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Universidad de Colima
Maestría en Ciencias Fisiológicas con
Especialidad en Farmacología
EL AGONISTA DOPAMINÉRGICO 7-HIDROXI-DIPROPILAMINOTETRALIN (7-
OH-DPAT), PRODUCE EFECTOS ELECTROFISIOLÓGICOS DIRECTOS NO
MEDIADOS POR RECEPTOR EN EL NODO S-A
Tesis que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Fisiológicas con
Especialidad en Farmacología
Presenta:
Héctor Rafael Tejeda Chávez
Asesor:
Dr. José Antonio Sánchez Chapula
Co-asesor:
Dr. José Jesús Lara Chávez
Colima, Col., Febrero 2005.
Universidad de Colima
Maestría en Ciencias Fisiológicas con
Especialidad en Farmacología
EL AGONISTA DOPAMINÉRGICO 7-HIDROXI-DIPROPILAMINOTETRALIN (7-
OH-DPAT), PRODUCE EFECTOS ELECTROFISIOLÓGICOS DIRECTOS NO
MEDIADOS POR RECEPTOR EN EL NODO S-A
Tesis que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Fisiológicas con
Especialidad en Farmacología
Presenta:
Héctor Rafael Tejeda Chávez
Asesor:
Dr. José Antonio Sánchez Chapula
Co-asesor:
Dr. José Jesús Lara Chávez
Colima, Col., Febrero del 2005.
Dedicado Especialmente a :
Mis Hijos: Héctor Rafael y Julio Bernabé.
Mi Esposa: Miriam Emir
Por su puesto a mis Papás Rafael y Josefina; Hermanos: Eliezer, Ma. de la
Luz, Rocío, Martha Alicia, Nora Judith, Tirzo Noe, Rosela, César y Marisa;
Sobrinos: Eliezer, Sony, Christopher, Oscar, Eric Rafael, Katia Fernanda,
Eduardo, Eric Dumar, Tirzo Noe, Eric Noe, Cesar Eduardo y Ángel Alejandro;
Cuñados (as): Cecilia, Juan, Oscar, Eduardo, Julio, Erika, Ruth Noemí, Lilia
Lizette y Julio Bernabé, Suegra: Ma. Guadalupe y Concuños: César y Rubén.
y
A todos aquellos que por amor al conocimiento,
luchan por él, a pesar de toda adversidad.
Sinceramente les doy las Gracias...
Al Dr. José Antonio Sánchez Chapula por abrirme las puertas de su
Laboratorio para la realización del presente proyecto y por todo el apoyo otorgado.
A mi alma Mater la Universidad de Colima y en particular al Centro
Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB) y todo el Cuerpo
Académico, que haya dedica una parte de su tiempo para enseñarme a
incursionar en la generación de nuevos conocimientos.
A los Drs.: José de Jesús Lara Chávez, Julián Torres Jácome y Ricardo
Navarro Polanco por compartir sus conocimientos.
A QFB. Marcelo por el apoyo técnico para realizar parte de la fase
experimental y al Estadístico Oswal por el apoyo en la fase analítica de este
trabajo.
Al personal de la biblioteca la Sra. Graciela y la Sra. Leticia por su buena
disposición de siempre en sus tareas cotidianas, así como al personal
administrativo: El C. P. Jorge y las Srias. Rosalba, Ofelia y Adriana.
Al personal del Bioterio: Jesús y Vicente.
Al CONACyT por la beca crédito otorgada para la realización de la Maestría.
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS 2
ABREVIATURAS 3
SUMMARY 4
RESUMEN 5
INTRODUCCIÓN 6
ANTECEDENTES 8-21
- Nodo Senoauricular. 8
- Potencial de Acción de las Células de Marcapaso. 9
- Corrientes iónicas del Potencial de Acción de Marcapaso 11
- Modulación de la actividad del marcapaso cardiaco. 17
- Receptores Dopaminérgicos. 20
JUSTIFICACIÓN 22
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 23
HIPÓTESIS 23
OBJETIVOS 24
MATERIALES Y MÉTODOS 25-28
- Nodo Senoauricular 25
- Registros Electrofisiológicos 26
- Preparación de soluciones 27
- Análisis estadístico 28
RESULTADOS 29-38
DISCUSIÓN 39
CONCLUSIONES 39
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43
2
ÍNDICE DE FIGURAS y TABLAS
Figura Página
1. Corrientes iónicas involucradas en las diferentes fases del ... 10
2. Parámetros electrofisiológicos del ... 24
3. Diagrama esquemático de la preparaciones del nodo S-A 26
4. Efectos del 7-OH-DPAT sobre la configuración del ... 30
5. Efectos del 7-OH-DPAT sobre la configuración del potencial de
acción de la células del nodo S-A de animales con simpatectomía
química.
32
6. Efectos del 7-OH-DPAT en presencia del U-99194A sobre la
configuración del ...
33
... potencial de acción de las células centrales del nodo S-A.
7. Curvas de la frecuencia de disparo y amplitud del potencial de
acción con el ...
35
8. Curvas de la duración del potencial de acción al 30 y 90% de la
repolarización con el ...
36
9. Curvas de la pendiente de subida de la fase 4 y la máxima
velocidad de subida de la fase 0 del potencial de acción con el ...
37
... 7-OH-DPAT en animales control, en animales con
simpatectomía química y en presencia del U-99194A.
Tablas
Parámetros electrofisiológicos del potencial de acción de las
células centrales del nodo S-A ...
1. ... en condiciones basales y en presencia del 7-OH-DPAT. 30
2. ... en condiciones basales y con el 7-OH-DPAT en conejos con
simpatectomía química.
32
3. ... en condiciones basales, con el U-99194A y la combinación del
7-OH-DPAT – U-99194A.
33
3
ABREVIATURAS
7-OH-DPAT 7-hidroxi-Dipropil Amino Tetralin (agonista de los receptores
dopaminérgicos D3). U-99194A Maleato 5,6-Dimetoxy-2-(di-n-propilamino) indan (Antagonista de los
Receptores Dopaminérgicos D3). ms Milisegundos. mV Milivolts. mA Miliamperes. M Mega Homs Ca2+ Ion Calcio. Na+ Ion Sodio. K+ Ion Potasio.
Mg++ Ion Magnesio. CaCl Cloruro de Calcio. NaCl Cloruro de Sodio. KCl Cloruro de Potasio.
MgCl2 Cloruro de Magnesio. NaH2PO4 Fosfato de Sodio. NaHCO3 Bicarbonato de Na+.
If Corriente f. ICa
2+ Corriente de Ca2+. Ik Corriente de Potasio.
IKr , IKs Corriente de K+ rectificadora tardía rápida y lenta. INaCa Intercambiador Na+-Ca2+ PA Potencial de Acción.
NSA Nodo Seno-Auricular. F Frecuencia de disparo espontánea.
APA Amplitud del Potencial de Acción. PDM Potencial Diastólico Máximo.
DPA30 Duración del Potencial de Acción al 30% de la Repolarización del PA.
DPA90 Duración del Potencial de Acción al 90% de la Repolarización del PA.
PF4 Pendiente de Subida de la Fase 4. Vmax Máxima Velocidad de Subida. M Micromolar.
mmol/L Milimoles por litro. M Molar
DMSO Dimetil Sulfóxido.
4
SUMMARY
Objective: To determine the electrophysiological effects of the D3 dopaminergic
agonist, 7-OH-DPAT, on the Action Potential (AP) of the central zone cells of the
sinoatrial node (SAN) of the rabbit.
Methods Intracellular registers were carried out on multicellular SAN preparations
using the traditional 2-electrode technique, taking three study groups into account: the
7-OH-DPAT was perfused to the preparations of the first group (control group, n=4)
and the second group (animals with chemical sympathectomy, pretreated with
reserpine, n=4) at concentrations of 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, and 3 M. The
preparations of the third group (n=5) was perfused with 7-OH-DPAT at the same
concentrations, but in the presence of the D3 dopaminergic receptor selective
antagonist, U99194, at 1 M.
Results: A significant increase, in relation to the baseline record, in the action
potential duration measured at 90% of the repolarization (DPA90) was observed in the
three study groups. At the same time, there was a significant decrease in the
spontaneous trigger frequency (F), the maximum diastolic potential (MDP), the
amplitude (APA), the phase 4 upstroke slope (P4S) and the phase 0 maximum
upstroke velocity (Vmax) of the nodal action potential at concentrations of 1M. No
significant differences were found among the three groups studied.
Conclusions: The electrophysiological findings show that 7-OH-DPAT has a direct
effect on the S-A node cells of the New Zealand rabbit, suggesting that these effects
are not mediated by D3 dopaminergic receptors - at least not in this specie.
Key words: Cardiac Pacemaker, D3 Dopaminergic Receptors
5
RESUMEN
Objetivo: Determinar los efectos electrofisiológicos del agonista dopaminérgico D3, el
7-OH-DPAT sobre el Potencial de Acción (PA) de las Células de la zona central del
Nodo Senoauricular (NSA) de conejo Nueva-Zelanda.
Método Se realizaron registros intracelulares en preparaciones multicelulares del
NSA con la técnica convencional de 2 electrodos, considerándose 3 grupos de
estudio: a las preparaciones del primer (grupo control, n = 4) y segundo grupo
(animales con simpatectomía química: pretratados con reserpina, n = 4) se les
perfundió el 7-OH-DPAT a las concentraciones 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 M y a las
preparaciones del tercer grupo (n = 5) se le perfundieron las mismas concentraciones
del 7-OH-DPAT pero en presencia del antagonista selectivo de los receptores
dopaminérgicos D3, el U99194 a 1 M.
Resultados: En los 3 grupos de estudio, se observó un incremento significativo
-respecto al registro basal- en la duración del potencial de acción medido al 90% de
la repolarización (DPA90) y al mismo tiempo disminuyó de forma significativa: la
frecuencia de disparo espontánea (F), el potencial diastólico máximo (PDM), la
amplitud (APA), la pendiente de subida de la fase 4 (PF4) y la máxima velocidad de
subida de la fase 0 (Vmax) del potencial de acción nodal a las concentraciones 1M.
No se encontraron diferencias significativas entre los 3 grupos estudiados.
Conclusiones: Los hallazgos electrofisiológicos evidencian que el 7-OH-DPAT
ejerce un efecto directo sobre las células del nodo S-A de conejo, sugiriendo que
estos efectos no son mediados por receptores dopaminérgicos D3, al menos en esta
especie.
Palabras claves: Marcapaso Cardiaco, Receptores Dopaminérgicos D3.
6
Introducción
INTRODUCCIÓN
Las investigaciones sobre la distribución y el papel funcional de los receptores
dopaminérgicos en el sistema nervioso central y en tejidos periféricos se han
intensificado desde que fueron clonados y secuenciados por Bunzow et al. en 1988.1
A la fecha, se conoce que la dopamina -amina endógena- ejerce sus acciones a
través de 5 subtipos de receptores dopaminérgicos, los cuales están acoplados a la
proteína nucleótido guanina (proteína G). La anterior clasificación de los receptores
dopaminérgicos incluía la familia de receptores D1 (renombrados receptores
parecidos a D1) y la familia de receptores D2 (renombrados receptores parecidos a
D2).1,2
Los receptores dopaminérgicos parecidos a D1 incluyen los D1 o D1A y D5 o D1B,
mientras que los receptores parecidos a D2 incluyen D3, D4 y dos isoformas del
subtipo D2. La expresión de los receptores dopaminérgicos varía de una especie
animal a otra y a menudo de un tejido a otro en el mismo animal.1,2
Los receptores dopaminérgicos parecidos a D1 y a D2 están acoplados positiva
y negativamente -en forma respectiva- a la adenilato ciclasa. Sin embargo, se ha
comprobado la interacción con otras señales intracelulares tales como la fosfolipasa
C. Los receptores a la dopamina han sido estudiados principalmente en el cerebro,
donde participan en el control de la actividad motora, en el comportamiento, el
lenguaje y la memoria.1
7
Introducción
Los receptores dopaminérgicos también están distribuidos en los tejidos
periféricos. Ellos son considerados similares pero no idénticos a sus homólogos, los
receptores cerebrales dopaminérgicos.1
El presente trabajo tiene el propósito de identificar los efectos electrofisiológicos
que ejerce el agonista dopaminérgicos D3 7-OH-DPAT, sobre las células del
marcapaso de conejo a través de los potenciales de acción, para demostrar desde el
punto de vista farmacológico la presencia o ausencia de los receptores
dopaminérgicos D3.
8
Antecedentes
ANTECEDENTES
Nodo Senoauricular (NSA)
El corazón del ser humano se contrae en promedio una vez cada segundo y
normalmente cada contracción o latido se inicia con un impulso eléctrico en el NSA,
la región llamada marcapaso. Este impulso eléctrico se genera espontáneamente y
se propaga al resto del corazón para producir la contracción del músculo cardiaco.3
En cada ciclo cardiaco, varios miles de células con actividad espontánea en el
NSA coordinan o sincronizan su actividad eléctrica para generar un sólo impulso.
Existen evidencias teóricas y experimentales que soportan esta idea del
acoplamiento eléctrico, subyaciendo la sincronización a través de las uniones
comunicantes entre las células de marcapaso y con el resto de los tejidos cardiacos.3
a). Automaticidad normal
En 1907 Keith y Flack descubrieron el NSA, el cual es una pequeña pieza de
tejido de forma ovalada o rectangular, situada en el techo de la aurícula derecha,
entre las venas cavas superior e inferior y limitada lateralmente por la crista
terminalis y el septum interauricular.3
En estudios con electrodos intracelulares del NSA, se ha encontrado que las
células tienen las siguientes propiedades : 1) habilidad para producir potenciales de
9
Antecedentes
acción rítmicos como un resultado de la despolarización lenta del potencial de
membrana durante la diástole, 2) potenciales diastólicos máximos relativamente
bajos, entre -50 y -60 mV, 3) la duración del potencial de acción de 100 hasta 300 ms
-dependiendo de la especie-, 4) la longitud de los ciclos espontáneos varían sobre un
rango amplio de valores.3
En 1980 Bleeker et al4 ampliaron estos estudios iniciales usando empales
sucesivos que mapearon sistemáticamente el NSA de conejo. En este estudio, se
demostró que existen áreas de marcapasos latentes y dominantes en la región del
NSA. Los criterios usados para hacer la distinción entre estas dos áreas fueron los
siguientes: La velocidad de despolarización diastólica, la lenta despolarización de
fase cero y la transición lisa desde la despolarización diastólica hasta la sistólica. Se
concluyó que un grupo de aproximadamente 5,000 células constituían la región del
marcapaso dominante. Estas células ocupan una región de 0.3 mm2 en el área
central del nodo y son de un tipo, las llamadas células nodales típicas (o células P).
Estas áreas en orden jerárquico son capaces de controlar la excitación del corazón
siendo responsables de establecer la frecuencia cardiaca. La crista terminalis es la
principal zona que propaga los impulsos iniciados en el NSA. El impulso cardiaco se
propaga desde la crista hasta la aurícula completa y al nodo aurículo-ventricular
(NAV). El impulso desde el NAV es conducido a través del sistema de conducción
especializado del paquete del haz de His y de las fibras de Purkinje para activar los
ventrículos.4
b). Potencial de Acción de las Células del Marcapaso
Las células dominantes del marcapaso cardiaco se localizan en el área central
del nodo S-A, las cuales emiten un potencial de acción característico (ver figura 1).5,6
10
Antecedentes
Algunas de las características a resaltar son, la presencia de una despolarización
diastólica espontánea, la lenta velocidad de despolarización del potencial de acción
(5-10 V/s), la ausencia de una meseta real similar a la del potencial de acción
ventricular. Como se puede observar el potencial de acción tiene tres fases: la fase 0
(despolarización), la fase 3 (repolarización) y la fase 4 (diastólica espontánea). Los
parámetros electrofisiológicos del potencial de acción fueron los siguientes: La
duración del potencial de acción (DPA) de 450 ms, la amplitud del potencial de
acción (APA) de 65 mV, con un potencial diastólico máximo (PDM) de -60mV y
presenta una lenta velocidad de despolarización de 5 V/s (Vmax).
3
4
0
iF
iN a - C a
iC a ( L )
iC a ( T )i
K
2 0 m V
- 6 0 m V
0
2 0 0 m s
Figura 1. Corrientes iónicas involucradas en la despolarización diastólica espontánea en el potencial de acción de las células del marcapaso de la zona central del corazón de conejo. ik = corriente de potasio; iCa(T) y iCa(L) = corriente de calcio tipo T y tipo L; iNaCa = Intercambiador Na+Ca+; iF = corriente de hiperpolarización activada. Fase 0 = Despolarización rápida de fase 0; Fase 3 = Repolarización; Fase 4 = Despolarización diastólica espontánea de fase 4. Fuente: Adaptado de Zipes DP, Jalife J. Cardiac Electrophysiology: From Cell to Bedside. 2nd ed. W.B. Saunders Company. 1995. El PA corresponde a un registro control de un experimento de este trabajo.
11
Antecedentes
c). Corrientes Subyacentes en el Potencial de Acción de las Células del
Marcapaso Cardiaco.
1. Corriente de Fondo
La Bomba Na+/K+, con un índice de acoplamiento de 3:2, tiende a causar una
corriente saliente. La corriente generada por la bomba participa de alguna manera en
la génesis del potencial de reposo de la células de trabajo auriculares y ventriculares
y el sistema de conducción ventricular. En las células de marcapaso, es difícil que la
bomba de Na+/K+ tenga efectos significativos sobre la actividad eléctrica ya que, en
esta se producen pequeños cambios fisiológicos del Na+ intracelular y el K+
extracelular durante la activación, debido a que en las células del nodo, hay muy
poca o nada de entrada de Na+ a través de canales de Na+. Sin embargo, la corriente
del intercambiador Na+-Ca2+ (INaCa), que es entrante durante todo el rango de la
despolarización diastólica, proporciona una corriente básica que asociada con otras
corrientes participan en la despolarización durante la diástole.5,6 Además, la corriente
de rectificación entrante de K+ está prácticamente ausente en las células del NSA.
2. Corriente de Marcapaso
La corriente activada con la hiperpolarización (If; también referida como IH) es
uno de los sistemas de corrientes asociado con la generación de actividad de
marcapaso.7 El subíndice f (del ingles “funny”, que significa raro) se aplica por las
propiedades inusuales de la corriente.8 Aunque usualmente referida como la
“corriente de marcapaso”, se ha demostrado que la If también está presente en varios
tipos de células, incluyendo células no cardiacas. La If fue llamada originalmente Ik2 y
fue descrita como una corriente de potasio saliente.9
12
Antecedentes
Estos problemas fueron abordados en un estudio muy sistemático y se
demostró que IK2 no era una corriente saliente y por tanto que era la misma corriente
entrante If.10. Además, en varias simulaciones por computadora y en trabajos
experimentales se observó que al bloquear el canal no se detenía la actividad de
marcapaso y que el valor del PDM en las células del marcapaso del NSA es bastante
despolarizado (-65 mV) y por lo tanto a este voltaje de activación la corriente saliente
no puede contribuir a la despolarización diastólica de fase 4.10,11 En base a estas
consideraciones, se ha sugerido que la If es la principal corriente responsable de la
despolarización diastólica en las células de Purkinje, considerando que el valor del
PDM está muy polarizado (cerca de -85 mV).12 Sin embargo, no es universalmente
aceptada su participación en la despolarización diastólica espontánea del nodo seno-
auricular.
Se ha encontrado y caracterizado la corriente If en varios tejidos cardiacos
completos y en preparaciones de células unitarias.7,11,13,14,15 La If no es específica
(dependiente de Na+ o K+), empieza a activarse alrededor de -40 mV hasta -50 mV y
tiene un potencial de inversión de -20 mV en el NSA. Se ha demostrado que, bajas
concentraciones de iones de cesio (1-2 mM) inhiben la If en varias preparaciones.
Hay datos muy limitados en canales unitarios sobre la If en el NSA. DiFrancesco
(1995) recientemente reportó los primeros registros de If en canales unitarios de las
células del NSA de conejo y demostró que la conductancia del canal es pequeña, lo
cual podría explicar la anterior inhabilidad para registrarla. Se demostró que con 70
mM KCl y 70 mM NaCl en la solución externa, la conductancia del canal unitario fue
de 1 pS, un valor pequeño para un canal no selectivo.16
Actualmente es casi seguro que alguna cantidad de If se activa durante la
13
Antecedentes
despolarización diastólica en las células de marcapaso del NSA.15 Además, la
cantidad de corriente puede variar debido a los cambios en la concentración de los
iones de calcio intracelular o puede ser subestimada especialmente si no son usadas
las mediciones adecuadas para minimizar la complicaciones de la resistencia en
serie.17
En resumen, la If tiene características peculiares que la distinguen de las otras
corrientes cardiacas. La If en condiciones fisiológicas: 1, está compuesta por el flujo
de cationes monovalentes: Na+ y K+ a través de los canales If, 2, es entrante en su
rango de activación. 3, se activa con la hiperpolarización cuando el voltaje de
membrana entra en el rango diastólico (aproximadamente -50 mV), un mecanismo
que se opone a los procesos de repolarización y por lo tanto contribuye a inducir la
despolarización espontánea después de la terminación del potencial de acción, y 4,
se desactiva durante el potencial de acción.6
3. Corrientes Entrantes Dependientes de Tiempo
3.1. Corriente de Calcio
Las corrientes de Ca2+ tipo T y L son transitorias con inactivación rápida y lenta,
respectivamente. Los canales de Ca2+ tipo T transportan una corriente que se
inactiva rápidamente y se activa con despolarizaciones menos positivas, ya que la
dependencia de voltaje de activación es más negativa que la de los canales tipo L. 18,19 El canal es relativamente insensible a la dihidropiridinas y al cadmio, pero
muestra sensibilidad al níquel y al fármaco mibefradil.42:18 La corriente de calcio tipo
T ha sido sugerida como participante en la primera fase de la despolarización
14
Antecedentes
diastólica espontánea.18,19 En contraste, el canal de Ca2+ tipo L, se activa e inactiva a
potenciales mas positivos y su inactivación es más lenta que la tipo T, permitiendo
por lo tanto, una despolarización sostenida que es particularmente responsable de la
última fase de la despolarización diastólica espontánea, de la fase de subida del
potencial de acción y del sostenimiento de la fase corta de meseta del potencial de
acción nodal.18,19 La corriente tipo L ha sido bien estudiada y corresponde a la
corriente de calcio convencional sensible a las dihidropiridinas.
4. Corrientes Salientes Dependientes del Tiempo.
4.1. Corriente Rectificadora Tardía.
La corriente de potasio rectificadora tardía (Ik) es importante en la repolarización
del potencial de acción cardiaco. Sobre todo el componente rápido de la rectificación
tardía, IKr.9 Durante un potencial de acción la Ik se activa produciendo una corriente
saliente que repolariza la célula. Durante la repolarización, esta corriente es
desactivada. La desactivación dependiente de tiempo de esta corriente saliente en
presencia de corrientes entrantes, de fondo (INaCa) y dependientes de tiempo (ICa),
participan en la despolarización diastólica espontánea.20
4.2. Otras Corrientes Salientes Dependientes del Tiempo.
Existen evidencias de que algunas corrientes están presentes en las células del
marcapaso, otras pueden estar ausentes y otras permanecen sin ser investigadas.
La corriente IK1, rectificadora entrante, juega el papel principal para determinar el
15
Antecedentes
potencial de membrana en reposo de la mayoría de las células cardiacas. La
ausencia de IK1 en las células del nodo seno-auricular explica los valores
relativamente muy bajos del potencial de reposo y una impedancia de entrada muy
alta (1-5 G) de estas células.21 La corriente transitoria de salida, Ito parece estar
presente únicamente en las células de la periferia del NSA. El canal de K+ sensible a
acetilcolina (Ach) es un canal de 50 pS que tiene propiedades comunes con el
rectificador entrante (IK1) y es un factor importante en el efecto de la estimulación
parasimpática del NSA (ver más adelante). Los canales de K+ sensibles a ATP, IKATP
también se han encontrado en las células del nodo. Estos canales de K+ se abren
con niveles bajos de ATP intracelular, permitiendo una corriente de K+ hacia fuera
que acorta la duración del potencial de acción e hiperpolarización de las células con
lo que se disminuye la frecuencia de disparo.6
5. Interacción de las corrientes Iónicas en la despolarización diastólica.
Se requiere una corriente entrante neta para despolarizar la membrana durante
la diástole en las células del marcapaso del NSA. Aunque la naturaleza exacta del
mecanismo (s) iónico (s) que provee esta corriente permanece incierta. Un consenso
emergió de varios experimentos y simulaciones por computadora mostraron que hay
una interacción entre diferentes corrientes iónicas y que cada corriente se activa en
algún punto durante la despolarización diastólica (fase 4) dependiendo del rango del
voltaje, en la cual la corriente normalmente se activa.11,10,22
En la figura 1, se muestra la despolarización diastólica de una célula del NSA y
se observa que en el inicio de la fase 4 (PDM de aproximadamente -65mV) operan
en conjunto tres sistemas de corrientes para empezar el proceso de despolarización
16
Antecedentes
diastólica, estas corrientes incluyen Ik, If, y la corriente básica del Intercambiador
(Na+-Ca2+). Hacia la mitad de la fase 4, la ICa(T) es activada y subsecuentemente
seguida por la activación de ICa (L) justo antes de alcanzar el umbral de subida.
d). Modulación de la Actividad del Marcapaso Cardiaco
La modulación de la actividad del marcapaso se da por la combinación de varios
factores y primariamente involucra la regulación de los canales iónicos responsables
de la despolarización diastólica. Estos incluyen mecanismos nerviosos (colinérgico y
-adrenérgico), intracelulares (iones de calcio, protones y ATP) e intercelulares
(mecanismos celulares de la sincronización del marcapaso).5,6
La activación de If es el principal mecanismo por el cual los neurotransmisores
colinérgicos (Acetilcolina) y -adrenérgicos (Noradrenalina) regulan el ritmo cardiaco
en condiciones fisiológicas.6 La estimulación colinérgica desvía la curva de activación
hacia potenciales negativos, lo que ocasiona que a los voltajes fisiológicos, menos
corriente If sea activada, disminuyendo la velocidad de despolarización diastólica y la
frecuencia de disparo de las células. Por otro lado, la estimulación -adrenérgica
desvía la curva de activación de la corriente If hacia potenciales positivos, lo que
ocasiona que en los rangos de potencial fisiológicos del nodo aumente la corriente If,
aumentando la velocidad de despolarización diastólica y la frecuencia de disparo de
las células.6
17
Antecedentes
1. Mecanismos Nerviosos:
1.1. Colinérgico
La Acetilcolina (ACh) es liberada por la fibra vagal postsináptica causando un
incremento en la permeabilidad de potasio mediado por receptor muscarínico, así
como una disminución en la permeabilidad de calcio. Las células de marcapaso
responden a la estimulación vagal o a la ACh aplicada exógenamente, con una
hiperpolarización de la membrana,23-25 además de un cronotropismo negativo.25
Actualmente se considera que los efectos de la ACh son sobre tres corrientes: calcio,
potasio y la If.
Paes de Carvalho et al. (1969).26 observaron que la ACh suprime la fase final de
subida en las células del nodo, indicando que la ICa puede ser sensible a la ACh.
Estos hallazgos se confirmaron con fijación de voltaje27,28,29 y se demostró que la
ACh reduce la conductancia máxima de la ICa, mientras que la cinética de la corriente
no se afecta.28 Tal inhibición de la ICa disminuirá la despolarización espontánea y por
tanto la frecuencia de la actividad del marcapaso.
Varios investigadores han caracterizado una corriente de K+ inducida por ACh,
IK(ACh), en células aisladas del marcapaso. Característicamente, el canal tiene un
tiempo de apertura promedio = 1 ms y una probabilidad de apertura baja, la cual fue
aumentada en presencia de ACh. Registros en canales unitarios y en células
completas mostraron que esta corriente de potasio exhibe una fuerte rectificación. En
presencia de 20 mM de potasio en la pipeta, por ejemplo, la conductancia de cuerda
18
Antecedentes
del canal unitario fue marcadamente menor en la dirección saliente que en la
entrante (5 pS comparado con 25 pS).
La inhibición de la actividad de marcapaso con ACh puede también ser ligada a
un efecto de la ACh sobre la corriente activada con la hiperpolarización, If.25,30 Las
concentraciones bajas de ACh (0.03-1M) inhiben la actividad de marcapaso también
como la If. La ACh cambia la activación de If a voltajes más negativos, lo cual origina
que a los potenciales de membrana fisiológicos de las células nodales, menos
corriente If sea activada. La inhibición de esta corriente inducida por ACh involucra
los receptores muscarínicos debido a que fue antagonizada con atropina. También,
fue abolida en presencia de toxina pertussis, sugiriendo el involucramiento de una
proteína G.25,30 DiFrancesco y Tromba (1987) también reportaron que la modulación
de canal If inducida por ACh involucra un segundo mensajero. Se concluyó que la
inhibición ocurrió por una disminución del AMPc, como resultado de la inhibición de
la alta actividad de la adenilato ciclasa normalmente presente en las células en
reposo.
1.2. Adrenérgico
Se conoce bien el mecanismo por el cual la adrenalina afecta las corrientes
iónicas; al estimular el simpático se libera noradrenalina, la cual se combina con los
receptores -adrenérgicos para causar un incremento en la permeabilidad de la
membrana a los iones de calcio y potasio. La unión de los agonistas -adrenérgicos
a los receptores activa la adenilato ciclasa y resulta un aumento del AMPc. Este
último activa una proteína cinasa, la cual fosforila los canales iónicos.
19
Antecedentes
La estimulación simpática tiene un efecto inotrópico positivo sobre el
marcapaso.8,18,27,31 Los experimentos en preparaciones de tejido del NSA8,31 y en
preparaciones de células unitarias18 demostraron que la estimulación adrenérgica
indujo aumento en la ICa subyaciendo también este mecanismo al efecto cronotrópico
positivo observado. La estimulación adrenérgica induce un incremento en la
conductancia de ICa sin un cambio en cinética de la corriente. Se estudio el efecto de
la isoprenalina -agonista -adrenérgico- sobre los dos tipos de corrientes de calcio,18
y se encontró que en ambos niveles de corrientes de canales unitarios y
macroscópica, el efecto de la isoprenalina fue sobre las corrientes de calcio tipo L y
no las tipo T.
En preparaciones de NSA,31 se observó que la estimulación adrenérgica
también causó un aumento en IK sin modificar la cinética de corriente. La
estimulación adrenérgica también causa un incremento en If,8 asociado con un
cambio positivo en la curva de activación de la corriente.15 Los datos de las
corrientes de canales unitarios de If mostraron que la modulación de la corriente
inducida por la adrenalina fue mediada por una incrementada probabilidad de
apertura del canal, sin cambios en la conductancia.16 Estos resultados por tanto
sugieren que el efecto de la adrenalina es sobre la dependencia de voltaje de lo
corriente, más que sobre la amplitud de corriente. Se ha reportado4 que algunas
células del NSA son más sensibles que otras a las catecolaminas y se demostró un
cambio del sitio de marcapaso desde las células del marcapaso primario hacia las
células del marcapaso secundario en presencia de catecolaminas, el aumento de If
en las células del marcapaso secundario causará la conversión a marcapaso
dominante. Es concebible que el papel principal de If en el marcapaso quizás sirva
20
Antecedentes
como el medio por el cual la velocidad del marcapaso es modulada con las
catecolaminas.
Receptores Dopaminérgicos
La dopamina es el neurotransmisor de las catecolaminas que predomina en el
cerebro de los mamíferos, donde controla una gran variedad de funciones
incluyendo: actividad de locomoción, cognición, emoción, reforzamiento positivo,
ingesta de alimentos y regulación endocrina. Esta catecolamina también juega
múltiples papeles en la periferia como: la liberación de catecolaminas, secreción
hormonal, tono vascular, función renal y motilidad gastrointestinal.2
La primera evidencia de la existencia de los receptores a dopamina en el SNC
fue en 1972, cuando los estudios bioquímicos mostraron que la dopamina era capaz
de estimular a la adenilato ciclasa (AC). En 1978, se tenían evidencias de la
existencia de dos poblaciones de receptores, una que se acoplaba positivamente a la
AC y la otra que era independiente del sistema generador del AMPc. En 1979,
Kebabian y Calne sumaron estas observaciones y sugirieron llamar D1 a los
receptores que estimulaban a la AC y D2 a los que no se acoplaban a la AC. A través
de estudios subsecuentes se confirmó este esquema de clasificación y los receptores
D1 y D2 fueron claramente diferenciados farmacológica, bioquímica y
fisiológicamente; así como su distribución anatómica.2
Después de la introducción de los procedimientos de clonación de genes, se
caracterizaron tres nuevos subtipos de receptores a DA. Estos fueron llamados D3,
21
Antecedentes
D4 y D5/D1b y a través de estudios estructurales conjuntamente con los estudios
previos se llegó a la conclusión de que, todos los subtipos de receptores a DA
estaban dentro de una de las dos categorías de receptores inicialmente reconocidas.
En efecto, los receptores D1 y D5/D1b compartían una alta homología en sus dominios
transmembranales. De igual forma, las secuencias transmembranales de los
receptores D2, D3 y D4 son altamente conservadas.2
Un requisito clave clásico para dilucidar el papal funcional de los subtipos de
receptores individuales es mediante la identificación de agonistas y antagonistas
selectivos. En efecto, manipulaciones farmacológicas han clarificado el papel de los
receptores D1 y D2 en el control de varias funciones.2
Los sitios de unión del receptor dopaminérgico parecido a D2 en el corazón de
humano fueron evidentes a través de los estudios autoradiográficos y la unión de
radioligandos como la espiperona [3H]. El mismo autor encontró uniones positivas en
el tejido auricular de rata y humano, usando clozapina [3H] (antagonista del receptor
dopaminérgico D4) como ligando, mientras que no se encontraron uniones
específicas de clozapina [3H] en ventrículos, sugiriéndose la expresión del subtipo de
receptor D4 en tejido auricular. Otros estudios han reportado la expresión de
receptores dopaminérgicos parecidos a D1 en corazones de rata y humano a través
del análisis de Western Blot y técnicas de inmunohistoquímica con microscopia de
luz. A pesar que los datos soportan la presencia de receptores dopaminérgicos en el
corazón, no hay información acerca de su papel fisiológico en las funciones
cardiacas.1
22
Justificación
JUSTIFICACIÓN
En un trabajo previo, se estudio el mecanismo de acción a través del cual el
agonista selectivo de los receptores dopaminérgicos D3, el 7-OH-DPAT, induce un
efecto cronotrópico negativo en el corazón de cobayo. Se usaron corazones de
cobayo control (n=28) y con simpatectomía química (n=12) (pretratados con
reserpina 5 mg/Kg de peso, ip). Los corazones fueron extraídos y colocados en el
sistema de perfusión retrógrada y se realizaron curvas de dosis-respuesta, con 7-
OH-DPAT (10-9 a 10-5 M) en ambos grupos, evaluando la frecuencia cardiaca. En dos
subgrupos de corazones no reserpinizados, la curva dosis-respuesta del 7-OH-DPAT
se realizó en presencia del antagonista selectivo de los receptores dopaminérgicos
D3, el maleato U-99194A (a 1 M, n=8 y 10 M, n=8). Se encontró que el efecto
inotrópico negativo del 7-OH-DPAT se inhibió a concentraciones nanomolar, en los
corazones control en presencia del antagonista y con simpatectomía química, lo que
sugirió que el 7-OH-DPAT probablemente esta activando receptores D3 presinápticos
en las terminales nerviosas del corazón. La persistencia del efecto cronotrópico
negativo a concentraciones micromolar en ambos grupos sugiere la localización
postsináptica del mismo receptor o un probable efecto no mediado por este subtipo
de receptor.
En consecuencia, se requieren estudios electrofisiológicos de los efectos del 7-
OH-DPAT sobre el potencial de acción (PA) de las células de marcapaso cardiaco en
preparaciones multicelulares aisladas del NSA de conejo, para determinar si existe
un mecanismo directo o indirecto. Por razones técnicas para la disección del NSA se
prefirió el uso de conejos en lugar de cobayos, ya que en el conejo la zona del nodo
se encuentra bien delimitada, lo que no sucede con otras especies, en las que es
más difícil registrar de la zona central del nodo. Por otro lado, la electrofisiología del
NSA de se encuentra bien caracterizada.
23
Planteamiento del Problema
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿El efectos del agonista dopaminérgico D3, el 7-OH-DPAT, sobre las células
centrales del nodo SNA es indirecto (mediados por receptor) o directo (no mediado
por receptor)?
HIPÓTESIS
Existe un efecto directo del agonista de los receptores dopaminérgicos D3, el 7-
OH-DPAT sobre las células del nodo S-A.
24
Objetivos
OBJETIVOS
General
- Determinar si el efecto del agonista 7-OH-DPAT es directo o indirecto sobre las
células del nodo S-A de la zona central del conejo Nueva-Zelanda.
Específicos
- Medir los parámetros electrofisiológicos siguientes: la frecuencia de los disparos
espontáneos (F), el potencial diastólico máximo (PDM), la amplitud (APA), Duración
al 30 y 90% de la repolarización (DPA30 y DPA90), la pendiente de subida de la fase 4
(PF4) y la máxima velocidad de subida de la fase 0 (Vmax) del potencial de acción de
las células centrales del nodo S-A, en presencia de diferentes concentraciones del 7-
OH-DPAT en animales íntegros, en animales reserpinizados y en combinación con el
U-99194A a 1 M. Estos parámetros se compararon con sus basales (figura 2).
P D M
L C
A P A
Vm a x
P F4
D P A9 0
D P A3 0
- 6 0 m V
0
2 0 m V
2 0 0 m s
Figura 2. Parámetros electrofisiológicos del potencial de acción de las células centrales del NSA. LC = Longitud del Ciclo; PDM = Potencial Diastólico Máximo, APA = Amplitud del Potencial de Acción; DPA30 y DPA90 = Duración al 30 y 90% de la amplitud del Potencial de Acción; PF4 = Pendiente de Subida de la Fase 4;Vmax = Máxima Velocidad de Subida de la Fase 0.
25
Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
Nodo Senoauricular (NSA) :
En este trabajo se utilizaron conejos machos Nueva-Zelanda de 1.5-2.5 Kg (un
grupo de ellos fueron previamente tratados con reserpina 5mg/Kg i.p. de 17 a 22
horas antes de ser sacrificados). Previo a la extracción del corazón se les administró
heparina (10mg/Kg) y fenobarbital (30 mg/Kg) como anticoagulante y anestésico
general, respectivamente, para posteriormente decerebrar el animal con un golpe en
la parte dorsal del cuello. El corazón se extrajo y se colocó en solución Tyrode
-previamente oxigenada- a temperatura de 30 °C. A la pieza quirúrgica se le retiró
pericardio y tejido remanente, dejando únicamente corazón y grandes vasos, se
procedió al reconocimiento de las cavidades cardiacas (aurículas y ventrículos) así
como la localización de la vena cava superior, posteriormente se realizó un corte
transversal entre aurículas y ventrículos respetando las primeras. Posteriormente, se
aisló la aurícula derecha y se abrió para exponer la superficie endocárdica del NSA.
Por disección paralela a la crista terminalis, se obtuvieron pequeños trozos de tejidos
(1.5 mm x 0.5 mm), los cuales fueron ligados con seda fina para obtener
preparaciones pequeñas (aproximadamente 0.35 mm x 0.35 mm)33,34,35 muchas de
estas preparaciones mostraron disparos espontáneos y el sitio de marcapaso no
cambió durante los experimentos (ver figura 3).
Las preparaciones pequeñas fueron colocadas en un baño de tejido (3 mL de
volumen) y mantenidas a 35 0.1 °C. La composición de la solución Tyrode fue (en
mmol/L): NaCl 125, KCl 5.4, MgCl26H2O 1, NaHCO3 24, NaH2PO4 0.42, Dextrosa
11.0, CaCl2 1.8). La solución fue gasificada con Carbógeno (O2 95% y CO2 5%).35
26
Materiales y Métodos
Figura 3. Preparaciones usadas. A. Diagrama Esquemático de los cortes en hebras (1-4) del nodo S-A. Las hebras fueron anudadas en series de preparaciones parecidas a una pelota. Se indican las relaciones anatómicas a su alrededor, la nomenclatura usada para las pelotas, así como las distancias aproximadas de las hebras y las pelotas a partir de la primera hebra y la primera pelota. B. Dibujo de una típica hebra dividida en la serie de preparaciones parecidas a pelotas. La pelota A siempre incluye parte de la rama derecha del paquete (una solapa de tejido) que rodea al nodo. Fuente: Kodama I, Boyett MR, Nikmaram MR, et al. Am J Physiol. 1999;276:H793-802.
Registros Electrofisiológicos Cardiacos :
Los potenciales de acción transmembrana de la células fueron registrados
diferencialmente con dos microelectrodos de vidrio (pipetas) llenados con una
solución conductora de KCl 3 M, las pipetas tenían una resistencia de 15 a 30 MΩ.
Un microelectrodo fue colocado fuera de la preparación en el baño de perfusión y
con el otro se empalaban las células. Los microelectrodos estaban conectados por
un alambre de Ag-Ag clorurado a un preamplificador de alta impedancia de entrada y
con un compensador de la capacitancia (Modelo 750, WPI, New Haven, CT, USA),
27
Materiales y Métodos
que a su vez estaba conectado a un CyberAmp 320 de Axon Instruments y a una
tarjeta de adquisición de datos los cuales eran analizados en el programa Axotape
(Axon Instruments).35
Los parámetros que se midieron fueron: frecuencias de los disparos
espontáneos (F), el potencial diastólico máximo (PDM), la amplitud del potencial de
acción (APA), la duración del potencial de acción fue medida desde el momento de la
despolarización de fase 0 hasta el tiempo en que se completó el 30 (DPA30) y el 90%
(DPA90) de la repolarización, la pendiente de subida de la fase 4 (PF4) y la máxima
velocidad de subida de la fase 0 (Vmax). Después de una hora de equilibrio con la
solución Tyrode, así como la temperatura estable y un flujo constante, se realizaron
las mediciones control y posteriormente se perfundió la solución Tyrode con el
agonista dopaminérgico 7OH-DPAT. El antagonista dopaminérgico U99194, fue
perfundido en la solución Tyrode 30 minutos antes de la perfusión de la curva del
antagonista + agonista, así mismo se realizaron mediciones controles del antagonista
a los 15 y 30 minutos de la perfusión y consecuentemente con las combinaciones de
los fármacos. Las concentraciones usadas del agonista 7-OH-DPAT fueron las
siguientes (M): 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 y 3 y la concentración del antagonista U99194
fue de: 1M.
Preparación de Soluciones:
Se prepararon 2 soluciones madres (10M y 10mM) del agonista dopaminérgico
D3, el 7-OH-DPAT (preparando 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 y 3M en 100mL de solución
Tyrode), el cual fue disuelto en agua desionizada. El antagonista selectivo de los
receptores dopaminérgico D3, el U99194 fue disuelto en agua desionizada a una
28
Materiales y Métodos
concentración de 1M (solución madre). Se prepararon dosis de reserpina a una
concentración de 5 mg/Kg, la cual fue disuelta en Dimetil Sulfóxido (DMSO), en una
proporción menor del 1%, para ser aplicada en el animal íntegro.
Análisis Estadístico:
Para el análisis se usaron únicamente aquellos experimentos que mantuvieron
el empale con todas las concentraciones. Los datos se analizaron a través del
siguiente modelo estadístico:
Modelo Estadístico. El análisis de los experimentos se realizó a través de un diseño
completamente al azar. Este se realizó con el propósito de ver si existe diferencia
significativa entre los tratamientos, para cada una de las variables medidas (F, PDM,
APA, DPA30, DPA90, PF4 y Vmax), por lo que se hizo uso del siguiente modelo
estadístico:
Yi j = µ + i +i j , . Con i = 1, 2,.......,t y j = 1, 2,......ri.
Donde: t = número de tratamientos. ri = número de repeticiones bajo el i-ésimo tratamiento. Yi j = Es la j-ésima observación tomada bajo el i-ésimo tratamiento. µ =Media general. i = Efecto del i-ésimo tratamiento. i j = Error experimental.
Se asume que los errores ij i = 1, 2, 3,....t; j = 1, 2 ,…, ri; son variables
aleatorias independientes e idénticamente distribuidas normalmente con media cero
y varianza 2. Para nuestro caso los tratamientos son: 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 M.
Además las comparaciones de las medias se realizaron con la prueba de Dunnett y
Bonferroni. Los datos son expresados como media error estándar.36, 37
29
Resultados
RESULTADOS
Se realizaron 14 experimentos en preparaciones multicelulares de la zona
central del nodo S-A (NSA) en corazones de conejo Nueva-Zelanda, los cuales, se
dividieron en tres grupos: en el primer grupo (n=4) se evaluó el efecto del agonista
selectivo de los receptores dopaminérgico D3, el 7-OH-DPAT con las siguientes
concentraciones: 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 y 3 M; en el segundo grupo (n=5) se evaluó
el efecto del mismo agonista dopaminérgico con las mismas concentraciones, pero
en animales reserpinizados -simpatectomía química- y en el tercer grupo (n=5), se
evaluó el efecto con esas concentraciones del agonista pero, en presencia de un
antagonista selectivo de los receptores dopaminérgicos D3, el U-99194A.
Para conocer el efecto global del 7-OH-DPAT sobre la actividad
electrofisiológica del NSA, se registró el potencial de membrana en la región central
del NSA in vitro con la técnica de microelectrodos convencional.
En la figura 4, se muestra un ejemplo representativo del efecto del agonista D3
(1 y 3 M) sobre la configuración del potencial de acción (PA) en una célula central
de una preparación del NSA a partir de su condición control. Cuando la
concentración del 7-OH-DPAT se incremento a 10 M, se observó una
despolarización mayor (potencial de -29.38 mV 0.25) que volvió inexcitable a las
preparaciones estudiadas. En la tabla 1, se muestran los parámetros
electrofisiológicos de los PAs en condiciones basales y en presencia de las
diferentes concentraciones del agonista. La duración del potencial de acción al 90%
de la repolarización (DPA90) aumentó gradualmente desde 121 6 hasta 168 6 ms
30
Resultados
P D M-5 0 m V
-5 7 m V
-6 3 m V
7 -O H -D P A T
-6 0 m V
0
2 0 m V
3 M1 MC o n tro l
4 5 0 m s
Figura 4. Efecto del 7-OH-DPAT sobre la configuración del potencial de acción de las células centrales del nodo S-A. Los registros corresponden a la misma preparación. Note que a partir del registro control, el 7-OH-DPAT con 1M y 3M aumenta de forma gradual la DPA90 (37 y 57%) y disminuye la F de disparo (19 y 34%), la PF4 (33 y 51%) y la Vmax (31 y 45%). Lo valores del PDM fueron de -63 mV (control), -57mV (1M) y -34 mV (3M).
Tabla 1. Parámetros electrofisiológicos del potencial de acción de las células centrales del nodo S-A en condiciones basales y en presencia del 7-OH-DPAT.
F †
APA (mV)
DPA30
(ms) DPA90
(ms) PF4
(V/s) Vmax (V/s)
Basal 14910 % 672.4 % 426 % 1216 % 7.90.44 % 5.20.60 % 7OH-DPAT (M)
1 x 10-8 14610 683.4 427 1226 7.80.24 5.00.56 3 x 10-8 14210 683.7 438 1247 7.40.34 4.20.64 1 x 10-7 1408 683.3 448 1296 7.10.29 4.20.63 3 x 10-7 1327 -11 653.2 -3 458 +7 1404 +16 6.30.47* -20 4.00.52 -23
1 x 10-6 1162 -22 605 -10 469 +10 1686* +39 5.60.36* -29 3.50.4* -33 3 x 10-6 908* -40 502 -25 571* +36 19217* +59 4.20.10* -47 3.10.6* -40
F = Frecuencia; † impulsos por minuto; APA = Amplitud del Potencial de Acción; DPA30% y DPA90%=
Duración al 30 y 90% de la amplitud del Potencial de Acción; PFIV = Pendiente de Fase IV; Vmax = Velocidad de Despolarización Máxima de la fase 0. Los valores se presentan en media error estándar. % porcentaje, – disminución y + aumento. * Estadísticamente significativo con un valor p 0.05 Bonferroni y Dunnett y ^ Bonferroni.
31
Resultados
(a 1 M) y 192 17 ms (a 3 M), así como la duración al 30% de la repolarización
(DPA30) desde 42 6 a 57 1 ms (a 1 M); por el contrario, disminuyen de manera
significativamente: la frecuencia de disparo (F) desde 149 10 hasta 90 8 (a 3 M)
impulsos por minuto, la pendiente de fase 4 (PF4) desde 7.9 0.44 hasta 6.3 0.47
V/s (a 0.3 M), 5.6 0.36 (a 1 M) y 4.2 0.1 V/s (a 3 M) y la Vmax desde 5.2 0.6
hasta 3.5 0.4 (a 1M) y 3.1 0.6 (a 3 M) V/s.
El efecto del 7-OH-DPAT sobre el PA de las células del NSA en los animales
con simpatectomía química -reserpinizados- fue muy similar al grupo anterior; donde
se observaron diferencias significativas con respecto al registro basal en los
siguientes parámetros electrofisiológicos: la DPA90 aumento de 134 8 ms a 179 5
(a 1 M) y 231 20 ms (a 3 M), la DPA30 incremento de 52 5 a 78 10 y
disminuyen: la F desde 146 2.6 hasta 119 7 (a 1 M) y 96 10 (a 3 M) impulsos
por minuto, la PF4 desde 5.1 0.5 V/s hasta 2.9 0.7 V/s (a 1 M) y la Vmax desde
5.3 0.6 V/s hasta 3 0.8 V/s (a 3 M) (figura 5 y tabla 2).
En la figura 6, se muestra el efecto del 7-OH-DPAT sobre el PA de las células
del marcapaso en presencia del U-99194A, donde se observa un incremento
significativo en la DPA90 desde 134 3 ms hasta 175 10 (a 1 M) y 214 5 ms (a 3
M), y en la DPA30 de 52 6 a 67 6 (a 3 M); así como una disminución
significativa en: la frecuencia espontánea de 135 4 a 93 8 (a 3 M) impulsos por
minuto, la APA desde 67 0.4 mV hasta 45 12 mV (a 3 M), la PF4 desde 7.5 1.4
hasta 5.0 0.6 (a 1 M) y 4.2 0.1 (a 3 M) y la Vmax de 4.2 0.28 V/s a 2.8 0.1 (a
1 M) y 2.5 0.1 V/s (a 3 M) (ver tabla 3).
32
Resultados
PD M-45m V
-57m V
-60m V
0
-60m V
20m V
Agonista
3M1MC ontro l
450m s
Figura 5. Efectos del 7-OH-DPAT sobre la configuración del PA de las células centrales del NSA en animales con simpatectomía química.
Note que a partir del registro control, el 7-OH-DPAT con 1 y 3M aumenta la DPA90 (27 y 60%) y al mismo tiempo se disminuye la F de disparo (16 y 30%), la PFIV (21, 40%) y la Vmax (21, 44%).
Tabla 2. Parámetros electrofisiológicos del PA de las células centrales del NSA en condiciones basales y en presencia del 7-OH-DPAT en animales con simpatectomía química.
F † APA (mV)
DPA30
(ms) DPA90
(ms) PF4
(V/s) Vmax (V/s)
Basal 1462.6 % 705 % 525 % 1348 % 5.10.5 % 5.30.6 %
7OH-DPAT (M) 1 x 10-8 1362.7 695 535 1407 4.80.4 5.20.6 3 x 10-8 1352.4 695 546 1428 4.70.5 5.20.6 1 x 10-7 1332.5 695 556 1467 4.60.6 5.10.6 3 x 10-7 1292.7 -12 685 -3 576 +10 1535 +14 4.50.5 -12 4.90.7 -81 x 10-6 1197.0*-18 644 -9 626 +19 1795* +34 3.90.4 -24 4.20.6 -21
3 x 10-6 9610* -34 536^ -24 7810* +50 23120* +72 2.90.7* -43 3.00.8^ -43 F = Frecuencia; † impulsos por minuto; APA = Amplitud del Potencial de Acción; DPA30% y DPA90%=
Duración al 30 y 90% de la repolarización del Potencial de Acción; PFIV = Pendiente de Subida de la Fase 4; Vmax = Máxima Velocidad de Subida de la Fase 0. Los valores se presentan en media error estándar. % porcentaje, – disminución y + aumento. * Estadísticamente significativo con un valor p 0.05 Bonferroni y Dunnett y ^ Bonferroni.
33
Resultados
7 - O H - D P A T
- 5 4 m V
- 6 0 m V
- 6 1 m V- 6 1 m V
P D M
2 0 m V
- 6 0 m V
0
3 1 U 9 9 1 9 4 1
C o n t r o l
4 5 0 m s
Figura 6. Efectos del 7-OH-DPAT (agonista) sobre la configuración del PA en presencia del U-99194A (antagonista). Note que el registro control y en presencia de U99194 se encuentran traslapados. En cambio, el 7-OH-DPAT a pesar de la presencia del U-99194A incrementó la DPA90 (31, 60%) y disminuyen la F de disparos espontáneos (14, 31%), la PF4 (33, 44%), la Vmax (33, 40%) con 1 y 3 M, respectivamente.
Tabla 3. Parámetros electrofisiológicos del PA de las células centrales del NSA en condiciones control, en presencia del U-99194A y la combinación de U-99194A+7-OH-DPAT.
F † APA (mV)
DPA30
(ms) DPA90
(ms) PF4
(V/s) Vmax (V/s)
Basal 1354 % 670.4 % 526 % 1343.0 % 7.51.4 % 4.20.28 % U99194 (10-6) 1344 670.4 526 1322.5 7.51.3 4.10.29
U99194 (10-6) + 7OH-DPAT (M)
1 x 10-8 1324 680.9 515 1341.4 7.10.9 3.40.22 3 x 10-8 1314 681.2 525 1340.9 7.21.0 3.40.22 1 x 10-7 1294 671.2 525 1371.2 6.81.0 3.40.22 3 x 10-7 1274 -6 670.9 0 535 +2 1451.4 +8 6.41.1 -15 3.20.2 -24 1 x 10-6 1166 -14 630.7 -6 584 +12 17510* +31 5.00.6* -33 2.80.1* -33 3 x 10-6 938* -31 457.0* -33 676* +29 2145.0* +60 4.20.1* -44 2.50.1* -40
F = Frecuencia; † impulsos por minuto; APA = Amplitud del Potencial de Acción; DPA30% y DPA90%=
Duración al 30 y 90% de la Repolarización del Potencial de Acción; PFIV = Pendiente de Subida de la Fase 4; Vmax = Máxima Velocidad de Subida de la Fase0. Los valores se presentan en media error estándar. % porcentaje, – disminución y + aumento. * Estadísticamente significativo con una valor p 0.05 Bonferroni y Dunnett..
34
Resultados
La figura 7, muestra los efectos del 7-OH-DPAT sobre la F (figura 7A) y la APA
(figura 7B) de las células del NSA en animales control, en animales con
simpatectomía química y en presencia del U-99194A. Los efectos del 7-OH-DPAT
sobre los tres grupos fueron únicamente significativos a concentraciones de 1 y 3
M. La diferencia entre los tres grupos no fue significativa.
La DPA30 y la DPA90 presentó un incremento dependiente de la concentración
del 7-OH-DPAT sobre los tres grupos, pero fueron solamente significativos en la
DPA30 con 1 M y en la DPA90 con las concentraciones 1 y 3 M. La diferencia entre
los tres grupos no fue significativa (ver figura 8).
La pendiente de subida de la fase 4 y la máxima velocidad de subida de los
potenciales de acción presenta un decremento dependiente de la concentración de
7-OH-DPAT sobre los tres grupos. Siendo solamente significativos los efectos a
concentraciones de 1 y 3 M. La diferencia entre los tres grupos no fue significativa
(ver figura 9).
Los resultados hasta ahora encontrados sugieren que el efecto del 7-OH-DPAT
pudiera ser directo y no mediado por receptores dopaminérgicos D3. En un estudio
previo de Boyett et al (1999) encontraron que el bloqueador selectivo del canal
rectificador tardío de potasio IKr, E-4031 produce efectos similares al observado en
nuestro trabajo por 7-OH-DPAT. En el presente trabajo y con el fin de investigar bajo
nuestras condiciones experimentales, el efecto de otro bloqueador selectivo de IKr, se
estudió el efecto de dofetilida (Torres et al 2004) sobre los diferentes parámetros
electrofisiológicos de las células centrales del NSA.
35
Resultados
A
70
80
90
100
110
120
130
140
150
1M 310.3U99194
0.10.030.01Control
Fre
cuen
cia
(impu
lsos
/min
)
U99194 + 7-OH-DPAT(M)
7-OH-DPAT (Control) 7-OH-DPAT + Reserpina 7-OH-DPAT + U99194
Figura 7. La frecuencia de disparo espontánea (A) y la amplitud del potencial de acción (B) en las células del NSA en presencia de 7-OH-DPAT en animales íntegros (), en animales con simpatectomía química () y en animales íntegros combinando el 7-OH-DPAT con U-99194A (). Los valores son expresados en media ± error estándar. A. La F disminuye de manera similar y progresiva en los 3 grupos, siendo mucho más intensa con la concentración de 1 y 3M. B. La APA también disminuyó de forma muy similar en los 3 grupos, en todas las concentraciones.
B
35
40
45
50
55
60
65
70
75
U99194
310.30.10.030.011Control
AP
A (
mV
)
U99194 + 7-OH-DPAT(M)
36
Resultados
A
30
40
50
60
70
80
90
310.30.10.030.011(M)
U99194
Control
DP
A30
(m
s)
U99194 + 7-OH-DPAT(M)
7-OH-DPAT (Control) 7-OH-DPAT + Reserpina 7-OH-DPAT + U99194
Figura 8. La DPA30 (A) y la DPA90 (B) de las células del marcapaso cardiaco en presencia del 7-OH-DPAT en animales control (), en animales con simpatectomía química () y en presencia del U-99194A (). Los valores son expresados en media ± error estándar.
B
120
140
160
180
200
220
240
260
310.30.10.030.01
U99194
1MControl
DP
A90
(m
s)
U99194 + 7-OH-DPAT(M)
37
Resultados
A
2
3
4
5
6
7
8
9
310.30.10.0310-6 0.01
U-99194A
Control
PF
IV (
mV
x m
s-1)
U-99194 + 7-OH-DPAT(M)
7-OH-DPAT (Control) 7-OH-DPAT + Reserpina 7-OH-DPAT + U99194
Figura 9. La PF4 (A) y la Vmax (B) del PA de las células del NSA en presencia del 7-OH- DPAT (), el 7-OH-DPAT en animales con simpatectomía química () y el U-991914A + 7-OH-DPAT (). Los valores son expresan en media ± error estándar.
B
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
310.30.10.030.01U-99194A
10-6Control
Vm
ax (
mV
x m
s-1)
U-99194A + 7-OH-DPAT(M)
38
Resultados
Se estudio el efecto de dofetilida a una concentración 5 M y se registró a
diferentes tiempos de perfusión del fármaco. En la Figura 10, se muestran registros
superpuestos de la actividad eléctrica espontánea de las células del NSA, en
condiciones control y a diferentes tiempos de perfusión del fármaco. Los efectos de
la dofetilida observados fueron similares a los obtenidos con el 7-OH-DPAT.
Figura 10. Efecto del bloqueador selectivo de Ikr, Dofetilida a diferentes tiempos con 5 M. Los registros corresponden a la misma preparación. Note el aumento progresivo en la DPA30 y en la DPA90 de la repolarización en los diferentes tiempos a partir del registro control, así como la disminución de la APA, del PDM, de la PF4 y de la Vmax hasta llegar a la despolarización por el bloqueo completo de Ikr.
39
Discusión y Conclusiones
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
En el presente trabajo se encontraron cambios significativos en diferentes
parámetros electrofisiológicos de las células de la zona central del NSA inducidos por
el agonista específico de los receptores dopaminérgicos D3, 7-OH-DPAT. Estos
efectos solamente fueron significativos a concentraciones micromolares del fármaco.
La frecuencia de disparo diminuyó significativamente así como la velocidad de la
despolarización diastólica espontánea, el potencial diastólico máximo, la amplitud del
potencial de acción y la velocidad de subida del mismo. Por otro lado, la duración del
potencial de acción medida al 90% de la repolarización aumento significativamente.
Con el fin de determinar si estos efectos son mediados por la activación de los
receptores dopaminérgicos D3, se realizaron experimentos estudiando el efecto del 7-
OH-DPAT en presencia del antagonista selectivo de receptores D3, U-99194A. La
presencia del antagonista no modificó los efectos del agonista sobre las células de
NSA. Estos resultados nos permiten suponer que los receptores D3, no se
encuentran involucrados en los efectos electrofisiológicos del 7-OH-DPAT en el NSA
de conejo. Otra evidencia del no involucramiento de estos receptores a nivel
presináptico en las terminales adrenérgicas es que en preparaciones obtenidas de
animales con simpatectomía química (pretratadas con reserpina), el efecto del 7-OH-
DPAT fue similar al observado en el grupo control. Por lo tanto, es probable que los
efectos de 7-OH-DPAT sobre las células centrales del NSA de conejo sean debidos a
efectos directos, no mediados por receptores.
Una posibilidad es que la 7-OH-DPAT estuviera ejerciendo efectos moduladores
sobre alguna de las corrientes iónicas presentes en las células del NSA. En un
40
Discusión y Conclusiones
trabajo del grupo de Boyett (1999),34 mostraron resultados similares a los obtenidos
por nosotros con el fármaco bloqueador selectivo de la corriente rectificadora tardía
rápida, IKr, E-4031. Este fármaco produjo una reducción en la frecuencia de disparo,
disminución del potencial diastólico máximo, reducción en las velocidades de
despolarización diastólica y de subida de los potenciales de acción, así como un
alargamiento en la duración del potencial de acción. En el presente trabajo nosotros
encontramos resultados similares con el también bloqueador selectivo de IKr,
dofetilida. Sin ser evidencias claras y contundentes, estos resultados nos sugieren
que el 7-OH-DPAT pudiera ejercer sus efectos electrofisiológicos sobre las células
del NSA por un efecto bloqueador de la corriente IKr. En estudios realizados en
nuestro laboratorio, en miocitos aislados de ventrículo de gato, se encontró que el 7-
OH-DPAT bloquea selectivamente la corriente IKr (Torres y col. 2004). Estas
conclusiones fueron reforzadas realizando experimentos sobre los efectos del 7-OH-
DPAT sobre el canal HERG expresado en la línea celular HEK 293 (Torres y col.
2004).37 El canal HERG es el correlato molecular de IKr.38
A continuación, trataré de explicar de qué manera el bloqueo de IKr puede
inducir los efectos electrofisiológicos descritos sobre las células del NSA. Como fue
descrito anteriormente, en las células del NSA sin la influencia de la actividad
autonómica, la repolarización se debe esencialmente a las dos corrientes
rectificadoras tardías, la rápida, IKr y la lenta, IKs. Sin embargo, la cinética de
activación tan lenta de IKs origina que su participación en estas células, que tienen un
potencial de acción relativamente corto, sea muy limitada, dejándole a IKr la mayor
influencia en la repolarización. También tenemos que destacar que en estas células
la corriente rectificadora entrante, IK1 esta prácticamente ausente. La corriente IK1 es
41
Discusión y Conclusiones
la responsable principal de la última fase de la repolarización y del potencial de
reposo de las células cardiacas auriculares y ventriculares. De esta manera, ¿que se
esperaría que ocurriera al bloquear la corriente repolarizante mas importante en
forma selectiva?: 1) alargamiento en la duración del potencial de acción, 2)
disminución del potencial diastólico máximo, la disminución de este parámetro
ocasiona que se active menos corriente de marcapaso, If y que una fracción de los
canales de calcio T y L que se inactivaron durante el potencial de acción previo no se
recuperen de la inactivación, esto provoca una disminución en la velocidad de
despolarización diastólica y en la velocidad de subida del potencial de acción.
Cuando el bloqueo de Ikr es completo, la célula se queda despolarizada a potenciales
de aproximadamente -25 a -30 mV y se vuelve inexcitable, ya que a este potencial
los canales de calcio T y L se encuentran inactivados y los canales If en el estado
cerrado.39
Desde el punto de vista electrofisiológico, al menos en esta serie de
experimentos no existen evidencias de la participación de receptores dopaminérgicos
D3 en el NSA de conejo. Resultados obtenidos por otros investigadores en cobayo y
rata, utilizando otras técnicas experimentales, corazón completo perfundido con la
técnica de Langendorff y animal íntegro, han encontrado evidencias que indican que
la activación de receptores D3 pueden explicar los efectos cronotrópico negativos del
7-OH-DPAT a concentraciones nanomolares, a concentraciones micromolares los
efectos del 7-OH-DPAT han sido sugeridos de ser directos, lo que esta de acuerdo
con nuestros resultados.32 En nuestros experimentos concentraciones nanomolares
de 7-OH-DPAT no modifican significativamente los parámetros estudiados. Las
diferencias entre nuestros resultados y los de estos autores pueden explicarse
42
Discusión y Conclusiones
por el uso de diferentes especies animales, o por el uso de diferentes técnicas
experimentales. Cuando los experimentos se realizan en el corazón completo o en el
animal íntegro, el numero de variables no controlables que participan es mucho
mayor, que cuando se utiliza el NSA aislado; como ejemplos, en el sistema de
perfusión Langendorff hay menor control de la temperatura, lo cual ocasiona
cambios marcados sobre la frecuencia cardiaca. Por otro lado, cuando se utiliza el
Langendorff, la perfusión del corazón se realiza por la circulación coronaria, por lo
que cambios en la perfusión, liberación de factores vasculares etc. pueden modificar
la frecuencia de disparo del nodo. La presencia de otros marcapasos latentes
pueden modificar la actividad eléctrica del NSA. La presencia de tejido neural
autonómico (ganglios parasimpáticos, terminales nerviosas simpáticas y
parasimpáticas pueden también afectar la actividad eléctrica del NSA, y son factores
de los cuales no se tuvo control en los trabajos citados.
En base a todas estas evidencias, se puede concluir que los efectos
electrofisiológicos del 7-OH-DPAT sobre las células centrales del NSA de conejo es
directo, probablemente sobre el canal de K+ rectificador tardío rápido, Ikr y no a través
de un receptor.
43
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