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Los activadores del plasminógeno, tiposurocinasa (u-AP) y tisular (t-AP), son se-rinproteasas cuya principal acción bioló-gica consiste en convertir el plasminóge-no inactivo en plasmina1-2. El tipo tisulares una glucoproteína de 70 kDa, sintetiza-da por las células endoteliales de los va-sos sanguíneos, cuyo principal efectobiológico es la fibrinólisis y la trombólisis.En su molécula pueden evidenciarse doscadenas (pesada y ligera) que permitensu acción biológica3, ejerciendo en ella unimportante papel la citoqueratina 84. Sudosificación sérica puede ser de interésen el diagnóstico y seguimiento de la en-fermedad de Graves, algunas hepatopatíasy retinopatía diabética y para evaluar latendencia a la trombosis y el riesgo de al-teraciones cardíacas en sujetos sometidosa hemodiálisis.En el ámbito tisular, Gris et al5 constata-ron una expresión similar de ambos acti-vadores en todos los tumores pulmona-res, excepto en los de células grandes,donde la del tipo urocinasa fue variable.Especial interés ofrecieron los dos inhibi-dores de los activadores del plasminóge-no (PAI-1 y PAI-2), cuya expresión oscilónotablemente y en muchos casos fue ne-gativa, lo cual parece reflejar la importanciafisiopatológica de todos los componentesdel sistema del activador del plasminóge-no. Heidtmann et al6 demostraron que to-das las líneas celulares de tumores nomicrocíticos producían activadores delplasminógeno y/o sus inhibidores, mien-tras que ello no ocurría en las derivadasde mesoteliomas y carcinomas de célulaspequeñas. Es interesante resaltar que al-gunas estirpes celulares los producen es-pontáneamente, mientras que otras sólolo hacen tras determinados estímulos.Robert et al7 comprobaron que la expre-sión de PAI-2 se correlacionaba con laausencia de invasión ganglionar, lo cualevidenciaba su papel en la progresión deestos tumores8, mientras que la del PAI-1lo hacía con el u-AP, reflejando mayoragresividad. Salden et al9, tras estudiar88 carcinomas pulmonares no microcíti-cos y 74 muestras normales, describie-ron mayores concentraciones de u-AP,

ORIGINALES

Utilidad de la determinación del activador del plasminógeno tipo tisular citosólico en el adenocarcinoma de pulmón

Álvaro Ruibal, Matilde Isabel Núñez, Mari Carmen del Ríoa, Jesús Rodríguezb

y José Feliciano Álvarez de Linerab

Laboratorio de Biología Tumoral Fundación Jiménez Díaz. Departamento de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. aFacultad de Ciencias de la Salud. Universidad Alfonso X el Sabio. Villanueva de la Cañada. Madrid.bServicio de Cirugía Torácica. Hospital Central de Asturias. Oviedo.

Correspondencia: Dr. A. Ruibal Morell.Laboratorio de Biología Tumoral FJD. Departamento de Medicina Nuclear.Fundación Jiménez Díaz. Avda. Reyes Católicos, 2. 28040 Madrid.

Recibido el 30-8-2001; aceptado para su publicación el 28-2-2002.

FUNDAMENTO: Estudiar el comportamiento del activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP) cito-sólico en adenocarcinomas pulmonares y sus posibles correlaciones con otros parámetros clini-cobiológicos.MATERIAL Y MÉTODO: El grupo de estudio incluyó 59 muestras tisulares de adenocarcinomas pul-monares y 16 de tejido normal de los mismos pacientes. El t-AP fue determinado mediante unenzimoinmunoanálisis (EIA) (Boehringer-Mannheim, Alemania). Se determinaron asimismo lasconcentraciones citosólicas de CA125, catepsina D, pS2, ácido hialurónico (AH), subunidadbeta de la hormona gonadotrófica coriónica, y enolasa específica neuronal, así como las del re-ceptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína oncogénica erbB2/neu, AH,CD44s, CD44v5 y CD44v6 en las membranas celulares. Otros parámetros considerados fueronlos siguientes: estadio clínico, grado histológico, ploidía y fase de síntesis celular (FS).RESULTADOS: En los adenocarcinomas, las concentraciones citosólicas de t-AP oscilaron entre0,1 y 14,6 ng/mg de proteína (mediana, 1,4) y fueron inferiores, pero sin significación estadís-tica, a las observadas en las muestras de pulmón normal (intervalo, 0,1-18,6; mediana, 2,95ng/mg de proteína). Asimismo, las concentraciones de t-AP disminuyeron conforme se incre-mentaba el estadio clínico, siendo superiores en el estadio I frente al II-III (p = 0,080) y frenteal III (p = 0,0622). No se constataron diferencias significativas en las concentraciones de laproteasa cuando el grado histológico, ploidía y FS fueron considerados. Los tumores con cifrasaltas de t-AP (> 3,7 ng/mg de proteína, que representan el percentil 75 de todo el grupo) cur-saron con menores concentraciones de CA125 (p = 0,015) y proteína erbB2 (p = 0,087).CONCLUSIONES: Los resultados anteriores apuntan a que el t-AP citosólico se relaciona inversa-mente con el estadio clínico en el adenocarcinoma de pulmón, sin que podamos precisar su in-terés como indicador pronóstico.

Palabras clave: Activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP). Citosol. Adenocarcinomaspulmonares.

Usefulness of cytosolic tissue-type plasminogen activator levels in lungadenocarcinomas

BACKGROUND: We aimed at studying the behavior of cytosol tissue-type plasminogen activator (t-PA) levels in lung adenocarcinomas and their correlation with other clinical and biologicalparameters.MATERIAL AND METHOD: t-PA cytosol levels were determined using EIA (Boehringer Mannheim.Germany) in 59 samples of lung adenocarcinoma and in 16 samples of normal lung tissue fromthe same patients. Cathepsin D, CA125, pS2, hyaluronic acid (HA), free beta subunit of cho-rionic gonadotropin hormone and neuron specific enolase (NSE) cytosol concentrations weredetermined. We also determined the concentrations of HA, erbB2 oncoprotein, epidermalgrowth factor receptor (EGFR), CD44s, CD44v5 and CD44v6 in cell surfaces. The following parameters were considered: clinical stage, ploidy, cellular S-phase fraction and histologicalgrade.RESULTS: In adenocarcinomas, t-PA cytosol levels ranged from 0.1 to 14.6 ng/mg prot. (median,1.4). These levels were lower than those in normal lung tissue (r, 0.1-18.6; median, 2.95ng/mg prot.) but did not reach statistical significance. On the other hand, t-PA concentrationsdecreased as the clinical stage increased and were higher in stage I than stage II-III (p =0.080) and stage III (p = 0.0622). No significant differences of t-PA levels were observedwhen the histological grade, ploidy and S-phase were considered. Adenocarcinomas with hight-PA values (> 3.7 ng/mg prot., representing the 75th percentil of the whole group), had lowerCA125 (p = 0.015) and erbB2 oncoprotein (p = 0.087) concentrations.CONCLUSIONS: These results suggest that cytosol t-PA levels are negatively correlated with tumorsize in lung adenocarcinomas. However, the usefulness of t-PA as a prognostic factor needs tobe clarified in further studies.

Key words: Tissue-type plasminogen activator (t-PA). Cytosol. Lung adenocarcinomas.

42.482

su receptor y ambos inhibidores en aqué-llos, sin que ello se asociase con una sig-nificación pronóstica.Menos conocido es el comportamientodel t-AP en los tumores pulmonares, don-de se ha descrito un descenso de susconcentraciones frente al tejido normal10,fenómeno opuesto al observado con losotros componentes del sistema11. Por ellohemos querido estudiar en este trabajosus concentraciones en los citosoles deadenocarcinomas de pulmón y correlacio-narlas con otros parámetros clinicobiológi-cos que pueden ser de ayuda para carac-terizar dichas neoformaciones malignas.

Material y métodoEl grupo de estudio incluyó 59 muestras de adeno-carcinomas pulmonares pertenecientes a 37 varonesy 22 mujeres de edades comprendidas entre 36 y 77(mediana, 64 años), y 16 muestras de tejido pulmo-nar normal procedentes de aquellos pacientes.Las muestras tisulares fueron limpiadas de sus com-ponentes grasos, congeladas y almacenadas en nitró-geno líquido hasta su homogeneización. Ésta se reali-zó en un buffer (TRIS 0,1 M, EDTA Na2 0,015 M,glicerol al 10%, monotioglicerol al 0,01%, pH 7,5) yen frío mediante un microhomogeneizador (OMNI1000, Waterbury, CT, EE.UU.), después las muestrasfueron centrifugadas a 1.500 rpm durante 10 min;posteriormente el sobrenadante se sometió a una ul-tracentrifugación a 100.000 g durante 1 hora a 4 oC,obteniéndose un nuevo sobranadante (citosol) y unprecipitado (membranas). El t-AP fue dosificado me-diante un enzimoinmunanálisis de Boehringer Mann-heim (Alemania), expresándose los resultados, comotambién el de los otros parámetros biológicos, por mi-ligramo de proteína (mg prot.), utilizando para ello elmétodo de Bradford. A nivel tisular el límite inferiorde sensibilidad del t-AP fue de 0,1 ng/mg prot. Deter-minamos además, las concentraciones citosólicas dela pS2 (IRMA-CIS, Francia), catepsina D (IRMA-CIS.Francia), ácido hialurónico (RLA-Pharmacia, Suecia),CA125 (IRMA-CIS, Francia), enolasa específica neu-ronal (NSE) (IRMA-CIS, Francia) y subunidad beta li-bre de la hormona gonadotrófica coriónica (HCGb)(IRMA-CIS, Francia), así como las de ácido hialuróni-co, proteína oncogénica erbB2/neu (EIA, Oncogene,EE.UU.), CD44s (EIA, Bender Diagnostica, Austria),CD44v5 (EIA, Bender Diagnostica, Austria), CD44v6(EIA, Bender Diagnostica, Austria) y receptor del fac-tor de crecimiento epidérmico (EGFR) (RLA, Vienna-lab, Austria) en las membranas celulares. Los dinte-les de positividad para el CD44s, CD44v5 y CD44v6fueron 80, 3 y 5 ng/mg prot., respectivamente. Tam-bién hemos considerado el estadio clínico, ploidía,fase de síntesis celular (ambas determinadas por ci-tometría de flujo en muestras en fresco [Fascam,Becton Dickinson, EE.UU.]) cuando fue posible y elgrado histológico. El análisis estadístico se realizómediante el programa BMDP3 y, como los factoresbiológicos no siguieron una distribución normal, he-mos empleado pruebas no paramétricas, y la de la χ2

para la comparación de proporciones, con la correc-ción de Yates si era necesaria. Los resultados se con-sideraron estadísticamente significativos cuando elvalor de p fue inferior a 0,05.

Resultados

En los 59 adenocarcinomas, las concen-traciones de t-AP oscilaron entre 0,1 y14,6 ng/mg prot. (mediana, 1,4) y fueronmenores, pero sin significación estadísti-ca, a las observadas en 16 muestras detejido pulmonar normal de los mismospacientes (intervalo, 0,1-18,6; mediana,2,95 ng/mg prot.). Tal como se puedeobservar en las tablas 1 y 2, los valores

de t-AP disminuyeron conforme aumen-taba el estadio clínico, siendo superioresen el estadio I frente a II-III (p = 0,080) y el III (p = 0,062). No se constataron di-ferencias en las concentraciones de laproteasa cuando el grado histológico (Ifrente a III), ploidía (diploides frente aaneuploides) y fase de síntesis celular(mayor del 7% frente a menor del 7,1%,y mayor del 14% frente a menor del 14,1%) fueron considerados. Cuando los ade-nocarcinomas fueron clasificados en fun-ción de un dintel de positividad de 3,7ng/mg de proteína (percentil 75 de todoel grupo tumoral), observamos que loscasos t-AP positivos presentaban meno-res concentraciones de CA125 (p =0,015), así como una tendencia a meno-res valores de proteína oncogénica erbB2que rozaron la significación estadística (p= 0,087).

Discusión

Al contrario de lo que ocurre con el u-AP,el t-AP ha sido menos estudiado en lostejidos tumorales. En los cánceres de co-lon, Raigoso et al12 han descrito mayoresconcentraciones en la mucosa normalque en los tumores colorrectales, aso-ciándose altas cifras con un peor com-portamiento clínico12, mientras que Ga-nesh et al13 resaltan el papel del sistemadel activador del plasminógeno en la car-cinogénesis colorrectal. En los melano-mas esta proteasa es reflejo de un peorpronóstico14, mientras que en los tumo-res de mama constituye un factor debuena evolución independientemente delestadio, el grado, la afección axilar y losreceptores esteroides2,15,16 y un indicadorde la hormonodependencia que se rela-ciona activamente con la pS217.Diferentes estudios parecen evidenciar laimportancia del sistema del activador delplasminógeno en la fisiopatología de loscarcinomas pulmonares, especialmenteno microcíticos. En líneas celulares decáncer de pulmón, se ha visto que lasmetastásicas expresan mayores concen-traciones de u-AP, su receptor (uAP-r) ymenores de t-AP y el inhibidor PAI-2,mientras que no se constataron diferen-cias en las concentraciones del inhibidorPAI-118. En los adenocarcinomas pulmo-nares estudiados las concentraciones ci-tosólicas de t-AP fueron inferiores a lasobservadas en las muestras normales delos mismos pacientes, pero sin apreciar-se diferencias estadísticamente significa-tivas entre ambos grupos. Similares con-clusiones han sido descritas por otrosgrupos10,11, si bien debemos resaltar queno todos los métodos empleados para

RUIBAL A, ET AL. UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TIPO TISULAR CITOSÓLICO EN EL ADENOCARCINOMA DE PULMÓN

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TABLA 1

Distribución de las concentracionescitosólicas del activador delplasminógeno tipo tisular en losadenocarcinomas pulmonaresclasificados en función de diferentesparámetros clinicobiológicos

Parámetro Número Intervalo Mediana

Estadio I* 32 0,1-14,6 2,1Estadio II 8 0,1-8,2 1,1Estadio III* 19 0,1-10,0 0,6GH1 9 0,1-11,2 2,2GH2 24 0,1-8,2 1,0GH3 26 0,1-14,6 2,5Diploides 6 0,1-14,6 1,6Aneuploides 42 0,1-11,2 1,55Fase S > 7% 33 0,1-11,2 1,7Fase S ≤ 7% 26 0,1-14,6 1,4Fase S >14% 19 0,1-8,2 1,3Fase S ≤ 14% 40 0,1-14,6 2,1

*I frente a III: p = 0,06219. GH: grado histológico.

TABLA 2

Distribución de los valores de los diferentes parámetros clinicobiológicos en losadenocarcinomas pulmonares clasificados en función de la positividad o no delactivador del plasminógeno tipo tisular citosólico

t-AP > 3,7 ng/mg de proteína(14) t-AP < 3,71 (45)Parámetro

Intervalo Mediana Intervalo Medianap

ErbB2a 171-117.750 2.497 656-20.590 3.438 0,087CA125 1,0-334 32,8 1,0-9.225 134 0,015Fase S 1,4-28,7 9,9 1,2-26,7 12,8 NSTamañod 1,5-7,5 4,5 2,0-10,0 4,0 NSEGFRe 0,9-128 25,1 1,8-97,8 21,4 NSCATDf 2,5-142 77,4 24,7-295 66 NSpS2+b 0,1-293 0,4 0,1-98,4 0,1 NSAHcitosolb 894-5.310 2.780 695-21.290 3.029 NSAHmembranab 159-2.862 911 50-4.622 983 NSHCGbb 0,01-78,3 0,05 0,01-8,9 0,03 NSNSEb 56,7-579 244 26,8-1.004 285,5 NSGH3 9/14 17/45 NSAneuploides 8/10 34/38 NS> 3 cm 10/14 35/45 NS> 5 cm 3/14 9/45 NSFase S > 7% 7/9 26/35 NSFase S > 14% 3/9 16/35 NSCD44s+b 10/14 32/45 NSCD44v5+b 6/14 21/45 NSCD44v6+b 6/14 28/45 NS

aNHI/mg de proteína; bng/mg de proteína; cU/mg de proteína; dcm; efmol/mg de proteína; fpmol/mg de proteínaAH: ácido hialurónico; NS: no significativo.

evidenciar el valor del t-AP son equipara-bles en sus resultados19. Mediante estu-dios inmunohistoquímicos, Nakstad y Ly-berg20 describen una negatividad para elt-AP en los adenocarcinomas, siendosólo positivo el endotelio. Este comporta-miento del t-AP podría explicar que altasconcentraciones en tumores pulmonaresfueran el reflejo de una situación celular«normal» y se asociaran con mejorescomportamiento y evolución. Nosotroshemos observado que las concentracio-nes de t-AP eran superiores en el estadioI frente al II-III y frente al III, rozándose lasignificación estadística, pero no consta-tamos diferencias cuando fueron consi-derados el grado histológico, la ploidía yla proliferación. Al clasificar los adenocar-cinomas en función de la positividad parael t-AP, tomando como dintel la cifra de3,7 ng/mg prot., que representa el per-centil 75 de todo el grupo, observamosque los casos positivos cursaron con me-nores concentraciones de CA125 (p =0,015) y de proteína erbB2, que rozaronla significación estadística (p = 0,087). ElCA125 es un marcador cuya principalaplicación clínica es en los tumores nomucinosos de ovario21, si bien puede uti-lizarse en otros como los de endometrio ypulmón, especialmente adenocarcino-mas y de células grandes. Por otro ladose ha observado que sus concentracio-nes tisulares son mayores en los adeno-carcinomas que en los carcinomas esca-mosos de pulmón, que se correlacionancon las séricas, las cuales aumentan conla pérdida de diferenciación celular y quese comportan como un factor pronóstico,de tal modo que valores superiores a 26 U/mg prot. reflejan menores intervalolibre de enfermedad y supervivencia glo-bal22-25. En relación con el oncogénerbB2/neu, se ha descrito su alteración enel 38% de los adenocarcinomas, compor-tándose como una factor pronóstico inde-pendiente de mala evolución y comporta-miento26,27, siendo su efecto aditivo conlas mutaciones en K-ras28. En líneas celu-lares pulmonares (H460), la sobrexpresiónde este oncogén se asoció con una mayorsecreción de urocinasa, lo cual podría ex-plicar una mayor agresividad y progresióntumoral29.Los resultados anteriores muestran que lasconcentraciones citosólicas de t-AP en losadenocarcinomas pulmonares tienen unatendencia a correlacionarse inversamentecon el estadio tumoral. Sin embargo, suposible valor como factor pronóstico nece-sita una evaluación posterior, pues se co-

rrelacionan negativamente con ciertos indi-cadores (CA125 y c-erbB2), pero no conotros factores (fase S, ploidía, grado histo-lógico) que sí parecen incidir en la evolu-ción ulterior de aquellas neoformaciones.

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