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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
MODALIDAD: (INVESTIGACIÓN)
TEMA:
COMPROBACIÓN DEL EFECTO CICATRIZANTE DE LOS EXTRACTOS
ETANÓLICO DEL CLADODIO DEL NOPAL (Opuntia ficus indica L) EN
RATONES DE EXPERIMENTACIÓN.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITOPREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACEUTICO
AUTORES:JENNIFER JOANA GARCÍA DELGADO
THAILÍ ANNABELL PONCE BELTRÁN
TUTOR:Q.F MARIA DEL CARMEN VILLACRES Ph.D
CO-TUTOR:Q.F GLENDA SARMIENTO M.Sc
GUAYAQUIL - ECUADOR
2017
AGRADECIMIENTO
Gracias a Dios por sus bendiciones, y haberme dado el don de la vida, quien
permitió darme sabiduría para lograr alcanzar esta meta.
Agradecida con mis padres por su apoyo incondicional, por demostrarme que
nada es fácil en la vida todo lo bueno merece sacrificio y constancia diaria.
A mi tía María Beltrán por acompañarme en mis primeros años de estudio.
A mi Tutura: Dra. María del Carmen Villacres por sus acertados soportes
académicos en la fase total de mi tesis.
A la Dra. Glenda Sarmiento por ayudarme en el Análisis Farmacológico.
A la Dra. Patricia Manzano por su aporte en el Análisis Cromatográfico.
Al Dr. Oswaldo Pesantes por su gentileza de facilitarme el ingreso al Laboratorio
de Productos Naturales.
A la Dra. Zoraida Burbano por apoyarme en el Análisis del Control de Calidad.
A mí compañera de Tesis Jennifer García por compartir sus valiosos
conocimientos para el desarrollo de nuestro trabajo gracias por ser una gran
amiga. A mi compañero Luis Proaño por ayudarme en la parte de experimentación.
Thailí Ponce Beltrán
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por abrirme puertas y oportunidades para llegar a este momento
de mi carrera. A mis padres por apoyo en todo momento, a mi esposo e hijos por
la motivación diaria. A mi tutora Dra Maria del Carmen Villacres y mi co-tutora la
Dra Glenda Sarmiento por los conocimientos otorgados y por estar siempre
prestas a ayudarnos. Al INSPI por la ayuda brindada para la realización de la tesis,
y a los laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas que nos permitieron la
realización de los ensayos.
Jennifer García Delgado
DEDICATORIA
Como siempre, primero Dios, todos mis logros son gracias a las fuerzas y
sabiduría con la que me levanta cada día, por protegerme en cada paso y
mantenerme firme en mis sueños, por ello este momento es dedicado a Él.
A mi madre, mujer luchadora, a mi padre, hombre ejemplar, ambos con su apoyo
constante me han llevado a donde estoy ahora, confiando en mí en cada paso,
animándome a salir adelante, enseñándome los valores necesarios.
A mi esposo, amor de mi vida, por su apoyo incondicional desde el primer
momento hasta el sol de hoy, por sus deseos de verme exitosa y salir adelante
juntos, por su paciencia infinita que me ha permitido llegar a este punto en mi
carrera.
A mis hijos, Román y Mateo, motor de mi vida, razón para salir adelante, se lo
dedico a ellos por los días y noches de ausencia. A la señora Rosa Macías que
fue parte fundamental para lograr mi objetivo.
A personas que me han ayudado en este proceso, mi compañera Thaili Ponce,
amiga de verdad, que siempre entendió mis responsabilidades y se ajustó a mi
tiempo, además a mis amigos, Luis Proaño, Juliana Lema, que de una u otra forma
siempre han estado para ayudarme.
Jennifer García Delgado
DEDICATORIA
Dedico esta tesis con mucho amor a Dios, por la vida y por permitirme
cumplir uno de mis objetivos propuestos.
A mi querida madre Libia Beltrán por ser el pilar fundamental en mi vida,
gracias por tu dedicación y ejemplo, eres la madre que todo hijo desearía
tener que afortunada me siento de ser tu hija nunca me cansare de
agradecerte lo buena que eres te amo. A mi padre Alberto Ponce por estar
siempre apoyándome en cada decisión que he tomado. A mi tía María a
quien quiero como una madre y siempre ha estado pendiente de mí. A mi
abuelita Noemí Rodríguez por ser quien me motiva a nunca rendirme.
Thailí Ponce Beltrán
ÍNDICE
RESUMEN............................................................................................................ I
ABSTRACT ......................................................................................................... II
CAPITULO I......................................................................................................... 1
I. INTRODUCCIÓN.......................................................................................... 1
I.1 PROBLEMA.................................................................................................... 2
I.2 HIPÓTESIS .................................................................................................... 4
I.3 OBJETIVOS ................................................................................................... 4
I.3.1 Generales................................................................................................. 4
I.3.2 Específicos............................................................................................... 4
CAPITULO II........................................................................................................ 5
II. MARCO TEÓRICO....................................................................................... 5
I.1 Nopal..................................................................................................... 5
II.1.1 Descripción taxonómica.................................................................. 5
II.1.2 Taxonomía ..................................................................................... 5
II.1.3 Habitad........................................................................................... 6
II.1.4 Actividad farmacológica.................................................................. 7
II.1.5 Composición química ..................................................................... 9
II.1.5.1 Piel.............................................................................................. 10
II.1.5.2 Cáscara ...................................................................................... 10
II.1.5.3 Pulpa .......................................................................................... 11
II.1.6 Usos Étnomedicinales ....................................................................... 12
II.2 Cicatrices ................................................................................................. 13
II.2.1 Definición........................................................................................... 13
II.2.2 Clasificación del proceso de cicatrización .......................................... 13
II.2.3 Proceso de cicatrización .................................................................... 14
CAPITULO III..................................................................................................... 16
III. METODOLOGÍA ..................................................................................... 16
III.1 Tipo de investigación y técnica................................................................ 16
III.2 Variables de la investigación ................................................................... 16
III.2.1 Variable dependiente ........................................................................ 16
III.2.2 Variable independiente ..................................................................... 16
III.2.3 Variable interviniente ........................................................................ 16
II.2.4 Operacionalización de las variables................................................... 17
III.3 Desarrollo de la parte experimental ......................................................... 18
III.3.1 Recolección de la especie vegetal .................................................... 18
III.3.2 Preparación del material vegetal y obtención de extracto etanólico de
los cladodios de la Opuntia ficus indica L. .................................................. 18
III.3.3 Control de calidad del extracto etanólico del cladodio....................... 19
III.3.3.1 Determinación de las características organolépticas................. 19
III.3.3.2 Determinación del índice de refracción.................................. 19
III.3.3.3 Determinación del pH ............................................................ 20
III.3.3.4 Determinación de la densidad relativa. .................................. 20
III.3.3.5 Determinación de Sólidos totales. ......................................... 21
III.3.3.6 Cuantificación de flavonoides ................................................ 22
III.3.3.7 Determinación de flavonoides................................................ 23
III.3.3.8 Cuantificación de polisacáridos ............................................. 24
III.3.4 Pruebas de control de calidad del cladodio de la muestra
pulverizada. ................................................................................................ 25
III.3.4.1 Determinación del contenido de humedad............................. 25
III.3.4.2 Determinación de cenizas totales .......................................... 26
III.3.4.3 Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico. .... 26
III.3.4.4 Sustancias solubles o extraíbles............................................ 27
III.3.5 Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico
28
III.3.5.1 Ensayo de Shinoda (Flavonoides) ......................................... 28
III.3.5.2 Ensayo de Mayer, Dragendorff y/o Wagner. (Alcaloides)....... 28
III.3.5.3 Ensayo de Liberman- Buchard (Triterpenos Y/O Esteroides) 29
III.3.5.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas) ......................................... 29
III.3.5.5 Ensayo de Fehling................................................................. 29
III.3.5.6 Ensayo de resinas................................................................. 30
III.3.5.7 Ensayo de Baljet (Cumarinas) ............................................... 30
III.3.5.8 Ensayo de Espuma (Saponinas) ........................................... 30
III.3.5.9 Ensayo de Cloruro Férrico (Taninos) ..................................... 30
III.3.5.10 Ensayo de Antocianidinas ..................................................... 31
III.3.5.11 Ensayo de Mucílagos. ........................................................... 31
III.3.6 Parámetros Macromorfológicos .................................................... 31
III.3.7 Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)
................................................................................................................... 31
III.3.7 Evaluación del ensayo pre-clínico: determinación del efecto
cicatrizante ................................................................................................. 33
CAPITULO IV .................................................................................................... 35
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 35
IV.1 Análisis organoléptico.......................................................................... 35
IV.2 Parámetros Macromorfológicos ........................................................... 36
IV.3 Tamizaje fitoquímico............................................................................ 37
IV.4 Humedad............................................................................................. 38
IV.5 Cenizas totales .................................................................................... 39
IV.6 Cenizas insolubles en HCl ................................................................... 40
IV.7 Sustancias solubles............................................................................. 41
IV.8 Densidad ............................................................................................. 42
IV.9 pH........................................................................................................ 43
IV.10 Índice de refracción.......................................................................... 43
IV.11 Solidos totales.................................................................................. 43
IV.12 Cuantificación de flavonoides........................................................... 45
IV.13 Determinación de flavonoides .......................................................... 47
IV.14 Cuantificación de polisacáridos........................................................ 47
IV.15 Efecto cicatrizante del extracto etanólico de la tuna en ratones de
experimentación............................................................................................. 52
V. CONCLUSIONES....................................................................................... 61
VI. RECOMENDACIONES ........................................................................... 63
ANEXOS ........................................................................................................... 67
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I : Clasificación taxonómica de la tuna....................................................... 5
Tabla II Composición química de la Tuna............................................................ 9
Tabla III Composición química de la piel de la tuna........................................... 10
Tabla IV Composición química de la cascara de la tuna.................................... 10
Tabla V composición química de la pulpa de la tuna ......................................... 11
Tabla VI Cuadro de Operacionalización de las variables................................... 17
Tabla VII Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM).................................. 32
Tabla VIII: Evaluación del proceso de cicatrización en cada grupo experimental
mediante la aplicación de cada uno de los materiales. ...................................... 34
Tabla IX: Resultados De Los Caracteres Organolepticos del extracto de los
cladodios de Opuntia ficus indica L.................................................................... 35
Tabla X: Análisis macromorfologico de la Opuntia ficus indica L. ...................... 36
Tabla XI: Resultados del Tamizaje fotoquímico del extracto etanólico del cladodio
.......................................................................................................................... 37
Tabla XII: Resultados de Humedad del cladodio pulverizado y secado............. 38
Tabla XIII: Resultados de Cenizas Totales del cladodio pulverizado y secado.. 39
Tabla XIV: Resultados de Cenizas Insolubles en HCl del cladodio pulverizado y
secado............................................................................................................... 40
Tabla XV: Resultados de Sustancias Solubles de cladodio secado y pulverizado
.......................................................................................................................... 41
Tabla XVI: Resultados de la densidad del extracto etanólico de cladodio ......... 42
Tabla XVII: Lecturas de pH del extracto etanólico de cladodio.......................... 43
Tabla XVIII: Lectura del índice de refracción del extracto etanólico de cladodio 43
Tabla XIX: Resultados de Solidos Totales del extracto etanólico de cladodio ... 44
Tabla XX: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico
.......................................................................................................................... 45
Tabla XXI: Resultado de la cantidad de flavonoides en el cladodio.................. 46
Tabla XXII: Resultados de la determinación de flavonoides utilizando
cromatografía capilar ......................................................................................... 47
Tabla XXIII: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico
.......................................................................................................................... 48
Tabla XXIV: Resultado de la cantidad de polisacárido en el cladodio............... 48
Tabla XXV: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el primer día de evaluación (Día 1). .............................. 52
Tabla XXVI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el segundo día de evaluación (Día 2)............................ 53
Tabla XXVII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el tercer día de evaluación (Día 3). ............................... 54
Tabla XXVIII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el cuarto día de evaluación (Día 4). .............................. 55
Tabla XXIX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el quinto día de evaluación (Día 5)................................ 56
Tabla XXX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el sexto día de evaluación (Día 6)................................. 57
Tabla XXXI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño
de herida obtenidas en el séptimo día de evaluación (Día 7). ............................ 58
ÍNDICE DE GRAFICOS
Gráfico I: Curva estandar de Flavonoides con sus absorbancias y
concentraciones ................................................................................................ 45
Gráfico II: Curva estándar de Polisacáridos con sus absorbancias y
concentraciones ................................................................................................ 47
I
RESUMEN
Existen estudios del cladodio mencionando diferentes propiedades medicinales
y haciendo énfasis a su efecto cicatrizante. Una preparación en particular dio
resultados satisfactorios mostrando regeneración rápida del tejido e inhibición de
la inflamación. Se realizaron pruebas de control de calidad como humedad,
cenizas totales, cenizas solubles en ácido clorhídrico, sustancias solubles, solidos
totales, pruebas físico-químicas de densidad, pH, índice de refracción y análisis
fitoquímicos encontrando presencia de taninos, flavonoides, alcaloides, cumarinas
y glucócidos. También se determinó la presencia de flavonoides y polisacáridos
del extracto etanólico del cladodio mediante ensayos cualitativos y cuantitativos.
Para la realización del ensayo pre-clínico se formó grupos de tratamiento A
(control negativo), B (control positivo), C, D, E (extracto 10 ul, 20 ul, 30 ul) y F
(etanol 10%). Mediante los resultados de los análisis realizados se comprobó el
efecto cicatrizante del extracto etanólico del cladodio (Opuntia ficus indica L) en
animales de experimentación, dando como resultado la reepitelización y
remodelación de la herida.
Palabras claves: Reepitelización, inflamación, remodelación, polisacáridos,
flavonoides
II
ABSTRACT
Studies examining cladode prove different medicinal properties and they
emphasize its healing effects. One of the first investigations that gave satisfactory
results reports a fast generation of the tissues and the inhibition of inflammation.
The performed quality control addressed factors like humidity, total ash, soluble
ash in hydrochloric acid, other soluble substances, total solids, physical-chemical
density tests, pH, the refractive index and phytochemical analysis found the
existence of tannins, flavonoids, alkaloids, cumarin and carbohydrates. Other than
that, qualitative and quantitative tests proved the presence of flavonoids and
polysaccharides in the extracted ethanol from the cladode. For the pre-clinical trial,
treatment groups were formed: A (negative control), B (positive control), C, D, E
(extract 10 ul, 20 ul, 30 ul) and F (ethanol 10%). The results of the analysis showed
the healing effect of the ethanol extract of the cladode (Opuntia ficus indica L) in
experimental animals, as re-epithelialization and remodeling of the wound were
documented.
Keywords: Re-epithelialization, inflammation, remodeling, polysaccharides,
flavonoids
1
CAPITULO I
I. INTRODUCCIÓN
La medicina tradicional es utilizada desde la antigüedad en diferentes
países a nivel mundial, la OMS apoya el uso de las medicinas tradicionales y
alternativas cuando éstas han demostrado ser útiles para el paciente y su riesgo
es mínimo ha declarado el Dr. LEE Jong-wook, Director General de la OMS. A
medida que aumenta el número de personas que utilizan esas medicinas, los
gobiernos deben exigir garantía acerca de sus beneficios y riesgos que este
posea. (Gutierrez, 2013)
El ser humano puede estar a expensas lesiones en la piel; mediante
estudios e investigaciones el nopal presenta varios beneficios una de ellas en la
cicatrización de heridas proveniente del extracto etanólico de los cladodios de la
Cactáceas. (Medizzine, 2010)
Estudios reportados por Ramírez, (2017) señala que esta especie es rica
en polifenoles, vitaminas, ácidos grasos polinsaturados y aminoácidos; cuyos
compuestos identificados poseen actividades farmacológicas como cicatrizante,
antiinflamatoria, antioxidante, hipoglucémica, antibacterial y neuroprotectora,
entre otros.
En la presente investigación de experimentación se pretende comprobar
el efecto cicatrizante reportado en ratones utilizando el extracto etanólico
proveniente de los cladodios del nopal (Opuntia ficus indica L) reportados de la
especie que crece en las Costa Ecuatoriana.
2
PROBLEMA
Las heridas se conocen como traumatismos mecánicos abiertos producido
por un agente externo en cual actúa de manera agresiva sobre una parte del
cuerpo humano de tal manera supera considerablemente la resistencia por parte
de los tejidos causando una rotura o fisura en la superficie cutánea o mucosa
también puede ser conocida como una lesión caracterizada por una discontinuidad
en el epitelio de revestimiento. (García, 2000)
La cicatriz aparece cuando el tejido o la superficie cutánea que ha sido
afectada por una herida desencadenan una series de procesos de reparación
cutánea por acción natural la cual es inevitable, de esta manera se produce una
alteración macroscópica con la aparición de tejido dérmico fibroso en el área
afectada y como resultado la formación de la cicatriz. (Onmeda, 2017)
Las personas en su vida cotidiana pueden presentar algún tipo de lesión o
herida por ello acuden notoriamente a productos farmacéuticos que pueden ser
administrados por diferentes vías, pero algunas investigaciones realizadas en el
Nopal (Opuntia ficus indica L) afirman que presenta varias acciones
farmacológicas las cuales son de ayuda en distintas afecciones en la salud, la
acción cicatrizante proveniente de los cladodios ayudarían en aquel proceso
debido a la presencia de polisacáridos en su composición. (Medizzine, 2010)
3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Ayudaría a cicatrizar las heridas el extracto etanólico de los cladodios del
Nopal (Opuntia ficus indica L) en ratones?
JUSTIFICACIÓN
El nopal presenta varios beneficios en la medicina tradicional se lo utiliza
en el tratamiento de quemaduras, edemas, úlcera péptica, especialmente es
utilizado el cladodio que actúa como cicatrizante e inducen un efecto beneficioso
gracias a los polisacáridos de la Opuntia ayudando en la reparación cutánea,
acelerando la reepitalizacion de la lesiones de la piel (Medizzine, 2010)
4
HIPÓTESIS
El extracto etanólico de los cladodios de Opuntia ficus indica L ayudará a
la cicatrización en los animales de experimentación.
OBJETIVOS
Generales
Comprobar el efecto cicatrizante del extracto etanólico del cladodio
(Opuntia ficus indica L) en ratones de experimentación.
Específicos
Obtener el extracto etanolico de los cladodios de Opuntia ficus indica L
Realizar el tamizaje fitoquímico y el control de calidad del extracto
etanólico
Evaluar el efecto cicatrizante del extracto aplicados en ratones de
laboratorio.
Analizar el extracto etanólico por Cromatografía de Gases acoplada a
espectrometría de masa.
5
CAPITULO II
I. MARCO TEÓRICO
I.1 Nopal
I.1.1 Descripción taxonómica
El Nopal (Opuntia ficus indica L) perteneciente a la familia de las cactáceas,
este tipo de plantas carece de hojas nomófilas, es decir que no tiene hojas propias
de la planta, son carnosas y suculentas (permiten el almacenamiento de agua). Él
tallo son planos, ovales de hasta 20 cm de diámetro las cuales están formadas
por segmentos o filocladios; posee dos clases de espinas unas largas - duras y
otras cortas - finas.
Las flores nacen en las en los bordes de los segmentos y pueden presentar
diversos colores como amarillo y rojo. El fruto de color rojo de hasta 5 cm, diámetro
5-7 cm, longitud 5-11cm, peso entre 43-220 g es de forma ovalada, gruesa,
carnosa con abundante semilla. (Ecured, 2012).
I.1.2 Taxonomía
En la Tabla I se detalla la clasificación taxonómica de la siguiente especie:
Tabla I : Clasificación taxonómica del nopal
Clasificación taxonómica
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
6
Orden Caryophyllales
Familia Cactaceae
Género Opuntia
Especie ficus-indica
Nombre científico Opuntia ficus-indica (L.) Mill
Tomado de: (Rodriguez, 2012)
Nombre común: Higo chumbo, tuna de castilla, nopal, tuna cardona, tuna
camuesa, tuna mansa, tuna leonera, tuna amarilla, tuna teca, tuna ranchera, tuna
tapona, tuna palmita, tuna pachona, tuna chavena, tuna duraznilla, tuna
I.1.3 Habitad
El Nopal habita en EE.UU, México, Perú, Ecuador, Bolivia en sus zonas
desiertas y en varios países de América del Sur generalmente, aunque también
habita en otros continentes pero en menor cantidad. Según Benalcàzar, (2015) en
Ecuador la mayor cantidad se encuentra en la Sierra Norte, seguida de Loja,
Tungurahua y Santa Elena, según datos de la Federación de Comunidades
Negras de Imbabura y Carchi .
Entre las condiciones en que esta especie ha sido cultivada exitosamente
se encuentran de 12 a 34°C, con un rango óptimo de 11 a 23°C y con una
precipitación promedio entre 400 a 800 mm. Se desarrolla en suelos sueltos,
arenosos, calcáreos, en tierras marginales y poco fértiles, superficiales,
pedregosos, caracterizándole una amplia tolerancia edáfica, mejor desarrollo lo
alcanza entre los 1.700 a 2.500 msnm (Zarucchi, 1993).
7
I.1.4 Actividad farmacológica
El nopal es una planta que en cuya composición fitoquímica contiene varios
compuestos como polifenoles, vitaminas, ácidos grasos; gracias aquellos
compuestos presentan una gran diversidad de actividades farmacológicas las
cuales son muy beneficiosas en su consumo e investigaciones.
Según Ramírez, (2017) señala que la Opuntica ficus indica (L) presenta las
siguientes actividades farmacológicas:
Actividad antiulcérica: mediante ensayos experimentales las fracciones de
Opuntia han sido utilizadas en el tratamiento de ulceras gástricas y ulceras
inducidas por el consumo de alcohol, siendo el mucilago que ayuda a la
introducción del agente necrotizante en la mucosa gástrica.
Actividad antiinflamatoria: Opuntia presenta la actividad analgésica y
antiinflamatoria debido a la presencia de metabolito B-sitosterol en la fruta o
mucilago de la tuna.
Actividad neuroprotectora: esta actividad se la confiere porque en su
composición presenta los flavonoides quercetina, dihidroquercetina, y quercetina
-3 metil- éter.
Actividad antiviral: principalmente el extracto de cladodio de Opuntia ayuda
en la inhibición de multiplicación intracelular del NA y RNA virus como el virus de
la influenza, herpes simple, virus del herpes equino.
Actividad hipoglucemiante: mediante la realización de algunos estudios y
ensayos experimentales el jugo de Opuntia disminuye los niveles de superóxido
8
dismutasa, glutatión reducido, colesterol HDL, hemoglobina, proteína y glicógeno
hepático de esta manera llevando a niveles normales.
Actividad hepatoprotectora: los extractos de Opuntia presentan gran ayuda
como protector si existiese un daño hepático este ensayo fue realizado en ratas.
Actividad anti daño renal: en los ensayos preclínicos se demostró que los
extractos de las flores y frutos de Opuntia presenta un efecto moderado en el
incremento de diuresis y natriuresis.
Actividad antioxidante: la caracterización de los extractos atomizados y su
potencial farmacéutico de Opuntia se demostró la actividad antioxidante,
inhibitoria de tirosina, antimicrobial y fotoprotectiva.
Actividad protectiva: la acción de esta actividad se encuentra relacionada
debido a la presencia del mucilago y pectina ayudando en la acción citoprotectiva
contra ulceras.
Actividad cicatrizante: el extracto metanólico proveniente de los cladodios
de la Opuntia presenta un efecto benéfico en la curación de las heridas debido a
la presencia de polisacáridos que ayudan a la reparación cutánea acelerando la
reepitalizacion de la heridas y lesiones de la piel (Medizzine, 2010).
9
I.1.5 Composición química
La composición química del nopal va a variar según varios factores como la
variedad de la planta, el tipo de cosecha, el tiempo de cosecha y varios factores
que cambian las concentraciones de los componentes de la misma. (Esquive,
2004)
Tabla II Composición química de la Tuna
Tomado de: (Terán et al, 2015)
10
I.1.5.1 Piel
En la Tabla III se muestran las características químicas de la piel del fruto
del Nopal la cual no es caracterizada con frecuencia ya que no se utiliza como
forma de consumo y por la dificultad que conlleva la separación de la pulpa. Las
pencas tienen una cantidad considerable de agua y minerales.
Tabla III Composición química de la piel del Nopal.
Tomado de: (Terán et al, 2015)
I.1.5.2 Cáscara
En la cáscara del fruto del nopal es donde se encuentra la mayor cantidad
de vitamina C que en las demás partes del fruto. Lo que se indica en la Tabla IV.
Además son ricas en sales minerales de Fosforo, Hierro, Calcio.
Tabla IV Composición química de la cascara del nopal.
Tomado de: (Terán et al, 2015)
11
I.1.5.3 Pulpa
Posee multiples vitaminas sobresaliendo el ácido ascorbico, riboflavina,
niacina, carotenos. Compuestos con actividad antioxidante tales como
flavonoides, betalainas, entre otros. Además de varios oligoelementos y alcaloides
como el indol. En la Tabla V podemos observar las características químicas del
fruto de la tuna:
Tabla V composición química de la pulpa del nopal
Tomado de: (Terán et al, 2015)
Varios estudios revelan la importancia de los polisacáridos en procesos de
cicatrización debido a que actúan sobre el sistema inmunológico aumentando la
actividad fibroblastos, ayudando a que el proceso de reepitelizacion se acelere y
a su vez la fase de remodelación celular.
El nopal presenta polisacáridos en gran cantidad, especialmente el
cladodio, a s vez también presenta glucósidos de flavonol que cumplen la misma
acción. (Arauza, 2011)
Un polisacárido llamado quitin-polisacárido extraído de la quitina
(componente principal de las paredes celulares de los hongos). Que presenta un
gran poder antioxidante y puede realizar un notable poder de cicatrización sobre
las heridas abiertas, incluso como sustituto artificial de la piel según la bibliografía
12
pero aun no demostrado experimentalmente. Las propiedades de este
polisacárido sobre la cicatrización se dan acortando el tiempo o mejorando las
heridas o ulceraciones crónicas, utilizadas por vía tópica o en diversas
presentaciones. (Heilemann, 2013)
I.3.1 Usos Étnomedicinales
El Nopal por sus múltiples beneficios sobre la salud es bien usando desde
varios años, unos de sus usos importantes es en el tratamiento de problemas
renales mediante la infusión de sus hojas mediante administracion por vía oral,
mientras que sus frutos son utilizados por vía tópica formando cataplasmas al
calentarlos en hornos y colocándola en la zona afectada.
Según Rodríguez, (2012) por cada 100g de pulpa comestible aporta 1,3 g
de proteínas, 6,8 g de fibras, 0,1 g de grasas, 17 mg de fósforo, 2,7 mg de hierro,
220 mg de Vitamina A, 0,03 mg de Vitamina B1, 0,04 mg de Vitamina B2, 0,4 mg
de niacina, 16 mg de Vitamina C y 29 calorías.
Además desde épocas precolombinas existen reportes de que los cladodios de la
Opuntia ficus indica L han sido utilizados por su actividad cicatrizante.
Varios estudios afirman que desde hace muchos años la opuntia ha sido
consumida debido a la cantidad de nutrientes que posee y los beneficios sobro el
organismo, por otro lado hoy en día esos estudios se han ampliado, confirmando
todas las creencias sobre la variedad de propiedades beneficiosas del nopal.
(Guzmán & Chávez, 2007)
13
I.3 Cicatrices
I.3.3 Definición
Las cicatrices son conocidas como alteraciones permanentes de la
apariencia dérmica debidas a un daño infligido a la piel las cuales se encuentran
asociadas con el proceso natural de reparación de la zona afectada, ocurre
cuando se reemplaza la piel dañada, la misma que presenta un aspecto de tejido
grueso, la mayoría de las veces blanquecino, fibroso, se forma en el proceso
de cicatrización de las heridas y su objetivo es sustituir al tejido corporal original
que ha sido dañado. (Onmeda, 2017)
I.2.2 Clasificación del proceso de cicatrización
La clasificación puede hacerse en función de diversos criterios.
Cicatrización normal: Es el proceso que deja una cicatriz con apariencia
normal, es decir, con un color semejante a la piel que la rodea, plana, lineal
y flexible. Además, no afectará a la integridad anatómica ni funcional de la
zona afectada.
Cicatrización patológica: Es el proceso que, a diferencia de la
cicatrización normal, sí puede afectar a la integridad anatómica y funcional
de la zona afectada. Este tipo de cicatrización se puede subdividir, a su
vez, en dos tipos, según el grado que alcance:
Excesiva. Se caracteriza por un exceso de cicatrización, es decir,
hay un exceso de tejido cicatricial causado por un aumento de la
celularidad y de la gran actividad de los fibroblastos
14
Insuficiente. Se caracteriza por un déficit de tejido cicatricial por ello
se comporta que las heridas acaben siendo crónicas y en muchos
casos inestables.
Cicatrización inestética: Es parecida a la cicatrización normal, ya que el
proceso de cicatrización es normal, no hay cicatrización excesiva ni
insuficiente, pero en este caso, la ubicación, dirección o técnica de
reparación no tiene buenos resultados y en la gran mayoría de casos será
necesario que se requiera de la cirugía para mejorar su aspecto.
Cicatrización ideal: Es aquella en la que no queda cicatriz externa y en la
que la integridad anatómico funcional no se ve afectada. Este tipo de
cicatrización, en humanos, únicamente se da en la cicatrización fetal.
I.1 Proceso de cicatrización
Es un proceso natural que ocurre en el cuerpo el cual va dirigido a
regenerar los tejidos de la dermis y epidermis que han sufrido una herida. Es un
proceso complejo que se divide en varias fases o etapas (Herranz & Santos,
2012):
Fase inflamatoria. Se caracteriza por un aumento de vascularización y
formación de la costra superficial debido a la llegada de plaquetas y células
inflamatorias a la zona dañada. Es decir, debido a la coagulación, se forma
un tapón que finalmente evolucionará dando lugar a la costra.
Fase proliferativa o fibroproliferativa. Se empieza a regenerar la zona
afectada a consecuencia del acumulo de fibrina y colágeno. El colágeno
es una proteína que genera el organismo y es la encargada de rellenar y
cerrar los defectos de continuidad de la piel.
15
Remodelación. Fase final del proceso de cicatrización, en la que se
produce una reabsorción del colágeno. Esta fase es lenta y suele alargarse
más de un año desde el inicio del proceso de cicatrización.
16
CAPITULO II
II. METODOLOGÍA
II.1TIPO DE INVESTIGACIÓN Y TÉCNICA
El estudio es de tipo experimental, diseño con post prueba y grupo control
en ratones que se realizaron en el Bioterio de la Universidad de Guayaquil de la
Facultad de Ciencias Químicas.
II.2Variables de la investigación
II.2.1 Variable dependiente
Tiempo del efecto cicatrizante
II.2.2 Variable independiente
Concentración del extracto
Tamaño de la herida
II.2.3 Variable interviniente
Condiciones ambientales
17
II.2.4 Operacionalización de las variables.
Tabla VI Cuadro de Operacionalización de las variables
Variable Conceptualización Indicador
Dependiente Tiempo del
efecto
cicatrizante
Lapso de duración en
el que se desarrolla
una acción o suceso.
Días
Independiente Concentración
del extracto
Es el alcance o
relación que hay entre
la cantidad de soluto y
la cantidad de
disolvente o disolución.
mg/ml
Tamaño de la
herida
Dimensiones físicas. Cm
Interviniente Condiciones
ambientas
Son los factores
externos ya sean físico
o químicos que se
encuentran descubierto -----------------------
-
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
18
II.3Desarrollo de la parte experimental
II.3.1 Recolección de la especie vegetal
El nopal se recolecto en la Universidad de Guayaquil en la Facultad de
Ciencias Químicas que se encuentra cultivada en las áreas verdes de dicha
facultad, posteriormente se realizó la recolección de los cladodios, que fueron
llevados a la Facultad de Ciencias Naturales para su respectiva clasificación
taxonómica y descripción botánica.
II.3.2 Preparación del material vegetal y obtención de extractoetanólico de los cladodios de la Opuntia ficus indica L.
Para la obtención del extracto etanólico de los cladodios del nopal en base
la selección de la materia prima de óptima calidad, siguiendo los siguientes pasos:
Al cladodio del Nopal se realizó una visualización en cuanto a sus
características organolépticas, color, aspecto y textura.
Luego se realizó un lavado y desinfección de la materia prima.
Se procedió a retirar la corteza del cladodio.
La muestra se la introdujo en la estufa a una temperatura de 60°C por 4
días.
Se trituro.
Se pulverizo.
Se pesaron 50 g de muestra pulverizada y se colocó 150ml de etanol 96%.
Se mantuvo macerada la muestra por 7 días.
Se filtró la muestra. (Carrasco, 2012)
19
II.3.3 Control de calidad del extracto etanólico del cladodio.
II.3.3.1 Determinación de las características organolépticas.
Determinación del olor.- Se toma una tira de papel secante de
aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de largo y se introduce un extremo
en un vaso de precipitación donde se encentra la muestra de ensayo. Se huele y
se determina si corresponde con la característica del producto.
Determinación del color.- Se colocó en tubo de ensayo limpio y seco la
muestra etanolica para observar el color y su transparencia y la presencia de
partículas que nos va a otorgar una apreciación sobre la turbidez de la muestra.
II.3.3.2 Determinación del índice de refracción.
Se coloca sobre el prisma una gota de agua destilada con la ayuda de una
varilla de vidrio que no tenga cantos agudos, se ajusta el equipo seleccionado la
zona del espectro visible que aparece en la línea límite del campo visual, luego
se coloca una gota del extracto etanolico del nopal sobre el prisma, cerrando el
termoprisma y se procede a enfocar la luz por medio del espejo, para que de esta
manera la luz incida sobre la apertura de entrada del prisma de medición y resulte
de igual forma que con el agua.
Para la expresión de los resultados se deben realizar tres lecturas y
calcular el promedio de las mismas. Dos o más lecturas no deben diferir en más
de 0.002. Si las determinaciones no se efectúan a la temperatura de referencia se
emplea la fórmula siguiente:
Nd25 = Ndt + 0.00044 (t-25)
20
Donde:
Nd25 = índice de refracción a 25 °C.
Ndt = Valor leído en la escala del aparato a la temperatura.
T = valor de la temperatura a que se realiza la medición (°C).
0.00044 = factor de correlación por Grados Celsius.
Los valores se aproximan hasta las milésimas (Carrasco, 2012)
II.3.3.3 Determinación del pH
La acidez o la alcalinidad de las soluciones etanòlicas se caracterizan por
el valor del índice de hidrógeno, es decir el valor el pH. Se trata de un índice
numérico utilizado para expresar la mayor o menor acidez de una solución en
función de los iones hidrógenos. Se calcula utilizando la ecuación: (Carrasco,
2012) = − log [H+ ]a [H+ ] = Actividad de los iones hidrógeno.
II.3.3.4 Determinación de la densidad relativa.
La densidad relativa es la relación entre masa de un volumen de la
sustancia a ensayar a una temperatura de 25°C y la masa de un volumen igual de
agua a igual temperatura que es equivalente al peso específico. Inicialmente se
pesa el picnómetro vació y secos 2° C y llénese con el extracto etanolico del nopal,
mantener a 25 °C (±1°C) durante 15 min y ajústesele el líquido al nivel empleado,
si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso secar exteriormente el
picnómetro.
21
Se pesa cuidadosamente el picnómetro con el extracto y se repite la
operación con el agua destilada a 25 °C, después de limpio el picnómetro.
Expresión del resultado:
25 = 1 −2 −Donde:
M1 = peso del picnómetro con la muestra (g)
M2 = peso del picnómetro con el agua (g)
M = peso el picnómetro vacío (g)
Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra.
II.3.3.5 Determinación de Sólidos totales.
Se denomina solidos totales a la masa que varía al exponer el extracto
etanolico del nopal al fenómeno de evaporación y secado en la estufa del residuo,
debido a la perdida a través de calor de sustancias volátiles.
Se procede llevando 5.0 mL del extracto a una cápsula previamente tarada
a 105 °C en la estufa, se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté
aparentemente seco. Luego este residuo se lo coloca en la estufa y se deja hasta
peso constante. Retiramos la cápsula de la estufa y la colocamos en una
desecadora hasta temperatura ambiente: La cantidad de sólidos totales,
expresado en %, R, se calcula por la siguiente fórmula;
= − ∗ 100
22
Donde:
Pr = masa de la cápsula más el residuo (g).
P == masa de la cápsula vacía (g).
V = volumen de la porción de ensayo.
100 = Factor matemático para el cálculo.
II.3.3.6 Cuantificación de flavonoides
Curva estándar de flavonoides – Quercetina
Pesar 20 g de Quercetina y llevar a volumen de 25 ml con metanol
(concentración 800 ug/ml) Solución madre de la misma solución tomar
2,5 ml, llevar a volumen final de 25 ml con metanol (concentración 80
ug/ml) Dilución primaria.
De la dilución primaria tomar 0.250 ul, 0.350 ul, 0.450 ul, 0.550 ul, 0.650
ul, 0.750 ul, agregar los reactivos cromóforos (200 ul Acetato de potasio
1M, 200 ul Nitrato de Aluminio 10%) llevar a volumen final en un matraz de
10 ml con etanol 96%.
Se debe leer a los 40 minutos una vez colocado la primera alícuota de
Nitrato de Aluminio.
Leer en el espectrofotómetro a 415 nm, usando como blanco Etanol 96 %
Muestra pulverizada de cladodio
Se realiza por triplicado, pesar 1g de la muestra agregando 10 ml de Etanol
96 % en un tubo de ependorff, colocar en el vortex por 3 minutos, filtrar, el filtrado
se deposita en un matraz de 25 ml y el residuo que se encuentra en el papel filtro
se coloca nuevamente en el tubo de ependorff con 10 ml de Etanol 96 %, llevar al
vortex durante 3 minutos y filtrar en el mismo matraz llevando a volumen final de
25 ml con Etanol 96 % (Solución A). Realizar el mismo procedimiento para las
réplicas B y C.
23
De las réplicas realizadas tomar 500 ul y agregar los reactivos cromóforos
(200 ul Acetato de potasio 1M, 200 ul Nitrato de Aluminio 10%) llevar a volumen
final en un matraz de 10 ml con etanol 96%.
Se debe leer a los 40 minutos una vez colocado la primera alícuota de
Nitrato de Aluminio.
Leer en el espectrofotómetro a 415 nm, usando como blanco Etanol 96 %
II.3.3.7 Determinación de flavonoides
Mezclar 1g del cladodio en polvo con 10ml de metanol por 5 min en un
baño de agua (60ºC).
Tomar 5ml de la solución y concentrar hasta sequedad. Colocar 2ml de
agua y 10ml de acetato de etilo, agitar por 10 min. Separar la fase de etil acetato
y concentrar hasta obtener un volumen de 1ml.
Usar el concentrado para la cromatografía. Se aplica 10ul del concentrado
en una placa cromatografica de silica gel 60F254 con la ayuda de un capilar. Dejar
secar después de cada aplicación Se introduce la placa en la cuba cromatográfica,
hasta que el solvente recorra la ¾ partes de la placa. Retirar de la cuba y dejar
secar para luego observar en una lámpara de UV 365nm. Revelara la placa y dejar
secar, y anotar los Rf.
Sistema de solventes: acetato de etilo, cloroformo (2:1)
Expresión del resultado:
=
24
II.3.3.8 Cuantificación de polisacáridos
Curva estándar de polisacáridos – Glucosa
Pesar 100 mg de glucosa y disolver en un matraz de 100 ml (SoluciónMadre)
Posteriormente de la solución madre tomar 2 ml y llevar volumen en un
matraz de 25 ml (Dilución primaria)
De la dilución primaria tomar en diferentes tubos de ependorff: 1ml, 0.750
ml, 0,5 ml, 0,25 ml, 0,125 ml con 1 ml de fenol 5 % y 4 ml ácido sulfúrico
concentrado.
Leer en el espectrofotómetro a 400 nm , usando como blanco 1 ml agua
destilada, 1 ml fenol 5% y 4 ml ácido sulfúrico.
Muestra pulverizada de cladodio
Se realiza por triplicado, pesar 0,5g de la muestra pulverizada de cladodio
llevar a reflujo con agua destilada a un volumen de 100 ml durante dos horas
En matraces de 250 ml , filtrar y separar el residuo al mismo se realiza un
lavado con agua caliente con 30 ml y posteriormente con 30 ml ( volumen de 60
ml ) y se enraza a 250 ml con agua destilada (Solución A). Realizar el mismo
procedimiento para las réplicas B y C.
De cada una de las réplicas realizadas tomar 1 ml y colocar en tubos de
ependorff con 1 ml de fenol 5% y 4 ml de ácido sulfúrico concentrado (por la
paredes del tubo lentamente), posteriormente se lleva a baño María (40°C) dejar
enfriar.
Leer en el espectrofotómetro a 400 nm, usando como blanco 1 ml agua
destilada, 1 ml fenol 5% y 4 ml ácido sulfúrico.
25
II.3.4 Pruebas de control de calidad del cladodio de la muestrapulverizada.
II.3.4.1 Determinación del contenido de humedad
Pesar 2 g. ± 0.5 mg del cladodio crudo y transportarlos a un pesa filtro
tarado anteriormente, secar a 100 °C por 3 horas. La pesa filtro se colocó en un
desecador hasta alcanzar temperatura ambiente y se pesó; colocándose
nuevamente en la estufa durante 1 hora y se repitió el procedimiento hasta masa
constante. El ensayo se realizó por triplicado.
Cálculos:
% = 2 − 1 ∗ 100Donde:
H = Porcentaje de Humedad
M = masa de la muestra de ensayo (g).
M1= masa del pesa filtro con la muestra desecada (g)
M2 = masa del pesa filtro con la muestra de ensayo (g).
100=factor matemático para los cálculos.
26
II.3.4.2 Determinación de cenizas totales
Pesar entre 2.0 g a 3.0 g del cladodio pulverizado y tamizado en un crisol
de porcelana anticipadamente tarado. Caliente suavemente el polvo del cladodio
aumentando la temperatura hasta carbonizar y posteriormente incinere en un
horno mufla a una temperatura de 500-550 ºC, durante 2 horas. Enfriar el crisol en
una desecadora y pesar, repitiéndose hasta masa constante. Al enfriar el crisol el
residuo es de color blanco o casi blanco.
Expresión de los resultados.
= M2 − M1 − × 100C = porcentaje de cenizas totales en base hidratada.
M = masa del crisol vacío (g)
M1= masa del crisol con la porción de ensayo (g)
M2= masa del crisol con la ceniza (g)
100= factor matemático para los cálculos.
Los valores se aproximan hasta las décimas.
II.3.4.3 Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico.
Al residuo del ensayo de cenizas totales se añadió de 15 a 20 mL de HCl
10%. Tapar la capsula y llevar a ebullición suavemente directo a la llama durante
5 minutos. La solución obtenida se filtró a través de papel filtro libre de cenizas
determinadas o declaradas. Se lavó el residuo con agua caliente hasta que
muestre negativo la prueba con AgNO3 0.1N. El papel con el residuo se transfirió
a la cápsula inicial, se carbonizó e incineró en un horno mufla a 500-550 °C,
durante 2 horas. Posteriormente se enfrió en el desecador hasta temperatura
ambiente y se pesó. Se repite el procedimiento hasta obtener masa constante.
27
Expresión de los resultados:
% = M1 − M21 − × 100B= porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada.
M = masa de la capsula tarada (g).
M1=masa de la capsula con la porción de ensayo (g).
M2= masa del crisol con la ceniza (g).
100= factor matemático.
Los valores se aproximan hasta las décimas.
II.3.4.4 Sustancias solubles o extraíbles
Realizar el ensayo por triplicado, tomar 5 g de cladodio en polvo, utilizando
agua y mezcla hidroalcohólica al 90 %. Las muestras se agitaron en un agitador
magnético por un tiempo de 6 horas.
Los cálculos se realizaron según:
. 500.100(100 − )Ss: sustancias solubles (%)
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
H: humedad residual (%)
500 y 100: factores matemáticos para el cálculo
28
II.3.5 Identificación de metabolitos secundarios por tamizajefitoquímico
Los procedimientos que se consideraran para la realización del tamizaje o
screanning fitoquìmico serán tomados de (Carrasco, 2012).
II.3.5.1 Ensayo de Shinoda (Flavonoides)
Se coloca 20 ml del extracto en un tubo de ensayo se agrega de dos a tres
virutas de magnesio y unas gotas de ácido clorhídrico concentrado observe el
cambio de coloración de rojo a magenta. Si se trata de un extracto acuoso, a la
alícuota se le añade 1 gota de HCl concentrado. Identificación: Rojo: presencia de
flavonoides; Rosa intenso: presencia de flavonas. (Carrasco, 2012)
II.3.5.2 Ensayo de Mayer, Dragendorff y/o Wagner. (Alcaloides)
Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la presencia
de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente
orgánico, se debe evaporar 2 mL del extracto etanolico del cladodio en baño de
agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua,
añadiendo 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si hay opalescencia se considera
(+), turbidez definida (++), precipitado (+++).
Ensayo de Mayer: Evaporar 2 mL del extracto etanolico del cladodio en
baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en
agua, añada una pizca de cloruro de sodio en polvo, agite y filtre. Añada 2 ó 3
gotas de la solución reactiva de Mayer, si se observa opalescencia (+), Turbidez
definida (++), precipitado coposo (+++).
Ensayo de Wagner: Se parte de la solución ácida, añadiendo 2 ó 3 gotas
del reactivo, clasificando los resultados de la misma forma, que en el ensayo de
Ensayo de Mayer.
29
II.3.5.3 Ensayo de Liberman- Buchard (Triterpenos Y/O Esteroides)
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en
baño de agua y el residuo disolverse en 1mL de cloroformo. Añadir 1mL de
anhídrido acético y mezclar. Por la pared del tubo de ensayo colocar 2-3gotas de
H2SO4 concentrado sin agitar. Un Cambio rápido de coloración supone un
resultado positivo.
Observar: Rosado – azul muy rápido; Verde intenso- visible aunque
rápido; Verde oscuro-negro-final de la reacción. Para realizar este ensayo no
puede haber agua en el medio de reacción pues ésta con el ácido sulfúrico
reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente. (Carrasco, 2012)
II.3.5.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas)
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en
baño de agua y el residuo disolverse en 1mL de cloroformo. Agregar 1mL de
hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco al 5 %. mezclar las fases y
dejar en reposo hasta su posterior separación. Observar: Positivo cuando la fase
acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado (++), rojo (+++).
II.3.5.5 Ensayo de Fehling.
Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores.
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en baño de
agua y el residuo redisolverse en 1-2 mL de agua. Añadir 2 mL del reactivo y se
calienta en baño de agua 5-10 minutos. Se considera positivo cuando la solución
se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.
30
II.3.5.6 Ensayo de resinas
Para detectar este tipo de compuestos se añade a 2mL del extracto
etanolico del cladodio, 10mL.de agua destilada. Observar: Positivo la aparición de
un precipitado.
II.3.5.7 Ensayo de Baljet (Cumarinas)
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio, luego aicionar 1ml del
reactivo. Observar: Positivo cuando aparece una coloración o precitado de color
rojo (++ y +++).
II.3.5.8 Ensayo de Espuma (Saponinas)
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y diluir con 5 veces su
volumen en agua, agitar la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos. El ensayo
se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2
mm de altura y persistente por más de 2 minutos. (Carrasco, 2012)
II.3.5.9 Ensayo de Cloruro Férrico (Taninos)
Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y agregarle 3 gotas de una
solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio
al 0.9% en agua). Observar: Positivo Coloración rojo-vino compuestos fenólicos
general. ; Coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos; Coloración
azul, taninos tipo pirogalotánicos.
31
II.3.5.10 Ensayo de Antocianidinas
Permite conocer en los extractos vegetales la presencia de estas
estructuras de secuencia C6C3-C6 del grupo de los flavonoides. Tomar 2 mL del
extracto etanolico del cladodio y calentar durante 10min, con 1mL., de HCl
concentrado. Enfriar y añadir 1mL., del agua y 2mL., de alcohol amílico. Agitar y
esperar a la separación de las 2 fases. Observar: Positivo la aparición de color
rojo a marrón en la fase amílica
II.3.5.11 Ensayo de Mucílagos.
Se toma una alícuota del extracto de agua se enfría a 0 – 5 ° C y si la
solución toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo. (Carrasco, 2012)
II.3.6 Parámetros Macromorfológicos
Se toman muestras de las hojas, pétalos, frutos, y corteza y a continuación
se consideran forman y tamaño las cuales serán observadas en el estereoscopio.
II.3.7 Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas(CG-EM)
Se trata de una técnica combinada que asocia el poder de discriminación
y la sensibilidad que posee un cromatógrafo de gases con la especificidad que
aporta una técnica espectroscópica. Aporta datos espectrales altamente
específicos de las distintas sustancias presentes en una mezcla compleja sin
necesidad de aislarlos previamente. (UNODC, 2012)
El extracto obtenido se inyectan al cromatógrafo de gases acoplado a un
detector selectivo de masas para su identificación.
32
Tabla VII Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM)
Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM)
Cromatógrafo de gases Agilent 7890ª
Detector Agilent 5975 (Avondale, Pa, USA)
Temperatura: 300º C
70 eV en modo de barrido (“scan”)
100 a 400 unidades de masa.
Columna HP-5ms de 25 m de largo (0,25 mm
de diámetro y 0,25 µm de espesor de
película).
Gas portador Helio de grado electrónico
Condiciones del horno Temperatura inicial: 100º C por 3 min,
incrementándose 8º C por minuto
hasta una temperatura final de 250° C
manteniendo por 10 min
Temperatura del inyector 250º C
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
Según la información de (UNODC, 2012) la identificación se consigue
comparando el tiempo de retención y el espectro de masa de la sustancia
analizada con los de un patrón de referencia. Todas las sustancias identificadas
33
mediante GC-MS de las que informe el encargado del análisis deben compararse
con un espectro de masas reciente del patrón de referencia apropiado,
preferiblemente obtenido con el mismo instrumento y en las mismas condiciones.
Las bibliotecas de espectros de masas que pueden adquirirse en el mercado o los
espectros generados por el usuario solo deben utilizarse con fines de referencia
II.3.8 Evaluación del ensayo pre-clínico: determinación del efectocicatrizante
Estudios realizados en piel demuestran la eficacia y rapidez en la
utilización del método de punch o técnica de sacabocado la cual permite que el
corte a realizar sea de una medición exacta. (Chile, 2014)
El presente estudio es de tipo experimental y grupo de control de ratones
que se realizó en el bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
de Guayaquil. Se utilizó como material vegetal el extracto etanólico de los
cladodios del Nopal, como producto farmacéutico se utilizó B - sitosterol (Mebo)
nombre comercial.
Para el ensayo pre clínico se realizaron 6 grupos de experimentación, cada
uno con 6 animales dando un total de 36 ratones. Se mantuvieron a los ratones
en jaulas de metal (30x45 cm) a 22°C. Su alimentación se mantuvo balanceada
con alimento de conejo, agua clorada y periodos de Luz/oscuridad.
Se rasuro la mitad del tercio superior del lomo, se mantuvieron un tiempo
de 24 horas para observar si no se presentaban irritaciones.
Los ratones se mantuvieron en ayunas previo a la aplicación de la
anestesia con Quetamina dosis 50mg/kg + maleato de acepromazina. Para
proceder a realizar el corte se utilizó un sacabocado de 0,5 cm de longitud, con la
ayuda de tijeras pequeñas se cortó la piel. Posteriormente se aplicó el tratamiento
cada 24 horas durante 7 días (Gallardo, 2015).
34
Tabla VIII: Evaluación del proceso de cicatrización en cada grupo experimental
mediante la aplicación de cada uno de los materiales.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
GRUPO TRATAMIENTO Volumen (ul)/Concentración(mg)
A Control
negativo
Con herida sin tratamiento
B Control positivo MEBO (0.25 % β- Sitosterol) 20 / 0.05
C Extracto 1 Opuntia 10 / 0,1457
D Extracto 2 Opuntia 20 / 0,2914
E Extracto 3 Opuntia 30 / 0,4371
F Vehículo Etanol 10 % 10 / 10
35
CAPITULO III
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1 Análisis organoléptico
Tabla IX: Resultados de los caracteres organolepticos del extracto de los
cladodios de Opuntia ficus indica L.
PARÁMETRO OPUNTIA
Aspecto Liquido
Color amarillo verdoso
Olor característico
Sabor Dulce
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
Los resultados que se encuentra en la Tabla IX sobre las características
organolépticas del extracto coinciden con los expuestos en la bibliografía y
presentan similitud con los estudios descritos según (Carrasco, 2012) en los
cuales el aspecto es liquido por tratarse de un extracto. Su color hace referencia
al del cladodio que es color verde y su sabor es dulce debido al porcentaje de
azucares presentes.
36
III.2 Parámetros Macromorfológicos
Tabla X: Análisis macromorfologico de la Opuntia ficus indica L.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En la Tabla X se describen los parámetros macromorfológico los cuales presentan
cierta similitud según (Carrasco, 2012), de los órganos vegetales de la Opuntia ficus
indica L.
Parámetros
Macromorfológicos
Arbusto
Segmentados terminales
verdes
Aplanados 20-30 x 8-15cm
Angostos – obovados
Aereolas 2-3mm
Espinas 1cm
Flores5cm con petaloides rojizos
amarillentos
Fruto7 x 5.5 cm amarillento al
madurar.
37
III.3 Tamizaje fitoquímicoTabla XI: Resultados del Tamizaje fotoquímico del extracto etanólico del cladodio
Ensayo Metabolito Tuna resultados
Dragendorf Alcaloides +++
Mayer Alcaloides -
Wagner Alcaloides ++
Cloruro férrico Taninos ++
Shinoda Flavonoides +
Resinas -
Antocianinas -
Quinonas -
Espuma Saponina -
Bouchardatt Triterpenos y/o
esteroides
-
Cumarinas +++
Glucósidos ++
Glucósidos
cardiotónicos
++
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
+++: ALTA EVIDENCIA
++: EVIDENCIA.
+: BAJA EVIDENCIA
−: NEGATIVO
38
La Tabla XI se expresan los metabolitos secundarios que se analizaron en
el extracto de los cladodios, de los cuales dieron positivos: alcaloides, flavonoides,
taninos, cumarinas y glucósidos (glucósidos cardiotónicos)
Lss pruebas de Wager, Mayer y Dragendorff, nos permiten identificar la
presencia de alcaloides en el extracto alcohólico. En este caso no se considera la
presencia de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, pues éstos solo se
encontrarán en el extracto acuoso. Por otro lado el ensayo de Cloruro Férrico dio
positivo para taninos, apoyando la hipótesis que pressentan propiedades
astringentes, hemostáticas, antisépticas y tonificantes según la bibliografía.
En la Tabla XI se observa un resultado positivo para el ensayo de Shinoda
que se traduce en la presencia de flavonoides en el extracto vegetal. Estos
flavonoides serían los componentes que ayudarían al proceso de cicatrización por
sus múltiples propiedades biologicas. Para el ensayo de cumarinas se observó
alta evidencia, especialmente Isorhamnetin 3 O- glucósidos que se trata de un
glucósido de flavonol. (YGARTUA, 1978)
III.4 Humedad
Tabla XII: Resultados de Humedad del cladodio pulverizado y secado
OPUNTIA
REPLICA 1 3,15 %
REPLICA 2 3,60 %
REPLICA 3 3,40 %
TOTAL 3,38 %
D.S 0,16 %
C.V 4,60 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
39
En la Tabla XII se detalla el porcentaje de humedad de los cladodios secos
y molidos con un resultado óptimo y gracias a esto se puede mantener conservado
por mayor tiempo, evitando la proliferación bacteriana. A pesar de que es una
planta con alto porcentaje de humedad, se trata de una planta que se descompone
lentamente, por su largo periodo de vida útil.
III.5 Cenizas totales
Tabla XIII: Resultados de Cenizas Totales del cladodio pulverizado y secado
OPUNTIA
REPLICA 1 23,45 %
REPLICA 2 23,20 %
REPLICA 3 23,40 %
TOTAL 23,35 %
D.S 0,10 %
C.V 0,43 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
Las cenizas en un producto generalmente son consideradas como un
índice de calidad o adulteración si estas se encuentran en valores elevados por el
contenido de minerales o compuestos inorganicos. Se conoce como cenizas
totales a los sólidos filtrables que pueden ser solubles en ácido clorhídrico o
insoluble en el mismo.
El resultado de cenizas totales expuestos en la Tabla XIII se encuentran
por encima de los valores referenciados citados por la OMS que es <12%. Esto
40
nos indica la posible presencia de minerales o compuestos orgánicos que pueden
interferir en la acción farmacológica que se desea demostrar.
III.6 Cenizas insolubles en HCl
Tabla XIV: Resultados de Cenizas Insolubles en HCl del cladodio pulverizado y
secado
OPUNTIA
REPLICA 1 5,65 %
REPLICA 2 5,60 %
REPLICA 3 6,60 %
TOTAL 5,95 %
D.S 0,43 %
C.V 7,28 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
Las cenizas insolubles en ácido clorhídrico otorgan una estimación de la
digestibilidad de un alimento, entre ellas tenemos ciertos minerales estables como
quelatos o no digestibles como el sílice. Este ensayo se realizó por triplicado para
evidenciar la reproducibilidad que nos otorga resultados más confiables.
41
III.7 Sustancias solubles
Tabla XV: Resultados de Sustancias Solubles de cladodio secado y pulverizado
OPUNTIA
REPLICA 1 6,49 %
REPLICA 2 6,29 %
REPLICA 3 6,93 %
TOTAL 6,57 %
D.S 0,24 %
C.V 3,67 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En la Tabla XV se observa el porcentaje de sólidos solubles que
representan la cantidad de azúcares en especial sacarosa que se encuentra en la
muestra. El valor encontrado de 6,57% es una cantidad alta lo que va a provocar
un valor elevado de Grados Brix y densidad ya que estas son pruebas físicas que
demuestran la presencia de sólidos solubles
42
III.8 Densidad
Tabla XVI: Resultados de la densidad del extracto etanólico de cladodio
OPUNTIA
REPLICA 1 0,850 g/ml
REPLICA 2 0,744 g/ml
REPLICA 3 0,846 g/ml
TOTAL 0,813g/ml
D.S 0,035 %
C.V 4,249 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En La Tabla XVI presenta los resultados de la densidad realizado en el
extracto etanólico proveniente del cladodio de Opuntia con un valor de 0,813 g/ml.
Este parámetro fue realizado por triplicado para asegurar la reproducibilidad del
ensayo. No se han encontrado datos pertinentes para realizar su comparación lo
que pone de manifiesto el valor de la densidad como nobel y unico del presente
estudio de investigación; se incluyeron además la desviación estándar y
coeficiente de variación el mismo debe tener un valor ≤ 10%.
43
III.9 pH
Tabla XVII: Lecturas de pH del extracto etanólico de cladodio
MUESTRA RESULTADO T°C
Opuntia 6.02 24.9
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
El resultado de la Tabla XVII detalla el valor de la lectura del pH en el
extracto etanólico de Opuntia con una valor de 6.02 a una temperatura de 24.9 °C.
Es conocido que el pH de la piel está comprendido entre 4.5 – 5.9. Para
tratamientos a nivel de piel se necesita productos tópicos comprendidos entre 5 –
7. (Orlandi, 2014) De esta manera, el valor del pH del presente estudio puede ser
usado en la piel.
III.10 Índice de refracción
Tabla XVIII: Lectura del índice de refracción del extracto etanólico de cladodio
MUESTRA I.R DETERMINADA I.R CORREGIDA
Opuntia 1,3639 1,364
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
La Tabla XVIII indica el valor de la lectura del índice de refracción del
extracto obteniéndose como resultado 1,3639. No se ha encontrado datos
preliminares de esta variable, por lo que se pone en manifiesto el valor del índice
de refracción del presente estudio es nuevo y único; este tipo de parámetro se lo
utiliza con el fin de verificar si existe alguna adulteración.
III.11 Solidos totales
44
Tabla XIX: Resultados de Sólidos Totales del extracto etanólico de cladodio
OPUNTIA
REPLICA 1 0,46 %
REPLICA 2 0,42 %
REPLICA 3 0,38 %
TOTAL 0,42 %
D.S 0,03 %
C.V 6,35 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En la Tabla XIX se presentan los resultados de sólidos totales del extracto
etanólico de Opuntia ficus indica con un valor de 0,42 %. Este ensayo fue realizado
por triplicado para asegurar la reproducibilidad el ensayo, se incluye además la
desviación estándar y el coeficiente de variación que debe ser ≤ 10 %. Este tipo
de ensayo sirve para conocer la cantidad de materia disuelta en un solvente. Estos
resultados son nuevos y únicos al estudio, ya que no se han encontrado datos
preliminares.
45
III.12 Cuantificación de flavonoides
Tabla XX: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico
MUESTRA ABSORBANCIAS 415 nm
OPUNTIA 0,041 0,041 0,04
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
0
0,035
0,077
0,110,14
0,1770,206
y = 0,0402x - 0,0026R² = 0,9992
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 1 2 3 4 5 6
ABSO
RB
AN
CIA
415
nm
CONCENTRACIÓN ug/mL
CURVA STANDAR QUERCETINA - FLAVONOIDE
Gráfico I: Curva estándar de Flavonoides con sus absorbancias y concentraciones
46
Tabla XXI: Resultado de la cantidad de flavonoides en el cladodio
OPUNTIA
REPLICA 1 54,23 mg/100 g cladodio
REPLICA 2 54,23 mg/100 g cladodio
REPLICA 3 52,99 mg/100 g cladodio
TOTAL 53,81 mg/100 g cladodio
D.S 0,55 %
C.V 1,03 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En la Ilustración 1 señala los valores de las absorbancias y
concentraciones en la curva estándar de flavonoides utilizando la quercetina como
patrón. La gráfica tiene un valor R² = 0,9992 indicando que la curva tiene una
linealidad apropiada entre cada uno de los puntos que se interceptan.
Los resultados en la Tabla XX obtenidos mediante la lectura en el
espectrofotómetro presentan valores comprendidos entre 0.04 – 0.041. Utilizando
la curva de la Ilustración 1 se puede determinar la concentración de flavonoides
que en este caso indican una concentración entre 1 – 2 ug/ml.
La Tabla XXI detalla la cantidad de flavonoide que se encuentra en el
cladodio de la Opuntia ficus indica con un valor de 53,81 mg/100 g cladodio. Este
resultado nos da a conocer que la Opuntia posee en los cladodios una cierta
cantidad de flavonoides los cuales ayudan en la cicatrización el cual es de suma
importancia en el presente estudio de investigación.
47
III.13 Determinación de flavonoides
Tabla XXII: Resultados de la determinación de flavonoides utilizando
cromatografía capilar
MUESTRA
FRENTE DE LA MUESTRA FRENTE DELSOLVENTE
Rf
A B C D A B C D
OPUNTIA 1 cm
2,8
cm 7 cm 13,5 cm 15,6 cm 0,06 0,18 0,45 0,87
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
Los resultados en la Tabla XXI señala un ensayo de flavonoides por
cromatografía capilar en sálica gel detecto la presencia de 4 flavonoides no sabe
con exactitud el tipo de flavonoides que se encuentra separados debido a la
ausencia de flavonoides patrón durante la realización del ensayo; pero se utilizó
solventes (fase móvil) que sirven para determinar los flavonoides; teniendo en
cuenta la ubicación de las manchas en la cromatografía aquellas que se
encuentran en la parte superior es de menor peso molecular y los de la parte
inferior de mayor peso molecular.
III.14 Cuantificación de polisacáridos
0 0,0110,124
0,334
0,561
0,813y = 0,0106x - 0,0623
R² = 0,9865
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90ABSO
RB
AN
CIA
400
nm
CONCENTRACIÓN
CURVA STANDAR POLISACÁRIDO
Gráfico II: Curva estándar de Polisacáridos con sus absorbancias y concentraciones
48
Tabla XXIII: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico
MUESTRA ABSORBANCIAS
OPUNTIA 0.800 0.802 0.800
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
Tabla XXIV: Resultado de la cantidad de polisacárido en el cladodio
OPUNTIA
REPLICA 1 1461,79 mg/100 g cladodio
REPLICA 2 1461,79 mg/100 g cladodio
REPLICA 3 1447,64 mg/100 g cladodio
TOTAL 1457,08 mg/100 g cladodio
D.S 6,29 %
C.V 0,43 %
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En el grafico 2 se indican los valores de las absorbancias y
concentraciones en la curva estándar de polisacáridos. Esta gráfica se obtuvo R²
= 0,9865, indicando que la curva tiene una linealidad apropiada entre cada uno de
los puntos que se interceptan.
La reacción de polisacáridos dio valores comprendidos entre 0.800 –
0.802. Utilizando la Ilustración 2 se calcula que los cladodios de la Opuntia
contienen una elevada concentración.
49
Los resultados de la Tabla XXIV detalla la cantidad de polisacárido que se
encuentra en el cladodio de la Opuntia ficus indica con un valor de 1457,08 mg/100
g cladodio. Este resultado indica que la Opuntia posee en los cladodios
abundantes polisacáridos y se estima que este tipo de metabolito secundario que
ayuda como inmunomulador.
III.13 Compuestos orgánicos presentes en el extracto delcladodio de la Opuntia ficus indica mediante el análisiscromatografico.
Tabla XXV. Compuestos detectados por cromatografía de gases acoplado amasas en el extracto etanólico de Opuntia ficus indica
Pico#
tr Compuesto %abundancia
1 8.763 Propanoic acid 0.305 12.266 3,7-Dioxa-2,8-disilanonane 0.106 13.018 2-Butenedioic acid 0.237 13.332 Butanedioic acid 0.508 13.735 Propanoic acid9 14.329 2-Butenedioic acid 0.1311 15.367 2,3-Dimethyl-4-
trimethylsilyl0.20
13 17.791 Butanedioic acid 0.3317 19.732 1-Dodecan 0.2118 20.094 5-(p-Bromophenyl)-
7,11,11-trimethy0.10
23 21.149 ARABINONIC ACID 0.29
2,3,5-TRI-O-TRIMETHYLSILYL-ARABINOJasmonoyl glutamic aci
24 21.306 Lyxofuranose 0.11RibofuranoseArabinofuranose
25 21.434 Arabinopyranose 0.7226 21.656 Dodecanoic acid 0.1127 22.081 Ribofuranose 0.16
Lyxofuranose
50
2-azathianthrene28 22.676 Levoglucosan 0.2129 22.886 Xylose 0.25
Per(trimethylsilyl)-D-lyxose30 23.369 5-(p-Bromophenyl)-
7,11,11-trimethy0.35
33 24.016 alpha.-D-Xylopyranose,1,2,3,4-te
0.51
D-ArabinopyranoseD-Xylose
35 24.232 D-Ribo-Hexonic acid, 3-deoxy-2,5,6
0.47
2-Butene-1,4-diol, 2,3-dibromo
40 25.036 1,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha 3.2543 25.753 3-Bromo-5-ethoxy-4-
hydroxybenzalde3.80
7-Isopropenyl-1,4a-dimethyl-4,4a,51,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha
44 25.864 Tetradecanoic acid,trimethylsilyl
0.22
51 27.560 Ethyl 2,3,4,6-tetrakis 0.1352 27.799 D-Allofuranose 0.44
TalofuranoseD-Galactofuranose
53 28.318 Jasmonoyl 0.4155 28.644 alpha.-D-Glucopyranose 0.28
alpha.-D-MannopyranoseD-GALACTOSE
58 29.734 Methanonorandrost 6.1861 31.430 Methanoazulene 0.0962 31.535 Heptadecanoic acid 0.1563 32.660 Octadecadienoic acid 1.1764 32.788 Oleic acid 5.9865 32.911 Octadecenoic acid 1.77
Oleic acid74 36.554 Octadecanoic acid 1.36
Eicosanoic acid78 37.440 HEXOPYRANOSE 0.3380 37.690 3-Bromo-5-ethoxy-4-
hydroxybenzalde0.15
84 38.174 thyl-11-methylene 0.4087 38.506 D-Altrose 0.8594 39.596 Docosanoic acid 0.60100 40.663 Mannobiose 0.29
51
103 41.094 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde
0.18
106 41.450 METHYBUTYRYL 0.60109 42.429 Kokoononol 0.53
Tetracosanoic acidTRIMETHYLSILYL ESTEROF TETRACOSAN
111 45.087 Hexacosanoic acid 0.51Tetracosanoic acidTRIMETHYLSILYL ESTEROF TETRACOSAN
112 46.264 Cholesterol trimethylsilylether
0.56
115 47.249 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde
0.10
117 47.774 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde
0.12
119 48.625 .beta.-Sitosterol trimethylsilyl 1.21Endogenous 24S-EthylcholesterolEthylcholesterol trimethylsily
Los compuestos que se detectaron con mayor abundancia fueron:Methanonorandrost (6.18%), Oleic acid (5.98%), 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde (3.80%), 1,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha (3.25%),Octadecenoic acid (1.77%), beta.-Sitosterol trimethylsilyl, (1.21%) yArabinopyranose 0.72.
52
III.15 Efecto cicatrizante del extracto etanólico de la tuna en ratonesde experimentación.
PRIMER DÍA:
Resultados obtenidos del ensayo pre-clínico (efecto cicatrizante) del
extracto etanólico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de
experimentación (Tabla XXV).
Tabla XXVI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el primer día de evaluación (Día 1).
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017).
En el primer día se realizó el corte produciendo la herida en la piel de los
ratones. Al momento del corte se observó un 100% de inflamación, humedad y el
tamaño de la herida fue de 0,5 cm y sin formación de costra.
GRUPOPARAMETROS
p>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
cmTamaño herida
AControl negativo
100 0 100 0,5 A
BControl positivo
100 0 100 0,5 A
COpuntia 10 ul
100 0 100 0,5 A
DOpuntia 20 ul
100 0 100 0,5 A
EOpuntia 30 ul
100 0 100 0,5 A
FEtanol 10 %
100 0 100 0,5 A
53
SEGUNDO DÍA:
A partir de este día se observó que los animales tratado con el extracto
etanólico del cladodio de Opuntia ficus indica presentaron humedad redcida e
inclusive algunos animales presentaron formación de costra. El tamaño de la
herida se mantuvo constante pero se observaron diferencias en el nivel de
inflamación.
Tabla XXVII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el segundo día de evaluación (Día 2).
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos fueron: Humedad: A (80 ± 7,1), B (82 ± 6,8), presenta diferencias
significativas entre grupos, D (65 ± 5,5), E (63 ± 5,2). En tanto que los grupos
tratados con el extracto se encuentran significativamente disminuidos en relación
GRUPO
PARAMETROSp>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
cmTamaño herida
AControl
Negativo80 ± 7,1 0 73 ± 8,2 0,5 A, D, A, -
BControlPositivo
82 ± 6,8 0 75 ± 8,4 0,5 A, D, A, -
COpuntia 10 ul
73 ± 5,2 15,8 ± 2,0 60 0,5AB, C, B,
-
DOpuntia 20 ul
65 ± 5,5 18 ± 2,6 55 ± 5,5 0,5BC, B, B,
-
EOpuntia 30 ul
63 ± 5,2 21 ± 2,0 53 ± 5,2 0,5 C, A, B, -
FEtanol 10 %
77 ± 12,1 0 60 ± 6,3 0,5 A, D, B, -
54
a los grupos controles. En tanto que de costra no presenta diferencia entre los
grupos. A y B (0), C (15,8 ± 2,0), D (18 ± 2,6), E (21 ± 2,0), F (0). En cuanto a
inflamación: A (73 ± 8,2), B (75 ± 8,4), C (60), D (53 ± 5,2), E (53 ± 5,2), F (60 ±
6,3); siendo el tamaño herida para todos los grupos de (0,5).
TERCER DÍA:
Tabla XXVIII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el tercer día de evaluación (Día 3).
GRUPOPARAMETROS
p>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
cmTamaño herida
AControl negativo
65 ± 5,5 13 ± 2,7 62 ± 4,1 0,5A, D,
A, A
BControl positivo
67 ± 8,2 12 ± 2,6 65 ± 5,5 0,5A, D,
A, A
COpuntia 10 ul
53 ± 5,2 23 ± 2,7 35 ± 5,5 0,4BC, B,
B, C
DOpuntia 20 ul
48 ± 4,1 25 ± 3,2 30 ± 6,3 0,4C, AB,
B, C
EOpuntia 30 ul
47 ± 5,2 27 ± 2,6 27 ± 4,1 0,4C, A,
B, C
FEtanol 10 %
57 ± 5,2 16 ± 2,0 60 0,5 ± 0,1B, C,
A, B
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos fueron: Humedad: A presento (65 ± 5,5), B (67 ± 8,2); C (53 ± 5,2), D
(48 ± 4,1), E (47 ± 5,2), F (57 ± 5,2). En tanto que la costra se observó diferencia
entre los grupos de control A, B y los de tratamiento. En cuanto a la inflamación:
55
A presento (62 ± 4,1), B (65 ± 5,5), C (35 ± 5,5), D (30 ± 6,3), E (27 ± 4,1), F (60);
siendo el tamaño de la herida A y B (0,5), C, D, E, (0,4), F (0,5 ± 0,1).
CUARTO DÍA:
Tabla XXIX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el cuarto día de evaluación (Día 4).
GRUPO
PARAMETROSp>q
0,05%
Humedad%
Costra%
Inflamacióncm
Tamaño herida
AControl negativo
52 ± 4,1 23 ± 2,7 43 ± 5,2 0,5A, C,
B, A
BControl positivo
53 ± 5,2 18 ± 2,6 48 ± 4,1 0,5A, D,
A, A
COpuntia 10 ul
28 ± 2,6 63 ± 5,2 22 ± 4,1 0,4C, B,
C, C
DOpuntia 20 ul
24 ± 2,0 67 ± 5,2 18 ± 2,6 0,4D, AB,
CD, C
EOpuntia 30 ul
22 ± 2,6 70 17 ± 2,6 0,3D, A,
D, C
FEtanol 10 %
48 ± 2,6 23 ± 5,2 41 ± 4,1 0,4B, C,
B, B
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos fueron: Humedad: A (52 ± 4,1), B (53 ± 5,2), C (28 ± 2,6), D (24 ± 2,0),
E (22 ± 2,6), F (48 ± 2,6). En tanto que la costra: A (23 ± 2,7), B (53 ± 5,2), C (63
± 5,2), D (67 ± 5,2), E, (70), F (23 ± 5,2). En cuanto a la inflamación: A (43 ± 5,2),
B (48 ± 4,1), C (22 ± 4,1), D (18 ± 2,6), E (17 ± 2,6), F (41 ± 4,1); siendo el tamaño
de la herida A, B, C (0,5), D (0,4), E (0,3), F (0,4).
56
QUINTO DÍA:
Resultados obtenidos del ensayo pre-clínico (efecto cicatrizante) del
extracto etanolico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de
experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXIX).
Tabla XXX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el quinto día de evaluación (Día 5).
GRUPOPARAMETROS
p>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
cmTamaño herida
AControlnegativo
28 ± 2,7 42 ± 4,1 27 ± 5,2 0,4 A, C, B, B
BControlpositivo
35 ± 5,5 33 ± 5,2 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 A, C, A, A
COpuntia 10 ul
13 ± 2,6 87 ± 5,2 11 ± 2,0 0,3 B, A, C, C
DOpuntia 20 ul
10 88 ± 6,9 8 ± 2,4 0,3 ± 0,1B, A, C,
CD
EOpuntia 30 ul
9 ± 3,8 88 ± 4,1 7 ± 2,6 0,3 ± 0,1 B, A, C, D
FEtanol 10 %
24 ± 2,0 50 23 ± 5,2 0,4 A, B, B, B
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos en cuanto Humedad tienen diferencia los grupos A, B, F, con los del
tratamiento de opuntia C, D, E. En tanto que la costra: A (42 ± 4,1), B (33 ± 5,2),
C (87 ± 5,2), D (88 ± 6,9), E (88 ± 4,1), F (50). En cuanto a la inflamación: A (27 ±
5,2), B (0,5 ± 0,1), C (11 ± 2,0), D (8 ± 2,4), E (7 ± 2,6), F (23 ± 5,2); siendo el
57
tamaño de la herida A (0,4) B (0,5 ± 0,1), C (0,3), D (0,3 ± 0,1), E (0,3 ± 0,1), F
(0,4).
SEXTO DÍA:
Resultados obtenidos del ensayo pre-clínico (efecto cicatrizante) del
extracto etanolico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de
experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXX).
Tabla XXXI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el sexto día de evaluación (Día 6).
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos fueron: Humedad: A (8 ± 2,7), B (10), C, D, E (0), F (5). En tanto que la
costra: A (60), B (55 ± 5,5), C, D, E, F (65 ± 5,5). En cuanto a la inflamación: A (8
± 2,6), B (13 ± 2,6), C, D, E (0), F (8 ± 2,7); siendo el tamaño de la herida A (0,3 ±
0,1), B (0,4 ± 0,1), C (0,3 ± 0,1), D (0,3 ± 0, 05), E (0,2), F (0,3).
GRUPO
PARAMETROSp>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
cmTamaño herida
AControl negativo
8 ± 2,7 60 8 ± 2,6 0,3 ± 0,1 B, C, B, A
BControl positivo
10 55 ± 5,5 13 ± 2,6 0,4 ± 0,1 C, D, A, A
COpuntia 10 ul
0 100 0 0,3 ± 0,1 D, A, C, B
DOpuntia 20 ul
0 100 0 0,3 ± 0, 05 D, A, C, B
EOpuntia 30 ul
0 100 0 0,2 D, A, C, C
FEtanol 10 %
5 65 ± 5,5 8 ± 2,7 0,3C, B, B,
AB
58
SEPTIMO DÍA:
Resultados obtenidos del ensayo pre-clínico (efecto cicatrizante) del
extracto etanolico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de
experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXXI).
Tabla XXXII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y
tamaño de herida obtenidas en el séptimo día de evaluación (Día 7).
GRUPOPARAMETROS
p>q0,05
%Humedad
%Costra
%Inflamación
CmTamaño herida
AControl negativo
0 88 ± 4,1 0 0,3 ± 0,1 -, B, -, -
BControl positivo
0 85 ± 5,5 5 0,3 -, C, -, -
COpuntia 10 ul
0 100 0 0,2 ± 0,1 -, A,-,-
DOpuntia 20 ul
0 100 0 0,1 ± 0,1 -, A, -, -
EOpuntia 30 ul
0 100 0 0,1 -, A, -, -
FEtanol 10 %
0 90 0 0,2 -, B, -, -
*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.
Elaborado por: (García & Ponce, 2017)
59
Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron
los grupos fueron: Humedad: A, B, C, D, E, F (0). En tanto que la costra: A (88 ±
4,1), B (85 ± 5,5), C, D, E (100), F (90). En cuanto a la inflamación: A (0), B (5),
C, D, E, F (0); siendo el tamaño de la herida A (0,3 ± 0,1), B (0,3), C (0,2 ± 0,1), D
(0,1 ± 0,1), E (0,1), F (0,2).
60
Discusión
El proceso de cicatrizaciónnormal implica ue en la parte inicial de la
inflamación se produce una extensión de la zona vascularizada con formación de
la costra superficial debido a la presencia de plaquetas y células inflamatorias en
la zona lesionada; y formación de un tapón (costra) producto de la coagulación.
Por otro lado, esta zona se regenera por la presencia de fibrina y colágeno (fase
proliferativa). El colágeno es reabsorbido y el proceso de remodelación puede ser
lento que en ocasiones puede tardar años. (Arauza, 2011)
En la data del dia 1 y 2 se observa la fase inflamatoria debido a la
presencia de histaminas, las cuales resultan en mayor humedad en la herida.
Posteriormente la presencia de tromboxanos y prostaglandinas permite que haya
mayor inflamación en todos los grupos de experimentación, pero aun no hay
formación de costra debido a la ausencia de fibroblastos que ayudan a la
cicatrización. (Senet, 2008)
La formación de costra fue notable a partir del dia 3 entre los grupos
tratados con Opuntia, debido a la presencia de fibroblastos que se dirigen al tejido
dañado (herida). Este desarrollo coincide con estudios anteriores, donde se
observó que las histaminas conjuntamente con los factores inflamatorios
disminuyeron totalmente. La formación de costra indica que existe una igualación
e los niveles de producción y degradación del colágeno. (Quiroga et al, 2013).
En la tabla XXVIII se observó que los grupos A y B presentan inflamación
y humedad a diferencia del grupo de aplicación C , D, E no hay presencia de
histaminas y la formación de costra llega al 50%, el grupo F tiene menor formación
de costra, no hay formación de fibroblastos por tal motivo el tamaño de la herida
no ha disminuido a comparación de la agrupación con el extracto del cladodio.
En la tabla XXIX se observó humedad en las heridas de los grupos de
aplicación, la costra en los grupos de Opuntia (C, D, E) han alcanzado el 100%
debido a que existe una igualación de los niveles de producción y degradación de
colágeno empezando la regeneración del tejido, ya que los fibroblastos dan paso
61
a los miofibroblastos que en unión a la actina hacen que los bordes de la herida
empiecen a contraerse. En cuanto a inflamación se presentó un 40% en el grupo
B es decir, que aún están presentes tromboxanos y prostaglandinas.
El tamaño de la herida va disminuyendo de manera progresiva de 0,5 a 0,3
cm a parti del dia 3 para los grupos de Opuntia. La cicatrización natural en el
grupo del control negativo empieza a partir del día 5, en este momento los
miofibroblastos son atraídos por la fibronectina y factores de crecimiento que se
desplazan para alcanzar los bordes de la herida, los fibroblastos depositan
colágeno en la herida para reforzarla, en esta etapa el cierre de la herida se da
con mayor rapidez debido a la presencia de los miofibroblastos. (Alonso, 2014)
IV. CONCLUSIONES
Se obtuvo el extracto etanolico del nopal (Opuntia ficus indica L) por
maceración, las caracteristicas sobre los factores organolépticos se encuentran
62
dentro de los parámetros establecidos en comparación con estudios antes
realizados, al igual que los resultados del control de calidad, los cuales nos indica
que el extracto se encuentra en condiciones aptas para realizar esta investigación.
Los valores de pH, índice de refracción y densidad se consideraron únicos debido
a inexistencia de datos preliminares.
Los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico evidenciaron la
presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, taninos, flavonoides,
cumarinas y glucósidos. Por otro lado, la cuantificación de flavonoides y
polisacáridos confirmo una mayor presencia de polisacáridos (1457,08 mg/100 g
cladodio) a diferencia de los flavonoides (53,81 mg/100 g cladodio).
Se comprobó experimentalmente el efecto cicatrizante que posee el
extracto del nopal (Opuntia ficus indica L) posee actividad cicatrizante pues al
realizar el estudio preclínico en diferentes grupos de tratamiento se logró observar
la disminución del tiempo de cicatrización ya que al segundo día de aplicación
hubo formación de costra, reducción de humedad, de inflamación debido a la
presencia de polisacáridos y flavonoides que ayudan en la aceleración de la
reepitelizacion de la zona y a la remodelación de los tejidos.
Se identificaron varios metabolitos del extracto etanolico de los cladodio
de Opuntia por medio del análisis cromatografico acoplado a masas.
63
V. RECOMENDACIONES
Realizar un gel que contengan los principios activos de cladodio de Opuntia
ficus indica que brinde acción antiinflamatoria – cicatrizante, cumpliendo los
diferentes controles de calidad, garantizando la seguridad en su aplicación.
Realizar ensayos de toxicidad a diferentes dosis del extracto del cladodio
(Opuntia ficus indica L) para la identificación de posibles reacciones adversas.
Elaborar formas farmacéuticas a partir del cladodio que cumplan con las
normas de BPM (Buenas Prácticas de Manufactura) y control de calidad
garantizando seguridad y eficacia para los consumidores.
Realizar estudios en las diferentes variedades de especie para la
cuantificación de polisacáridos presentes en los cladodios
64
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67
ANEXOS
TRATAMIENTO DE LOS CLADODIOS PARA REALIZAR EL EXTRACTO ETANOLICO
Recoleccion demuestra
Desespinado del cladodio Eliminacion de la corteza
Cortes pequeños delcladodio
Introducir la muestra en laestufa
Muestra seca
Triturado del cladodioseco
Pulverizado de la muestraseca
Tamizado
68
Muestra pulverizada ytamizada
Macerado etanolico de lamuestra pulverizada
Filtrado del maceradoetanolico
TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Medicion del indice de refraccion y pH del extracto etanolico de los cladodios
Refractometro Indice de refracción Toma de Ph
69
Análisis Organoleptico Cumarinas Triterpenos
Antocianinas Quinonas Bouchardaf
Glucocidos Taninos Shinoda
71
Solidos totales Cenizas totales
Filtrado de las cenizas con HCl Cenizas despues de la mufla
Sustancias solubles
La muestra luego de pasar 6 horas con elagitador magnético se lo dejo reposar 24
horas.
Filtrado de la muestra que estuvo enreposo
72
Cuantificación de polisacáridos
Pesada de la muestra Refrujo de la muestra con aguadestilada
Filtrado de la muestra Lectura en el espectrofotometro
Solidos totales
5ml del extracto de opuntia Evaporado y secado en la estufa
73
Cuantificación de flavonoides
Pesada Agitación vortex Muestradespués delvortex
Filtrado de muestra
Lectura en el espectrofotometro
74
Determinación de flavonoides
Aplicación de la muestra en la silica gel Muestra aplicada encromatografía de capa fina
Lectura de cromatografía de capa fina
75
Ensayo Pre- clínico en ratones de experimentación
Ratones rasurados Aplicación de anestesia
Corte de la piel Medicion de la herida
82
Perfil cromatografico del extracto etanolico de Opuntia ficus indica
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
1e+08
2e+08
3e+08
4e+08
5e+08
6e+08
7e+08
8e+08
9e+08
Time-->
Abundance
TIC: OPUNTIA 1.D\data.ms
84
Resultados de la clasificación taxonomica realizada en el herbario de laFacultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil