universidad de guayaquil facultad de ciencias...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
TESIS DE GRADO
PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERO AGRÓNOMO
TEMA
“EFECTOS DE CINCO DOSIS DE QUITOSANO PARA EL
ESTABLECIMIENTO in vitro DEL PLÁTANO DOMINICO HARTÓN
(Musa AAB Simmonds) EN LA ZONA DE DAULE”
AUTOR:
MARCEL OSWALDO MÉNDEZ MANTUANO
DIRECTORA DE TESIS:
ING. AGR. LAURA PARISMORENO RIVAS
DAULE – ECUADOR
2014
i
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
La presente tesis de grado titulada: “EFECTOS DE CINCO DOSIS
DE QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO in vitro DEL
PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA
ZONA DE DAULE”, realizada por el egresado Marcel Oswaldo Méndez
Mantuano, bajo la dirección de la Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas,
ha sido aprobada y aceptada por el Tribunal de Sustentación como requisito
previo para obtener el título de:
INGENIERO AGRÓNOMO
TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
ii
Guayaquil, 11 de julio del 2014
CERTIFICADO DEL GRAMÁTICO
Ing. Carolina Castro Mendoza, con domicilio ubicado en la ciudad de
Guayaquil, por el presente certifico que he revisado la Tesis de Grado
elaborada por el Sr. Marcel Oswaldo Méndez Mantuano, con C.I.
092534026-7, previa a la obtención del TÍTULO DE INGENIERO
AGRÓNOMO, cuyo tema es: “EFECTOS DE CINCO DOSIS DE
QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO in vitro DEL
PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA
ZONA DE DAULE”.
La tesis de grado arriba señalada ha sido escrita de acuerdo a las normas
gramaticales y de sintaxis vigentes de la Lengua Española.
Ing. Carolina Castro Mendoza
C.I. 0919052175
N° Registro SENESCYT: 1006-11-1071409
iii
DEDICATORIA
“No temas, porque yo estoy contigo; no desmayes, porque yo soy tu
Dios que te esfuerzo; siempre te ayudaré, siempre te sustentaré con la
diestra de mi justicia” (Isaías 41:10).
Cuando alcanzamos nuestras metas más anheladas, no debemos olvidar a
quienes nos ayudaron a llegar a la misma; es por esto que dedico este
triunfo académico a:
Dios primeramente, por ser el pilar que sostiene mi vida y todos mis
ideales, ya que sin su infinita bondad nada podría ser posible.
A mis padres Narcisa Mantuano Holguín y Oswaldo Méndez Mosquera,
que desde mi niñez han sido ejemplos de superación, responsabilidad y de
virtudes inigualables; además de apoyarme desinteresadamente en todos
mis planes y proyectos.
A mi sobrina Angélica Abigail, ya que me ha transmitido valor, alegría y
fortaleza, además de ser un símbolo de lucha y fuerza a pesar de las
circunstancias difíciles que le ha tocado superar.
A mi sobrino Kalev Isaías, el miembro más joven de la familia y parte
importante de ella.
A mis hermanos Eliana y David.
iv
A mis familiares y amigos.
A mis hermanos en la fe de la Iglesia Evangélica Alianza de Daule.
Y a las futuras generaciones.
Dios les bendiga y prospere grandemente.
v
AGRADECIMIENTO
“Una actitud de agradecimiento tiene el poder de convertir las
dificultades en oportunidades, los problemas en soluciones, las pérdidas en
ganancias y además expande nuestra visión y nos permite descubrir todo
aquello que era invisible para nosotros debido a nuestra actitud
limitadora” (Louise L. Hay).
Desde estas palabras quiero agradecer a quienes de una u otra forma han
contribuido a este trabajo, ya que sin su valioso aporte esto no hubiera sido
posible.
A la Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas, ya que primeramente me
permitió realizar este ensayo en el Laboratorio AGROVITROPARIS de su
propiedad, además por sus constantes sugerencias durante el desarrollo del
mismo, por sus aportes de conocimientos, por su amistad y cariño.
Al Ing. Agr. Eison Valdiviezo Freire, quien, con su acertada orientación
me guió en la parte estadística de la presente tesis.
A todos quienes fueron mis maestros durante el período de tiempo que
estuve en las aulas de la Universidad, ya que sin sus valiosas enseñanzas
esto sólo hubiera sido una utopía.
A todos aquellos que a lo largo de la realización de este trabajo me han
ayudado, compartiendo sus conocimientos y experiencias.
vi
A mi familia y amigos por estar a mi lado en todo momento y no perder
la confianza en mí.
A todos, ¡muchísimas gracias!
vii
RESPONSABILIDAD
La responsabilidad de los resultados, conclusiones y
recomendaciones del presente trabajo de investigación
pertenecen exclusivamente al autor.
Marcel Oswaldo Méndez Mantuano
C.I. 092534026-7
Teléfono celular: (+593) 0991979474
E-mail: [email protected]
viii
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO de tesis TÍTULO Y SUBTITULO: EFECTOS DE CINCO DOSIS DE QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO
in vitro DEL PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA ZONA DE DAULE.
AUTOR Marcel Oswaldo Méndez Mantuano
TUTOR: Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas.
REVISORES:
Ing. Agr. Pedro Vera Asang, D.D.S.
Ing. Agr. Carlos Ramírez Aguirre, MSc.
INSTITUCIÓN:
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD:
CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA: Ingeniería Agronómica
FECHA DE PUBLICACIÓN: Julio/2014
N. DE PAGS: 130
ÁREAS TEMÁTICAS:
Biotecnología, Cultivos Anuales.
PALABRAS CLAVE:
Plátano, Dominico Hartón, in vitro, micropropagación, quitosano, contaminación, cormos, brotes, repique, Daule.
RESUMEN:
La presente investigación se realizó de enero a junio del 2014, en el cantón Daule, Provincia del Guayas, en el
laboratorio de cultivos de tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, que se encuentra ubicada entre las
coordenadas geográficas 1º 51' 37,77" (Latitud Sur), 79º 58' 34,42" (Longitud Occidental) y a 15 m.s.n.m.
El estudio tuvo como objetivo la regeneración in vitro del plátano “Dominico Hartón” (Musa AAB Simmonds),
probando cinco dosis de quitosano, ya que éste ayudaría en la reducción de contaminación por hongos y bacterias;
además promovería el desarrollo de los explantes en cada una de las etapas de la micropropagación.
Se utilizaron los cormos (hijos espada) del plátano Dominico Hartón, cuyas plantas madres presentaron buenas
características agronómicas; éstos se los colocó en frascos con nutrimentos necesarios para su desarrollo y las
dosis de quitosano a evaluar (2,5g/L; 5g/L; 10g/L; 15g/L; 20g/L; 0g/L).
Posteriormente, se los repicó para cinco generaciones (L). En la cuarta generación (L4) se evaluó el número de
brotes que se regeneraron por explante y finalmente en el último repique (L5) se seleccionaron al azar 60 brotes
(10 por tratamientos), para evaluar variables como: número de hojas, número de raíces y longitud de las plántulas.
El tratamiento cuatro (T4) fue el que menor porcentaje de contaminación presentó en la evaluación acumulada
con 15g/L de quitosano; en cuanto al desarrollo foliar, radicular y de elongación de las plántulas; ninguno de los
tratamientos mostró significancia estadística.
Se concluyó que el quitosano ayudó a disminuir la contaminación pero no mejora el desarrollo de los explantes ni
disminuye el necrosamiento de los mismos.
N. DE REGISTRO (en base de datos): N. DE CLASIFICACIÓN:
DIRECCIÓN URL (tesis en la web):
ADJUNTO URL (tesis en la web):
ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0991979474
E-mail: [email protected]
CONTACTO EN LA INSTITUCION: Nombre: Universidad de Guayaquil – Ciencias Agrarias
Teléfono: 2288040
E-mail: www.ug.edu.ec/facultades/cinciasagrarias.aspx
ix
ÍNDICE GENERAL
Págs.
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
1.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 3
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 4
II. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................ 5
2.1 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ................................................................ 5
2.1.1 Morfología del plátano ................................................................... 5
2.1.2 Características del cormo o rizoma del plátano .............................. 6
2.2 CULTIVO IN VITRO ................................................................................... 7
2.2.1 Etapas del cultivo in vitro ............................................................... 8
2.2.1.1 Etapa cero: selección del material vegetal ............................... 9
2.2.1.1.1 Fase de desinfección ........................................................... 9
2.2.1.1.2 Medio de cultivo ............................................................... 11
2.2.1.2 Etapa uno: fase de establecimiento ......................................... 13
2.2.1.3 Etapa dos: fase de multiplicación ........................................... 13
2.2.1.4 Etapa tres: fase de enraizamiento ........................................... 14
2.2.1.5 Etapa cuatro: aclimatación de las plántulas enraizadas .......... 15
2.2.2 Experiencia de cultivos in vitro en musáceas ............................... 15
2.2.3 Principales problemas en el cultivo in vitro ................................. 16
2.2.3.1 Contaminación ........................................................................ 17
2.2.3.2 Oxidación fenólica .................................................................. 18
2.3 QUITOSANO .......................................................................................... 18
2.3.1 Propiedades del quitosano (según Lárez, 2008) ........................... 20
2.3.1.1 Actividad bactericida .............................................................. 20
2.3.1.2 Actividad fúngica ................................................................... 22
2.3.1.3 Estimulador del crecimiento ................................................... 24
2.3.2 Proceso químico para la obtención de la quitina .......................... 24
III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................... 26
3.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO ............................................................. 26
3.2 DATOS GEOGRÁFICOS ........................................................................... 26
3.3 DATOS CLIMÁTICOS .............................................................................. 26
x
3.4 DURACIÓN DEL EXPERIMENTO .............................................................. 27
3.5 MATERIALES Y EQUIPOS ....................................................................... 27
3.5.1 Materiales de laboratorio .............................................................. 27
3.5.2 Equipos ......................................................................................... 28
3.5.3 Material vegetal ............................................................................ 28
3.5.4 Material químico para la propagación o medio de cultivo ........... 28
3.5.4.1 Macronutrientes MS ............................................................... 28
3.5.4.2 Micronutrientes ms ................................................................. 29
3.5.4.3 Quelatos de hierro MS ............................................................ 29
3.5.4.4 Vitaminas Morel ..................................................................... 30
3.5.4.5 Sacarosa .................................................................................. 30
3.5.4.6 Phytagel .................................................................................. 31
3.5.5 Material experimental ................................................................... 31
3.6 UNIDAD DE OBSERVACIÓN .................................................................... 31
3.7 CONSIDERACIONES PARA LA MICROPROPAGACIÓN IN VITRO ................. 31
3.7.1 Esterilización de los explantes ...................................................... 32
3.7.2 Factores físicos ............................................................................. 32
3.7.3 Área estéril .................................................................................... 32
3.8 PROCEDIMIENTOS REALIZADOS EN EL EXPERIMENTO ........................... 33
3.8.1 Etapa 0 (día 1) ............................................................................... 33
3.8.2 Etapa 1 (desde el día 1 hasta el día 27) ......................................... 33
3.8.3 Etapa 2 (desde el día 28 hasta el día 111) ..................................... 34
3.8.4 Etapa 3 (desde el día 112 hasta el día 140) ................................... 35
3.8.5 Factor de multiplicación ............................................................... 36
3.9 FACTORES EN ESTUDIO ......................................................................... 36
3.9.1 Descripción de tratamientos ......................................................... 36
3.10. DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................... 37
3.10.1 Análisis de varianza .................................................................... 37
3.11 VARIABLES Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN ........................................... 37
3.11.1 Número de explantes libres de contaminación ........................... 37
3.11.2 Número de brotes regenerados por explantes ............................. 38
3.11.3 Número de hojas por explantes .................................................. 38
3.11.4 Número de raíces por explantes .................................................. 38
3.11.5 Longitud de la plántula ............................................................... 38
3.11.6 Porcentaje total de necrosis por oxidación ................................. 39
xi
IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES ............................................. 40
4.1 PORCENTAJE DE CONTAMINACIÓN EN LA ETAPA 1 ................................ 40
4.1.1 Número de explantes nuevos y porcentaje de contaminación en la
etapa 2 .................................................................................................... 41
4.1.1.1 Primer repique o primera generación “L1” (día 28 al 48) ...... 41
4.1.1.2 Segundo repique o segunda generación “L2” (día 49 al 69) .. 42
4.1.1.3 Tercer repique o tercera generación “L3” (día 70 al 90) ........ 43
4.1.1.4 Cuarto repique o cuarta generación “L4” (día 91 al 111) ...... 44
4.1.1.5 Quinto repique o quinta generación “L5” (día 112) ............... 45
4.1.1.5.1 Porcentaje de contaminación en “L5” (día 112 al 140) ... 46
4.2 NÚMERO DE BROTES POR EXPLANTE EN “L4” ....................................... 47
4.3 NÚMERO DE HOJAS POR EXPLANTES EN “L5” ....................................... 48
4.4 NÚMERO DE RAÍCES POR EXPLANTE EN “L5” ........................................ 50
4.5 LONGITUD DE LA PLÁNTULA EN “L5” ................................................... 51
4.6 PORCENTAJE DE NECROSIS POR OXIDACIÓN .......................................... 52
V. DISCUSIÓN ........................................................................................... 53
5.1 CONTAMINACIÓN ................................................................................. 53
5.2 BROTES ................................................................................................ 60
5.3 HOJAS .................................................................................................. 62
5.4 RAÍCES ................................................................................................. 63
5.5 LONGITUD DE PLÁNTULAS .................................................................... 63
5.6 OXIDACIÓN .......................................................................................... 64
VI. CONCLUSIONES ............................................................................... 66
VII. RECOMENDACIONES .................................................................... 67
VIII. RESUMEN ........................................................................................ 68
IX. SUMARY .............................................................................................. 70
X. LITERATURA CITADA ..................................................................... 72
XI. ANEXOS ............................................................................................... 86
XII. FIGURAS DE ANEXOS .................................................................. 98
xii
ÍNDICE DE CUADROS
Págs.
Cuadro 1. Composición de los macronutrientes. ....................................... 29
Cuadro 2. Composición de los micronutrientes. ....................................... 29
Cuadro 3. Composición de los quelatos. ................................................... 30
Cuadro 4. Composición de las vitaminas. ................................................. 30
Cuadro 5. Azúcar. ...................................................................................... 30
Cuadro 6. Composición del Phytagel. ....................................................... 31
Cuadro 7. Descripción de los tratamientos. ............................................... 36
Cuadro 8. Análisis de varianza. ................................................................. 37
Cuadro 10. Porcentaje de contaminación de los explantes
hasta los 27 días en la etapa 1 (L0), 2014. ........................................ 40
Cuadro 11. Número de explantes obtenidos en el repique
(L1), porcentaje de contaminación, 2014. ........................................ 41
Cuadro 12. Número de explantes obtenidos en el repique
(L2), porcentaje de contaminación, 2014. ........................................ 42
Cuadro 13. Número de explantes obtenidos en el repique
(L3), porcentaje de contaminación, 2014. ........................................ 43
Cuadro 14. Número de explantes obtenidos en el repique
(L4), porcentaje de contaminación, 2014. ........................................ 44
Cuadro 15. Número de explantes obtenidos en el repique
(L5), 2014. ......................................................................................... 45
Cuadro 16. Porcentaje de contaminación en “L5”, 2014........................... 46
Cuadro 17. Número de brotes en cada uno de los
tratamientos, 2014. ............................................................................ 47
Cuadro 18. Análisis de varianza del número de brotes. ............................ 48
Cuadro 19. Número de hojas por explantes en cada uno de
los tratamientos, 2014. ...................................................................... 48
Cuadro 20. Análisis de varianza del número de hojas. .............................. 49
Cuadro 21. Número de raíces en cada uno de los
tratamientos, 2014. ............................................................................ 50
Cuadro 22. Análisis de varianza del número de raíces. ............................. 51
Cuadro 23. Longitud de las plántulas en cada uno de los
tratamientos, 2014. ............................................................................ 51
xiii
Cuadro 24. Análisis de varianza de la longitud de las
plántulas. ........................................................................................... 52
Cuadro 25. Promedio de los porcentajes de contaminación
en cada uno de los tratamientos. ....................................................... 58
xiv
ÍNDICE DE CUADROS DE ANEXOS
Págs.
Anexo 1: Esquema de micropropagación mediante el uso de
meristemos o brotes apicales (Alonso 2002,
modificado) ....................................................................................... 87
Anexo 2: Croquis del lugar donde se realizó el experimento..................... 88
Anexo 3: Fases del experimento ................................................................. 89
Anexo 4: Prueba de Tukey para número de brotes
(comparación múltiple) ..................................................................... 90
Anexo 5: Prueba de Tukey para número de brotes
(subconjuntos homogéneos) ............................................................. 91
Anexo 6: Prueba de Tukey para número de hojas
(comparación múltiple) ..................................................................... 92
Anexo 7: Prueba de Tukey para número de hojas
(subconjuntos homogéneos) ............................................................. 93
Anexo 8: Prueba de Tukey para número de raíces
(comparación múltiple) ..................................................................... 94
Anexo 9: Prueba de Tukey para número de raíces
(subconjuntos homogéneos) ............................................................. 95
Anexo 10: Prueba de Tukey para longitud de plántulas
(comparación múltiple) ..................................................................... 96
Anexo 11: Prueba de Tukey para longitud de plántulas
(subconjuntos homogéneos) ............................................................. 97
xv
ÍNDICE DE FIGURAS
Págs.
Figura 1. Porcentaje de contaminación total en la etapa 1
(L0) .................................................................................................... 40
Figura 2. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la etapa 1 (L0) ................................................................................... 41
Figura 3. Porcentaje de contaminación en la primera
generación “L1” ................................................................................ 42
Figura 4. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la primera generación “L1” ............................................................... 42
Figura 5. Porcentaje de contaminación en la segunda
generación “L2” ................................................................................ 43
Figura 6. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la segunda generación “L2” .............................................................. 43
Figura 7. Porcentaje de contaminación en la tercera
generación “L3” ................................................................................ 44
Figura 8. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la tercera generación “L3” ................................................................ 44
Figura 9. Porcentaje de contaminación en la cuarta
generación “L4” ................................................................................ 45
Figura 10. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la cuarta generación “L4” ................................................................. 45
Figura 11. Porcentaje de contaminación en la quinta
generación “L5” ................................................................................ 46
Figura 12. Porcentaje de contaminación por tratamientos en
la quinta generación “L5” ................................................................. 47
Figura 13. Medias del número de brotes por tratamientos ........................ 48
Figura 14. Medias del número de hojas por tratamientos .......................... 49
Figura 15. Medias del número de raíces por tratamientos ......................... 50
Figura 16. Medias de la longitud de las plántulas por
tratamientos ....................................................................................... 52
Figura 17. Porcentaje de necrosis por oxidación ....................................... 52
Figura 18. Porcentaje de contaminación en cada generación .................... 53
xvi
Figura 19. Porcentajes de contaminación en cada
generación por tratamiento. .............................................................. 57
Figura 20. Promedio de los porcentajes de contaminación. ...................... 58
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS DE ANEXOS
Págs.
Figura 1A. Recolectando los cormos (hijuelos de espada)
del plátano Dominico Hartón (Musa AAB
Simmonds). Lomas de Sargentillo, 2014. ......................................... 99
Figura 2A. Cormos que servirán de explantes para la
micropropagación. Lomas de Sargentillo, 2014. .............................. 99
Figura 3A. Lavando los cormos provenientes del campo.
Daule, 2014. .................................................................................... 100
Figura 4A. Recudiendo el tamaño de los cormos. Daule,
2014. ................................................................................................ 100
Figura 5A. Cormos puestos en cada uno de los tratamientos
de quitosano. Daule, 2014. .............................................................. 101
Figura 6A. Quitosano empleado en el experimento. Daule,
2014. ................................................................................................ 101
Figura 7A. Cantidad de explantes después del primer
repique o L1. Daule, 2014............................................................... 102
Figura 8A. Explantes después del segundo repique o L2.
Daule, 2014. .................................................................................... 102
Figura 9A. Medios de cultivos con las diferentes dosis de
quitosano para el tercer repique o L3. Daule, 2014. ....................... 103
Figura 10A. Desarrollo de los explantes en la tercera
generación o L3. Daule, 2014. ........................................................ 103
Figura 11A. En la cámara laminar, repicando los cormos.
Daule, 2014. .................................................................................... 104
Figura 12A. Repicando los cormos de L3. Daule, 2014. ......................... 104
Figura 13A. Terminando el repique de los explantes. Daule,
2014. ................................................................................................ 105
Figura 14A. Explante de plátano L4 contaminado por
hongos 1. Daule, 2014. ................................................................... 105
Figura 15A. Explante de plátano L4 contaminado por
hongos 2. Daule, 2014. ................................................................... 106
Figura 16A. Explantes desarrollándose. Daule, 2014. ............................. 106
xviii
Figura 17A. Toma del número de brotes que tiene el
explante de plátano. Daule, 2014. ................................................... 107
Figura 18A. Junto al Ing. Eison Valdiviezo en el
laboratorio AGROVITROPARIS. Daule, 2014. ............................ 108
Figura 19A. Número de brotes que presentaron en la cuarta
generación. Daule, 2014. ................................................................ 108
Figura 20A. Explante con necrosis por bacterias en L4.
Daule, 2014. .................................................................................... 109
Figura 21A. Seis tratamientos y 10 repeticiones para la
toma de las últimas variables en la etapa 3 (L5).
Daule, 2014. .................................................................................... 109
Figura 22A. Desarrollo de las plántulas en la quinta
generación o L5. Daule, 2014. ........................................................ 110
Figura 23A. Plántulas desarrollándose en el día 133 del
experimento. Daule, 2014. .............................................................. 110
Figura 24A. Evaluación de las variables. Daule, 2014. ........................... 111
Figura 25A. Tomando datos de las diferentes variables.
Daule, 2014. .................................................................................... 111
1
I. INTRODUCCIÓN
El cultivo de plátano (Musa AAB) representa un importante sostén para
la socioeconomía y seguridad alimentaria del país; desde este punto de vista
el plátano genera fuentes estables y transitorias de trabajo, además de
proveer permanentemente alimentos ricos en energía a la mayoría de la
población. Actualmente se reportan en el país un total de 144.981 ha de
plátano, de las cuales 86.712 ha están bajo el sistema de monocultivo y
58.269 ha se encuentran asociadas con otros cultivos (INEC, 2011).
La mayor zona de producción de esta musácea es la conocida como el
triángulo platanero, la cual abarca las provincias de Manabí, Santo
Domingo y Los Ríos, con 52.612, 14.249 y 13.376 ha, respectivamente. Las
principales variedades explotadas en estas zonas son el “Dominico”, que se
lo destina principalmente para el autoconsumo y el “Dominico Hartón”
(Musa AAB Simmonds) que se lo destina en su mayor parte a la
exportación, estimándose que anualmente se exportan alrededor de 90.000
TM de este cultivar (INIAP, 2013).
El interés de producir plátano para exportación crece cada día en el
Ecuador, ya que existen oportunidades para ampliar su venta en el mercado
internacional, siempre y cuando se ofrezca un producto de excelente
calidad. Al plátano se lo puede considerar como un producto marginal y
más si se lo compara con el banano, cuyo volumen de exportación es
considerable. Presenta algunas ventajas que los expertos se encargan de
resaltar: menor costo de producción, mejor precio de venta por caja,
2
estabilidad de los precios, mercados alternativos, posibilidad de exportar
durante todo el año y de colocar el rechazo en el mercado interno.
La reproducción asexual de plantas es una técnica muy importante para
la multiplicación in vitro del plátano, debido a la esterilidad de la especie.
En la actualidad, la atención está centralizada en aprovechar las ventajas
que presenta la metodología de propagación rápida mediante el cultivo de
tejidos (Müller & Sandoval, 1986).
El método consiste en cultivar asépticamente el “meristemo”
proveniente de hijuelos, en un medio nutritivo artificial; luego, mediante la
adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo, se estimula la
multiplicación y la obtención de plantas completas debido a la totipotencia
inherente en las células vegetales (Müller & Sandoval, 1986).
La multiplicación in vitro ha permitido la reproducción masiva de la
especie para plantaciones comerciales. Sin embargo, una de las limitantes
para la micropropagación in vitro de Musa spp. ha sido la alta tasa de
contaminación en los explantes en la etapa I del cultivo, debido
principalmente a contaminación endógena, acentuada en zonas tropicales,
donde las condiciones de alta temperatura y pluviosidad hacen que los
microorganismos encuentren un hospedero ideal en esta especie (Ortega et
al., 2011).
Es por esto que surge la necesidad de aplicar nuevas herramientas
biotecnológicas en este importante cultivo, para mejorar la obtención de
plantas destinadas a la producción. Algunas entidades del país ya están
3
realizando propagación in vitro a través de meristemos, lo que garantiza la
obtención de plantas libres de algunas enfermedades vasculares, además
existen cultivos establecidos con estas plantas y los resultados en
rendimiento y calidad de fruta son promisorios.
El plátano es un cultivo importante para la alimentación mundial y
Ecuador no es la excepción. Además, es un rubro de exportación
trascendental y una fuente sustancial de empleo en muchas zonas del país.
Debido a la importancia que tiene el cultivo, es necesario que existan
herramientas confiables para que el agricultor maneje el mismo desde las
primeras etapas de éste, adecuada y rentablemente.
Es por ello que se planteó la necesidad de establecer un adecuado
protocolo de desinfección que proporcionará un establecimiento de
explantes de plátano con bajo porcentaje de contaminación, como fase
inicial para la micropropagación in vitro de la especie a través de sus
“hijuelos”.
1.1 Objetivo general
Evaluar cinco dosis de quitosano para el establecimiento aséptico en
plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds).
4
1.2 Objetivos específicos
Determinar la dosis más eficiente de quitosano para evitar la
contaminación de patógenos en los medios de cultivos.
Comprobar si el uso de quitosano mejora el desarrollo de los brotes y
plántulas in vitro del plátano Dominico Hartón (Musa AAB
Simmonds).
Obtener plántulas in vitro de plátano Dominico Hartón (Musa AAB
Simmonds) desarrolladas caulinar y radicularmente.
5
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Clasificación taxonómica
La clasificación del plátano Dominico Hartón es la siguiente, según
Stover & Simmonds, 1987:
Clase: Monocotiledónea (herbácea)
Orden: Escitaminales
Familia: Musaceae
Género: Musa
Especie: Musa AAB Simmonds
Los nombres específicos se han abandonado y actualmente todos son
denominados por el complemento de su genoma. Se considera que existen
tres grupos de clones principales: AAA, AAB, y ABB (A: genoma
acuminata; B: genoma de balbisiana). Incluyendo mutantes somáticos se
encuentran cerca de 500 clones reconocidos, incluyendo también AA, AB,
AABB, AAAB (Faure et al., 1993; citados por Sánchez, 2002).
2.1.1 Morfología del plátano
El plátano es una planta anual, consta de cormo subterráneo (tallo) en el
cual nacen las raíces y los pecíolos de las hojas (pseudotallo); en la parte
superior del cormo está ubicado el meristemo principal el cual produce el
racimo. Cuando el racimo emerge viene protegido por hojas modificadas
llamadas brácteas generalmente de color rojo, y que al desprenderse van
descubriendo los grupos florales tanto masculinos como femeninos,
6
formándose a partir de estas últimas los frutos partenocarpicos y la bellota
(Vergara, 2010).
El desarrollo o llenado de los frutos está condicionado por la
acumulación de pulpa en las paredes internas de la cáscara, el tiempo de
formación del fruto desde la floración hasta la cosecha, fluctúa entre 14 y
18 semanas, punto en el cual el fruto no presenta aumento en peso fresco,
este periodo es afectado por condiciones ambientales que pueden alargarlos
o acortarlos; en la variedad Dominico Hartón el racimo tiene de seis a ocho
gajos pero en edad temprana se reduce a cinco gajos, cortando lo que
llaman la mano falsa para tener entre 25 y 35 frutos de gran tamaño.
Algunos cultivos no producen semilla pero se propagan vegetativamente
por medio de rizomas (Vergara, 2010).
2.1.2 Características del cormo o rizoma del plátano
Se considera que el cormo es el tallo verdadero de la planta, el cual es
subterráneo, con ramificaciones monopódicas de donde se originan las
hojas que parten del meristemo apical o punto vegetativo que se encuentra
en la parte superior del rizoma.
El tallo está formado por muchos entrenudos cortos, cubiertos
externamente por la base de las hojas y de los nudos brotan las raíces
adventicias. Un cormo bien desarrollado puede tener de 25 a 40 cm de
diámetro y pesar de 6,9 a 11,5 kg de acuerdo con el clon y la edad de la
planta.
7
Durante la emisión de hojas se producen los hijos que son yemas
laterales que salen del cormo original, opuestas a cada hoja en un ángulo de
180 grados de la posición original.
Las yemas vigorosas que forman nuevos retoños ocupan toda la longitud
del entrenudo y distorsionan el nudo inicialmente circular a causa de su
crecimiento (Mejía et al., 2000).
2.2 Cultivo in vitro
El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en emplear
una porción de planta denominada explante, y brindarle todas las
condiciones ambientales para que pueda expresar su “potencial intrínseco o
inducido” (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al., 2010).
Esta técnica es conocida como propagación in vitro porque se lleva a
cabo en frascos o recipientes transparentes, se desarrolla en condiciones
estériles empleando una dieta balanceada de nutrientes y hormonas,
contenida en un medio de cultivo que busca la regeneración de órganos,
tejidos e incluso plantas enteras (Abdelnour & Escalant, 1994; citados por
Jadán et al., 2010).
Esta técnica constituye una herramienta de propagación vegetativa, y al
igual que en otros casos, la descendencia presenta las mismas características
que la planta madre, es decir, son clones de la planta que la originaron,
hecho que no ocurre por la vía sexual donde se originan individuos únicos
(Abdelnour & Escalant, 1994; citados por Jadán et al., 2010).
8
El éxito de esta técnica radica en la capacidad de desdiferenciar a las
células del explante y devolverles su capacidad de multiplicarse y
especializarse en cualquier tipo de tejido (Cubero, 2003; citado por Jadán et
al. 2010).
El cultivo in vitro de tejidos vegetales presenta una serie de ventajas,
frente a los métodos de propagación convencionales; entre éstas se pueden
incluir: obtención de miles de plantas a partir de una planta madre;
reducción del tiempo necesario para la multiplicación de una planta;
reducción de las áreas físicas empleadas para la multiplicación, así como la
reducción de costos; estricto control sobre las condiciones de sanidad del
material multiplicado; facilidades en el transporte de material vegetal
incluso de un país a otro, pues las restricciones aduaneras son mucho
menores y la posibilidad de reproducir especies de las cuales existan pocos
individuos (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
2.2.1 Etapas del cultivo in vitro
La micropropagación comprende una serie de eventos que pueden
agruparse en cinco etapas claramente definidas (Anexo 1): la etapa cero en
la que se selecciona el material vegetal con el que se va a trabajar; la etapa
uno o de establecimiento, en la cual se establece un cultivo primario; la
etapa dos o de multiplicación, en la que se busca obtener la mayor cantidad
de plántulas; la etapa tres o de enraizamiento, donde se busca volver a la
planta autotrófica y capaz de sobrevivir en condiciones de campo; y, la
etapa cuatro o de transferencia final al campo (Roca & Mroginski, 1991;
citados por Jadán et al. 2010).
9
2.2.1.1 Etapa cero: selección del material vegetal
Uno de los factores determinantes en el éxito del cultivo in vitro de una
especie es el origen del explante a utilizarse, éste puede variar de acuerdo al
objetivo de la técnica de cultivo in vitro a utilizarse.
Existen factores que deben ser tomados en cuenta como son: el origen de
la planta madre y las condiciones en las que se desarrolló, pues, plantas de
campo pueden ofrecer mayores inconvenientes que plantas de invernadero;
la edad de la planta madre, porque no hay que olvidar que el material
vegetal obtenido tendrá la misma edad biológica que la planta madre y por
último, el estado fisiológico de la planta madre pues ésta debe encontrarse
en buenas condiciones nutritivas, metabólicas y de sanidad para proveer
material vegetal de óptimas características (Abdelnour & Escalant, 1994;
citados por Jadán et al. 2010 ).
Una vez que se haya determinado cuál es la mejor planta para iniciar el
cultivo, es necesario seleccionar el explante a usarse, lo cual depende de: el
tipo de cultivo a iniciarse, el propósito del cultivo y la especie vegetal con
la cual se trabajará (George et al., 2008; citados por Jadán et al. 2010).
2.2.1.1.1 Fase de desinfección
Uno de los principales factores que contribuyen al establecimiento de
cultivos asépticos es la desinfección exitosa de la superficie del explante a
emplearse, debido a que si sobre el explante persiste algún microorganismo,
ya sea hongo o bacteria, éstos destruirían el cultivo pues compiten con el
10
explante por los nutrientes del medio, siendo ellos más exitosos por sus
altas tasas de multiplicación y desarrollo acelerado (Roca & Mroginski,
1991; citados por Dávila, 2011).
En la actualidad existe una serie de agentes químicos que aportan a la
desinfección de un material vegetal, dentro de estos agentes se pueden
mencionar a: alcohol al 70 %; hipoclorito de sodio en concentraciones de
entre 1 % y 3 %, cuya principal fuente es el cloro comercial; otros
desinfectantes usados menos frecuentemente son el hipoclorito de calcio y
el cloruro de mercurio; cabe recalcar que este último es de naturaleza tóxica
y no se remueve fácilmente de la superficie del explante (Roca &
Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
En ocasiones es útil incluir en el protocolo de desinfección el empleo de
un tensoactivo como es el Monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 20),
en concentraciones no mayores a 0,1 %, siempre y cuando se use antes de
aplicar alcohol (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
La función del tensoactivo o detergente es romper la tensión superficial
y permitir que los agentes químicos estén en mejor contacto con el explante
(Abdelnour & Escalant, 1994; citados por Jadán et al. 2010).
Mientras se realiza la desinfección debe buscarse eliminar la totalidad de
microorganismos, sin afectar la integridad del explante y su viabilidad. No
es posible establecer un mismo protocolo de desinfección para cualquier
explante de cualquier especie, éste debe ser diseñado en función de varios
factores (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
11
2.2.1.1.2 Medio de cultivo
Una vez que se ha determinado el objetivo de cultivo in vitro es
necesario seleccionar un medio de cultivo que contenga todos los nutrientes
necesarios para obtener la respuesta deseada; además de los componentes
del medio de cultivo es muy importante la forma en la que éste se prepara
(Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
Es necesario tener en cuenta que el material vegetal sólo va a crecer en
un medio que le suministre todos los nutrientes necesarios, generalmente un
medio de cultivo contiene una solución de sales que aportan con macro y
micronutrientes esenciales, acompañados por vitaminas, reguladores de
crecimiento, aminoácidos y una fuente de carbono (George et al., 2008;
citados por Jadán et al. 2010).
Para un crecimiento adecuado, el medio de cultivo debe contener altas
cantidades de elementos como: nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca),
fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S); estos son los denominados
macronutrientes. Adicionalmente, se requiere de pequeñas cantidades de
elementos como: hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), zinc
(Zn), boro (B), cobre (Cu) y molibdeno (Mo); estos son conocidos como
microelementos o elementos traza. Estos elementos junto al carbono (C),
oxígeno (O) e hidrógeno (H) se conocen como esenciales (George et al.,
2008; citados por Jadán et al. 2010).
El medio de cultivo también es fuente de sustancias orgánicas en forma
de carbohidratos que reemplaza al carbono que las plantas toman del
12
ambiente como materia prima para iniciar la fotosíntesis (George et al.,
2008; citados por Jadán et al. 2010).
La fuente de carbono es muy importante porque escasos cultivos son
autótrofos en condiciones in vitro, es por ello que el medio de cultivo debe
incluir una fuente de carbono como la sacarosa o cualquier otro azúcar
(Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
Las vitaminas son un elemento más del medio de cultivo, entre las que
se encuentran la tiamina o vitamina B1, el ácido nicotínico o niacina y la
piridoxina o vitamina B6; éstas, junto al mioinositol, son consideradas
esenciales en muchos casos; sin embargo, no todas las vitaminas pueden ser
consideradas totalmente esenciales o inútiles, su ausencia o presencia en el
medio y sus concentraciones dependen de la especie vegetal y el tipo de
cultivo que se esté desarrollando (George et al., 2008; citados por Jadán et
al. 2010).
En lo que se refiere al agente gelificante, la cantidad del mismo está en
función de la clase de medio de cultivo que se desee preparar, usándose
concentraciones desde 0,6 % hasta 1 % (Roca & Mroginski, 1991; citados
por Jadán et al. 2010).
Entre los reguladores de crecimiento más comúnmente usados están las
auxinas: ácido dicloro fenoxiacético (2,4-D), ácido naftalenacético (ANA),
ácido indolacético (AIA), ácido indolbutírico (AIB); las citoquininas:
kinetina (KIN), benzilamino purina (BAP), zeatina (ZEA); y las giberelinas
como el ácido giberélico (AG3). Éstas pueden usarse por separado o juntas,
13
guardando un balance de acuerdo a lo que se pretenda obtener del cultivo
(Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).
Existen además otros componentes que pueden o no incluirse en el
medio de cultivo, entre ellos se encuentran: el agua de coco, extracto de
levadura, extracto de tubérculos de papá, glicina o cisteína como fuentes de
nitrógeno, así como otros aminoácidos (Roca & Mroginski, 1991; citados
por Jadán et al. 2010).
2.2.1.2 Etapa uno: fase de establecimiento
Una vez que se cuenta con el material vegetal desinfectado y los medios
de cultivo preparados y estériles se da inicio a la etapa de establecimiento,
en la cual el explante es introducido en el medio de cultivo bajo condiciones
de asepsia total, generalmente, en cámaras de flujo laminar que reduzcan al
mínimo las posibilidades de contaminación del explante o del medio de
cultivo. Luego de esta operación los frascos que contienen a los explantes
son llevados a la sala de incubación donde permanecerán hasta presentar
algún cambio, necrosis o contaminación (Roca & Mroginski, 1991; citados
por Jadán et al. 2010).
2.2.1.3 Etapa dos: fase de multiplicación
Si la fase de introducción fue superada con éxito y el explante responde
adecuadamente a los componentes del medio de cultivo y a las condiciones
de incubación, es posible observar la formación de tejido nuevo en el
explante; este tejido puede ser fragmentado y trasladado a nuevos medios
14
de cultivos en el cual podrá seguir desarrollándose, dando lugar a la
formación de tejido indiferenciado o formación de brotes.
En cualquiera de los dos casos el tejido nuevo permite reproducir el
explante inicial dando lugar a la multiplicación que alcanza niveles
exponenciales.
De modo general, se emplean medios de cultivo diferentes en las fases
de introducción y multiplicación de cualquier especie, con el fin de
conseguir una organización celular adecuada (Cubero, 2003; citado por
Jadán et al. 2010).
2.2.1.4 Etapa tres: fase de enraizamiento
Luego de la etapa de multiplicación es necesario dar paso al proceso de
enraizamiento en los brotes propagados in vitro, lo cual requiere, en la
mayoría de los casos, el traspaso a un medio de cultivo nuevo.
Existe una serie de modificaciones que puede tener dicho medio, con el
objetivo de inducir la emisión de un sistema radicular, entre las que se
encuentran: disminución de la concentración de sales, cambio en el balance
hormonal a favor de auxinas exógenas, eliminación de citoquininas
exógenas o disminución de la fuente de carbono (Roca & Mroginski, 1991;
citados por Jadán et al. 2010).
15
2.2.1.5 Etapa cuatro: aclimatación de las plántulas enraizadas
Una vez que las plántulas tengan un adecuado sistema radicular, estas
son trasladas a invernadero donde tienen que hacer frente a una serie de
factores adversos para los cuales no están preparadas fisiológicamente.
Las plántulas han crecido y desarrollado en ambientes con humedades
relativas muy altas por lo que sus estomas no son funcionales de modo
parcial o completamente; adicionalmente, las plántulas no cuentan con
cutícula que es una capa cerosa que impide la pérdida de agua y la
desecación de las plántula (Castillo, 2004; citado por Jadán et al. 2010).
2.2.2 Experiencia de cultivos in vitro en musáceas
La micropropagación ha sido usada para reproducir en forma masiva el
banano y plátano. La propagación clonal rápida fue la principal aplicación
de la técnica del cultivo de tejidos vegetales en Musa; otras aplicaciones
importantes han sido la erradicación de enfermedades y la conservación e
intercambio de germoplasma (Robles & Mora, 1996; citados por López,
2010).
En Musa, la escasez de plántulas para el establecimiento de nuevas
plantaciones y la utilización de propágulos infectados con virus y en
especial por nemátodos, representan una seria desventaja.
Mediante el cultivo de tejidos en Musa es posible transferir al campo
material sano, disponer del material de siembra en cualquier época del año,
16
multiplicar aceleradamente genotipos deseables, transportar fácilmente los
propágulos y uniformizar las plantaciones y cosecha (Robles & Mora, 1993;
citados por López, 2010).
Los primeros reportes de plantas del género Musa producidas por cultivo
in vitro, vinieron de Taiwán y China a principio de los años 70´s (Robles &
Mora, 1993; citado por López, 2010). A partir de 1980, un amplio rango de
especies y cultivares de Musa han sido propagadas con éxito mediante el
cultivo in vitro de ápices (López, 2010).
En musáceas, la micropropagación ha sido obtenida por diferentes vías,
mediante el cultivo de embriones cigóticos (Cronauer & Krikorian, 1988;
Escalant & Teisson, 1988); tejido foliar y rizoma (Novak et al., 1989);
meristemos altamente proliferantes o escalpos (Dhed’a et al., 1991) y a
partir de flores masculinas (Ma, 1991) y femeninas (Grapin et al., 1998).
Estas dos últimas técnicas han sido las más exitosas, lo cual ha
permitido el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas
(SCE), la regeneración, germinación de embriones, el desarrollo de plantas
y su evaluación en campo.
2.2.3 Principales problemas en el cultivo in vitro
Cada uno de los pasos necesarios en el proceso de cultivo in vitro tiene
sus problemas específicos, aunque algunos de ellos se pueden implicar en
dos o más etapas (Debergh & Read, 1991). Los principales problemas son:
la contaminación de los explantes y la oxidación fenólica (Alonso, 2002).
17
2.2.3.1 Contaminación
Las contaminaciones pueden causar pérdidas económicas muy
importantes dentro de la técnica de cultivo in vitro. La contaminación, más
que matar a los explantes directamente, invade el cultivo haciendo que el
explante no sea apto para su micropropagación (Debergh & Read, 1991;
citados por Recalde, 2007).
La mayor parte de los contaminantes en el cultivo de tejidos proceden de
la planta donadora. Al establecer los cultivos y dependiendo del explante
que se utilice, se pueden transmitir microorganismos de la superficie del
explante o de su interior.
Con el cultivo de meristemos se pueden eliminar la mayoría de los
organismos; sin embargo, en el caso de hojas, peciolos y tallos casi todos
los microorganismos en el tejido pueden transmitirse (Bhojawani &
Razdab, 1996; citados por Recalde, 2007). Por lo tanto, es conveniente
analizar las plantas madres de las cuales proceden los explantes en
búsqueda de individuos limpios.
Los principales microorganismos asociados a las superficies de las
plantas son: hongos, levaduras, bacterias y molicutes (fitoplasmas,
espiroplasmas y organismos relacionados). Muchos de estos
microorganismos se pueden eliminar mediante esterilizaciones
superficiales. Los microorganismos endófitos que se pueden desarrollar en
las plantas pueden ser: virus, viroides, bacterias, micoplasmas y hongos, y
18
pueden afectar de forma inter o intracelular (Toro, 2004; citado por
Recalde, 2007).
Las plantas contaminadas pueden tratarse mediante termoterapia y/o
cultivo de meristemos, o también aplicando productos antifúngicos,
antibióticos y antivíricos a las plantas durante la desinfección del material
vegetal, aunque en ocasiones estos compuestos químicos pueden tener
efectos bioestáticos más que biocidas (Trujillo, 2004; citado por Recalde,
2007).
2.2.3.2 Oxidación fenólica
La producción de compuestos fenólicos se estimula cuando las plantas se
exponen a situaciones de estrés como pueden ser los daños mecánicos que
se producen al aislar los explantes de la planta madre (Debergh & Read,
1991; citados por Recalde, 2007).
Las superficies de corte de muchos explantes comienzan a decolorarse
justo después de cortarlas. Los explantes completos o partes de ellos
frecuentemente continúan oscureciéndose cuando se introducen en el
recipiente de cultivo y exudan sustancias que producen a su vez el
oscurecimiento del medio (George, 1996; citado por Recalde, 2007).
2.3 Quitosano
El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico. Es un polímero
policatiónico que contiene más de 5.000 unidades de glucosamina; es un
19
compuesto derivado de la quitina en forma parcialmente desacetilada 2-
amino2-deoxy-β-D-glucosa (Pastor de Abram, 2004; citado por García,
2010).
Sus cargas positivas le confieren numerosas propiedades fisiológicas y
biológicas, con un gran potencial y amplio intervalo de uso en la industria
farmacológica, médica y agrícola (Liu et al., 2004; Bautista et al., 2005;
citados por García, 2010).
Este compuesto posee propiedades antifúngicas, ya que en previos
estudios in vitro se observó que inhibió el crecimiento micelial,
esporulación y germinación de varios hongos.
Otros estudios también reportaron que el quitosano no sólo afectó el
crecimiento y desarrollo del patógeno, sino que también indujo cambios
morfológicos, alteraciones estructurales y desorganización molecular de las
células de algunos hongos fitopatógenos e incluso bacterias (El-Ghaouth et
al., 1997; Ait-Barka et al., 2004; citados por García, 2010).
La interacción de quitosano-membrana genera afectaciones en la
integridad de membrana e inclusive se ha observado en bicapas de lípidos y
provoca la formación transitoria de agujeros por donde podrían liberarse
proteínas (Hong et al., 2006; citados por García, 2010).
20
2.3.1 Propiedades del quitosano (según Lárez, 2008)
2.3.1.1 Actividad bactericida
La carga positiva que se desarrolla en el quitosano en medio ácido (pH <
5), debido a la protonación del grupo amino presente en cada una de sus
unidades glucosamina, lo hace soluble en medio acuoso, diferenciándolo de
su polímero matriz quitina, y, según muchos autores, confiriéndole también
mayor actividad biocida (Papineau et al., 1991; Helander et al., 2001;
Devlieghere et al., 2004).
Los mecanismos de acción por los cuales el quitosano (con distintos
grados de acetilación), y por extensión sus derivados, ejercen dicha
actividad no han sido dilucidados completamente; sin embargo, hay algunos
mecanismos propuestos para explicar acciones específicas, como por
ejemplo:
La interacción electrostática entre el quitosano cargado positivamente
(polielectrolito catiónico) y algunas bacterias con membranas
celulares cargadas negativamente (Gram negativas como la
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
typhimurium, etc.) altera significativamente las propiedades de
barrera de la membrana exterior del microorganismo (Helander et al.,
2001).
Algunos autores han propuesto que la formación del complejo
polielectrolito bloquea físicamente la membrana celular externa del
microorganismo, impidiendo el flujo normal de
21
nutrimentos/desechos, provocando la muerte bacteriana (Chung et
al., 2004).
La interacción electrostática entre los grupos NH3+ del policatión y
los grupos fosforilos (Fernández et al., 2003) de los fosfolípidos
presentes en la membrana celular de bacterias Gram negativas causa
daños en ésta, provocando la salida de material intracelular (Liu et
al., 2004).
En este sentido se han realizado estudios espectroscópicos de la
salida de dicho material, el cual absorbe en la región ultravioleta (270
nm).
Más recientemente, Chung & Chen (2008), han determinado que la
salida del material intracelular bacteriano se ve favorecida por grados
de acetilación más altos, tanto en bacterias Gram negativas (E. coli)
como en Gram positivas (Staphylococcus aureus).
Para algunas bacterias Gram positivas (como S. aureus y Bacillus
cereus) que carecen de cargas negativas en la membrana celular, el
quitosano ha mostrado actividad incluso mayor, en algunos casos,
que para bacterias Gram negativas.
En el caso de S. aureus recientemente se ha planteado la posibilidad
de que la membrana celular de estos microorganismos tenga poros lo
suficientemente grandes como para que el quitosano logre entrar al
interior de las células (Li et al., 2007) y alterar funciones vitales de
éstas.
Su interacción con el ADN, por ejemplo, podría inhibir la replicación
del ARNm y la síntesis de proteínas (Hadwiger et al., 1986;
22
Sudarshan et al., 1992) y su efecto quelante podría disminuir la
concentración de algunos metales necesarios en procesos enzimáticos
(Cuero et al., 1991).
Sin embargo, otros autores creen que la longitud de persistencia del
quitosano cargado positivamente es demasiado grande para poder
pasar al interior de las células (Chung et al., 2003).
La interacción selectiva del quitosano con trazas de metales pudiera
inhibir la producción de toxinas y el crecimiento microbiano
(Sudarshan et al., 1992). En este sentido se conoce bien que el
quitosano puede ejercer una acción quelante bien específica (Varma
et al., 2004).
2.3.1.2 Actividad fúngica
La actividad fungicida del quitosano se ha estudiado, tanto in vitro (El-
Ghaouth et al., 1992) como in vivo (Li & Yu, 2001; Yu et al., 2007). El
quitosano inhibe multitud de especies de hongos, exceptuando, o siendo
menos efectivo con aquellas que lo poseen en sus paredes celulares (Roller
& Covill, 1999; Allan & Hardwiger, 1979).
Los hongos que poseen quitosano como componente de sus paredes
celulares deberían ser menos sensibles a la aplicación de dosis razonables
de éste por dos razones: (a) la presencia natural de quitosano en las paredes
celulares no genera efectos adversos para el microorganismo, y, (b) las
interacciones electrostáticas del quitosano añadido (exógeno), cargado
positivamente, deberían verse menos favorecidas con paredes celulares que
23
poseen quitosano endógeno que cuando éstas poseen material con cargas
negativas.
Estos estudios han dejado claros los principales requerimientos que
deben satisfacerse para lograr una mayor efectividad fungicida del
biopolímero.
Los más importantes son:
Existe una alta correlación entre la concentración de quitosano
aplicada y la inhibición fúngica; por ello, para una buena efectividad,
se deberá encontrar la dosis adecuada en cada situación.
Existen evidencias de que la sensibilidad de los hongos patógenos
hacia el quitosano puede cambiar en los diferentes estadios de su
desarrollo.
Por ejemplo, en el trabajo de Liu et al. (2007), se reporta que el
quitosano es mejor inhibidor de la germinación de Penicillium
expansum que la de Botrytis cinerea, contrariamente a lo que se
observó en el crecimiento micelial de estas especies.
De manera similar, un estudio reciente ha mostrado que el quitosano
es más efectivo sobre los conidios que sobre las hifas de algunos
hongos fitopatógenos (Palma et al., 2008).
En general, estos resultados son similares a los reportados para otros
agentes fungicidas, como por ejemplo, el caso reportado por Everett
et al. (2005), quienes encontraron que la germinación de esporas de
Botryosphaeria parva fue menor con la aplicación del agente
24
fluazinam que la de Colletotridum gloeosporioiodes, pero ocurrió lo
contrario para la inhibición del crecimiento micelial.
2.3.1.3 Estimulador del crecimiento
En términos generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos
positivos en el crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la
germinación de semillas como en el crecimiento de partes de la planta como
raíces, retoños y hojas.
En algunos casos, se ha observado que la estimulación de la germinación
de semillas por tratamiento con quitosano ha logrado elevar el porcentaje de
germinación a los niveles requeridos para la certificación (Bhaskara et al.,
1999).
2.3.2 Proceso químico para la obtención de la quitina
La α-quitina se obtiene comercialmente del exoesqueleto de cangrejos y
camarones. El exoesqueleto tiene como componentes principales quitina,
carbonato de calcio y proteínas. También contiene pigmentos y grasa en
pequeñas cantidades. La quitina es muy estable a los ácidos y álcalis y no es
soluble en disolventes ordinarios.
Por lo tanto, se puede aislar como un producto que permanece después
de la descomposición con ácido y álcali de las otras sustancias presentes en
el exoesqueleto.
25
El exoesqueleto primero se limpia y trata con ácido para remover el
carbonato de calcio. Para la desmineralización generalmente se utiliza HCl,
HNO3, H2SO3, CH3COOH o HCOOH, pero el HCl es el preferido durante 1
a 48 horas, a temperaturas que varían de 0 a 100 °C. El HCl durante el
proceso también disminuye el peso molecular de la quitina.
El exoesqueleto descalcificado se corta en pequeños pedazos o se
pulveriza y se desproteiniza con tratamientos alcalinos. La solución alcalina
penetra en los intersticios de la matriz del caparazón para romper el enlace
entre las proteínas y la quitina.
Típicamente se trata con soluciones acuosas de NaOH durante 1 a 72
horas a temperaturas que varían de 65 a 100 °C. La quitina se obtiene como
un polvo blanquecino. El tratamiento alcalino, además, produce
desacetilación en la molécula de quitina. También se pueden utilizar
métodos complementarios al tratamiento ácido-base. Por ejemplo, la
degradación enzimática de las proteínas con proteasas en condiciones
suaves. Sin embargo, después del tratamiento permanece proteína residual
de entre 1 a 7 % y el tiempo de reacción es más largo comparado con el
método químico (Osuna, 2012).
26
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Ubicación del experimento
La presente investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivos de
tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, ubicada en:
Provincia: Guayas
Cantón: Daule
Dirección: Av. Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434
Número telefónico: 042797639
3.2 Datos geográficos
La empresa está localizada al noreste del cantón, a una altitud de 15
m.s.n.m y en un terreno de topografía plana, con una Latitud Sur de 1º 51'
37,77" S (613866.52 UTM)1/
y una Longitud Occidental de 79º 58' 34,42"
W (9794326.09 UTM)1/
.
3.3 Datos climáticos
La temperatura media anual es de 28 oC, tiene una precipitación media
anual de 1.607,86 mm; con una humedad relativa anual de 76 %2/
y una
humedad relativa máxima del 84 %2/
(enero) y una mínima del 66 %
(diciembre)2/
.
1/Fuente: http://www.mundivideo.com/coordenadas_chrome.htm (2014)
2/Fuente: Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (INAMHI, 2013)
27
3.4 Duración del experimento
El inicio del ensayo se lo realizó en la tercera semana de enero del 2014
y culminó a inicios de junio del mismo año.
3.5 Materiales y equipos
3.5.1 Materiales de laboratorio
Cajas de petri
Hojas de bisturí
Autoclave
Agujas
Mechero
Medio de cultivo MS
Hidróxido de sodio
Agua destilada estéril
Alcohol al 75 %
Gradilla
Micropipeta
Agitador magnético
Tirillas de tornasol
Papel kraf
Papel de aluminio
Marcador permanente
Phytagel
Monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80)
28
Hipoclorito de sodio (Cloro)
Cloruro de mercurio
Sulfato de Cobre Pentahidratado (Phyton)
Frascos de cristal
3.5.2 Equipos
Cámara vertical
Estereoscopio
Balanza de precisión
Refrigeradora
Estanterías con lámparas fluorescentes
3.5.3 Material vegetal
Para este estudio se utilizó como material vegetal de inicio cormos (de
espada) de plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds), recolectado
en la Hcda. La Lorena, que se encuentra en el Rcto. Las Cañas, cantón
Lomas de Sargentillo (Guayas).
3.5.4 Material químico para la propagación o medio de cultivo
3.5.4.1 Macronutrientes MS
Como medio de cultivo se usó la fórmula de Murashige & Skoog (MS,
1962) para macronutrientes; el mismo que estaba constituido por los
siguientes reactivos químicamente puros, y son:
29
Cuadro 1. Composición de los macronutrientes.
Nombres: Fórmula química Concentración en mg/L
Nitrato de amonio NH4NO3 1.650,00
Nitrato de potasio KNO3 1.900,00
Cloruro de calcio CaCl2 . 2H2O 332,02
Sulfato de magnesio MgSO4 . 7H2O 80,70
Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 170,00
3.5.4.2 Micronutrientes ms
Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962). Estuvo constituido
por los siguientes reactivos químicamente puros:
Cuadro 2. Composición de los micronutrientes.
Nombres: Fórmula química Concentración en mg/L
Yoduro de potasio KI 0,83
Ácido bórico H3BO3 6,20
Sulfato de manganeso MnSO4 . 4H2O 22,30
Sulfato de zinc ZnSO4 . 7H2O 8,60
Molibdato de sodio Na2MoO4 . 2H2O 0,25
Sulfato cúprico CuSO4 . 5H2O 0,025
Cloruro de cobalto CoCl2 . 6H2O 0,025
3.5.4.3 Quelatos de hierro MS
Se usó el de Murashige & Skoog (MS, 1962), estando constituido de los
siguientes elementos:
30
Cuadro 3. Composición de los quelatos.
Nombres: Fórmula química Concentración en g/L
Sulfato ferroso FeSO4 . 7H2O 5,57
Ácido etilendiamintetracético disodio Na2 . EDTA . 2H20 7,45
3.5.4.4 Vitaminas Morel
Fueron usadas según la fórmula de Morel (1950), y estuvieron
constituidas por las siguientes vitaminas:
Cuadro 4. Composición de las vitaminas.
Nombres: Fórmula química Concentración en mg/L
Pantotenato de calcio (vitamina B5) C18H32CaN2O10 1,00
Mio-inositol (vitamina B8) C6H12O6 100,00
Ácido nicotínico (vitamina B3) C21H27N7O14P2 1,00
Piridoxina HCL (vitamina B6) C8H11NO3 1,00
Tiamina (vitamina B1) C12H17N4OS+ 1,00
Biotina (vitamina B7) C10H16N2O3S 0,01
3.5.4.5 Sacarosa
Como fuente de carbohidrato, se aplicó azúcar común en la siguiente
concentración:
Cuadro 5. Azúcar.
Nombre: Fórmula química Concentración en g/L
Sacarosa (azúcar) C12H22O11 30
31
3.5.4.6 Phytagel
Los explantes fueron colocados en el interior de la superficie de un gel
acuoso solidificado, éste le dio la dureza a los medios de cultivos.
Cuadro 6. Composición del Phytagel.
Nombre: Fórmula química Concentración en g/L
Phytagel C6H12O6 + sphingomonas elodea 2
3.5.5 Material experimental
Se probó el quitosano ya que éste teóricamente serviría para reducir la
contaminación de patógenos y ayudaría al desarrollo de los brotes y de las
plántulas.
3.6 Unidad de observación
Los frascos que, para el inicio fueron utilizados, poseían un volumen de
capacidad de 100 ml (4,5 cm de diámetro y 6 cm de altura), sellados con
una lámina de aluminio y envuelto en plástico transparente, donde se
dispensaron 20 ml de medio de cultivo y las dosis de quitosano a estudiar.
3.7 Consideraciones para la micropropagación in vitro
Para el éxito de esta técnica de propagación masiva se necesitaron ciertas
consideraciones que no pudieron ser alteradas u omitidas.
32
3.7.1 Esterilización de los explantes
Fue indispensable realizar una asepsia rigurosa utilizando el
desinfectante cloruro de mercurio (HgCl2), hipoclorito de sodio (cloro) y
monooleato de polioxietilensorbitan (tween 80).
3.7.2 Factores físicos
Los factores físicos que se tomaron en cuenta son: la temperatura, la cual
va en los intervalos de 20 a 25 ºC (se estableció la temperatura idónea de
acuerdo con la exigencia de los explantes); la luz, la cual fue requerida para
la fotosíntesis de los explantes verdes cultivados in vitro, además la
luminosidad fue indispensable para regular ciertos procesos morfológicos,
la misma que fluctuó en las intensidades normales contenidas en las
lámparas fluorescentes tubulares de 40 w, a base de neón.
3.7.3 Área estéril
Fue necesario trabajar con toda la limpieza posible y disponer de una
cámara aséptica, la cual debió ser limpiada con alcohol y ponerse a
funcionar una hora antes de su utilización. Además, se usó el tubo de luz
ultravioleta (UV) para que funcione fuera de las horas de servicio, ya que
éste ayudó a controlar la asepsia del área. Esta cámara aséptica debió estar
equipada con mecheros de alcohol, que se utilizaron para flamear los
instrumentos colocados con alcohol (bisturí, cuchillas, pinzas y agujas),
recipientes estériles (cajas de Petri, frascos), papel de filtro y agua destilada.
33
Los medios de cultivo y agua destilada fueron estelarizados en la
autoclave a 15 lbs/in2 (103,4 Kpa) a 121
oC de temperatura durante 20
minutos.
3.8 Procedimientos realizados en el experimento
3.8.1 Etapa 0 (día 1)
Los cormos de plátanos fueron tomados de plantas madres de buen
aspecto agronómico, donde se seleccionaron 18 cormos; luego, se
eliminaron las raíces y los restos de tierra para que finalmente sean lavados
con abundante agua.
3.8.2 Etapa 1 (desde el día 1 hasta el día 27)
En el laboratorio las muestras fueron reducidas a un tamaño aproximado
de 5 cm. Para su desinfección éstas se sumergieron en solución de
hipoclorito de sodio al 20 % y una solución de agua destilada estéril al 80 %
durante 20 minutos.
Seguidamente se pasaron con otro enjuague de cloruro de mercurio (3
gotas/500 ml) dentro de la cámara y finalmente fueron lavados con
abundante agua estéril. Se realizaron más cortes longitudinales y
transversales, reduciendo su tamaño hasta llegar a 10 mm x 10 mm.
Posteriormente, se los sembró uno en cada frasco con medio de cultivo
Murashige & Skoog (MS), agregándoles cisteína y citocininas. En esta
34
etapa ya se les adicionaron las distintas dosis de los tratamientos de
quitosano a estudiar (ítem 3.9.1).
La formulación química que se colocó en cada frasco en esta etapa fue:
Macronutrientes (MS)
Micronutrientes (ms)
Quelatos de hierro (MS)
Vitaminas (Morel)
Sacarosa (azúcar)
Phytagel
pH (5,6)
Quitosano (5 dosis + testigo)
+
28 mg/L de cisteína
2 mg/L de BAP (citocinina – benziladenina)
3.8.3 Etapa 2 (desde el día 28 hasta el día 111)
En esta fase los brotes que se alargaron y ensancharon, además que se
encontraron libres de patógenos contaminados y sobrevivieron a la
oxidación, fueron repicados (divididos) cada 20 días, hasta llegar a la 5ta.
generación de explantes (una generación por cada repique). Esta etapa
difirió de la anterior ya que se le adicionó auxinas y se aumentó la
concentración de citocininas para que ayudaran en la proliferación del
tejido. Las concentraciones químicas usadas fueron las siguientes:
Macronutrientes (MS)
Micronutrientes (ms)
35
Quelatos de hierro (MS)
Vitaminas (Morel)
Sacarosa (azúcar)
Phytagel
pH (5,6)
Quitosano (5 dosis + testigo)
+
0,025 mg/L de ANA (auxina - ácido naftalenacético)
5 mg/L de BAP (citocinina - benziladenina)
3.8.4 Etapa 3 (desde el día 112 hasta el día 140)
En esta etapa se continuó el repique de brotes y se escogió al azar 10
muestras con cada uno de los tratamientos que sobrevivieron para evaluar
cada variable, las que determinaron la eficacia o no del quitosano en la
micropropagación del plátano, induciéndolos químicamente a producir
órganos (hojas, raíces). La formulación del medio fue:
Macronutrientes (MS)
Micronutrientes (ms)
Quelatos de hierro (MS)
Vitaminas (Morel)
Sacarosa (azúcar)
Phytagel
pH (5,6)
Quitosano (5 dosis + testigo)
36
3.8.5 Factor de multiplicación
En todas las generaciones que fueron repicadas, el factor de
multiplicación fue dos, es decir, se intentó que de cada explante que pase a
la siguiente generación emitan dos brotes únicamente.
3.9 Factores en estudio
Se probaron cinco dosis de quitosano y un testigo que sirvió de
referencia.
3.9.1 Descripción de tratamientos
Se evaluaron las dosis de quitosano para determinar cuál de ellas fue la
más recomendable para evitar la contaminación en cada uno de los
tratamientos y si mejoró el desarrollo de los brotes y plántulas in vitro del
plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds).
Cada dosis estuvo dada para un litro de medio de cultivo
(macronutrientes, micronutrientes, quelatos de hierro, vitaminas, sacarosa,
gel y hormonas).
Cuadro 7. Descripción de los tratamientos.
Dosis evaluadas (g/L)
Quitosano T1: 2,5 T2: 5,0 T3: 10,0 T4: 15,0 T5: 20,0 T6: 0
37
3.10. Diseño experimental
Para el análisis estadístico se utilizó el Diseño Completamente al Azar,
con seis tratamientos y 10 réplicas de cada uno. En comparación de las
medias se aplicó la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad y el cálculo de
coeficiente de variación se expresó en porcentajes.
3.10.1 Análisis de varianza
Cuadro 8. Análisis de varianza.
F. de V. GL
Tratamiento t – 1; (6 – 1) 5
Error (N – 1) – (t – 1); (59 – 5) 54
Total N – 1; (60 – 1) 59
3.11 Variables y métodos de evaluación
En las etapas 1 y 2
3.11.1 Número de explantes libres de contaminación
Las variables que se midieron dependieron de las etapas del cultivo, por
ejemplo, en las etapas 1 y 2 se calculó cada 20 días el porcentaje de
contaminación de los brotes con la siguiente fórmula:
38
Como contaminación se tomó en cuenta los explantes con síntomas de
hongos, bacterias, oxidación o levaduras.
3.11.2 Número de brotes regenerados por explantes
Se midió el número de brotes por explante dentro de la unidad
experimental (frasco), a los 111 días de iniciada la siembra.
En la etapa 3
3.11.3 Número de hojas por explantes
Se contó el número de hojas desarrolladas que presentó cada plántula en
cada unidad experimental, a los 140 días.
3.11.4 Número de raíces por explantes
Para la evaluación de esta variable se tomaron en cuenta las plántulas
que al menos formaron una raíz de 0,5 cm a los 140 días de iniciado el
cultivo in vitro en todos los tratamientos.
3.11.5 Longitud de la plántula
Se midió la altura de las plántulas en centímetros, desde la base hasta su
extremo apical, a los 140 días.
39
3.11.6 Porcentaje total de necrosis por oxidación
Del total de explantes que fueron contaminados, se contabilizó el
número de aquellos que hayan muerto exclusivamente por la necrosis
originada de la oxidación; esta variable se la medió al finalizar el ensayo, es
decir, a los 140 días, por medio de la siguiente fórmula:
40
IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES
4.1 Porcentaje de contaminación en la etapa 1
Para el inicio del ensayo se tomaron tres domos de plátano para cada uno
de los seis tratamientos de quitosano (incluido el testigo), teniendo una
población de 18 domos. Se evaluó la contaminación hasta los 27 días de
haber sido sembrados, cuyos resultados son los siguientes:
Cuadro 10. Porcentaje de contaminación de los explantes hasta los 27 días
en la etapa 1 (L0), 2014.
Trat.
Número de
explantes en
cada
tratamiento
Contaminados
hasta los 27 días
(%)
Número de
explantes
contaminados
T1 3 33 1
T2 3 33 1
T3 3 0 0
T4 3 0 0
T5 3 0 0
T6 3 33 1
∑ = 18 ∑ = 3
Figura 1. Porcentaje de contaminación total en la etapa 1 (L0)
0
100
no contaminados contaminados
83
17
41
Figura 2. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la etapa 1 (L0)
4.1.1 Número de explantes nuevos y porcentaje de contaminación en la
etapa 2
A partir del día 28 se empezó el repique de los explantes que quedaron
en la etapa anterior.
4.1.1.1 Primer repique o primera generación “L1” (día 28 al 48)
Cuadro 11. Número de explantes obtenidos en el repique (L1), porcentaje
de contaminación, 2014.
Trat. A* B* Contaminados hasta
los 48 días (%)
Número de explantes
contaminados
T1 2 4 50 2
T2 2 4 25 1
T3 3 5 20 1
T4 3 5 0 0
T5 3 6 17 1
T6 2 4 25 1
∑ = 15 ∑ = 28 ∑ = 6 A* = número de explantes de la etapa anterior.
B* = número de explantes que salieron con el repique.
0
20
40
T1 T2 T3 T4 T5 T6
33 33
0 0 0
33
42
Figura 3. Porcentaje de contaminación en la primera generación “L1”
Figura 4. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la primera
generación “L1”
4.1.1.2 Segundo repique o segunda generación “L2” (día 49 al 69)
Cuadro 12. Número de explantes obtenidos en el repique (L2), porcentaje
de contaminación, 2014.
Trat. A* B* Contaminados hasta
los 69 días (%)
Número de explantes
contaminados
T1 2 4 25 1
T2 3 5 40 2
T3 4 8 25 2
T4 5 9 22 2
T5 5 10 20 2
T6 3 6 33 2
∑ = 22 ∑ = 42 ∑ = 11 A* = número de explantes de la etapa anterior.
B* = número de explantes que salieron con el repique.
0
100
no contaminados contaminados
79
21
0
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6
50
25 20
0
17 25
43
Figura 5. Porcentaje de contaminación en la segunda generación “L2”
Figura 6. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la segunda
generación “L2”
4.1.1.3 Tercer repique o tercera generación “L3” (día 70 al 90)
Cuadro 13. Número de explantes obtenidos en el repique (L3), porcentaje
de contaminación, 2014.
Trat. A* B* Contaminados hasta
los 90 días (%)
Número de explantes
contaminados
T1 3 6 17 1
T2 3 6 17 1
T3 6 11 27 3
T4 7 13 15 2
T5 8 16 13 2
T6 4 8 13 1
∑ = 31 ∑ = 60 ∑ = 10 A* = número de explantes de la etapa anterior.
B* = número de explantes que salieron con el repique.
0
100
no contaminados contaminados
74
26
0
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6
25 40
25 22 20
33
44
Figura 7. Porcentaje de contaminación en la tercera generación “L3”
Figura 8. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la tercera
generación “L3”
4.1.1.4 Cuarto repique o cuarta generación “L4” (día 91 al 111)
Cuadro 14. Número de explantes obtenidos en el repique (L4), porcentaje
de contaminación, 2014.
Trat. A* B* Contaminados hasta
los 111 días (%)
Número de explantes
contaminados
T1 5 10 0 0
T2 5 10 10 1
T3 8 16 13 2
T4 11 22 0 0
T5 14 27 7 2
T6 7 13 8 1
∑ = 50 ∑ = 98 ∑ = 6 A* = número de explantes de la etapa anterior.
B* = número de explantes que salieron con el repique.
0
100
no contaminados contaminados
83
17
0
50
T1 T2 T3 T4 T5 T6
17 17 27
15 13 13
45
Figura 9. Porcentaje de contaminación en la cuarta generación “L4”
Figura 10. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la cuarta
generación “L4”
4.1.1.5 Quinto repique o quinta generación “L5” (día 112)
Cuadro 15. Número de explantes obtenidos en el repique (L5), 2014.
Trat. A* B*
T1 10 20
T2 9 18
T3 14 27
T4 22 43
T5 25 47
T6 12 25
∑ = 92 ∑ = 180 A* = número de explantes de la etapa anterior.
B* = número de explantes que salieron con el repique.
0
100
no contaminados contaminados
94
6
0
10
20
T1 T2 T3 T4 T5 T6
0
10 13
0
7 8
46
4.1.1.5.1 Porcentaje de contaminación en “L5” (día 112 al 140)
De los 180 explantes obtenidos en el último repique, se seleccionaron 10
de cada tratamiento (60 explantes en total), para medir las variables de:
número de hojas, número de raíces y longitud de la plántula.
Adicionalmente, se evaluó también la contaminación en esta etapa, dando
los siguientes resultados:
Cuadro 16. Porcentaje de contaminación en “L5”, 2014.
Trat. Número de
explantes
Contaminados
hasta los 140 días
(%)
Número de explantes
contaminados
T1 10 0 0
T2 10 0 0
T3 10 0 0
T4 10 10 1
T5 10 0 0
T6 10 0 0
∑ = 60 ∑= 1
Figura 11. Porcentaje de contaminación en la quinta generación “L5”
0
100
no contaminados contaminados
98
2
47
Figura 12. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la quinta
generación “L5”
4.2 Número de brotes por explante en “L4”
Esta variable se la tomó a los 111 días de haber iniciado el experimento,
a 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos tomados al azar ya que
había una población de 92 explantes en total. Mostrando los siguientes
datos:
Cuadro 17. Número de brotes en cada uno de los tratamientos, 2014.
T1 T2 T3 T4 T5 T6
R1 3 3 3 3 5 6
R2 3 3 3 3 4 6
R3 2 3 2 4 5 5
R4 3 3 3 3 3 4
R5 3 2 2 4 5 5
R6 3 3 3 3 5 4
R7 2 3 3 4 4 4
R8 3 2 2 3 4 3
R9 2 3 3 3 5 4
R10 3 3 3 2 3 5
∑ 27 28 27 32 43 46
X 2,7 2,8 2,7 3,2 4,3 4,6
0
5
10
T1 T2 T3 T4 T5 T6
0 0 0
10
0 0
48
Figura 13. Medias del número de brotes por tratamientos
Cuadro 18. Análisis de varianza del número de brotes.
F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”
5% (*) 1% (**)
Tratamiento 5 36,3 7,26 16,40** 2,39 3,38
Error 54 23,9 0,44
Total 59 60,18
C.V (%) = 20 X= 3,38
4.3 Número de hojas por explantes en “L5”
Esta variable se la evaluó a los 140 días de haber iniciado el
experimento, a los 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos.
Cuadro 19. Número de hojas por explantes en cada uno de los tratamientos,
2014.
T1 T2 T3 T4 T5 T6
R1 3 3 3 3 3 3
R2 3 2 2 2 3 3
R3 2 3 2 3 4 2
R4 3 3 3 3 3 3
0
5
T1 T2 T3 T4 T5 T6
2,7 a 2,8 a 2,7 a 3,2 a
4,3 b 4,6 b
* Promedios con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Tukey α 0,05)
49
R5 3 2 3 3 3 2
R6 2 2 3 0 3 3
R7 3 2 3 2 2 3
R8 3 3 2 3 2 3
R9 3 3 2 3 3 3
R10 3 4 3 3 3 2
∑ 28 27 26 25 29 27
X 2,8 2,7 2,6 2,5 2,9 2,7
Figura 14. Medias del número de hojas por tratamientos
Cuadro 20. Análisis de varianza del número de hojas.
F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”
5% (*) 1% (**)
Tratamiento 5 1,0 0,2 0,5NS
2,39 3,38
Error 54 21,6 0,4
Total 59 22,6
C.V (%) = 24 X= 2,68
2,2
2,4
2,6
2,8
3
T1 T2 T3 T4 T5 T6
2,8 2,7
2,6
2,5
2,9
2,6
50
4.4 Número de raíces por explante en “L5”
Esta variable se la tomó a los 140 días de haber iniciado el experimento
a 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos tomados al azar,
teniéndose los siguientes datos:
Cuadro 21. Número de raíces en cada uno de los tratamientos, 2014.
T1 T2 T3 T4 T5 T6
R1 3 4 3 3 4 3
R2 4 3 3 3 3 5
R3 5 3 4 3 3 4
R4 2 3 4 4 4 3
R5 4 4 3 4 3 3
R6 3 3 3 0 4 4
R7 3 2 3 5 3 5
R8 3 5 5 5 5 3
R9 4 4 3 3 3 3
R10 4 2 3 2 3 3
∑ 35 33 34 32 35 36
X 3,5 3,3 3,4 3,2 3,5 3,6
Figura 15. Medias del número de raíces por tratamientos
3
3,5
4
T1 T2 T3 T4 T5 T6
3,5
3,3 3,4
3,2
3,5 3,6
51
Cuadro 22. Análisis de varianza del número de raíces.
F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”
5% (*) 1% (**)
Tratamiento 5 1,08 0,22 0,24NS
2,39 3,38
Error 54 49,5 0,92
Total 59 50,58
C.V (%) = 28 X= 3,42
4.5 Longitud de la plántula en “L5”
Esta variable se la evaluó a los 140 días de haber iniciado el
experimento, a los 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos.
Cuadro 23. Longitud de las plántulas en cada uno de los tratamientos,
2014.
T1 T2 T3 T4 T5 T6
R1 5,3 4,7 3,8 4,0 3,9 4,6
R2 4,8 4,4 4,2 3,8 5,2 5,1
R3 3,8 4,2 5,5 3,7 3,9 5,0
R4 4,9 5,2 3,9 5,2 4,7 5,3
R5 5,1 5,1 4,4 3,5 4,7 4,6
R6 3,6 3,7 4,6 0 4,8 5,0
R7 3,9 4,0 4,9 5,4 4,9 3,8
R8 4,1 3,6 5,2 5,3 5,4 4,3
R9 5,5 3,9 5,1 4,8 3,7 4,2
R10 5,0 3,5 4,9 3,6 4,7 5,1
∑ 46 42,3 46,5 39,3 45,9 47
X 4,6 4,2 4,65 3,9 4,6 4,7
52
Figura 16. Medias de la longitud de las plántulas por tratamientos
Cuadro 24. Análisis de varianza de la longitud de las plántulas.
F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”
5% (*) 1% (**)
Tratamiento 5 4,63 0,93 1,33NS
2,39 3,38
Error 54 37,72 0,70
Total 59 42,35
C.V (%) = 19 X= 4,44
4.6 Porcentaje de necrosis por oxidación
Se contabilizaron 37 explantes muertos en total de las cinco
generaciones; de ellos nueve murieron por la oxidación espontánea, es
decir, no se comprobó la presencia de hongos o bacterias, teniendo el
siguiente porcentaje:
Figura 17. Porcentaje de necrosis por oxidación
0
5
T1 T2 T3 T4 T5 T6
4,6 4,2 4,65 3,9
4,6 4,7
0
100
Hongos/bacterias Oxidación
76
24
53
V. DISCUSIÓN
5.1 Contaminación
En cada una de las generaciones del cultivo in vitro se obtuvieron
distintos porcentaje de contaminación, como se lo muestra en la siguiente
figura:
Figura 18. Porcentaje de contaminación en cada generación
Dichos resultados discrepan notablemente con otros experimentos
realizados; como por ejemplo, los resultados de porcentaje de
contaminación señalados por Uzcátegui et al. (2010) quien reportó que la
presencia de agentes contaminantes resultó el 25 % para los explantes de
Musa AAB cv. Hartón, usando un protocolo de desinfección de una
solución de agua y jabón azul por 5 minutos, enjuagados con agua destilada
e inmediatamente introducidos en una solución de hipoclorito de sodio al
20 % durante 20 minutos.
Otros resultados conseguidos en plátano a nivel nacional son los
obtenidos en Musa balbisiana AAB (plátano var. Maqueño), realizados por
0
10
20
30
L0 L1 L2 L3 L4 L5
17 21
26
17
6 2 P
orc
enta
je
Generaciones de explantes
54
Canchignia et al. (2008) en la Universidad Técnica de Quevedo, quienes
mencionaron que para el establecimiento aséptico de yemas de plátano
Maqueño, con el tratamiento 30 % de cloro durante 10 minutos más 0,15 %
de bicloruro de mercurio por 7 minutos, el porcentaje de contaminación fue
de 54 %.
Florio et al. (2010) reportó que tuvo un 12 % de contaminación en
plátano cv. ‘Hartón Gigante’ (Musa AAB), usando el protocolo de
desinfección para los cormos con jabón iodado antiséptico (Iosep®) al 3 %
durante 10 min en agitación constante; solución de fungicida Benlate®
(4
g/L) con adherente Tween 20® (30 gotas por litro) durante 10 min; solución
de bactericida y fungicida Kasumín®
(4 ml/L) con Tween 20® (30 gotas por
litro) por 15 minutos e hipoclorito de sodio (5,25 i.a) al 10 % durante 20
minutos; después de cada paso mencionado se realizaron tres lavados
consecutivos con agua destilada. Esto se lo hizo en un medio líquido con
soporte puente Heller.
Si únicamente tomamos en cuenta el porcentaje de contaminación de la
primera etapa del experimento, es decir, cuando se establecieron los
explantes provenientes de los cormos de plátano hasta los 27 días que duró
la misma, tenemos que el porcentaje de 17 % (Figura 1), es inferior a los
reportados por Uzcátegui et al. (2010); con 25 % de explantes
contaminados, y a los de Canchignia et al. (2008) con 54 % de explantes
contaminados.
Sin embargo, este mismo porcentaje es alto si se lo compara al de Florio
et al. (2010) que reportó 12 % de contaminación y al de Canchignia &
55
Ramos (2004), que al trabajar con plátano Barraganete y aplicando 20 % de
cloro y 0,1 % de bicloruro de mercurio alcanzaron un 100 % de explantes
sanos.
Estos resultados (17 % de contaminación) superan a los de Orellana
(1994), quien trabajando con ápices caulinares de banano “Gran Enano” y
usando un protocolo de desinfección sólo con hipoclorito de sodio al 3 %,
obtuvo elevados porcentajes de contaminación de los explantes de hasta
30 %.
Igualmente, superan a los reportados por Van den Houwe et al. (2004),
quienes al aplicar un protocolo de desinfección basado en etanol al 70 % e
hipoclorito de sodio al 2 %, obtuvieron 20 y 30 % de contaminación
bacteriana en los ápices de 5 mm y 50 % en los de 10 mm en cultivares de
banano “Gran Enano” y “Pisang Palembang”, respectivamente.
Otro factor que pudo ser determinante en la contaminación es el tamaño
de los explantes que fueron sembrados en la primera etapa del
establecimiento del cultivo in vitro, para este caso de plátano Dominico
Hartón (Musa AAB Simmonds), ya que se realizó el corte de los cormos
hasta dejarlos de aproximadamente 10 mm x 10 mm, pero Pérez et al.
(2006) y Colmenares & Giménez (2007) señalaron, que la longitud óptima
de los ápices caulinares para el cultivo in vitro de bananos (AAA) y
plátanos (AAB) debe encontrarse en un rango de 3 a 5 mm y cultivados en
medios sólidos, principalmente para evitar el incremento de la
contaminación por organismos patógenos.
56
Es decir, el tamaño de los explantes pudo influir en una mayor
contaminación de los mismos. Otras investigaciones han señalado la
influencia del tamaño del explante inicial en la incidencia de contaminación
y se ha comprobado en experimentos que en la medida que el tejido es más
pequeño y más cercano al meristema apical, las poblaciones de
microorganismos, disminuyen (García et al., 2002).
La contaminación de manera general se presentó en todas las
generaciones (L), principalmente en la segunda generación (L2) con un
26 % de todos sus explantes contaminados como lo demuestra la Figura 18,
los mismos que fueron desechados.
Esto quizás se debió a la época lluviosa en la que se realizó el
experimento, ya que esto habría provocado la proliferación de agentes
contaminantes (especialmente hongos) en el ambiente, los cuales llegaron
hasta el área de transferencia o lugar de siembra aséptica de los explantes.
Realizando un análisis individual de los tratamientos en la primera etapa
del cultivo, antes del primer repique, hay una tendencia clara que los
tratamientos T1, T2 y T6 (los que menos dosis de quitosano tuvieron
2,5g/L; 5,0g/L; 0g/L, respectivamente) son los únicos que presentaron
contaminación ya sea fúngica o bacterial (Cuadro 10, Figura 2).
Además, en la primera generación (L1) se reafirma esta tendencia ya que
el tratamiento uno (T1) presenta una contaminación del 50 % de sus
explantes (Cuadro 11, Figura 4). Posteriormente, en la segunda generación
(L2) los tratamientos T4 y T5 con más dosis de quitosano (15,0g/L y
57
20,0g/L) son los que menos porcentajes de contaminación presentaron, 22
% y 20 % respectivamente.
En la tercera generación de explantes (L3), los tratamientos T4, T5 y T6
fueron los que menos presencia de patógenos mostraron.
En la cuarta generación (L4), los tratamientos T1 y T4 no demostraron
ninguna apariencia de contaminación por hongos o baterías en ninguno de
sus explantes.
Figura 19. Porcentajes de contaminación en cada generación por
tratamiento.
Por último, en la quinta generación (L5) solamente el tratamiento cuatro
(T4) mostró un explante infectado por hongos, de sus diez repeticiones.
33
50
25
17
0 0
33
25
40
17
10
0 0
20
25 27
13
0 0
17 20
13
7
0
33
25
33
13
8
0 0
10
20
30
40
50
60
L0 L1 L2 L3 L4 L5
Po
rcen
taje
Generaciones
T1
T2
T3
T4
T5
T6
58
El promedio de los porcentajes determinó que el tratamiento cuatro (T4)
es el que menor porcentaje de contaminación presentó de manera general en
todas las generaciones.
Cuadro 25. Promedio de los porcentajes de contaminación en cada uno de
los tratamientos.
T1 T2 T3 T4 T5 T6
L0 33 33 0 0 0 33
L1 50 25 20 0 17 25
L2 25 40 25 22 20 33
L3 17 17 27 15 13 13
L4 0 10 13 0 7 8
L5 0 0 0 10 0 0
∑ 125 125 85 47 57 112
X 20,83 20,83 14,17 7,83 9,50 18,67
Figura 20. Promedio de los porcentajes de contaminación.
Según el Cuadro 25 y la Figura 19, el tratamiento cuatro (T4) tiene un
menor porcentaje de contaminación acumulada; es decir 15,0 g/L de
quitosano inhibieron la mayor cantidad de agentes contaminantes de los
explantes y medios de cultivos.
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
T1 T2 T3 T4 T5 T6
20,83% 20,83%
14,17%
7,83% 9,50%
18,67%
Po
rcen
taje
Tratamientos
59
Este resultado no concuerda con la literatura que indica que los
tratamientos in vitro con quitosano 2 y 3 %, es decir, 20 y 30 g/L, tienen
efectos fungicida (Bautista et al., 2003), pero en este ensayo el mejor
tratamiento (T4) es decir al 1,5 % tuvo un mejor desempeño y los resultados
más promisorios en cuanto a la reducción de contaminación en los cultivos
in vitro de plátano, incluso comparándolo con el tratamiento 5 (T5) al 2 %
de quitosano.
Aunque algunos tratamientos porcentualmente fueron mejor que otros,
esto no indica que se haya demostrado la efectividad del quitosano para la
reducción de patógenos en el cultivo in vitro de plátano, por dos obvias
razones: la primera es que los datos de contaminación fueron muy variables
en todas sus generaciones; es decir, no hubo una constancia en cuanto a la
no contaminación. La segunda, las dosis aplicadas en algunos tratamientos
no están ni cerca de las referidas por otros investigadores.
Esto nos lleva a dar sólo un análisis prematuro si lo que de verdad redujo
la contaminación fue el quitosano u otros aspectos aleatorios.
Ahora, tomando como hipótesis que el quitosano fue el responsable de la
significativa reducción de contaminación, ya que la actividad fungicida del
quitosano se ha asociado desde hace mucho a su carácter catiónico.
La interacción de los grupos amino libres, cargados positivamente en
medio ácido, con los residuos negativos de las macromoléculas expuestas
en la pared de los hongos, cambian la permeabilidad de la membrana
plasmática, con la consecuente alteración de sus principales funciones
60
(Benhamou, 1992). Otras posibles explicaciones de la actividad fungicida
del quitosano se relacionan con la inhibición de la síntesis de algunas
enzimas presentes en los hongos (El-Ghaouth et al., 1992) con ocurrencia
de alteraciones citológicas, como se ha reportado en el caso de B. cinerea,
donde se ha observado en el microscopio la aparición de vesículas y/o
células vacías carentes de citoplasma, después del tratamiento con
soluciones acuosas al 1,75 % de quitosano (Ait-Barka et al., 2004).
5.2 Brotes
En relación al número de brotes por explante, el promedio de todos los
tratamientos fue de 3,38 brotes/explante; sin embargo, el testigo (T6)
mostró un mejor desarrollo de los mismos con 4,6 brotes/explante.
Hay que recordar que se usó la cantidad de BAP más común para este
tipo de investigaciones, es decir de 5 mg/L.
Comparando los resultados con los obtenidos por Florio et al. (2010),
quien, usando la misma cantidad de BAP en un medio líquido sumergido
consiguió en promedio 8,93 brotes/explante; el mismo autor con la misma
concentración hormonal pero en un medio sólido obtuvo 1,56 brotes/
explante a los 45 días de cultivo en la etapa de multiplicación, en el plátano
‘Hartón Gigante’ (Musa AAB).
Hay que mencionar que en esta etapa se usó un medio sólido, es decir, el
valor que servirá de referencia de comparación es el obtenido por Florio et
al. (2010), de 1,56 brotes/explante; por lo tanto, se concluye que todos los
61
tratamientos tuvieron un mejor desempeño en cuanto al número de brotes,
en comparación con los resultados de dichos autores.
También hay que resaltar que se los evaluó a los 20 días después del
repique cuatro (L4) y no a los 45 como citan Florio et al. (2010).
El promedio general obtenido en este experimento de 3,38
brotes/explante difieren de los obtenidos por Arinaitwe et al. (2000),
quienes establecieron una tasa promedio de 10,2 brotes/explante en el
cultivar “Ndiziwemiti”; 9,5 en el cultivar “Kibuzi” y 8,2 en el cultivar
“Bwara”, con una dosis de 5 mg/L de BAP en medio líquido en constante
agitación. Se presume que la diferencia en estos resultados puede atribuirse
a las características propias de cada genotipo y el empleo de equipos
sofisticados.
Estos resultados se asemejan a los obtenidos por Uzcátegui et al. (2010),
quienes mencionaron que en el plátano (Musa AAB cv. Hartón) obtuvieron
en promedio 4 brotes/explante, usando la misma cantidad de citocinina
(5mg/L de BAP).
Comparado con los resultados a nivel nacional obtenidos por Canchignia
et al. (2008), 2,46 brotes/explante en plátano var. Maqueño (Musa
balbisiana), el resultado es porcentualmente superior al mismo.
El mejor resultado lo obtuvo el testigo (T6) sin ninguna dosis de
quitosano, lo que destaca el efecto positivo de las citocininas en promover
62
el crecimiento de los brotes de plátano, más que el del quitosano, siendo
mayor cuando se usa BAP en medio líquido.
Las respuestas se asemejan con lo reportado en bananos (AAA) y
plátanos (ABB), donde BAP fue la citocinina más efectiva en la inducción y
proliferación de los brotes (Arinaitwe et al., 2000; Jambhale et al., 2001;
Muhammad et al., 2006; Colmenares & Giménez, 2007).
5.3 Hojas
El promedio del número de hojas fue de 2,68 de manera global entre
todos los tratamientos, aunque el mejor desarrollo lo mostró el tratamiento
cinco (T5), con un promedio de 2,9 hojas; esto no demostró significancia
estadística con la prueba de Tukey al 5 % (Anexo 6 y 7), lo que comprueba
que entre las dosis dadas ninguna de ellas ayudó al desarrollo foliar de los
explantes.
Comparando los datos con los obtenidos por Florio et al. (2010), quien
obtuvo 5,03 hojas en un medio sólido, estos demostraron ser
estadísticamente inferiores.
Esto contradice a Bhaskara et al. (1999) quien sostiene que en términos
generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos positivos en el
crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la germinación de
semillas como en el crecimiento de partes de la planta como raíces, retoños
y hojas.
63
5.4 Raíces
El promedio del número de raíces de 3,42 raíces/explante (entre todos
los tratamientos) tampoco demostró significancia estadística (Anexos 8 y
9), determinándose que ninguna de las dosis indujo a la proliferación de
estas.
Sin embargo, este resultado fue mejor a otros reportados en esta
variable; por ejemplo, a los de Uzcátegui et al. (2010) donde se obtuvieron
tres raíces/explante de Musa AAB cv. Hartón.
El número de raíces se habría incrementado si se le hubiera aplicado al
medio auxinas, ya que según Bidwel (1990), el número de raíces en las
plantas se ve influenciado por las relaciones hormonales en la planta, más
específicamente por las auxinas.
Hay que señalar que el testigo fue el que mayor número de raíces
desarrolló, dándose un promedio de 3,6 raíces/explante.
5.5 Longitud de plántulas
El promedio general obtenido en todos los tratamientos, en la variable
longitud de plántulas fue de 4,44 cm. El testigo (T6) fue el que mejor
desarrollo tuvo con 4,7 cm de promedio en sus explantes, este promedio
discrepa con el obtenidos por Sandoval et al. (1991) donde se obtuvo un
promedio de 10,5 cm de altura por plántulas en plátano “Dominico” (Musa
AAB) y 9,1 cm en plátano “Currare” (Musa AAB), a los 45 días de cultivo.
64
Lo que confirma que el quitosano no ayudó en la elongación de las
plántulas.
5.6 Oxidación
Según la Figura 17, del 100 % de explantes muertos, el 24 % de estos
fue por necrosis causada por oxidación, el restante 76 % lo ocasionaron la
contaminación por hongos o bacterias.
La mortalidad se distribuyó de la siguiente manera:
En L1: 2 explantes con oxidación; 1 en T1 y 1 en T5.
En L2: 2 explantes con oxidación; 1 en T2 y 1 en T4.
En L3: 2 explantes con oxidación; 1 en T3 y 1 en T4.
En L4: 3 explantes con oxidación; 1 en T3 y 2 en T5.
Según los datos expuestos se deduce que, el quitosano no ayudó a evitar
la muerte por necrosis causada por la oxidación fenólica de los explantes,
sino que la pudo haber provocado el mismo producto, ya que el testigo (T6)
el cual no se le adicionó quitosano, en ninguna de sus etapas mostró muerte
de alguno de sus brotes por esta causa.
El porcentaje antes descrito (24 %) coincide con la investigación
realizada por Uzcátegui et al. (2010) quienes reportaron que los ápices de
Musa AAB cv. Hartón obtuvieron una respuesta fisiológica positiva al
establecimiento, con una oxidación fenólica en el grado de moderadamente
oxidado y un porcentaje de muerte por necrosis del 25 %.
65
Hay que señalar que desde el inicio del establecimiento del plátano, se
manifestó oxidación prudencial en la zona de reserva, el resto del explante
mantenía coloración verde con aumento de tamaño y masa vegetativa.
Esto ocurrió en la mayoría de los brotes, indiscriminadamente del
tratamiento que tuvieran, lo que concuerda con Cajacuri (2007), quien
indicó que el plátano Musa AAB cv. Hartón presentan oxidación entre
ligeramente oxidado y moderadamente oxidado para todas las etapas del
cultivo.
Al medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) se le pudo haber
añadido carbón activado para reducir el necrosamiento, ya que el mismo se
ha usado para superar problemas específicos de oxidación los cuales se
asocian con el cultivo de tejidos en musáceas (Roca & Mroginski, 1991).
66
VI. CONCLUSIONES
La dosis que mejor efecto tuvo para evitar la contaminación fue de 15
g/L de quitosano del tratamiento cuatro (T4).
El tratamiento cinco (T5) con 20 g/L del producto evaluado, también
mostró reducción de la contaminación en sus explantes.
Se confirmó con los tratamientos cuatro y cinco la propiedad
antimicótica y antibacteriana del quitosano in vitro.
El quitosano no mostró en ninguno de sus tratamientos que ayuda en
el aumento del número de brotes, ni en el mayor número de hojas, ni
en el desarrollo de las raíces, ni en el aumento en la longitud de las
plántulas; lo que descartaría la propiedad de ser un estimulador de
crecimiento en órganos vegetativos.
Las plántulas regeneradas, a través de este proceso de
micropropagación, se desarrollaron satisfactoriamente tanto caulinar
y radicularmente para continuar con su proceso agronómico de
aclimatación.
67
VII. RECOMENDACIONES
Realizar nuevos ensayos con quitosano y quitina, con otras dosis,
para evaluar si con estas se reduce la contaminación por patógenos y
la oxidación.
Realizar la micropropagación in vitro de plátanos en zonas con
temperaturas menores a los 28 ºC.
Micropropagar el plátano Dominico Hartón en medios líquidos y
sólidos, para verificar en cuál de ellos se logra un mejor desarrollo
caulinar y radicularmente en este cultivar.
Investigar con diferentes tamaños de ápices basales y florales del
plátano Dominico Hartón en condiciones asépticas.
68
VIII. RESUMEN
La presente investigación se realizó de enero a junio del 2014, en el
cantón Daule, Provincia del Guayas, en el laboratorio de cultivos de tejidos
in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, que se encuentra ubicada entre
las coordenadas geográficas 1º 51' 37,77" (Latitud Sur), 79º 58' 34,42"
(Longitud Occidental) y a 15 m.s.n.m.
El estudio tuvo como objetivo la regeneración in vitro del plátano
“Dominico Hartón” (Musa AAB Simmonds), probando cinco dosis de
quitosano, ya que éste ayudaría en la reducción de contaminación por
hongos y bacterias; además promovería el desarrollo de los explantes en
cada una de las etapas de la micropropagación.
Se utilizaron los cormos (hijos espada) del plátano Dominico Hartón,
cuyas plantas madres presentaron buenas características agronómicas; éstos
se los colocó en frascos con nutrimentos necesarios para su desarrollo y las
dosis de quitosano a evaluar (2,5g/L; 5g/L; 10g/L; 15g/L; 20g/L; 0g/L).
Posteriormente, se los repicó para cinco generaciones (L). En la cuarta
generación (L4) se evaluó el número de brotes que se regeneraron por
explante y finalmente en el último repique (L5) se seleccionaron al azar 60
brotes (10 por tratamientos), para evaluar variables como: número de hojas,
número de raíces y longitud de las plántulas.
El tratamiento cuatro (T4) fue el que menor porcentaje de contaminación
presentó en la evaluación acumulada con 15g/L de quitosano; en cuanto al
69
desarrollo foliar, radicular y de elongación de las plántulas; ninguno de los
tratamientos mostró significancia estadística.
Se concluyó que el quitosano ayudó a disminuir la contaminación pero
no mejora el desarrollo de los explantes ni disminuye el necrosamiento de
los mismos.
70
IX. SUMARY
This research was conducted from January to June 2014 in the canton
Daule, Guayas Province, in laboratory tissue cultures in vitro
AGROVITROPARIS Company, which is located between the geographical
coordinates 1° 51' 37.77" (Latitude South), 79º 58' 34.42" (West Longitude)
and 15 m.a.s.l.
The study aims to in vitro regeneration of banana "Dominico Harton"
(Musa AAB Simmonds), testing five doses of chitosan, as this would help
in reducing contamination by fungi and bacteria; further promote the
development of the explants in each of the stages of micropropagation.
Corms (children sword) Banana Dominico Harton, plants whose mothers
had good agronomic characteristics were used; these are placed in jars with
the nutrients necessary for their development and evaluate chitosan dose
(2,5 g/L, 5 g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L; 0g/L).
Subsequently, the tolled for five generations (L). In the fourth generation
(L4) the number of shoots regenerated per explant and finally in the last
peal (L5) was assessed 60 randomly selected shoots (10 treatments) to
assess variables such as number of leaves, number of and root length of the
seedlings.
Treatment four (T4) was the lowest percentage of contamination
introduced into the accumulated evaluation with 15g/L of chitosan; as to the
71
leaf, root elongation and development of seedlings; Neither treatment
showed statistically significant.
It was concluded that chitosan helped reduce pollution but does not
improve the development of the explants and decreases necrosis thereof.
72
X. LITERATURA CITADA
Abdelnour, A.; Escalant, J. 1994. Conceptos Básicos del Cultivo de
Tejidos Vegetales. Turrialba: CATIE, CR. 5-6 p.
Ait-Barka, E.; Eullaffroy, P.; Clément, C.; Vernet, G. 2004. Chitosan
improves development, and protects Vitis vinifera L. against Botrytis
cinerea. Plant Cell Reporter. Reims: FR. 22: 608-614 p.
Allan, C.; Hardwiger, L. 1979. The fungicidal effect of chitosan on fungi
of varying cell wall composition. Experimental Mycology.
Washington: US. 3: 285-287 p.
Alonso, M. 2002. Biotecnología aplicada a la mejora de Pelargonium. Tesis
Doctoral. Universidad Complutense de Madrid. Madrid: ES. 31-32 p.
Arinaitwe, G.; Rubaihayo, P.; Magambo, M. 2000. Proliferation rate
effects of cytokinins on shoot proliferation rates in AAA-EA (Musa
spp.) cultivars. Scientia Horticulturae. 86: 13-21 p.
Bautista, S.; Hernández, M.; Bosquez, E.; Wilson, C. 2003. Effects of
chitosan and plant extracts on growth of Colletotrichum
gloeosporioides, anthracnose levels and quality of papaya fruit. Crop
Protection. México DF: MX. 22: 1087-1092 p.
Bautista, S.; Hernández, A.; Velázquez, M.; Bosquez, E.; Sánchez, D.
2005. Quitosano: una alternativa natural para reducir
73
microorganismos post cosecha y mantener la vida de anaquel de
productos hortofrutícolas. Revista Iberoamericana de Tecnología Post
cosecha. Mexico DF: MX. 7: 1-6 p.
Benhamou, N. 1992. Ultrastructural and cytochemical aspects of chitosan
on Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, agent of tomato
crown and root rot. Phytopathology. Québec: CA. 82: 1185-1193 p.
Bhaskara, M.; Arul, J.; Angers, P.; Couture, L. 1999. Chitosan
Treatment of Wheat Seeds Induces Resistance to Fusarium
graminearum and Improves Seed Quality. Journal of Agriculture and
Food Chemistry. Québec: CA. 47: 208-1216 p.
Bhojawani, S.; Razdab, M. 1996. Plant Tissue Culture: Theory and
Practice, a revised edition. Elsevier Editorial. Alemania. 767 p.
Bidwel, R. 1990. Fisiología Vegetal. Editorial A.G.T. Editor, S.A. México
DF: MX. 559-608 y 612-618 p.
Cajacuri, M. (2007). Evaluación morfológica e histológica del proceso de
formación de yemas múltiples de Musa (AAB) cv. Plátano Hartón.
Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Maracaibo: VE. 19-25 p.
Canchignia, H.; Sigcha, L.; Toaquiza, J.; Ramos, L.; Saucedo, S.;
Carranza, M.; Cevallos, O. 2008. Alternativas para la Propagación
in vitro de Plátano Variedad Maqueño (Musa balbisiana AAB). Tesis
74
de Grado. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Técnica Estatal
de Quevedo. Los Ríos: EC. 3-6 p.
Canchignia, F.; Ramos, L. 2004. Micropropagación de plátano variedad
barraganete. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Universidad
Técnica Estatal de Quevedo. Los Ríos: EC. 6pp.
Castillo, A. 2004. Propagación de plantas por cultivo in vitro: una
biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo. (En línea).
Consultado en enero del 2014. Disponible en:
http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382
.pdf.
Chung, Y.; Chen, C. 2008. Antibacterial characteristics and activity of
acid-soluble chitosan. Bioresource Technology. Taipei: TW. 99:
2806-2814 p.
Chung, Y.; Su, Y.; Chen, C.; Jia, G.; Wang, H.; Wu, J.; Lin, J. 2004.
Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface
characteristics of cell wall. Acta Pharmacologica Sinica. Taipei: TW.
25: 932-936 p.
Chung, Y.; Wang, H.; Chen, Y.; Li, S. 2003. Effect of abiotic factors on
the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens.
Bioresource Technology. Taipei: TW. 88:179-184 p.
75
Colmenares, M.; Giménez, A. 2007. Inducción de yemas múltiples en
Musa plátano “Hartón Gigante” con Inmersión Temporal. La
Universidad del Zulia. Maracaibo: VE. 331-340 p.
Cronauer, S.; Krikorian, A. 1988. Plant regeneration via somatic
embryogenesis in the seeded diploid banana Musa ornata Roxb. Plant
Cell Reports. New York: US. 7: 23-25 p.
Cubero, J. 2003. Introducción a la mejora genética vegetal. España:
Mundi-Prensa Libros. Madrid: ES. 567 p.
Cuero, R.; Osuji, G.; Washington, A. 1991. N-carboxymethyl chitosan
inhibition of aflatoxin production: role of zinc. Biotechnology
Letters. 13: 441-444 p.
Dávila, W. 2011. Evaluación de la actividad hormonal de: thidiazuron
(TDZ), thidiazuron con ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA) vs. 6-
bencil amino purina (BAP), 6-bencil amino purina con ácido α
naftalen acético (BAP/ANA); como inductores de brotes en la etapa
de multiplicación a partir de yemas apicales de balsa (Ochroma
lagopus). Tesis previa a la obtención del título de Ingeniero en
Biotecnología. ESPE-Sangolquí: EC. 14-15 p.
Debergh, P.; Read, P. 1991. Micropropagation: Technology and
Application. Debergh, P. y Zimmerman, R. (eds). Kluwer Academic
Publishers, Holanda. 1-13 p.
76
Devlieghere, F.; Vermeulen, A.; Debevere, J. 2004. Chitosan:
antimicrobial activity, interactions with food components and
applicability as a coating on fruit and vegetables. Food Microbiology.
Ghent: BE. 21: 703-714 p.
Dhed´A, D.; Dumortier, F.; Panis, B.; Vuylsteke, D.; de Langhe, E.
1991. Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking
banana cv. ‘Bluggoe’ (Musa spp. ABB group). Paris: FR. Fruits
46(2):125-135 p.
El-Ghaouth, A.; Arul, J.; Grenier, J.; Asselin, A. 1992. Effect of
chitosan and other polyions on chitin deacetylase in Rhizopus
stolonifer. Québec: CA. Experimental Mycology16: 173-177 p.
El-Ghaouth, A.; Arul, J.; Wilson, C.; Benhamou, N. 1997. Biochemical
and cytochemical aspects of the interactions of chitosan and Botrytis
cinerea in bell pepper fruit. Québec: CA. Postharvest Biology and
Technology 12: 183-194 p.
Escalant, J.; Teisson, C. 1988. Embryogenèse somatique chez Musa sp.
Physiologie Vegetale 306 (3): 277-281 p.
Everett, K.; Owen, S.; Cutting, J. 2005. Testing efficacy of fungicides
against postharvest pathogens of avocado (Persea Americana cv.
Hass). New Zealand Plant Protection 58: 89-95 p.
77
Faure, S.; Noyer, J.; Horry, C.; Bakry, F.; González, D. 1993. A
molecular marker-based linkage map of diploid bananas (Musa
acuminate). Guadeloupe: FR. Theor Appl. Genet. 87: 517-526 p.
Fernández, C.; Ausar, S.; Badini, R.; Castagna, L.; Bianco, I.;
Beltramo, D. 2003. An FTIR spectroscopy study of the interaction
between αs-casein-bound phosphoryl groups and
chitosan.International Dairy Journal 13: 897-901.
Florio, S.; De Real, L.; Mogollón, N. 2010. Regeneración in vitro del
plátano cv. ‘Hartón gigante’ (Musa AAB). Boletín del Centro de
Investigaciones Biológicas, Universidad del Zulia. Maracaibo: VE.
Volumen 44, No. 4, 425-440 p.
García, L.; Pérez, B.; Sarría, Z.; Clavero, J. 2002. Alternativas para la
propagación in vitro del cultivar híbrido FHIA-20. Universidad del
Zulia. Maracaibo: VE. InfoMusa 11(1): 35-38 p.
García, P. 2010. Evaluación in vitro del quitosano e isotiocianatosen el
desarrollo y morfología de fusarium oxysporum SHELECHT f. sp.
gladioli (MASSEY) SNYDER & HANSEN. Tesis para obtener el
grado de maestrías en ciencias en Manejo Agroecológico de Plagas y
Enfermedades. Yautepec: MX. 8-11 p.
George, E. 1996. Problems in initiating and maintaining cultures. En: Plant
propagation by tissue culture. Part 2. In practice. Gill, R. (eds).
Exegenetics Ltda, Inglaterra. 638-669 p.
78
George, E.; Hall, M.; De Klerk, G. (Eds.). 2008. Plant propagation by
tissue culture. Holanda: Springer Netherlands.
Grapin, A.; Ortiz, J.; Domergue, R.; Babeau, J.; Monmarson, S.;
Escalant, J.; Teisson, C.; Côte. F. 1998. Establishment of
embryogenic callus and initiation and regeneration of embryogenic
cell suspensions from female and male immature flowers of Musa.
INFOMUSA 7(1): 13-15 p.
Hadwiger, L.; Kendra, D.; Fristensky, B.; Wagoner, W. 1986. Chitosan
both activates genes in plants and inhibits RNA synthesis in fungi. In:
Muzzarelli, R.A.A., Jeuniaux, C., Gooday, G.W. (Eds.), Chitin in
Nature and Technology, Plenum Press. New York: US. 209-214 p.
Helander, I.; Nurmiaho, L.; Ahvenainen, R.; Rhoades, J.; Roller, S.
2001. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane
of Gram-negative bacteria. International Journal of Food
Microbiology. Finland. 71: 235-244 p.
Hong, S.; Leroueil, P.; Janus, E.; Peters, J.; Kober, M.; Islam, M.; Orr,
B.; Baker, J.; Banaszak, M. 2006. Interaction of polycationic
polymers with supported lipid bilayer and cell: nanoscale hole
formation and enhanced membrane permeability. Bioconjugate
Chemistry. Michigan: US. 93: 18-22 p.
Instituto Nacional de Estadísticas y Censos (INEC). 2011. Datos
Estadísticos Agropecuarios. Encuesta de superficie y producción
79
agropecuaria continua (ESPAC). (En línea). Consultado en enero del
2014. Disponible en: http://www.inec.gob.ec/espac_p
ublicaciones/espac-2011/INFORME_EJECUTIVO%202011.pdf.
Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias
(INIAP). 2013. Programa Nacional del Banano y Plátano. (En línea).
Consultado en enero del 2014. Disponible en:
http://www.iniap.gob.ec/~iniapgob/sitio/index.php?option=com_cont
ent&view=article&id=29:banano&catid=6:programas.
Jadán, G; Oña, M; Lorena, E. 2010. Evaluación del efecto de
brasinoesteroides en las etapas de establecimiento, multiplicación y
enraizamiento in vitro de banano variedad Williams. Tesis de la
Carrera de Ingeniería en Biotecnología. ESPE-Sangolquí: EC. 10-18
p.
Jambhale, N.; Patil, S.; Jadhav, A.; Pawar, S.; Waghmode, B. 2001.
Effect of number of subcultures on in vitro multiplication of four
banana clones. Maharashtra: India. INFOMUSA 10(1): 38-39 p.
Lárez, C. 2008. Algunas potencialidades de la quitina y el quitosano para
usos relacionados con la agricultura en Latinoamérica. Laboratorio de
Polímeros, Departamento de Química, Facultad de Ciencias,
Universidad de Los Andes. Mérida: VE. 2-7 p.
80
Li, H.; Yu, Y. 2001. Effect of chitosan on incidence of brown rot, quality
and physiological attributes of postharvest peach fruit. Journal of the
Science of Food and Agriculture. Zhejiang: CN. 81: 269-274 p.
Li, Y.; Chen, X.; Liu, N.; Liu, C.; Liu, C. G.; Meng, X.; Yu, L.;
Kenendy, J. 2007. Physicochemical characterization and
antibacterial property of chitosan acetates. Qingdao: CN.
Carbohydrate Polymer 67: 227-232 p.
Liu, H.; Du, Y.; Wang, W.; Sun, L. 2004. Chitosan kills bacteria through
cell membrane damage. International Journal of Food Microbiology.
Wuhan: CN. 95: 147-155 p.
Liu, J.; Tian, S.; Menga, X.; Xua, Y. 2007. Effects of chitosan on control
of postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit.
Postharvest Biology and Technology. Beijing: CN. 44: 300-306 p.
López, Z. 2010. Organogénesis directa de Novo en Musa AAA “Enano
Gigante” y “FHIA 23”. Tesis para obtener el grado de maestra en
ciencias. Texcoco: MX. 35p.
Ma, S. 1991. Somatic embryogenesis and plant regeneration from cell
suspension culture of banana. In Symposium on Tissue Culture of
Horticultural Crops. National Taiwan University. Taipei: TW. 181-
188 p.
81
Mejía, F.; Botero, F.; Guerrero, L. 2000. Aprovechamiento industrial de
residuos de cosecha y poscosecha del plátano en el departamento de
Caldas. Artículo Científico. Universidad de Caldas. Caldas: CO. 52-
68 p.
Morel, G. 1950. Sur la culture des tissus de deux monocotylédones. C. R.
Acad. Sc. Paris. Paris: FR. 230: 1099-1101 p.
Muhammad, A.; Rashid, H.; Hussain, I.; Saqlan, S. 2006. Comparison
of BAP and Kinetin on proliferation rate of banana (Musa spp.) cv.
“Basrai”. Memorias de la XVII Reunión ACORBAT. Santa Catarina:
BR. 494-497 p.
Müller, L.; Sandoval. J. 1986. In vitro germoplasm conservation of Musa
spp. In: Abstracts, VI. International Congress Plant Tissue and Cell
Culture. Minnesota: US. 426 p.
Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Wisconsin: US. Physiologia
Plantarum 15: 473-497 p.
Novak, F.; Afza, R.; Duren, M. van; Perea, D.; Conger, B.; Tang, X.
1989. Somatic embryogenesis and plant regeneration in suspension
cultures of dessert (AA and AAA) and cooking (ABB) bananas
(Musa spp.). Nature Publishing Group. Bio/Technology 7:154-159 p.
82
Orellana, P. 1994. Tecnología para la micropropagación in vitro de clones
de Musa spp. Resumen de Tesis Doctoral. Universidad Central de las
Villas. Santa Clara: CU. 25 p.
Ortega, D.; Tamayo, A.; Calderón, J.; Galván, R. 2011. Establecimiento
aséptico en la micropropagación in vitro de Banano Williams (AAA,
subgrupo Cavendish). Revista de la Universidad EARTH. Las
Mercedes de Guácimo, Limón: CR. 205-219 p.
Osuna, M. 2012. Heteropolisacáridos. Química Orgánica III. Universidad
Autónoma de Sinaloa. Sinaloa: MX. 1-2 p.
Palma, J.; Jansson, B.; Salinas, J.; Lopez, L. 2008. Effect of chitosan on
hyphal growth and spore germination of plant pathogenic and
biocontrol fungi. Journal of Applied Microbiology. Alicante: ES.
104: 541-553 p.
Papineau, A.; Hoover, D.; Knorr, D.; Farkas, D. 1991. Antimicrobial
effect of water-soluble chitosans with high hydrostatic pressure. Food
Biotechnology 5: 45-57 p.
Pastor de Abram, A. 2004. Quitina y quitosano: obtención, caracterización
y aplicaciones. Pontificia Universidad Católica del Perú, Fondo
editorial. Lima: PE. 312 p.
Pérez, M.; Vásquez. V.; Osuna, J. 2006. Efecto del plant preservative
mixture (PPM) y bencilaminopurina en la propagación in vitro de
83
plátano “Macho” (Musa AAB). Memorias de la XVII Reunión
ACORBAT. Santa Catarina: BR. 504-509 p.
Recalde, C. 2007. Establecimiento del cultivo in vitro y aclimatación en
invernadero de nepeta hederacea variegata, Tabacundo-Pedro
Moncayo, 2006. Tesis previa a la obtención del título de Ingeniera en
Biotecnología. ESPE-Sangolquí: EC. 39-40 p.
Robles, G.; Mora, M. 1993. Propagación de banano por cultivo de tejidos.
Desplegable para productores No 2. SARH-INIFAP-CIPAC. Jalisco:
MX.
Robles, G.; Mora, M. 1996. Producción de Enano Gigante mediante la
técnica de cultivo de tejidos. Folleto para productores. No1.INIFAP,
CIPAC, CE Tecomán. Jalisco: MX. 12 p.
Roca, W.; Mroginski, L. (Eds.). 1991. Cultivo de Tejidos en la
Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Colombia: CIAT (Centro
Internacional de Agricultura Tropical). Cali: CO. 970 p.
Roller, S.; Covill, N. 1999. The antifungal properties of chitosan in
laboratory media and apple juice. London: UK. International Journal
of Food Microbiology47: 67-77 p.
Sánchez, J. 2002. Efectos de extractos de Ruta graveolens (Rutaceae) sobre
Radopholus similis e identificación de nematodos asociados al cultivo
84
de plátano Musa spp. Tesis para obtener el grado de Maestro en
Ciencias. Tecomán: MX. 42 p.
Sandoval, J.; Brenes, G.; Pérez, L. 1991. Micropropagación de plátano y
banano (Musa AAB Y AAA) en el CATIE. Turrialba: CR. Informe
técnico, No. 186.
Stover, R.; Simmonds, N. 1987. Bananas. 3rd
edn. Longman. London: UK.
468 p.
Sudarshan, N.; Hoover, D.; Knorr, D. 1992. Antibacterial action of
chitosan. Food Biotechnology 6: 257-272 p.
Toro, M. 2004. Establecimiento de protocolos para la regeneración in vitro
de cerezo dulce (Prunus avium L.) variedad Lambert. Tesis para
optar el título de Ingeniero Agrónomo. Universidad Católica de
Temuco. Temuco: CL.
Trujillo, R. 2004. Micropropagación: Fundamentos del cultivo de tejidos.
Universidad Máximo Gómez Báez de Ciego de Ávil, Centro de
Bioplantas. Ciego de Ávil: CU. 13-16 p.
Uzcátegui, J.; Hernández, Y.; Osorio, D.; Rivas, M. 2010. Evaluación
del comportamiento in vitro de ápices de plátano Musa AAB cv.
“Hartón” y “Hartón Doble Tallo”. Universidad Nacional
Experimental Sur del Lago “Jesús María Semprum”. Laboratorio de
85
Biotecnología GIBAS. Santa Bárbara de Zulia: VE. Vol.3, No1: 8-12
p.
Van Den Houwe, I.; Strosse, H.; Panis, B. 2004. Banana cell and tissue
culture- review. In: Jains, S. y R. Swennen (Eds.). Cellular, molecular
biology and induced mutations. Science Publishers Inc. Enfield: US.
400 p.
Varma, A.; Deshpande, S.; Kennedy, J. 2004. Metal complexation by
chitosan and its derivatives: a review. Pune: IND. Carbohydrate
Polymer 55: 77-93 p.
Vergara, E. 2010. Origen e Historia del plátano Musa paradisiaca L. (En
línea). Consultado en enero del 2014. Disponible en:
http://apiciusysuslibros.blogspot.com/2010/12/origen-e-historia-del-
platano-musa.html.
Yu, T.; Li, H.; Zheng, X. 2007. Synergistic effect of chitosan and
Cryptococcus laurentii on inhibition of Penicillium expansum
infections. International Journal of Food Microbiology. Hangzhou:
CN: 114: 261-266 p.
86
XI. ANEXOS
87
Anexo 1: Esquema de micropropagación mediante el uso de meristemos o
brotes apicales (Alonso 2002, modificado)
88
Av.
Pie
dra
hit
a
± 2
50
m.
± 4
50
m.
Vía
Dau
le –
Sta
. Lu
cía
Anexo 2: Croquis del lugar donde se realizó el experimento
Puente de Banife
Municipio de
Daule
Iglesia del Carmen
Paseo Shopping
Daule
CTE - Daule
LABORATORIO
AGROVITROPARIS Lavadora “Pelito”
Iglesia Evangélica
“Momento de Dios”
89
Anexo 3: Fases del experimento
Lab
ores
en
días
1 al
27
28 a
l 48
49 a
l 69
70 a
l 90
91 a
l 111
111
112
al 1
4014
0
Du
raci
ón e
n dí
as27
día
s20
día
s20
día
s20
día
s20
día
s1
día
28 d
ías
1 dí
a
Fec
ha d
e in
icio
y
fina
l
13 d
e en
ero
hast
a el
9 d
e
febr
ero
10 d
e
febr
ero
hast
a
el 2
de
mar
zo
3 de
mar
zo
hast
a el
23
de m
arzo
24 d
e m
arzo
hast
a el
13
de a
bril
14 d
e ab
ril
hast
a el
4 d
e
may
o
4 de
may
o
5 de
may
o
hast
a el
2 d
e
juni
o
2 de
juni
o
Gen
erac
ione
sL0
L1L2
L3L4
L4L5
L5
Eta
pas
Eta
pa 0
y
Eta
pa 1
Var
iabl
esN
úmer
o de
brot
es
Con
tam
inac
ión
y va
riab
les
con
ande
va
Var
iabl
es
con
ande
va
Eta
pa 2
Eta
pa 3
Con
tam
inac
ión
90
Anexo 4: Prueba de Tukey para número de brotes (comparación múltiple)
(I) Tratamientos (J)
Tratamientos
Diferencia de
medias (I-J) Error típico Sig.
Intervalo de confianza al 95 %
Límite inferior Límite superior
1,00
2,00 -,10000 ,29752 ,999 -,9790 ,7790
3,00 ,00000 ,29752 1,000 -,8790 ,8790
4,00 -,50000 ,29752 ,550 -1,3790 ,3790
5,00 -1,60000* ,29752 ,000 -2,4790 -,7210
6,00 -1,90000* ,29752 ,000 -2,7790 -1,0210
2,00
1,00 ,10000 ,29752 ,999 -,7790 ,9790
3,00 ,10000 ,29752 ,999 -,7790 ,9790
4,00 -,40000 ,29752 ,759 -1,2790 ,4790
5,00 -1,50000* ,29752 ,000 -2,3790 -,6210
6,00 -1,80000* ,29752 ,000 -2,6790 -,9210
3,00
1,00 ,00000 ,29752 1,000 -,8790 ,8790
2,00 -,10000 ,29752 ,999 -,9790 ,7790
4,00 -,50000 ,29752 ,550 -1,3790 ,3790
5,00 -1,60000* ,29752 ,000 -2,4790 -,7210
6,00 -1,90000* ,29752 ,000 -2,7790 -1,0210
4,00
1,00 ,50000 ,29752 ,550 -,3790 1,3790
2,00 ,40000 ,29752 ,759 -,4790 1,2790
3,00 ,50000 ,29752 ,550 -,3790 1,3790
5,00 -1,10000* ,29752 ,006 -1,9790 -,2210
6,00 -1,40000* ,29752 ,000 -2,2790 -,5210
5,00
1,00 1,60000* ,29752 ,000 ,7210 2,4790
2,00 1,50000* ,29752 ,000 ,6210 2,3790
3,00 1,60000* ,29752 ,000 ,7210 2,4790
4,00 1,10000* ,29752 ,006 ,2210 1,9790
6,00 -,30000 ,29752 ,913 -1,1790 ,5790
6,00
1,00 1,90000* ,29752 ,000 1,0210 2,7790
2,00 1,80000* ,29752 ,000 ,9210 2,6790
3,00 1,90000* ,29752 ,000 1,0210 2,7790
4,00 1,40000* ,29752 ,000 ,5210 2,2790
5,00 ,30000 ,29752 ,913 -,5790 1,1790
*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
91
Anexo 5: Prueba de Tukey para número de brotes (subconjuntos
homogéneos)
Tratamientos N
Subconjunto para alfa =
0.05
a b
1,00 10 2,7000
3,00 10 2,7000
2,00 10 2,8000
4,00 10 3,2000
5,00 10 4,3000
6,00 10 4,6000
Sig. ,550 ,913
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
92
Anexo 6: Prueba de Tukey para número de hojas (comparación múltiple)
(I) Tratamientos (J) Tratamientos Diferencia de
medias (I-J) Error típico Sig.
Intervalo de confianza al 95 %
Límite inferior Límite superior
1,00
2,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
3,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357
4,00 ,30000 ,28284 ,895 -,5357 1,1357
5,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
6,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
2,00
1,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
3,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
4,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357
5,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357
6,00 ,00000 ,28284 1,000 -,8357 ,8357
3,00
1,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357
2,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
4,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
5,00 -,30000 ,28284 ,895 -1,1357 ,5357
6,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
4,00
1,00 -,30000 ,28284 ,895 -1,1357 ,5357
2,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357
3,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
5,00 -,40000 ,28284 ,718 -1,2357 ,4357
6,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357
5,00
1,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
2,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357
3,00 ,30000 ,28284 ,895 -,5357 1,1357
4,00 ,40000 ,28284 ,718 -,4357 1,2357
6,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357
6,00
1,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357
2,00 ,00000 ,28284 1,000 -,8357 ,8357
3,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357
4,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357
5,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
93
Anexo 7: Prueba de Tukey para número de hojas (subconjuntos
homogéneos)
Tratamientos N
Subconjunto para alfa =
0.05
a
4,00 10 2,5000
3,00 10 2,6000
2,00 10 2,7000
6,00 10 2,7000
1,00 10 2,8000
5,00 10 2,9000
Sig. ,718
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
94
Anexo 8: Prueba de Tukey para número de raíces (comparación múltiple)
(I) Tratamientos (J) Tratamientos Diferencia de
medias (I-J) Error típico Sig.
Intervalo de confianza al 95 %
Límite inferior Límite superior
1,00
2,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650
3,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
4,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650
5,00 ,00000 ,42817 1,000 -1,2650 1,2650
6,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
2,00
1,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650
3,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
4,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
5,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650
6,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650
3,00
1,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
2,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
4,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650
5,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
6,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650
4,00
1,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650
2,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
3,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650
5,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650
6,00 -,40000 ,42817 ,936 -1,6650 ,8650
5,00
1,00 ,00000 ,42817 1,000 -1,2650 1,2650
2,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650
3,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
4,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650
6,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650
6,00
1,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
2,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650
3,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650
4,00 ,40000 ,42817 ,936 -,8650 1,6650
5,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
95
Anexo 9: Prueba de Tukey para número de raíces (subconjuntos
homogéneos)
Tratamientos N
Subconjunto para alfa =
0.05
a
4,00 10 3,2000
2,00 10 3,3000
3,00 10 3,4000
1,00 10 3,5000
5,00 10 3,5000
6,00 10 3,6000
Sig. ,936
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
96
Anexo 10: Prueba de Tukey para longitud de plántulas (comparación
múltiple)
(I) Tratamientos (J) Tratamientos Diferencia de
medias (I-J) Error típico Sig.
Intervalo de confianza al 95 %
Límite inferior Límite superior
1,00
2,00 ,37000 ,37375 ,919 -,7342 1,4742
3,00 -,05000 ,37375 1,000 -1,1542 1,0542
4,00 ,67000 ,37375 ,479 -,4342 1,7742
5,00 ,01000 ,37375 1,000 -1,0942 1,1142
6,00 -,10000 ,37375 1,000 -1,2042 1,0042
2,00
1,00 -,37000 ,37375 ,919 -1,4742 ,7342
3,00 -,42000 ,37375 ,869 -1,5242 ,6842
4,00 ,30000 ,37375 ,966 -,8042 1,4042
5,00 -,36000 ,37375 ,927 -1,4642 ,7442
6,00 -,47000 ,37375 ,806 -1,5742 ,6342
3,00
1,00 ,05000 ,37375 1,000 -1,0542 1,1542
2,00 ,42000 ,37375 ,869 -,6842 1,5242
4,00 ,72000 ,37375 ,398 -,3842 1,8242
5,00 ,06000 ,37375 1,000 -1,0442 1,1642
6,00 -,05000 ,37375 1,000 -1,1542 1,0542
4,00
1,00 -,67000 ,37375 ,479 -1,7742 ,4342
2,00 -,30000 ,37375 ,966 -1,4042 ,8042
3,00 -,72000 ,37375 ,398 -1,8242 ,3842
5,00 -,66000 ,37375 ,496 -1,7642 ,4442
6,00 -,77000 ,37375 ,323 -1,8742 ,3342
5,00
1,00 -,01000 ,37375 1,000 -1,1142 1,0942
2,00 ,36000 ,37375 ,927 -,7442 1,4642
3,00 -,06000 ,37375 1,000 -1,1642 1,0442
4,00 ,66000 ,37375 ,496 -,4442 1,7642
6,00 -,11000 ,37375 1,000 -1,2142 ,9942
6,00
1,00 ,10000 ,37375 1,000 -1,0042 1,2042
2,00 ,47000 ,37375 ,806 -,6342 1,5742
3,00 ,05000 ,37375 1,000 -1,0542 1,1542
4,00 ,77000 ,37375 ,323 -,3342 1,8742
5,00 ,11000 ,37375 1,000 -,9942 1,2142
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
97
Anexo 11: Prueba de Tukey para longitud de plántulas (subconjuntos
homogéneos)
Tratamientos N
Subconjunto para alfa =
0.05
a
4,00 10 3,9300
2,00 10 4,2300
5,00 10 4,5900
1,00 10 4,6000
3,00 10 4,6500
6,00 10 4,7000
Sig. ,323
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.
Realizado en: IBM SPSS Statistics 20
98
XII. FIGURAS DE
ANEXOS
99
Figura 1A. Recolectando los cormos (hijuelos de espada) del plátano
Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds). Lomas de Sargentillo,
2014.
Figura 2A. Cormos que servirán de explantes para la micropropagación.
Lomas de Sargentillo, 2014.
100
Figura 3A. Lavando los cormos provenientes del campo. Daule, 2014.
Figura 4A. Recudiendo el tamaño de los cormos. Daule, 2014.
101
Figura 5A. Cormos puestos en cada uno de los tratamientos de quitosano.
Daule, 2014.
Figura 6A. Quitosano empleado en el experimento. Daule, 2014.
102
Figura 7A. Cantidad de explantes después del primer repique o L1. Daule,
2014.
Figura 8A. Explantes después del segundo repique o L2. Daule, 2014.
103
Figura 9A. Medios de cultivos con las diferentes dosis de quitosano para el
tercer repique o L3. Daule, 2014.
Figura 10A. Desarrollo de los explantes en la tercera generación o L3.
Daule, 2014.
104
Figura 11A. En la cámara laminar, repicando los cormos. Daule, 2014.
Figura 12A. Repicando los cormos de L3. Daule, 2014.
105
Figura 13A. Terminando el repique de los explantes. Daule, 2014.
Figura 14A. Explante de plátano L4 contaminado por hongos 1. Daule,
2014.
106
Figura 15A. Explante de plátano L4 contaminado por hongos 2. Daule,
2014.
Figura 16A. Explantes desarrollándose. Daule, 2014.
107
Figura 17A. Toma del número de brotes que tiene el explante de plátano.
Daule, 2014.
108
Figura 18A. Junto al Ing. Eison Valdiviezo en el laboratorio
AGROVITROPARIS. Daule, 2014.
Figura 19A. Número de brotes que presentaron en la cuarta generación.
Daule, 2014.
109
Figura 20A. Explante con necrosis por bacterias en L4. Daule, 2014.
Figura 21A. Seis tratamientos y 10 repeticiones para la toma de las últimas
variables en la etapa 3 (L5). Daule, 2014.
110
Figura 22A. Desarrollo de las plántulas en la quinta generación o L5.
Daule, 2014.
Figura 23A. Plántulas desarrollándose en el día 133 del experimento.
Daule, 2014.
111
Figura 24A. Evaluación de las variables. Daule, 2014.
Figura 25A. Tomando datos de las diferentes variables. Daule, 2014.