Validación del estudio de mutaciones somáticas en el gen EGFR mediante PCR digital

C. Pérez-Barrios, M. Barquín Del Romo, M. Colmena, L. González, A. Martínez-Rodríguez, M. Turpín, M. Provencio, A. Romero

Hospital Universitario Puerta de Hierro

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

EGFR -> TKIs

INTRODUCCIÓN

Estudio del ADN circulante en cáncer de pulmón avanzado

1. Identificación de pacientes candidatos a terapias dirigidas

2. Monitorización del tratamiento

3. Valor pronóstico

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OBJETIVOS

OBJETIVOS

1. Realizar la validación analítica de 4 ensayos Taqman® para el estudio de mutaciones en el gen EGFR a partir de ADN circulante.

2. Realizar un estudio de intercomparación de los resultados.

- p.L858R (AHRSRSV). - p.E746_A750delELREA (AHLJ0XO). - p. G719S (AH0JEWC). - p.T790M (AHRSROS).

Falta de protocolos

Guías de armonización ICH Guidelines: “Validation of analytical procedures”:

- Limit of Quantification (LOQ).

- Limit of detection (LOD).

Falta de programas de calidad externos

Implantación de la técnica

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MATERIAL Y MÉTODOS

Cálculo de LOD y LOQ

La extracción de ADN circulante se realizó con el sistema Maxwell® RSC ccfDNA Plasma kit.

Se realizaron 4 curvas patrón a partir de líneas celulares puras (1%, 0,5%, 0,1%, y 0,05%).

Las muestras fueron después analizadas en un sistema QuantStudio® 3D Digital PCR System.

Intercomparación

Se realizó el estudio de estas mutaciones en 15 muestras de ADN circulante previamente analizado por un laboratorio externo.

La concordancia entre laboratorios se evaluó mediante el coeficiente Kappa de Cohen.

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RESULTADOS

Cálculo de LOQ y LOD

p.E746_A750delELREA p.G719S p.L858R p.T790M LOQ 0.45% 0.13% 0.20% 0.26% LOD 0.15% 0.04% 0.07% 0.08%

Mutación R2

p.E746_A750delELREA 0,978

p.G719S 0,999

p.L858R 0,996

p.T790M 0,995

p.L858R p.T790M

0,1%

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RESULTADOS

Se obtuvieron resultados concordantes en 14 de las de las 15 muestras analizadas (93.33%).

El índice kappa obtenido fue 0,763 (IC95%: 0,3-1), indicando una buena concordancia entre ambos laboratorios.

Intercomparación

LABORATORIO 1

LABORATORIO 2

positivos negativos positivos 12 1 negativos 0 2

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CONCLUSIONES

1. Los ensayos Taqman® RareMutation AHRSROS, AHRSRSV, AHLJ0XO y AH0JEWC para el sistema QuantStudio® 3D Digital PCR System han sido validados para el estudio de mutaciones somáticas en el gen EGFR a partir de ADN circulante, con un límite de detección de 0,1%.

2. Los estudios de intercomparación entre laboratorios suponen una buena alternativa cuando no se dispone de programas de calidad externos.

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AGRADECIMIENTOS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017