galls formed by theCynipinae. Why and how?”. American MidlandNaturalist 110(1): 225-234.

Cojocaru, M.; Droby, S.; Glotter, E.; Goldman,A.; Gottlieb, H.E.; Jacoby, B.; Prusky, D.(1986). “5-(12-Heptadecenyl)-resorcinol, themajor component of the antifungal activity inthe peel of mango fruit”. Phytochemistry 25:1093-1095.

Dao, L.; Friedman, M. (1992). “Chlorogenic acidcontent of fresh and processed potatoes deter-mined by ultraviolet spectrophotometry”. Jour-nal of Agricultural and Food Chemistry 40:2152-2150.

Frontera M.A.; Tomás M.A. (1994). “Estudio Quí-mico de la planta Scbinus longifolius L.”. Ana-les de la Asoiación Química Argenina. 82(5):365-370.

Harbone, J.B.; Williams, C. (2000). “Advances in

18

Agudelo y Ricco

flavonoid research since 1992”. Phytochemistry55: 481-504.

Hartley, S.E.; Lawton, J.H. (1992). “Host-plantmanipulation by gall-insects: a test of thenutrition hypothesis”. Journal of Animal Ecology61(1): 113-119.

Hartley, S.E. (1998). “The chemical composition ofplant galls: are levels of nutrients and secondarycompounds controlled by the gall-former?”.Oecologia 113: 492-501.

Joel, D.M. (1980). “Resin ducts in the mango fruit:a defense system”. Journal of ExperimentalBotany 31: 1707-1718.

Khare, C.P. (2007). Indian Medicinal Plants. Ed.Springer-Verlag. Berlin/Heidelberg: 1-836.

Lahitte, H.B.; Hurrell, J.A.; Belgrano, M.L.;Jankowski, L.S.; Haloua, M.P.; Mehltreter, K.(1998). Plantas medicinales Rioplatenses.LOLA. Buenos Aires: 1-240.

Mabry, T.J.; Markham, K.R.; Thomas, M.B. (1970).The Systematic Identification of the Flavonoids.Springer-Verlag. Berlin and New York: 1-175.

Makkar, H.P.S.; Bluemmel. M.; Borowy, N.K.;Becker. K. (1993). “Gravimetric determinationof tannins and their correlations with chemicaland protein precipitation methods”. Journal ofthe Science of Food and Agriculture 61: 161-165.

Maksimovic, Z.; Malencic, D.; Kovacevic, N.(2005). “Polyphenol contents and antioxidantactivity of Mayadis stigma extracts”. BioreserchTechnology 96: 873-877.

Markham, K.R. (1982). Techniques of FlavonoidIdentification. Academic Press. London: 1-113.

Matsuki, M. (1996). “Regulation of plant phenolicsynthesis: from biochemistry to ecology and evo-lution”. Ausraliant Journal of Botany 44: 613-634.

Meyer, J. (1987). Plant Galls and Gall Inducers.Gebrüder Borntraeger (ed.). Berlin, Stuttgar: 291.

Mitchell, J.D. (1990). “The poisonous Anacardiaceaegenera of the world”. Advances in EconomicBotany 8: 103-129.

Nyman T.; Widmer, A.; Roininen, H. (2000). “Evo-lution of gall morphology and host-plant rela-tionships in willow-feeding sawflies (Hymenop-tera: Tenthredinidae)”. Evolution 54(2): 526-533.

Price, P.W.; Fernandes, G.W.; Waring, G.L. (1987).“Adaptive nature of insect galls”. Environmen-tal Entomology 16(1): 15-24.

Quideau, S.; Deffieux, D.; Douat-Casassus, C.;Pouységu, L. (2011). “Plant polyphenols: Chemi-cal properties, biological activities and synthe-sis”. Angewante Chemie International Edition50(3): 586-621.

Ricco, R.A.; Agudelo, I., Garcés, M., Evelson, P.,Wagner, M.L.; Gurni, A.A. (2011). “Polifenolesy actividad antioxidante en Equisetum giganteumL. (Equisetaceae)”. Boletín Latinoaericano y delCaribe de Plantas Medicinales y Aromáticas10(4): 325-332.

Rossi, A.M.; Stiling, P.D.; Strong, D.R.; Johnson,D.M. (1992). “Does gall diameter affect parasit-ism of Asphondylia borrichiae (Diptera:Cecidomyiidae)?”. Ecological Entomology 17:149-154.

Shorthouse, J.D. (1986). “Significance of nutritivecells in insect galls”. Proceedings of the Ento-mological Society of Washington 88: 368-375.

Simmonds. M. (2001). “Importance of flavonoidsin insect-plant interactions: feeding and ovipo-sition”. Phytochemistry 56: 451-252.

Simmonds, M. (2003). “Flavonoid-insect interac-tions: recent advances in our knowledge”. Phy-tochemistry 64: 21-30.

Stone, G.N.; Schönrogge, K.; Atkinson, R.J.;Bellido, D.; Pujade-Villar, J. (2002). “The popu-lation biology of oak gall wasps (Hynenoptera–Cynipidae)”. Annual Review of Entomology47: 633-668.

Stone, G.; Schönrogge, K. (2003). “The adaptativesignificance of insect gall morphology”. Trendsin Ecology and Evolution 18: 512-522.

Wagner, H; Bladt, S. (1996). Plant Drug Analysis.2nd Ed., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork: 362

Waterman, P.G.; Mole, S. (1994). Analysis ofPhenolic Plant Metabolites. Blackwell Sci-entific Publications (ed.). Cambridge, MA,USA: 45-65.

Weis, A.E. (1982). “Use of a symbiotic fungus bythe gall maker Asteromyia carbonifera to inhibitattack by the parasitoid Torymus capite”. Ecol-ogy 63: 1602-1605.

Zwölfer, H.; Arnold-Rinehart, J. (1994). “Parasitoidsas a driving force in the evolution of the gall sizeof Urophora on Cardueae hosts” en Plant Galls:Organisms, Interactions, Populations. Williams,M.A.J. (ed) Clarendon Press: 245-257.