producciÓn de proteÍnas recombinantes en cÉlulas de...
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES EN CÉLULAS DE
MAMÍFEROS
• En 1986 el activador de
plasminógeno tisular humano
(tPA, Activase; Genentech USA)
fue la 1er proteína terapeútica
proveniente de células de
mamífero en ser aprobada para
la venta.
• Más del 70 % de las proteínas
recombinantes terapeúticas de
las farmaceúticas son producidas
en células de mamíferos
EXPRESIÓN DE GENES EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Producción de proteínas biofarmaceúticas
Baeshen et al. Microbial Cell Factories 2014, 13:141
US sales of top nine classes of biologic drugs in 2011. Adapted from Aggarwal et. al
Recent advances in mammalian protein production. Ashok D. Bandaranayake1 and
Steven C. Almo. FEBS Lett. 2014 January 21; 588(2): 253–260.
Nature Biotech. Vol 22, 11, 2004
21 días
Mejoramiento en 20 años
¿Cómo se mejoró la producción en estos años?
Mejoramiento de:
Vectores
Ingeniería de la célula huésped
Desarrollo de medios de cultivo
Métodos de screening
Desarrollo e ingeniería de procesos
EXPRESIÓN
ESTABLE
TRANSITORIA
EXPRESIÓN DE GENES ESTABLE
Integración del gen de interés en genoma por
recombinación no homóloga
Ubicación aleatoria
Líneas celulares: CHO (Chinese hamster ovary)
NSO (mouse myeloma)
BHK (baby hamster kydney)
HEK-293 (human embryo kidney)
Lineas celulares usadas para producir glicoproteínas por industrias farmaceúticas
Adaptado de Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells
Marie-Eve Lalonde, Yves Duroche. Journal of Biotecnology, 2017
Células CHO
Se adaptan y crecen en suspensión
Pocos virus humanos se propagan en ellas
Pueden crecer en medio libre de suero y medios
químicamente definidos
Modificaciones postraduccionales
Funcionan varios sistemas de amplificación génica
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
Fosfato de calcio, DEAE dextran (transit), polietileneimina
Electroporación
Liposomas
Bombardeo con partículas
Microinyección
La linearización de los plásmidos mejora la eficiencia de la transfección estable
Fosfato de calcio: precipita con el ADN
Polietileneimina: polímero catiónico
DEAE dextran: polímero catiónico
ENDOCITOSIS
ELECTROPORACIÓN
LIPOSOMAS
Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun
John A O'Brien and Sarah C R Lummis Nature Protocols 1, 977 - 981
(2006)
BIOLÍSTICA
MICROINYECCIÓN
VECTORES
Origen de replicación bacteriano
Marcador de selección bacteriano
Promotor para mamíferos y elementos regulatorios
Señal de terminación de la transcripción y poliadenilación
Marcador de selección para células de mamíferos
AGENTES DE SELECCIÓN
DHFR: dihidro folato reductasa
GS: glutamina sintetasa
ANTIBIÓTICOS: G418, puromicina,
higromicina
El gen de selección y el gen recombinante pueden estar en el mismo vector o en vectores separados
Para aumentar la chance de obtener líneas celulares altamente productoras el gen de selección puede estar bajo un promotor débil
DHFR: convierte DHF en THF, requerido en
síntesis de glicina, purinas y timidina
Células: CHO DHFR-
Medio de selección: sin hipoxantina, timidina, ni
glicina
Amplificación génica: METOTREXATE (MTX)
AMPLIFICACIÓN
GÉNICA CON MTX
El gen de la DHFR se amplifica
cuando las células son sometidas al
metotrexate (mecanismo de
resistencia)
Metotrexate
αMEM, FCS dializado
Clonado: dilución límite
CLONADO DE CÉLULAS RESISTENTES
2. Clonado por dilución límite
1. Aislamiento con cilindros
GLUTAMINA SINTETASA
Células: varias, NSO (murina), CHO K1, ambas con
baja actividad de GS
Medio de selección: sin glutamina
Amplificación génica: METIONINA SULFOXIMINA
(MSX)
Método más rápido que DHFR
Glufosinato: herbicida. Inhibe a GS,
causa aumento de NH4 que
envenena a las plantas
PROMOTORES y enhancers
Virales: CMV. MPSV (myeloproliferative sarcoma
virus), SV40, AdMLP (adenovirus major late promoter)
Celulares: EF Iα (factor de elongación α), βactina
Regulables: tetraciclina
El transporte citoplasmático y la traducción eficiente del RNAm en eucariotas depende del splicing, por lo tanto agregar al menos 1 secuencia intrónica entre el promotor y el ADNc
VECTORES BI CISTRÓNICOS
INTERNAL
RIBOSOME
ENTRY SITE
expresión balanceada de genes
IRES
marcador de selección
Para aislar células
productoras x FACS
Expresión estable
Sistema de expresión regulada en células de mamíferos
ON: cumermicina OFF: novobiocina
Sistema para expresión transitoria y estable
Elemento regulatorio pos transcripcional
WOODCHUCK: WPRESecuencia presente en región 3´ no traducida (3´UTR) del virus de
hepatitis B
Su presencia mejora la expresión genética a nivel post transcripcional
modificando: poliadenilación, exportación y/o traducción.
Matrix attachment regions: MARsSecuencias del ADN en donde la cromatina se une a la matriz nuclear.
Zonas transcripcionalmente activas, asociadas con hiperacetilación de
histonas.
Ubiquitous Chromatin Opening element: UCOE
Isla CpG libre de metilación que anula los efectos dependientes del sitio
de integración (insulator) y mantiene la cromatina ‘’abierta’’…mayor
transcripción
MEJORAMIENTO DE LA PRODUCTIVIDAD
ESPECÍFICA DE LAS LÍNEAS CELULARES
Método de transfección/cantidad de plásmido
transfectado ??
Aumentando la rigurosidad de la presión de
selección: altas dosis de MTX en células DHFR-
transformadas con DHFR reducción de nº de
líneas celulares a examinar
Pero, altas dosis de drogas crecimiento lento de
las células
Atenuación del marcador de selección
Mutación del gen para reducir su actividad
uso de codones
promotor débil
Modulación de la expresión desestabilización del ARNm: sec. ARE (rica en AU)
desestabilización de la proteína: sec. PEST
atenuación de IRES
PEST sequences and regulation by proteolysis Martin Rechsteiner and Scott W. Rogers TIBS 21 - JULY 1996
Regiones ricas en P, E/D, S y T flanqueadas por aa básicos
presentes en proteínas de vida media corta. Están en enzimas
claves de control metabólico, ciclinas, proteínas quinasas y
fosfatasas, factores de transcripción
Ingeniería celular
Generación de líneas celulares con mayor
productividad y supervivencia: transformación
con proto oncogenes, genes reguladores del ciclo
celular, genes de factores de crecimiento (ej.
IGFI), genes antiapoptóticos.
Expresión de fosfatasa alcalina, junto con p27 y bcl-xl. Vector tricistrónico inducible
Optimización del
medio de cultivo
Medios de cultivo de
composición definida
Cultivos sin suero
Medios libres de suero
Suplementos: transferrina
factores de crecimiento: insulina/ IGF1
hidrolizados (animales, levaduras, plantas)
albúmina
Problemas: adaptación celular
velocidad de crecimiento reducida
menores rendimientos
MEJORAMIENTO DE SCREENING
PARA DETECTAR LAS MEJORES
PRODUCTORAS
La células en suspensión pasan en “fila india” y son
iluminadas por un rayo láser. La luz dispersada o la
fluorescencia emitida (si fueron marcadas con un
fluorocromo) es colectada, filtrada y convertida a valores
digitales que son guardados en una computadora
Citometría de Flujo
Técnica analítica que mide propiedades de células
suspendidas en un fluido
MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA
DETECTAR LAS MEJORES PRODUCTORAS
Métodos basados en FACS: fluorescense activated
cell sorting = citofluorometría de flujo
Extensión de la citometría de Flujo
Permite la separación física de poblaciones celulares
seleccionadas, para luego utilizarlas en diferentes
ensayos.
Luego del análisis, el fluído es separado en una serie
de gotas.
Aquellas gotas que contengan las células de interés,
son electrostáticamente cargadas y desviadas hacia
un receptáculo.
FACS
FACS
Coexpresión del gen de interés (GI) con GFP, células
seleccionadas por fluorescencia de GFP
Coexpresión del GI con una proteína de superficie
que puede ser marcada por un anticuerpo específico
fluorescente
Incubación de células transformadas con DHFR con
MTX fluorescente
Para aislar células
productoras x FACS
ClonePix
Selector de colonias automático
Se cultivan las células en medio semi sólido para formar colonias
individuales
Los clones mejores productores son aspirados
y transferidos a una nueva placa
Cell Xpress
Identifica y purifica las células mejores productoras.
Lisis foto mecánica de las células que producen poco
ESTABILIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA
RECOMBINANTE
Silenciamiento génico: reducción o eliminación de la
transcripción del gen
Mayor determinante: estructura de la cromatina en el sitio
de integración (hipoacetilación de histonas, metilación de H3, aumento de
la metilación CpG del promotor) heterocromatinización
Las líneas celulares candidatas deben ser cultivadas
durante varios meses sin presión de selección
Experiencia con CHO-DG44: sin presión de selección
½: silenciamiento en días
1/3: silenciamiento gradual en 6 meses
15-25%: estables sin selección
Hacker et al, Biotech. Advances, xxx, 2009
ESTRATEGIAS PARA EVITAR EL SILENCIAMIENTO
LCR (locus control region): segmento de ADN que controla la
estructura de la cromatina aumentando la expresión de genes
ligados, de manera tejido específica, dependiente del nº de copias e
independientemente de la posición
Insulators: elementos regulatorios de la transcripción que modulan
la interacción entre enhancers y promotores y protegen a los genes
del silenciamiento por cromatina adyacente de manera tejido
independiente
Bloqueo de desacetilación de histonas: butirato, ac. Valproico
Inhibidores de ADN metil transferasas: azacitidina.
“Gene targeting”: dirigir inserción a zonas de eucromatina
Barras: células que expresan IL2R, promedio de 10 líneas celulares estables
(blancas: 1 copia del gen , negras: multicopia)
La presencia del insulator cHS4 βglobina protege la expresión
del transgen en el tiempo
Methods in Molecular Biology, vol 267: Recombinant Gene Expression
Recombinación sitio-específica
Recombinasas fago P1: cre lox
Saccharomyces cerevisiae: flp FRT (Flp recombination target)
fago λ: λ integrasa attP y attB (irreversible)
“Genomic hot spot”
Mammalian Chromosome Engineering: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 738, 2011
Integración dirigida
ZFN: Zn finger n.
Endonucleasas TALENS: transcription activator-like effector n.
Meganucleasas
Cortan secuencias específicas de ADN se favorece la integración de genes
por recombinación homóloga
CRISPR
Cromosomas artificiales: tecnología ACE
Fundamentalmente secuencias repetitivas, ADN satélite, ricas en AT
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 21
Cromosomas artificiales: tecnología ACE
Transferencia de cromosomas a otras líneas celulares
Aislamiento de los ACEs por citometría de flujo. Tinción diferencial
con Hoescht 33258 (AT) y cromomicina-A3 (GC).
Cultivos celulares para producción
Células adheridas
microcarriers
Roller bottles
Células en suspensión
Adaptación de las células a crecer en suspensión
Transformación de células en suspensión
Desarrollo de bioprocesos en escala pequeña, “scale down”
Spinner flask
Volúmen min. 50 ml. Densidad celular 2-3 10 6 cel/ml
TubeSpin reactors
Tubos ventilados de 50 ml . Se alcanzaan
densidades celulares > 107 cel/ml en 5-20 ml
SimCell technology
EXPRESIÓN DE GENES TRANSITORIA
¿Para qué?
• Verificar la identidad del gen clonado por la
expresión de una actividad
• Probar efecto de mutaciones sobre la actividad de
una proteína
• Aislar genes de una biblioteca por la expresión de
una actividad
• Ahorrar tiempo y dinero
CÉLULAS COS: African green monkey cells
transformadas con virus SV40 defectuoso en el origen
de replicación. Producen el antígeno T grande pero no
partículas virales.
Vector: ori de SV40, 10.0000 a 100.000 copias/célula.
CÉLULAS WOP: células de ratón 3T3 transformadas
con virus polioma defectuoso en el origen de replicación.
Producen ag. T grande pero no partículas virales.
Vector: ori de polioma.
Supresor ambar: Se propaga en E. coli que contiene el plásmido helper P3
que tiene mutaciones ambar en gen de R a tetraciclina y ampicilina
EXPRESIÓN TRANSITORIA
Células COS
Expresión transitoria: 2 sitios de clonado
CÉLULAS COS
No introducen fucosas.
En algunos casos la
glicosilación es pobre
EXPRESIÓN TRANSITORIA A GRAN ESCALA
• Período: 1-14 días post transfección en cultivos en
suspensión.
• Células: CHO y HEK-293 (human embryonic kidney)
Sistemas episomales: HEK-293 T (Ag T SV40), HEK-293
EBNA (Ag virus Epstein Barr), CHO-T (Ag T Py).
• Desarrollo de vectores para expresión episomal
(producen el Ag T)
• Volúmen hasta 2008: 100 l.
• Ahorro de tiempo y $: no hay selección
• En HEK293: se llegó hasta 1 g/l en 14 días (2008)
• No hay proteína de uso terapeútico aprobada hasta
el momento….???
• Transfección: fosfato de calcio, polietileneimina,
DEAE dextrano o electroporación. Eficiencia: > 70 %
• Infección viral: alfavirus, adenovirus, vaccinia.
Estrategias para aumentar la expresión
Sobre expresar proteínas anti apoptóticas: bcl2,bcl-x
Detener el ciclo celular: agentes anti mitóticos
conchicina, vinblastina, etc o genéticamente con
inhibidores del ciclo celular p21,p18, 27
Agregar factores de crecimiento: FGFa, IGF
Inhibidores de ADN metil transferasas y de histonas
deacetilasas (ácido valproico, butirato)
