CIENTIFICAInvestigaciónVolumen 6, número 2 enero–julio 2012, issn 1870–8196

Contenido de polifenoles y actividad antioxidante de

extractos de siempreviva

julio cÉsar mÁrQuez rosales marisol galvÁn valencia

sergio m. durÓn torres virginia flores morales

Unidad Académica de Ciencias QuímicasUniversidad Autónoma de Zacatecas

Correo–e: galvanmisol@yahoo.com

CIENTIFICAInvestigación

2

Resumen

Sedum praealtum dC (siempreviva) es una planta con propiedades analgésicas, antiinflamatorias y anti-conceptivas, probablemente vinculadas con el con-tenido de compuestos polifenólicos. En el presente estudio se utilizaron hojas de siempreviva de una planta adulta cultivada en Zacatecas, de la que se obtuvieron jugo, extracto etanólico y cinco fraccio-nes orgánicas. Mediante técnicas espectrofotométri-cas se evaluó el contenido total de polifenoles (Fo-lin–Ciocalteu) y la capacidad antioxidante (ca) por comparación de los métodos de dpph• y abts•+. El antioxidante de referencia, representativo de los po-lifenoles fue el ácido gálico. Es importante mencio-nar que en todos los métodos empleados se encon-tró una relación entre el contenido de polifenoles y la ca de las muestras analizadas, en las que el jugo presentó la velocidad de neutralización y los valores más altos de ambos parámetros.

Palabras clave: plantas medicinales, polifenoles, dpph•, abts•+.

Abstract

Sedum praealtum dC locally known as siempreviva is popularly used to treat general inflammatory pro-cesses, as an analgesic and contraceptive, probably these properties are related to phenolic compounds content. For the present investigation juice, crude ethanolic extract and five organic fractions were obtained from fresh leaves from siempreviva. The leaves were collected from an adult plant that is grown at Zacatecas. The content of total phenolics in the samples was determined spectrometrically according to the Folin–Ciocalteu procedure and calculated as gallic acid equivalents. The methods dpph• y abts•+ were compared for measuring anti-oxidant activity. The present study demonstrates the correlation between the high phenolic content and antioxidant activity of Sedum praealtum juice. Refer-ence antioxidant polyphenols was gallic acid. It is noteworthy that in all methods found a relationship between the polyphenol content and the ca of the

samples, in which the juice had the neutralization rate and the highest values of both parameters.

Key words: medicinal plants, polyphenols, dpph•, abts•+.

Introducción

Sedum praealtum, comúnmente conocida como siempreviva, es una planta silvestre utilizada con fines de ornato y en la medicina tradicional mexi-cana por sus propiedades antiinflamatoria, analgé-sica y anticonceptiva, para tratar enfermedades de los ojos, erupciones cutáneas y de regeneración de tejidos [1]. En un estudio previo de caracterización cualitativa por cromatografía en capa fina, se iden-tificaron los principales metabolitos secundarios presentes en las hojas de arbustos de siempreviva cultivados en el estado de Zacatecas. La siempreviva contiene una gran variedad de compuestos, de los cuales destacan alcoholes, compuestos carbonílicos, flavonoides, glicósidos, alcaloides y azúcares libres y aminoácidos [2]. La actividad de esta planta medici-nal en la prevención y cura de enfermedades se atri-buye a la capacidad antioxidante de sus compuestos polifenólicos. Éstos son un grupo amplio de molé-culas anfipáticas cuya acción antioxidante se debe a sus características redox que les permiten actuar como agentes reductores, donadores de hidrógeno, neutralizadores de oxígeno singlet y quelantes de metales [3]. Existen una variedad de métodos ana-líticos empleados en la cuantificación de polifeno-les totales y la actividad antioxidante de productos naturales; de ellos, se prefieren los métodos espec-trofotométricos porque son sencillos, rápidos y eco-nómicos.

El objetivo de este trabajo fue cuantificar el contenido de compuestos fenólicos en extractos de hojas de siempreviva y correlacionarlo con la capacidad antioxidante a través de dos métodos es-pectrofotométricos: dpph• (2.2–diphenyl–1–picryl-hydrazyl) y abts•+ (2.2′–azinobis sulfonato 3–ethyl-benzothiazoline 6), cuyas condiciones de reacción fueron estandarizadas.

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Materiales y métodos

Preparación de la muestra

En la preparación, las hojas frescas de siempreviva (144 g en 200 ml de etanol al 96 por ciento) fueron maceradas durante un mes, en el que se mantuvo agitación constante y una atmósfera libre de oxígeno gracias a la incorporación de N

2. El extracto se filtró

y concentró en un rotavapor (buchi r–300) e inme-diatamente se liofilizó (2.5 Liter Freeze Dry System, labconco). Parte del liofilizado se utilizó para cargar una columna cromatográfica, empacada con anterio-ridad con silica gel 60HF

254 (J.T. Backer) y solvatada

con una mezcla de hexano–acetato de etilo. Al variar la proporción de hexano–acetato de etilo desde 4:6 v/v hasta 100 por ciento de acetato de etilo se obtu-vieron cinco fracciones orgánicas. Luego, se eluyó la columna con etanol con la intención de recuperar la sexta fracción. Cada fracción fue concentrada en un rotavapor y se liofilizó para su uso posterior. También se obtuvo el jugo de las hojas frescas de siempreviva con un extractor comercial, se filtró y se liofilizó [2]. Después, se prepararon soluciones de cada extracto y fracción. Debido a la diferente solubilidad de las muestras se usaron como disolventes etanol, acetona y agua, con los que se prepararon soluciones en una concentración de 1 mg/ml para cada ensayo espec-trofotométrico.

Determinación de polifenoles totales

Fue evaluado el contenido de polifenoles por el mé-todo de Folin–Ciocalteu (fc) [4]. 200 μl de la mues-tra en solución se mezclaron con 1 ml del reactivo fc (Sigma–Aldrich) diluido 1:10 en agua destilada y 800 μl de una solución de carbonato de sodio al 7.5 por ciento. El tubo de reacción fue incubado dos horas en obscuridad. La absorbancia medida en un espectrofo-tómetro (6405 uv–Vis jenway) fue de 760 nm. Como referencia se empleó ácido gálico, por tanto, los resul-tados se expresaron como equivalentes de ácido gálico (mg ml–1).

Ensayo de la capacidad neutralizadora del radical 2,2–Diphenyl–1–picrylhydrazyl (dpph•)

La técnica fue aplicada de acuerdo con lo propuesto por Schlesier y colaboradores [5]. En un inicio se pre-paró una solución 2.4 mg del reactivo dpph (Sigma–Aldrich) en metanol para formar el radical dpph•. La absorbancia máxima se observó a los 515 nm y la actividad antioxidante de las muestras fue evaluada en función de su disminución. Para el ensayo espec-trofotométrico, 1.95 ml de la solución del radical dpph• fueron mezclados con 50 μl de la muestra pro-blema y se tomaron lecturas a 515 nm cada cinco mi-nutos hasta que la variación en la absorbancia fuera ≤0.003 unidades/min. Cada medición se realizó por triplicado y el porcentaje de inhibición del radical dpph• se calculó mediante la siguiente fórmula [5]:

%𝐴𝐴𝐴𝐴=( )𝐴𝐴 ∙

0 − 𝐴𝐴 ∙𝑓𝑓

𝐴𝐴 ∙0 𝑥𝑥 100 DPPH DPPH

DPPH

En cada muestra de siempreviva la velocidad de neutralización del radical dpph• se evaluó al corre-lacionar el porcentaje de aa en función del tiempo hasta tener lecturas de absorbancia constantes.

Ensayo de la capacidad neutralizadora del radical catión 2,2–azinobis (3–ethylbenzothiazoline–6–sul-fonic acid) (abts•+) y persulfato de potasio

También para este procedimiento se siguieron los postulados de Schlesier y colaboradores [5, 6], en el que la solución del radical abts•+ (Sigma–Aldrich) se preparó en agua desionizada a una concentración de 7 mM y K

2O

8S

2 a 2.45 mM. Se emplearon entre 16

y 24 hrs en la incubación de la mezcla en la obscuri-dad y a temperatura ambiente. Más tarde, se efectuó un estudio de estabilidad del radical abts•+ en fun-ción del pH del medio de disolución; las soluciones usadas fueron agua, buffer de fosfatos (10 mM pH 7.4) y buffer de acetatos (20 mM pH 4.5). Al inicio se midió la absorbancia de la solución del radical y dos horas después (punto final de la reacción), con el propósito de observar la degradación del radical abts•+. En las mediciones espectrofotométricas, la

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4

solución con el radical abts•+ fue diluida en agua hasta obtener una absorbancia 0.700 + 0.020 a 734 nm; en contraste, para el tubo control se colocaron 1 ml de la solución del radical abts•+ y 20 μl del solvente de la muestra y se tomó lectura tras dos ho-ras. En el ensayo espectrofotométrico se emplearon 1 ml de la solución del radical abts•+ más 20 μl de la muestra problema. En este caso las lecturas de absorbancia se llevaron a cabo a los 30, 60 y 120 minutos a 734 nm. A fin de calcular el porcentaje de neutralización del radical abts•+ se utilizó la misma fórmula que en el ensayo del radical dpph•.

Resultados y discusión

Polifenoles totales

Dentro del ensayo de Folin–Ciocalteu en un medio alcalino ocurre la transferencia de electrones desde los compuestos fenólicos y otras especies reducto-ras al molibdeno (por ejemplo, aminas aromáticas y ácido ascórbico), las cuales forman complejos az-ules que se detectan con el espectrofotómetro entre 750–765 nm; de manera que si no se eliminan las in-terferencias se recomienda sustituir el término «con-tenido fenólico total» por el de «capacidad reductora total» [7]. De acuerdo con lo anterior y debido al hecho de que el jugo presentó los valores más altos en la prueba de Folin–Ciocalteau (0.1304 mg ml–1

equivalentes de ácido gálico, lo que representa el 13.04 por ciento del peso de la muestra) se estaría val-orando la capacidad reductora total, ya que el jugo puede contener compuestos interferentes (como el ácido ascórbico) y no se efectuó ningún proceso de purificación en él; mientras que para las fracciones, particularmente F3 y F4, aplicaría el término conte-nido fenólico total (figura 1).

figura 1

y = 11.501x + 0.027R² = 0.9997

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Abs

orba

ncia

(760

nm

)

Ácido gálico (mg ml–1)

Curva de calibración de ácido gálico utilizado como compuesto polifenólico estándar en la prueba de Folin–

Ciocalteau. En el inserto se muestran los valores promedio del contenido de polifenoles ± D.S. en las muestras de siempreviva obtenidos por interpolación en el gráfico.

Actividad antioxidante (dpph• y abts•+)

Para la cuantificación de la actividad antioxidante de productos naturales se usan con frecuencia los méto-dos dpph• y abts•+. En ese sentido, es preciso tener en cuenta las diferentes condiciones del ensayo de abts•+ que se reportan en diversas investigaciones: agente químico/enzimático que genera el radical abts•+ (dióxido de manganeso, aaph, persulfato de potasio, metmioglobina y peroxidasa de rábano), tiempo de reacción (minutos y horas), longitud de onda en la detección (abts•+ tiene máximos de abs-orción a 414, 645, 734 y 815 nm), antioxidante de ref-erencia (trolox, ácido ascórbico, ácido gálico) y pH del medio de disolución en el que ocurre la reacción [5, 6]. Las condiciones de reacción dentro del método abts•+ fueron optimizadas en función de la estabili-dad del radical abts•+. En la figura 2 se presenta el estudio de estabilidad a tres valores de pH de la solu-ción de reacción durante dos horas. Como puede ob-servarse, en solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4 el radical es menos estable y la absorbancia inicial disminuye en más de un 20 por ciento después de 90 minutos de reacción. Por el contrario, en medio ácido y agua la degradación del radical es mínima (3.14 y 1.3 por ciento). Respecto a la longitud de onda de detección, las lecturas se realizaron a 734 nm, ve-

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locidad que minimiza la absorbancia de interferentes y la turbidez [7].

figura 2

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Porc

enta

je d

e D

egra

daci

ón

Tiempo (min)

ABTS (Agua)

ABTS (PBS)

Del estudio de estabilidad se determinó el porcentaje de

degradación del radical abts+ en función del tiempo, utilizando

tres medios de disolución a pH neutro (7.4 y 4.5).

Una vez identificadas las condiciones de la solución y el tiempo de reacción, se midió la actividad anti-oxidante de las muestras de siempreviva mediante la lectura de absorbancia a los 30, 60 y 120 minutos, con el fin de tener plena seguridad de los resultados obte-nidos. Los valores encontrados por ambos métodos se presentan en la tabla 1, mientras que la figura 3 expone la correlación entre los dos. Cabe destacar que dicha correlación, para las mismas muestras, fue adec-uada (r2 = 0.9688).

tabla 1porcentaje de la actividad antioxidante determinada

para cada una de las muestras de siempreviva analizadas

por los métodos dpph• y abts•+

Muestradpph

Porcentaje de aa

abts

Porcentaje de aa

Jugo 70.85 94.20

E. Etanólico 2.89 4.10

F1 0.42 3.51

F2 0.78 3.67

F3 23.41 17.09

F4 12.27 15.42

F5 3.09 6.87

figura 3

y = 1.2719x + 0.033R² = 0.9688

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Porc

enta

je

AA

del r

adic

al

AB

TS

Porcentaje AA del radical DPPH

Correlación entre los valores del porcentaje de la actividad antio-

xidante (% aa) de las siete muestras de siempreviva evaluadas por

los métodos de dpph• y abts•+.

Con el método de dpph• se evaluó la velocidad de neutralización del radical de las siete muestras de siem-previva (figura 4). En el extracto etanólico (fracciones 1, 2 y 5) se presentaron las velocidades de neutrali-zación menores, que alcanzaron su máximo desde los primeros cinco minutos y se mantuvieron constantes los quince minutos en que transcurrió la neutrali-zación. Con dichas muestras fue neutralizado ≤3 por ciento de radical dpph•. De igual modo, durante los primeros cinco minutos la fracción 4 neutralizó cerca del 12 por ciento del radical dpph, cifra constante en los quince minutos en que la reacción fue observada. La fracción 3, como se aprecia en la figura 4, alcanzó una velocidad de neutralización del 20 por ciento en los primeros cinco minutos, posteriormente su ve-locidad decreció, entre los 20 a 25 minutos llegó a su máximo y se mantuvo estable hasta los 35 minutos en que se terminó el ensayo. Por último, el jugo presentó una neutralización rápida >50 por ciento del radical dpph• en los primeros cinco minutos y continuó au-mentando a una velocidad menor hasta el minuto 30, en que llegó a una meseta con un máximo del 70 por ciento de neutralización hasta el final del estudio (45 minutos).

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figura 4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Porc

enta

je

AA

del r

adic

al

DPP

H

Tiempo (min)

Jugo

E. Etanólico

F1

F2

F3

F4

F5

Estudio cinético de la capacidad de neutralización de los extractos y fracciones de siempreviva por el método de

dpph•.

Correlación entre ensayos

Se elaboró un análisis de regresión para correlacionar los resultados obtenidos del ensayo de Folin Ciocal-teau y la capacidad antioxidante por los métodos del dpph• y abts•+ (figura 5). Al medir la capacidad an-tioxidante los dos métodos correlacionaron de forma significativa el contenido de polifenoles (r2 = 0.9857 en abts•+ y r2 = 0.9741 en dpph•). El jugo de siempreviva y las fracciones orgánicas 3 y 4 tuvieron los niveles de polifenoles más altos correlacionados con la mayor ca-pacidad de neutralización de los radicales generados artificialmente.

figura 5

y = 562.43x - 1.3199R² = 0.9741

y = 731.11x - 2.1369R² = 0.9857

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140

Porc

enta

je A

A

Equivalentes de Ácido Gálico (mg ml - 1)

DPPHABTS

Análisis de correlación lineal entre los ensayos de Folin–Ciocalteau y de actividad antioxidante (dpph• y abts•). En

ambos la correlación fue altamente significativa.

Conclusiones

La capacidad antioxidante de extractos de plantas no sólo depende de su composición química sino de las condiciones de los ensayos utilizados. Existen nu-merosos métodos publicados para medir in vitro la ca-pacidad antioxidante total. Los ensayos basados en la transferencia de electrones miden la capacidad de un antioxidante para reducir un oxidante, el cual cambia de color cuando se reduce y ese cambio se correlacio-na con la concentración de antioxidantes en la mues-tra. Los ensayos de Folin–Ciocalteau, dpph• y abts•+ entran en esa clasificación. Ninguno de ellos es sufi-ciente, más bien es necesario corroborar la capacidad antioxidante de un extracto por varios métodos. En este estudio se determinó el contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante de extractos y fracciones orgánicas obtenidos de la planta medicinal Sedum praealtum; para ello se emplearon las técnicas Folin–Ciocalteau, dpph• y abts•+, cuyo mantenimiento y uso son sencillos, no requieren de equipos costosos y los tiempos para los ensayos son adecuados. Todos esos parámetros los convierten en una opción ideal en el análisis de rutina. Además, un punto impor-tante en su implementación es la reproducibilidad de los resultados. Dentro de esta investigación todos los estudios fueron realizados por triplicado y, una vez controladas las variables de las soluciones de reac-ción, la variación intra ensayos fue mínima. Por otro lado, los métodos de dpph• y abts•+ dieron resulta-dos comparables de la capacidad antioxidante de los extractos y fracciones de siempreviva. La correlación entre concentración de compuestos polifenólicos en los extractos de la planta y su capacidad para neu-tralizar un radical fue altamente significativa, lo que explica la actividad terapéutica que se le atribuye a la siempreviva.

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