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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Doctorado en Ciencias Fisiológicas con especialidad en
Farmacología.
“Efectos electrofisiológicos de los agonistas muscarínicos,
pilocarpina y 4-aminopiridina sobre el nodo seno auricular de
conejo”.
Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas
con especialidad en Farmacología.
PRESENTA:
MC. Martín Rodríguez Martínez
ASESORES:
Dr. José Antonio Sánchez Chapula.
Dr. Julián Torres Jácome.
Colima, Col. Marzo del 2010
Mi agradecimiento al:
Dr. José Antonio Sánchez Chapula.
Dr. Julián Torres Jácome.
Dr. Arael Aréchiga Figueroa.
Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco.
Q.F.B. Miguel A. Flores Virgen. Técnico del laboratorio.
Por su tenacidad para involucrarme en el difícil campo de la ciencia, sin escatimar
su valioso tiempo.
A todos los Doctores del CUIB que contribuyeron en mi cambio radical, creo que
para bien, ya que me permitirá mejorar en el campo docente y personal.
A mis AMIGOS: El Aldo, el Ritss, el Eloy (pequeño), Arael, el Iván (la muñe), el
Bonales (la bestia), Danita, Angy, Alondrita, el Mike, Mario (Juan Diego) Tania,
Marcelo, Jorge (el conta) quienes siempre estuvieron pendientes para echarme la
mano cuando se me presentaron dificultades inherentes a mi formación. GRACIAS
por los buenos momentos.
A la Sra. Norma Moreno Salazar. Gracias a su desinteresada ayuda me facilitó
concluir esta etapa y me enseño que su fortaleza es inquebrantable.
Agradezco al CONACyT por haberme otorgado la beca
para manutención de los estudios de doctorado. Este
proyecto de tesis fue financiado por CONACYT-FOMIX
PROYECTO 82948.
DEDICO ESTE TRABAJO A:
Mi esposa: Sra. Guadalupe Guevara Cobián
Mis hijos: Miguel A. Martín (Miguelito); Nayeli (Nay); Martín (frijol); Fernando
Martín (el Fer); A. Martín (Güerito) y Suyay (mi pequeñita). Gracias a ustedes
hijos por ser mi fortaleza para iniciar y terminar esta etapa.
Mis Nietos: Enriquito Martín y Martincito frijolito.
Mis padres: el Sr. Candelario y la Sra. Ma. Elena.
Mis hermanos: Celia, Estela, Micaela, Norma, Baltazar, Alberto, Lorena, Liliana.
Muy especialmente para Francisco Maldonado Trujillo y Familia (Rosalba, Kiko
y Karen) a quienes siempre tuve presentes en todo momento.
ÍNDICE
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 1
ABREVIATURAS 3
RESUMEN 5
ABSTRACT 7
INTRODUCCIÓN 9
El Sistema Nervioso en la regulación de la actividad de NSA. 9
El sistema nervioso simpático. 10
El sistema nervioso parasimpático. 12
El nodo seno auricular. 14
Los potenciales de acción cardiacos. 14
Corrientes iónicas involucradas en el potencial de acción de NSA. 16
Corriente de marcapaso (If). 17
Corrientes de Calcio (ICa) tipo L y T. 17
Corrientes de potasio de rectificación tardía. 18
Corriente de potasio activada por ACh (IkACh) y su importancia fisiológica. 19
ANTECEDENTES INMEDIATOS 20
PRIMERA HIPÓTESIS 26
SEGUNDA HIPÓTESIS 26
OBJETIVOS GENERALES 27
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27
MATERIALES Y MÉTODOS 28
Procedimiento para disecar el nodo seno auricular de conejo. 28
Registros de potenciales de acción. 29
Dispersión de miocitos de NSA de conejo. 30
Registro de corrientes iónicas en miocitos aislados de NSA de conejo. 32
Fármacos. 33
Análisis estadístico. 34
RESULTADOS 35
Efecto cronotrópico negativo de pilocarpina sobre preparaciones
multicelulares centrales de NSA de conejo.
35
La pilocarpina activa a IKACh en miocitos de NSA de conejo. 38
Efecto de pilocarpina sobre la corriente de marcapaso, If en miocitos de
NSA de conejo.
41
Efecto de 4-AP sobre los potenciales de acción espontáneos registrados
de preparaciones multicelulares de la región central de NSA de conejo.
42
Efecto de 4-AP sobre los potenciales de acción espontáneos registrados
de preparaciones multicelulares de la región periférica de NSA de
conejo.
46
DISCUSIÓN 49
Efecto cronotrópico negativo de pilocarpina en NSA de conejo. 49
Efecto de 4-AP en preparaciones multicelulares de NSA de conejo. 53
CONCLUSIONES 57
BIBLIOGRAFÍA 58
1
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Terminales nerviosas del sistema nervioso autónomo que
modulan la función cardiaca.
10
Figura 2. Vía de señalización que involucra la activación de canales
KACh mediada por el receptor M2 cardiaco.
13
Figura 3. Los potenciales de acción cardiacos son propios del tejido
en que se estudian.
15
Figura 4. Corrientes iónicas que participan en la actividad eléctrica del
PA ventricular y del NSA.
16
Figura 5. Efectos de la 4-AP 1 mM sobre el PA auricular. 20
Figura 6. Efectos de 4-AP 1mM sobre las corrientes de membrana en
miocitos auriculares de gato.
21
Figura 7. La If interviene en la modulación cronotrópica de la actividad
marcapaso por transmisores autonómicos.
24
Figura 8. Diagrama de una preparación de NSA para registros
multicelulares de potenciales de acción espontáneos con la técnica de
microelectrodos.
29
Figura 9. Efectos de la pilocarpina sobre potenciales de acción
registrados en la región central en preparaciones multicelulares de
NSA de conejo.
36
Figura 10. Consecuencia del bloqueo de If (Cs+ 2 mM), e IKACh
(tertiapina Q 300 nM) sobre el efecto cronotrópico negativo producido
por pilocarpina sobre la actividad espontánea de NSA de conejo.
38
Figura 11. Corriente activada por pilocarpina en miocitos aislados de
NSA de conejo.
39
Figura 12. Efecto de tertiapina Q sobre la corriente activada por
pilocarpina en miocitos aislados de NSA de conejo.
40
Figura 13. Efecto de pilocarpina sobre la corriente marcapaso, If,
registrada en miocitos aislados de NSA de conejo.
41
Figura 14. Efecto de E-4031 1 μM sobre potenciales de acción
espontáneos registrados en la región central de preparaciones
multicelulares de NSA de conejo.
42
2
Figura 15. Efectos de 4-AP 5 mM sobre potenciales de acción
espontáneos registrados en la región central de preparaciones
multicelulares de NSA de conejo.
44
Figura 16. Efectos de la 4-AP (5 mM) sobre potenciales de acción
registrados en preparaciones multicelulares de la región periférica de
NSA de conejo.
47
Tabla 1. Efectos de pilocarpina sobre potenciales de acción
registrados en la región central de preparaciones multicelulares de
NSA de conejo.
37
Tabla 2. Efectos de 4-AP sobre potenciales de acción registrados en
la región central de preparaciones multicelulares de NSA de conejos
reserpinizados y no reserpinizados.
45
Tabla 3. Efectos de 4-AP sobre potenciales de acción registrados en
la región periférica de preparaciones multicelulares de NSA de conejo
reserpinizados y no reserpinizados.
48
3
ABREVIATURAS
AC: adenilato ciclasa.
ACh: acetilcolina.
Amp: amplitud del potencial de acción.
AMPc: monofosfato cíclico de adenosina.
ATP: trifosfato de adenosina.
Ca+2: ion calcio.
CCh: carbacol.
dV/dtMáx: velocidad de despolarización diastólica
DDE: despolarización diastólica espontánea
DPA50: duración del potencial de acción al 50% de su repolarización.
GDP: difosfato de guanosina.
GTP: trifosfato de guanosina.
ICa: corriente de calcio
ICaL: corriente de calcio tipo L.
ICaT: corriente de calcio tipo T.
If: corriente marcapaso.
IK: corriente de potasio rectificadora tardía.
IK1: corriente rectificadora entrante.
IKACh: corriente de potasio activada por acetilcolina.
LC: longitud del ciclo.
IKATP: corriente de potasio sensible a trifosfato de adenosina.
IKr: corriente de potasio rectificadora tardía de activación rápida.
IKs: corriente de potasio rectificadora tardía de activación lenta.
IST: corriente entrante sostenida
Ito: corriente de potasio transitoria de salida
K+: ion potasio
KACh: canales de potasio sensibles a acetilcolina
M-AChRs: receptores colinérgicos muscarínicos
M1…M5: subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos, del M1 al M5.
Na+: ion sodio
NAV: nodo aurículo ventricular.
4
NSA: nodo seno auricular.
PA: potencial de acción.
PCA: proteína cinasa A.
PDM: pontecial diastólico máximo.
PIP2: fosfatidil inositol bifosfato.
PTX: toxina pertussis.
RM2: receptor muscarínico subtipo 2.
ST: sobretiro.
TTX: tetrodotoxina.
VMáx.: velocidad máxima de despolarización.
5
RESUMEN
En el presente trabajo, se investigaron los efectos del agonista de
receptores muscarínicos, pilocarpina, en miocitos aislados y en preparaciones
multicelulares de la región central del nodo senoauricular (NSA) de conejo. Sobre
los potenciales de acción espontáneos registrados en preparaciones
multicelulares, pilocarpina (3 - 30 µM), produjo una disminución de la frecuencia
de disparo, hiperpolarización del potencial diastólico máximo, acortamiento de la
duración del potencial de acción y disminución de la velocidad de despolarización
diastólica. Estos efectos fueron inhibidos por el bloqueador del canal de K+
muscarínico (IKACh), tertiapina Q. En presencia del bloqueador de la corriente
marcapaso, If, cesio (Cs+), observamos que los efectos de pilocarpina 3 - 30 µM
no fueron significativamente modificados. En miocitos de nodo senoauricular,
pilocarpina (3 - 30 µM) activó a IKACh de manera dependiente de concentración y
de voltaje, mayor activación a potenciales de membrana más positivos. Tertiapina
Q (300 nM) bloqueó la corriente activada por pilocarpina, IKACh. Pilocarpina (3 - 30
µM) inhibió a la corriente If, el efecto de pilocarpina a -80 mV fue
significativamente mayor que el observado a -120 mV, sugiriendo que el agonista
podría estar desplazando la curva de activación de If hacia potenciales más
negativos. Los efectos cronotrópicos negativos de pilocarpina sobre el NSA,
pueden ser explicados por la activación de IKACh y posiblemente por el
desplazamiento de la curva de activación de If hacia potenciales más negativos,
ambos mecanismos mediados por la activación de receptores muscarínicos M2.
La 4-aminopiridina (4-AP), es un bloqueador de canales de K+ que ha sido
utilizado en la caracterización de la corriente de K+ transitoria de salida, Ito, en
tejidos cardiacos y no cardiacos. En el presente trabajo, en preparaciones
multicelulares de la región central del nodo senoauricular de conejos no
reserpinizados, encontramos que 5 mM de 4-AP, a pesar de sus efectos como
bloqueador de IKr e IKs, no produjo efectos significativos sobre el potencial
diastólico máximo y la duración de los potenciales de acción espontáneos, sin
embargo, produjo un incremento significativo en el sobretiro de los potenciales de
acción, en la frecuencia y en la velocidad de despolarización diastólica. El
antagonista de receptores muscarínicos, atropina, no modificó significativamente
6
los efectos de la 4-AP sobre la frecuencia de disparo. En preparaciones
multicelulares de animales no reserpinizados, en presencia del antagonista de
receptores -adrenérgicos, propranolol, 4-AP provocó un incremento significativo
en la duración, disminución del potencial diastólico máximo y eventualmente el
cese de la actividad espontánea.
En preparaciones multicelulares de conejos reserpinizados, 4-AP produjo
efectos similares a los observados en presencia de propranolol, provocó un
incremento significativo en la duración, disminución del potencial diastólico
máximo y eventualmente el cese de la actividad espontánea en preparaciones
multicelulares también de la región central del NSA.
Considerando estos resultados, concluimos que a pesar de la utilidad de la
4-AP como bloqueador de Ito, se debe tener cuidado, ya que a las
concentraciones usadas para caracterizar a Ito, este fármaco produce múltiples
efectos sobre preparaciones cardiacas. 4-AP inhibe las corrientes de K+ cardiacas
Ito, IKr e IKs, además, 4-AP activa a IKACh, y en preparaciones multicelulares
produce la liberación de neurotransmisores desde las terminales nerviosas del
sistema nervioso autónomo.
7
ABSTRACT
In the present work, the effect of the partial agonist of muscarinic receptors,
pilocarpine was investigated in isolated myocytes and multicellular preparations
from rabbit central sinoatrial node (SAN). In multicellular preparations, pilocarpine
(3 – 30 µM), produced on spontaneous action potentials a decrease in frequency,
a hyperpolarization of the maximum diastolic potential, a shortening in action
potential duration and a decrease in the rate of diastolic depolarization. Those
effects were antagonized by the muscarinic potassium channel (IKACh) blocker,
tertiapin Q. With the blocker of pacemaker current, If, cesium (Cs +), we observed
that the effects of pilocarpine 3 – 30 μM were not significantly modified. In
sinoatrial node myocytes, pilocarpine (3 – 30 µM) activated IKACh in concentration-
and voltage-dependent ways, more activation at more positive membrane
potentials. Tertiapin Q (300 nM) blocked the IKACh pilocarpine-activated current.
Pilocarpine (3 – 30 µM) inhibited If current, the effect of pilocarpine at -80 mV was
significantly greater than at -120 mV, suggesting that the drug could be shifting to
negative potential of If activation curve. The negative chronotropic effects of
pilocarpine on SAN could be explained by both mechanisms gated by M2
receptors, activation of IKACh and shift to negative potentials of the If activation
curve.
4-aminopyridine, 4-AP is a potassium channel blocker, which has been
useful in the characterization of the transient outward potassium current, Ito in
cardiac and non cardiac tissues. In the present work, we found that 4-
aminopyridine, 5 mM, in multicellular preparations of the central region of the
sinoatrial node from non reserpinized rabbits, in spite of its IKr and IKs blocking
effects, 4-AP produced on spontaneous action potentials no significant effects on
the maximum diastolic potential and action potential duration, but, produced an
increase in action potential overshoot, frequency and rate of diastolic
depolarization. The muscarinic antagonist, atropine did not significantly modify the
4-AP effect on frequency. In multicellular preparations from non reserpinized
animals, 4-AP in the presence of the -adrenergic antagonist, propranolol
produced a marked increase in duration and a marked decrease in maximum
diastolic potential and eventually, cessation of the spontaneous activity in
8
preparations from the SAN central region. In multicellular preparations from
reserpinized rabbits, 4-AP produced similar effects to those observed in the
presence of propranolol, a marked increase in duration and a marked decrease in
maximum diastolic potential and eventually, cessation of the spontaneous activity
in the preparations of the SAN central region. We conclude that in spite of the
usefulness of 4-AP as Ito blocker, care should be taken, since the drug produces
multiple effects on cardiac preparations, at the concentrations used to characterize
Ito. 4-AP inhibits the cardiac K+ currents, Ito, IKr and IKs. In addition, 4-AP activates
IKACh, and in multicellular preparations 4-AP produces neurotransmitter release
from the autonomous nervous system nerve terminals
9
INTRODUCCIÓN
La función primordial del corazón es generar la presión suficiente para que
la sangre circule en forma continua por todo el sistema vascular. La eficiencia del
corazón depende de una onda de excitación generada en el nodo senoauricular
(NSA), que se propaga desde las aurículas hasta los ventrículos. La actividad
coordinada del corazón está determinada por las cuatro propiedades básicas de
los tejidos cardiacos: excitabilidad, automatismo, conducción y contractilidad.
Estas propiedades están desarrolladas en grado variable en los diferentes tejidos
cardiacos (Levy y Martin, 1989).
El Sistema Nervioso en la regulación de la actividad del NSA.
En mamíferos, la actividad eléctrica del NSA es modulada por el sistema
nervioso autónomo a través de sus dos componentes, el sistema nervioso
simpático (SNS) y el sistema nervioso parasimpático (SNP) (Loffelholz y Pappano,
1985; Dhein et al., 2001).
La vía eferente del sistema nervioso autónomo ejerce un control funcional
de diferentes aparatos y sistemas a través de las fibras que se originan en el
sistema nervioso central. La actividad eferente simpática y parasimpática es
generada en respuesta a la entrada de información sensorial aferente originada
en los órganos efectores, vía neuronas aferentes (mecanorreceptoras y
quimiorreceptoras).
Las vías eferentes simpáticas contienen neuronas preganglionares, que se
encuentran en la médula espinal, y terminan en los ganglios simpáticos, los
cuales están organizados en dos cadenas bilaterales que corren paralelas a la
médula espinal. En estos ganglios, las terminales axónicas hacen sinapsis con las
neuronas simpáticas postganglionares que envían su axón a los órganos
efectores (Figura 1). La estimulación simpática incrementa la frecuencia y la
fuerza de la contracción cardiaca. El neurotransmisor principal de las neuronas
simpáticas postganglionares es la noradrenalina, mientras que la acetilcolina es el
neurotransmisor en las sinapsis ganglionares tanto del SNS como del SNP.
Las fibras eferentes postganglionares del sistema parasimpático difieren
del simpático en que ellas inician en neuronas en el tallo cerebral y la médula
10
espinal y hacen sinapsis con las neuronas postganglionares, pero éstas se
encuentran cerca o dentro de los órganos efectores (Figura 1). La acetilcolina es
el neurotransmisor utilizado en las sinapsis preganglionares y postganglionares
del sistema nervioso parasimpático. La acetilcolina, a través de los receptores
muscarínicos produce en el corazón una disminución de la frecuencia y la fuerza
de la contracción cardiaca (Hildreth et al., 2009).
El sistema nervioso simpático.
El sistema nervioso simpático ejerce una influencia significativa sobre la
función cardiaca a través de la estimulación de receptores -adrenérgicos y esto
lo hace en gran parte por el incremento en la producción monofosfato cíclico de
adenosina. (AMPc). Para un mejor entendimiento del mecanismo por el cual los
receptores muscarínicos regulan la respuesta dependiente de AMPc así como la
importancia de los efectos resultantes, sólo puede ser apreciada con la
comprensión de cómo la estimulación simpática afecta el corazón. Se ha
reportado que este sistema inerva todo el corazón (Levy y Martin, 1989). La
estimulación simpática puede producir efectos sobre los miocitos cardiacos por
activación de dos tipos de receptores: los y los -adrenérgicos. La ruta de
señalización que involucra a los receptores -adrenérgicos es la que influye en la
actividad de los canales iónicos cardiacos a través del incremento de AMPc.
Figura 1: Terminales nerviosas del
sistema nervioso autónomo que modulan
la función cardiaca a través del sistema
nervioso simpático mediante la cadena
ganglionar paravertebral y el sistema
nervioso parasimpático por medio del
nervio vago. Modificada de
med.javeriana.edu.co/fisiologia/nguias/sn
a.htm.
11
Diferentes subtipos de receptores -adrenérgicos son expresados en tejido
cardiaco (1, 2 y 3), (Kaumann, 1997; Brodde y Michel, 1999). Cuando el
receptor -adrenérgico es activado por su ligando noradrenalina, la subunidad s
libera el difosfato de guanosina (GDP) permitiendo que el trifosfato de guanosina
(GTP) tome su lugar. Este intercambio provoca que la proteína G (PG) formada
por el trímero (, , ) se disocie en dos componentes activos: la subunidad y el
dímero . En este caso, la subunidad s interacciona con todas las isoformas de
adenilato ciclasa (AC) expresadas en tejido cardiaco y estimula la producción de
AMPc. Una vez que la subunidad s hidroliza el GTP a GDP se une nuevamente
con el dímero y se forma nuevamente la proteína G inactiva (Fleming et al.,
1992; Sunahara et al., 1996; Ishikawa y Homcy, 1997; Smit y Iyengar, 1998).
El AMPc puede alterar la función de algunos canales iónicos, ya sea
directamente por acción sobre la proteína del canal o bien indirectamente por
activación de la proteína cinasa A (PCA). Los canales marcapaso expresados en
miocitos del NSA y del nodo aurículo-ventricular (NAV), así como en células de
conducción especializada en el corazón de mamífero adulto son afectados por
interacción directa del AMPc con la proteína del canal (Accili et al., 2002). El
escenario más común de la regulación de los canales iónicos cardiacos es por la
activación indirecta, en donde el AMPc por mediación de la PCA fosforila el canal
(Hartzell, 1988). Los canales regulados de esta manera incluyen los canales de
calcio (Ca2+) tipo L (ICaL) (Tsien, 1973; Osterrieder et al., 1982; Bean et al., 1984;
Kameyama et al., 1985; Trautwein et al., 1987), los canales de potasio (K+) tipo
rectificadores tardíos (Tsien et al., 1972; Bennett y Begenisich, 1987; Walsh y
Kass, 1988; Duchatelle-Gourdon et al., 1989; Giles et al., 1989; Harvey y Hume,
1989; Marx et al., 2002; Kurokawa et al., 2003), y canales de sodio (Na+)
dependientes de voltaje (Hisatome et al., 1985; Cheng et al., 1991; Ono et al.,
1993; Schreibmayer et al., 1994).
Los efectos del AMPc sobre los canales marcapaso se cree que son uno
de los mecanismos primarios que subyace al incremento de la frecuencia cardiaca
inducida por el sistema simpático (Accili et al., 2002). Igualmente, la actividad de
la PCA, fosforilando los canales de Ca2+ tipo L, juega un papel clave en la
regulación simpática de la contracción del músculo cardiaco (Tsien, 1977;
Lindemann y Watanabe, 1989). Cambios en la actividad de los canales de Ca2+
12
así como los de Na+ pueden afectar la propagación del impulso eléctrico a través
de cambios en la velocidad de subida del potencial de acción (Hisatome et al.,
1985; Sperelakis y Josephson, 1989; Cheng et al., 1991). Los canales
rectificadores tardíos son también un determinante importante en la duración del
potencial de acción cardiaco.
El sistema nervioso parasimpático.
El sistema nervioso parasimpático juega un papel importante en la
regulación fisiológica de la función cardiaca por ejercer una influencia significativa
sobre la iniciación y propagación de los impulsos eléctricos, además de ser capaz
de regular la fuerza de contracción (Loffelholz y Pappano, 1985; Hartzell, 1988).
Estos efectos son mediados, en todo o parte, a través de los cambios de la
actividad de los canales iónicos que ocurren en respuesta a la activación de los
receptores colinérgicos muscarínicos, debido a la liberación del neurotransmisor
acetilcolina (ACh) de las terminales axónicas del nervio vago. Uno de los
mecanismos clave en la regulación cardiaca es la activación de una población
específica de canales de K+ sensibles a ACh (KACh) (Noma y Trautwein, 1978;
Osterrieder et al., 1981). Los canales KACh son regulados por receptores
muscarínicos M2 y otros tipos de receptores, los cuales se acoplan a proteínas
Gi/o, este efecto se delimita a la membrana celular, es decir que el canal es
activado directamente por dichas proteínas G y no requieren de segundos
mensajeros (Figura 2), (Brown y Birnbaumer, 1990).
Múltiples subtipos de receptores muscarínicos a ACh (M-AChRs) que van
del M1 al M5 han sido clonados y su función ha sido descrita. El M1, M3 y M5 se
caracterizan por estar acoplados preferentemente a proteínas Gq/11 cuya ruta es la
vía del fostatidil inositol bifosfato (PIP2) y el M2 y M4 se acoplan a proteínas Gi/o,
sensibles a toxina pertussis (PTX), los cuales están asociados con la inhibición de
la adenilato ciclasa (Bonner, 1989; Kurachi, 1995).
Existe un consenso general que proviene de varios estudios realizados con
diferentes estrategias metodológicas y por diversos grupos de investigadores, de
que el subtipo predominante de M-AChR en tejido cardiaco de varias especies
animales, incluyendo los humanos, es el M2 (Bonner et al., 1987). La activación
de receptores M2 por ACh, involucra cambios en la función de los canales
cardiacos que pueden ser explicados por dos vías. El primero involucra una
13
regulación directa dependiente de proteínas G para la activación de los canales
iónicos. El segundo comprende una regulación indirecta de la actividad de los
canales iónicos a través de una modulación dependiente de AMPc. La ruta de
señalización directa está involucrada en la regulación del acople de las proteínas
G a los canales de potasio rectificadores entrantes (GIRK) expresados
principalmente en los miocitos auriculares, de NSA y de NAV. La activación de
IKACh, vía los receptores M2, es un componente esencial del control parasimpático
sobre el corazón (Soejima y Noma, 1984; Breitwieser y Szabo, 1985; Yamada et
al., 1998) (Figura 2).
Figura 2. Vía de señalización que involucra la activación de canales KACh mediada por el receptor
M2 cardiaco. El acople de ACh al receptor M2 induce la activación de las proteínas Gi/o, activando
al canal KACh permitiendo la salida de K+ de la célula, provocando la hiperpolarización de la misma.
El inserto muestra trazos representativos de la corriente con rectificación entrante, característica
del canal KACh. Modificada de Yamada et al. (1998).
El efecto indirecto que a menudo se asocia con la estimulación de
receptores muscarínicos en tejido cardiaco por la exposición a la ACh, es una
inhibición de la respuesta dependiente de AMPc. Estos efectos fueron atribuidos a
la inhibición de la actividad de la adenilato ciclasa por una interacción que
14
involucra a las proteínas Gαi/o (Sunahara et al., 1996; Smit y Iyengar, 1998). Esto
apoya la idea que la ACh puede antagonizar la respuesta -adrenérgica por
inhibición de la síntesis del AMPc.
El nodo senoauricular.
Como ya se mencionó anteriormente, en los mamíferos la actividad
eléctrica del corazón inicia en el NSA, esta onda eléctrica es seguida de la
contracción de millones de miocitos cardiacos. El NSA está constituido por células
especializadas con actividad marcapaso (miocitos del NSA), dicha estructura se
localiza en el borde de la aurícula derecha, limitada por la vena cava superior e
inferior, el septum inter-auricular y la crista terminalis (Bleeker et al., 1980).
Los potenciales de acción cardiacos.
Los potenciales de acción (PA) en el corazón generalmente duran algunos
cientos de milisegundos, siendo variable tanto la duración como su morfología,
dependiendo del tejido cardiaco en que se estudia. Las fases del PA se originan
por la activación de diferentes corrientes iónicas que le confieren diferencias
morfológicas a éste en los distintos tejidos cardiacos (Figura 3). El PA del músculo
cardiaco ventricular presenta cinco fases distintas. La fase 0 corresponde a la
fase de despolarización rápida o fase de subida del PA. Durante la fase 1 se
produce una repolarización inicial rápida, la cual termina en el inicio de la meseta
del PA que corresponde a la fase 2 del mismo. En esta fase 2 el potencial de
membrana cambia muy poco durante decenas de milisegundos, ya que tanto las
corrientes entrantes como las salientes se contrarrestan, unas a otras. Durante la
meseta se inicia una lenta repolarización, la cual se acelera y da lugar a la fase 3.
Finalmente, la fase 4 corresponde al potencial de membrana en reposo (Figura
4A).
15
Figura 3. Los potenciales de acción cardiacos son propios del tejido en que se estudian. Sus
diferentes fases se originan por la activación de diferentes corrientes iónicas y la variación en su
morfología se debe principalmente a la diferencia existente en la contribución relativa de dichas
corrientes iónicas. Modificada de med.javeriana.edu.co/fisiologia/nguias/sna.htm.
El PA en miocitos del NSA se diferencia claramente del PA de miocitos de
trabajo (Figura 4B). La fase 0 en el NSA presenta una velocidad de
despolarización más lenta, no presenta claramente la fase 1, la meseta o fase 2
es más corta y durante la fase 4, la membrana no se encuentra propiamente en
reposo ya que presenta una despolarización lenta conocida como despolarización
diastólica espontánea, la cual es responsable de la capacidad de producir PA
espontáneos, propiedad conocida como automatismo (Sánchez-Chapula et al.,
2007; Mangoni y Nargeot, 2008).
16
Figura 4. Corrientes iónicas que participan en la actividad eléctrica del PA ventricular (A) y del
NSA (B). El PA ventricular (A) es el más representativo ya que presenta claramente las cinco
fases; fase 0, de despolarización rápida; fase 1, de repolarización inicial rápida; fase 2, de meseta;
fase 3, de repolarización; fase 4, potencial de membrana en reposo. En el PA del NSA (B) durante
la fase 0, la despolarización es más lenta; no son claras la fase 1 y 2 observadas en el PA
ventricular; no existe una fase en reposo, en su lugar, la fase 4 representa la despolarización
diastólica de los potenciales espontáneos. Ito = corriente de potasio transitoria de salida; IK =
corrientes de potasio de rectificación tardía; ICaL e ICaT = corriente de calcio tipo L y T,
respectivamente; If = corriente de marcapaso; INa = corriente de sodio; IK1 = corriente de potasio de
rectificación entrante. Modificada de Nathan, (1985).
Corrientes iónicas involucradas en el potencial de acción del NSA.
En miocitos del NSA, la actividad marcapaso está regulada por una
complicada interacción de múltiples corrientes moduladas por el sistema nervioso
autónomo y no sólo debido a una corriente en particular. Los latidos o
contracciones espontáneas están asociados con interacciones entre la activación
de la ICaT y la ICaL, el decaimiento dependiente de tiempo (desactivación) de la
conductancia de los rectificadores tardíos (IK) y la corriente entrante de
marcapaso, activada por hiperpolarización, llamada If (Noble, 1984; Guo et al.,
1995; Mitsuiye et al., 2000). La contribución de la ICaT al marcapaso es pequeña y
se limita aproximadamente al primer tercio de la despolarización diastólica
espontánea (Noble, 1984). En contraste la ICaL es particularmente responsable de
la última fase de la despolarización diastólica espontánea, de la fase de subida y
del sostenimiento de la fase corta de meseta del PA nodal (Hagiwara et al., 1988).
Satoh (2003) señala que el intercambiador Na+/Ca2+ genera una pequeña
17
corriente entrante durante la despolarización diastólica proporcionando una
corriente básica que participa en la despolarización diastólica espontánea de la
fase 4 del PA. El grupo de Noma (Guo et al., 1995; Mitsuiye et al., 2000;
Shinagawa et al., 2000) demostró más recientemente, la participación de una
corriente de fondo en miocitos del NSA de rata, la corriente entrante sostenida
(IST). Estas corrientes junto con la ICaL, la If y la IK son las que comandan la
actividad de marcapaso. La IST es una corriente de Na+ sensible a la nicardipina,
con una conductancia de 13 pS y con una densidad de corriente muy pequeña (2
pA/pF) en miocitos del NSA de conejo (Mitsuiye et al., 2000). La IST es resistente a
tetrodotoxina (30µM). La apertura de canales de Ca2+ aumenta la IST. Así, la
activación de la IST desarrolla una mayor contribución a la despolarización de
marcapaso.
Corriente de marcapaso (If).
La corriente marcapaso, If, fue primeramente descrita en miocitos del NSA
de mamíferos y contribuye esencialmente a la génesis de la actividad del ritmo
cardiaco (Brown et al., 1979; Brown y Difrancesco, 1980; Yanagihara y Irisawa,
1980). La If es generada por el flujo de iones de Na+ y K+, es una corriente
entrante, su umbral de activación está alrededor de -40 a -50 mV, su potencial de
inversión es de -20 mV, y tiene una activación máxima entre -100 y -110 mV
(DiFrancesco, 1981; DiFrancesco et al., 1986).
Corrientes de calcio tipo L y T.
Las corrientes de Ca2+ tipo T (ICaT) y tipo L (ICaL) han sido reportadas en
miocitos de NSA, de aurícula y de ventrículo (Bean, 1985; Nilius et al., 1985; Mitra
y Morad, 1986; Hagiwara et al., 1988; Tseng y Boyden, 1989; Tytgat et al., 1990).
Hagiwara et al., (1988) confirmaron la presencia de ICaT y de ICaL en miocitos del
NSA de conejo usando el método de fijación de voltaje en célula completa. La
clasificación de la ICa fue de acuerdo a su cinética de inactivación: los canales que
mostraron inactivación rápida o también llamada transitoria fueron nombrados tipo
T, y los canales que inactivan lentamente son conocidos como tipo L (Nilius et al.,
1985). La ICaT difiere de la ICaL en cuanto a sus características cinéticas y
farmacológicas. La contribución de la corriente ICaT al marcapaso es pequeña y se
limita aproximadamente al primer tercio de la fase 4 del PA (Noble, 1984). La
18
corriente ICaL es la más importante por ser la generadora del potencial de acción
en miocitos de NSA, siendo particularmente responsable de la última fase de la
despolarización diastólica espontánea, de la fase de subida del potencial de
acción, así como del sostenimiento de la fase corta de meseta del PA nodal
(Satoh y Tsuchida, 1993).
Corrientes de potasio de rectificación tardía.
Los canales de potasio rectificadores tardíos participan en la generación de
los PA espontáneos de los miocitos marcapaso del NSA. Se conoce que estas
corrientes de potasio participan de manera importante durante la fase lenta de
despolarización diastólica en miocitos del NSA (Irisawa et al., 1993). La activación
de IK junto con la inactivación de ICaL contribuye a la repolarización de la
membrana de los miocitos del marcapaso, y su subsecuente desactivación afecta
el curso temporal de la despolarización diastólica de los potenciales espontáneos
(Noma y Irisawa, 1976; DiFrancesco et al., 1979; Nakayama et al., 1984;
Anumonwo et al., 1992). Actualmente, se sabe que la IK en miocitos cardiacos
está conformada por al menos dos componentes, la IKr y la corriente de potasio
lenta (IKs) en miocitos ventriculares de conejo (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990; Liu
y Antzelevitch, 1995; Gintant, 1996; Salata et al., 1996). La presencia de la IKr en
miocitos del NSA así como la participación en la generación de los potenciales de
acción espontáneos, ha sido extensamente estudiada en una variedad de
especies; Sanguinetti y Jurkiewicz (1990), en miocitos ventriculares de cobayo,
demostraron que la IKr puede ser aislada de la IK por el agente antiarrítmico clase
III, E-4031. Este agente, bloquea específicamente a la IKr de manera reversible
(Sanguinetti y Jurkiewicz, 1991).
Utilizando la especificidad de este bloqueador, se ha demostrado la
presencia de la IKr en los miocitos del NSA de conejo (Ito y Ono, 1995); estos
últimos encontraron que 0.5 µM del E-4031 suprime completamente la actividad
de canal unitario de la IKr, la cual se restablece previo lavado del fármaco. Se
demostró también que 3 µM de la E-4031 no afecta la probabilidad de apertura de
los canales de K+ muscarínicos, al igual que el resto de las corrientes que
participan en el PA. Existen diferencias en la expresión de la IKs entre tejidos y
entre especies. En miocitos del NSA de rata tanto la IKr como la IKs están
presentes (Shinagawa et al., 2000; Lei et al., 2002), donde el bloqueo de la IKr al
19
igual que en miocitos nodales de otras especies provocaría un potencial diastólico
máximo más positivo y el aumento en la duración del potencial de acción,
probablemente debido a que la frecuencia sinusal podría estar siendo regulada
por la IKr y/o la IKs. Concentraciones de 3-5 µM del E-4031 suprimieron la actividad
espontánea en los miocitos del NSA de rata, mientras que 30 µM del cromanol-
293B (bloqueador de la IKs) no genera un efecto considerable en estos mismos
miocitos. Efectos similares, provocados por estos bloqueadores, han sido
detectados en miocitos del NSA de conejo y de ratón (Shinagawa et al., 2000; Lei
et al., 2002; Cho et al., 2003); por lo tanto la contribución de la IKs a los
potenciales de acción espontáneos es pequeña en estas especies.
Corriente de potasio activada por la ACh (IKACh) y su importancia fisiológica.
Los canales KACh pertenecen al grupo de canales de K+ rectificadores
entrantes (Kir, por sus siglas en inglés) acoplados a las proteínas G, miembros de
la subfamilia Kir 3.0. Evolutivamente, los canales Kir representan la clase más
primitiva de canales iónicos y se les encuentra desde bacterias hasta mamíferos
superiores (Hille, 2002). La estructura primaria de estas subunidades predice 2
regiones transmembranales, una región formadora de poro y los extremos amino
y carboxilo del lado citoplásmico. La secuencia glicina-tirosina-glicina en la región
P o H5 formadora de poro constituye el filtro de selectividad para K+. Los canales
Kir están compuestos de 4 subunidades Kir 3.x (x=1-4). Cada subunidad posee un
sitio de unión para G en los extremos amino y carboxilo terminal del canal.
Diferentes combinaciones de subunidades Kir 3.x se encuentran en tejidos y
células. Así, el canal KACh está compuesto de Kir 3.1 y 3.4 en una estequiometría
2:2 (Kurachi y Ishii, 2004). El mecanismo de rectificación entrante de los canales
Kir es causado por un rápido bloqueo dependiente de voltaje por el Mg2+ y las
poliaminas intracelulares (Ruppersberg, 2000).
En estudios in vivo con ratones deficientes para Kir 3.4 quedó demostrada
la participación directa de los canales KACh en la bradicardia inducida por
estimulación vagal y por adenosina, además de ser necesarios para la regulación
rápida de la frecuencia cardiaca en reposo (Wickman et al., 1998; Mark y Herlitze,
2000).
20
ANTECEDENTES INMEDIATOS
Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula (1997) mostraron que 1 mM de 4-
aminopiridina (4-AP) producía una serie de efectos sobre el PA de miocitos
auriculares de gato: un aumento de la amplitud máxima, una ligera
hiperpolarización del potencial de reposo y un acortamiento de la duración del PA
(Figura 5).
Figura 5. Efectos de la 4-AP (1 mM) sobre el PA auricular: aumento de la amplitud máxima, una
ligera hiperpolarización y un acortamiento de la duración. Control (○), 4-AP 1mM (●). Modificada
de Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula, (1997).
Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula en 1997, examinaron, con fijación de
voltaje de miocitos auriculares de gato, que la 4-AP produce un efecto dual sobre
las corrientes de potasio: se disminuye la corriente de K+ transitoria de salida (Ito1)
y simultáneamente se activan componentes de corriente entrante y saliente
siendo este último componente claramente dependiente de tiempo y voltaje
(Figura 6). El efecto de 4-AP sobre las corrientes iónicas explicaron las
modificaciones en la morfología del PA.
21
Figura 6. Efectos de la 4-AP (1mM) sobre las corrientes de membrana en miocitos auriculares de
gato. Estos experimentos muestran trazos de corrientes inducidos por pulsos hiperpolarizantes (B
y D) y pulsos despolarizantes (A y C) desde un potencial de mantenimiento de -40mV, a
potenciales entre -100 y +50mV con una duración de 500 ms, obtenidas dentro de condiciones
control (A y B) y en presencia de la 4-AP (C y D). 4-AP produce un efecto dual sobre las corrientes
de K+: se disminuye la Ito y simultáneamente se activan corrientes entrantes y salientes a voltajes
hiperpolarizantes y despolarizantes, respectivamente. Modificada de Navarro-Polanco y Sánchez-
Chapula, (1997).
En este mismo trabajo, Navarro-Polanco y Sánchez-Chapula (1997),
comprobaron que en la activación de ambos componentes de corrientes
participan M-AChRs acoplados a las proteínas Gi/o, ya que la atropina
(antagonista colinérgico inespecífico), la GDPS (inhibidor inespecífico de
proteínas G) y la toxina pertussis, aplicados por separado, eran capaces de inhibir
totalmente a los componentes de corriente tanto salientes como entrantes,
activados por la 4-AP. Con registros de canal unitario se comprobó que el
componente entrante activado por la 4-AP se trataba de IKACh. El componente
saliente se analizó con más detalle, examinando dependencia de voltaje, cinética
y sensibilidad farmacológica, poniendo de manifiesto que no se trataba de los
rectificadores tardíos descritos en corazón, la IKr y la IKs. Fermini y Nattel, (1994);
Shi et al. (1999); Wang et al. (1999); Shi et al. (2003) publicaron que, en miocitos
auriculares de perro, colina, tetrametilamonio (TMA), pilocarpina y 4-AP activaron
corrientes de K+ muy similares a las encontradas por Navarro-Polanco y Sánchez-
22
Chapula (1997), proponiendo la existencia de diferentes rectificadores tardíos
acoplados a distintos subtipos de M-AChRs. A estos supuestos rectificadores
tardíos los nombraron como IKM3 cuando eran activados por colina, TMA y
pilocarpina a través del receptor M3 e IK4AP a la corriente activada por 4-AP a
través del receptor M4 (Fermini y Nattel, 1994; Shi et al., 1999; Wang et al., 1999;
Shi et al., 2003).
Para llegar a estas conclusiones, utilizaron antagonistas de los diferentes
subtipos de receptores muscarínicos, dándoles un mayor soporte a estos
hallazgos con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con
retrotranscriptasa (RT-PCR) de aurícula homogenizada en donde además del
ARNm del subtipo M2 también encontraron los subtipos M1, M3, M4 y M5 (Shi et al.,
1999; Wang et al., 2001). Esto contrasta con múltiples evidencias que señalan al
receptor M2 como el subtipo funcional predominante en el corazón (Watson et al.,
1983; Bonner et al., 1987; Mizushima et al., 1987; Peralta et al., 1987) y el que
contribuye a la regulación de la frecuencia cardiaca, la fuerza de contracción,
forma y duración de los potenciales de acción (Jeck et al., 1988; van Zwieten y
Doods, 1995). Posteriormente, Meyer et al., (2001) reportó que los receptores
muscarínicos M3 no están presentes en miocitos de aurícula de rata, esto al hacer
RT-PCR en miocitos aislados y cultivados; pero sí encontraron receptores M3 al
hacer el RT-PCR del cultivo de aurícula completa. Estos hallazgos hacen suponer
que lo reportado por Shi et al. (1999) pudiera ser un artefacto de los M3AChR que
se encuentran en células endoteliales y vasos, al homogenizar la aurícula
completa. En estudios posteriores, donde se utilizó RT-PCR competitiva para
cuantificar los ARNm de los distintos M-AChRs en aurícula, reafirmó la enorme
predominancia del M2AChR respecto a los otros subtipos muscarínicos M2 93.9%,
M1 0.8%, M3 1.1%, M4 0.2% y el M5 4.1% (Krejci y Tucek, 2002). Además se
tienen estudios con ratones knockout para los distintos M-AChRs donde se
descarta toda participación fisiológica en la regulación de la frecuencia cardiaca a
cualquier M-AChRs distinto al M2 (Stengel et al., 2000; Wess, 2004).
Estudios realizados en miocitos auriculares de diferentes especies
animales (perro, rata, ratón, conejo y cobayo), mostraron que la 4-AP activa los
componentes de corriente de K+ tanto entrantes como salientes (Benavides-Haro,
2001).
23
En corazón de mamífero, el NSA o marcapaso cardiaco, es el tejido más
densamente inervada por ambas ramas, adrenérgicas y colinérgicas, del sistema
nervioso autónomo (DiFrancesco, 2003). A través de esta inervación del NSA, el
sistema nervioso ejerce un control sobre la frecuencia de latido. Los agonistas
simpáticos, por mediación de los receptores -adrenérgicos, y los agonistas
parasimpáticos, por mediación de receptores muscarínicos, modifican la
frecuencia cardiaca a través de cambios en la pendiente de la fase 4, también
conocida como despolarización diastólica espontánea (DDE). Los agonistas -
adrenérgicos como el Isoproterenol (Iso) incrementan la pendiente de la DDE;
este incremento en la velocidad de despolarización hace que se alcance el umbral
de disparo en un tiempo menor y se genere un nuevo PA, lo que implica un
incremento en la frecuencia. Por el contrario, los agonistas muscarínicos como la
ACh reducen la pendiente de la DDE incrementando la duración del intervalo
entre potenciales de acción y reduciendo la frecuencia cardiaca (Figura 7A).
Se tienen evidencias de la participación de If en la generación de la DDE en
el NSA de conejo. Sin embargo, el papel que desempeña la If durante la fase de
despolarización diastólica espontánea en otras especies aún está en discusión.
Por un lado, debido a que el bloqueo total de esta corriente por el Cs+ no cesa la
actividad espontánea de los miocitos marcapaso (Denyer y Brown, 1990a);
además, los miocitos del NSA de conejo y de cobayo expresan la corriente If,
mientras que en el nodo de rata no siempre es registrada y, sin embargo, los
miocitos que no muestran esta corriente, presentan actividad espontánea
(Shinagawa et al., 2000).
24
Figura 7. La If interviene en la modulación cronotrópica de la actividad marcapaso por
transmisores autonómicos. (A), registro de los PA espontáneos en dos miocitos aislados del NSA
en condiciones control y perfundidos con Iso 0.3 μM (Izq.) o ACh 0.3 μM (Der.). (B) Registros de la
If obtenidos durante hiperpolarizaciones a -85 mV desde un potencial de mantenimiento de -35
mV, en dos miocitos diferentes: en condiciones control y durante perfusión con Iso 0.3 μM (Izq.) o
ACh 0.3 μM (Der.) Modificada de DiFrancesco, (2003).
En el ratón, las propiedades de la If se asemejan a aquella registrada en
conejo (Denyer y Brown, 1990a, b; Mangoni y Nargeot, 2001). La If no se expresa
comúnmente en miocitos del NSA de mono y de rata, y aún así presentan
actividad espontánea (Satoh, 2003). Estos resultados sugieren que la If no es
esencial para la actividad marcapaso, por lo tanto, el papel de esta corriente
parece ser el de modular la frecuencia y no el de generar la despolarización
marcapaso como tal, aunque los miocitos que no presentan actividad espontánea,
no exhiben la If.
DiFrancesco, (2003) reportó que dosis bajas de ACh inhiben la If
presentándose una bradicardia sin afectar la IKACh; y que un incremento en la
conductancia de K+ es obtenido solamente con aumentos en las concentraciones
de ACh. Estudios similares realizados por DiFrancesco y Tromba (1988a, b) ya
habían observado que la ACh inhibía la If en miocitos del NSA, por un mecanismo
que involucraba la inhibición de adenilato ciclasa, la disminución de la producción
de AMPc y un corrimiento de la curva de activación de If a voltajes más negativos.
25
También habían concluido que la acción de la ACh sobre la If era mediada por
receptores muscarínicos y bloqueada por atropina.
La 4-AP ha sido utilizada ampliamente por electrofisiólogos y farmacólogos
como una herramienta farmacológica para estudiar la corriente de potasio
transitoria de salida, Ito (Tseng y Hoffman, 1989; Boyle y Nerbonne, 1992; Boyett
et al., 1998). Sin embargo, muchos de los autores han considerado a la 4-AP
como un bloqueador selectivo de las corrientes Ito e IKur (rectificador tardío ultra
rápido), en diferentes preparaciones cardiacas como NSA y miocitos ventriculares
(Boyett et al., 1998; Banyasz et al., 2007; Sridhar et al., 2007), sin tomar en
cuenta algunos reportes que han sugerido que la 4-AP bloquea la corriente
rectificadora tardía rápida, IKr (Elizalde et al., 1999; Ridley et al., 2003). Además,
en diferentes estudios se ha sugerido y mostrado evidencias que la 4-AP es
capaz de producir la liberación de neurotransmisores simpáticos (noradrenalina) y
parasimpáticos (ACh) en preparaciones aisladas de tejidos cardiacos y no
cardiacos. (Yanagisawa et al., 1978; Glover, 1981; Furukawa et al., 1985).
26
PRIMERA HIPÓTESIS
La disminución de la frecuencia de disparo del NSA ocasionada por el
agonista, pilocarpina, es provocada por la activación del canal KACh y por la
inhibición de If, como resultado de la interacción voltaje dependiente de este
agonista con el receptor muscarínico M2, en forma similar a como lo hace el
neurotransmisor fisiológico, la ACh.
SEGUNDA HIPÓTESIS
La 4-aminopiridina (4-AP) produce efectos electrofisiológicos complejos y
diferentes sobre los potenciales de acción espontáneos registrados en
preparaciones multicelulares del NSA de conejo. Estos efectos son debidos a que
en los miocitos del NSA la 4-AP, además del conocido efecto bloqueador de la
corriente de potasio, Ito, también produce bloqueo de las corrientes rectificadoras
tardías, IKr e IKs, y activación de IKACh. Además, produce una liberación del
neurotransmisor noradrenalina en preparaciones multicelulares aisladas del NSA.
27
OBJETIVOS GENERALES
I. Examinar los efectos de la pilocarpina sobre la actividad eléctrica espontánea
en preparaciones multicelulares del NSA de conejo.
II. Determinar en miocitos aislados del NSA los mecanismos iónicos involucrados
en los efectos de la pilocarpina sobre el potencial de acción del NSA de conejo.
III. Examinar los efectos de la 4-AP sobre la actividad eléctrica espontánea en
preparaciones multicelulares del NSA de conejo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar los efectos electrofisiológicos de la pilocarpina sobre los diferentes
parámetros de los potenciales de acción espontáneos registrados en
preparaciones multicelulares de la región central del NSA de conejo. Los
parámetros del potencial de acción a estudiar son: la frecuencia de disparo, el
potencial diastólico máximo, la velocidad máxima de despolarización, la amplitud
del sobretiro (overshoot), la amplitud del potencial de acción y su duración.
2. Determinar los mecanismos iónicos del potencial de acción que permitan
explicar los efectos electrofisiológicos de la pilocarpina sobre el NSA de conejo.
3. Caracterizar los efectos electrofisiológicos de la 4-AP sobre los diferentes
parámetros de los potenciales de acción espontáneos registrados en
preparaciones multicelulares de la región central y periférica del NSA de conejo.
Los parámetros del potencial de acción a estudiar son: la frecuencia de disparo, el
potencial diastólico máximo, la velocidad máxima de despolarización, la amplitud
del sobretiro (overshoot), la amplitud y la duración.
4. Determinar la probable participación de la liberación de noradrenalina por la 4-
AP en sus efectos sobre la actividad espontánea del NSA.
28
MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con conejos Nueva Zelanda blancos, de sexo indistinto, de 1.5 a
2.5 Kg de peso vivo.
Procedimiento para disecar el nodo senoauricular de conejo.
A los animales se les administró heparina 10 mg/kg vía intraperitoneal (IP);
15 min después se indujo anestesia general con pentobarbital sódico a una dosis
de 45 mg/kg vía IP. Una vez anestesiados, se procedió a abrir el tórax, el corte se
realizó a nivel de las uniones costocondrales (incluyendo el esternón). Cuando el
corazón estuvo expuesto, fue extraído con cortes rápidos y precisos e
inmediatamente se introdujo en un vaso de precipitado con solución Tyrode
(temperatura ~ 4°C) previamente burbujeada con una mezcla de 95% CO2, 5% O2
(carbógeno). Para eliminar la mayor cantidad posible de sangre remanente de las
cavidades auriculares y ventriculares se le dieron ligeros masajes.
El corazón fue transferido a una cámara que contenía solución Tyrode, esta
vez a temperatura ambiente, donde se procedió con la disección del NSA. A
grandes rasgos, los ventrículos fueron separados del resto del tejido cardiaco por
un corte a lo largo del septum aurículo-ventricular. Un corte longitudinal desde la
región inferior y a lo largo del septum inter-auricular hasta la región superior de la
vena cava, nos permitió exponer a simple vista la superficie endocárdica del tejido
nodal. Por último, el NSA fue disecado cuidadosamente de la crista terminalis
(adyacente a la aurícula derecha) y del septum inter-auricular.
El NSA fue dividido en 4 tiras de tejido nodal de 0.3 a 0.4 mm de ancho y 3
a 4 mm de largo; realizando cortes en dirección perpendicular a la crista terminalis
(Figura 8A) ubicando siempre la región central del NSA. Las tiras se numeraron
del 1 al 4 en dirección cráneo-caudal, donde la tira 1 es la más próxima a la región
craneal del NSA, mientras que la tira 4 se ubica en la región caudal (Figura 8A y
B). Cada una de las tiras fue anudada utilizando hilo de seda 7 ceros con el fin de
obtener pequeñas preparaciones con segmentos aislados de ~0.35 mm x 0.35
mm identificados como A, B, C, D y E en dirección latero-medial. Los segmentos
A y B fueron los más próximos a la crista terminalis ubicándose en la periferia del
NSA. Los segmentos D y E fueron distantes a la crista terminalis, ubicándose en
29
la región central del nodo (Figura 8B). Los segmentos C fueron típicamente de la
región de transición entre la periferia y el centro del tejido nodal.
Figura 8. Diagrama de una preparación de NSA para registros multicelulares de potenciales de
acción espontáneos con la técnica de microelectrodos. A, localización del NSA respecto a la
aurícula derecha (AD), el septum inter-auricular y las regiones superior e inferior de la vena cava.
En B, podemos ver con mayor detalle el arreglo de una preparación multicelular de NSA disecado,
señalando las regiones central (recuadros sombreados) y periférica del tejido nodal. Un trazo
representativo de un potencial de acción marcapaso donde se señalan: a) el potencial diastólico
máximo (PDM); b) la velocidad de despolarización diastólica (dV/dTmáx); c) la velocidad máxima de
despolarización o disparo (Vmáx); d) La frecuencia de los disparos (F) en función de la longitud del
ciclo (LC); y la amplitud del potencial de acción (e), puede observarse en C. Modificada de Boyett
et al., (1998).
La preparación utilizada fue colocada en una cámara de registro con
capacidad de 3 mL fijándose al fondo con alfileres entomológicos y cuidando que
la superficie del endocardio esté orientada hacia arriba. El tejido nodal fue
perfundido constantemente con solución Tyrode a una velocidad de 2-3 mL/ min,
con la ayuda de un intercambiador de calor, la temperatura de la solución en la
cámara se mantuvo constante durante los registros (~35°C), debido a que
variaciones en la misma se reflejan en la frecuencia de disparo de los potenciales
espontáneos.
Registros de potenciales de acción.
En estas preparaciones, se realizaron registros de potenciales de acción
espontáneos característicos de la región central y en algunos casos de la periferia
del NSA. Los registros se realizaron con la técnica convencional de dos
microelectrodos; utilizando microelectrodos de vidrio con una resistencia entre 25-
30
30 MΩ una vez llenos con solución KCl 3M (solución interna de registro). Los
microelectrodos fueron conectados a la entrada de un amplificador de alta
impedancia modelo 750 WPI. Para su análisis, los potenciales se digitalizaron y
se almacenaron en una computadora personal, con una velocidad de muestreo de
3 KHz mediante el uso de una interfase Digidata 1200. Para la adquisición de
datos se uso el software Axoscope 9.2. La composición de la solución Tyrode
(solución externa de registro) fue la siguiente (mM): NaCl 118, KCl 5.4, NaHCO3
24, MgCl2 1.05, NaH2PO4 0.42, CaCl2 1.8 y glucosa 11. La solución Tyrode fue
burbujeada con carbógeno para ajustar el pH a 7.4.
Los efectos de la pilocarpina y la 4-aminopiridina fueron evaluados sobre el
potencial diastólico máximo (PDM); la velocidad de despolarización diastólica
(dV/dtMáx.); la velocidad máxima de despolarización (VMáx.); la amplitud del
potencial de acción (Amp); la duración del potencial de acción al 50% de su
repolarización (DPA50) y la frecuencia de los disparos espontáneos (F) como
función de la longitud del ciclo marcapaso (LC) respecto al tiempo (Figura 8C).
Los efectos de la pilocarpina 3, 10 y 30 μM sobre la actividad espontánea
de la región central del NSA fueron evaluados en condiciones control, en
presencia de Cs+ 2 mM, en presencia de atropina 1µM y en presencia de
tertiapina Q 300 nM. Los registros con la 4-AP 5 mM se realizaron tanto en
segmentos de la región central como periférica del tejido nodal, en conejos
reserpinizados (en condiciones control y en presencia de isoproterenol 1, 3 y 10
nM) y no reserpinizados (en presencia de atropina 1 μM y propranolol 1 μM).
Durante los registros fue importante verificar los tiempos de exposición a cada
uno de estos compuestos, la temperatura durante el registro y los tiempos de
lavado. Nuestros resultados son presentados como media ± error estándar para el
número de registros indicados. El análisis estadístico se hizo con un análisis de
varianza y la prueba de Dunnet, considerando significativa una p≤ 0.05.
Dispersión de miocitos del NSA de conejo.
Los miocitos del NSA de corazón de conejo fueron aislados de acuerdo al
procedimiento experimental descrito por Sánchez-Chapula y Torres-Jácome,
(ensayo experimental no publicado, transmitido en comunicación directa). Al igual
que para los registros de potenciales de acción espontáneos en preparaciones
multicelulares del NSA, se utilizaron conejos Nueva Zelanda blancos en el mismo
31
rango de peso. Se realizó el mismo procedimiento quirúrgico y de anestesia para
la extracción del corazón. Dicho órgano se recibió en un vaso de precipitado de
100 mL con solución Tyrode a una temperatura de 4°C, se depositó en un
recipiente adecuado para limpiarlo de tejidos remanentes como pulmón, tráquea,
tejido conectivo y adiposo, dejándolo solo con sus vasos sanguíneos principales,
cuidando que la aorta fuera visible y suficiente para colocar el corazón a un
sistema de perfusión retrógrada tipo Langendorff.
El corazón fue perfundido durante 8 a 10 min con solución Tyrode a 35-36
°C para eliminar los restos de sangre en el tejido cardiaco. La solución Tyrode
contenía (mM): NaCl 118, KCl 5.4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.05, NaHCO3 24, NaH2PO4
0.42, taurina 10 y glucosa 11. Esta solución fue saturada con carbógeno para
alcanzar un pH de 7.4. Este procedimiento fue seguido por la perfusión del
corazón con solución Tyrode sin Ca2+ durante 6 a 8 min (el tiempo variará
dependiendo el grado de relajación del tejido cardiaco). La composición de la
solución Tyrode sin Ca2+ fue la misma de la solución Tyrode sólo que sin agregar
CaCl2. Transcurrido este tiempo, el corazón fue perfundido con solución Tyrode
sin Ca2+ adicionada con colagenasa 8mg/30 mL (tipo I de Sigma-Aldrich) durante
5 a 7 min para agregar después proteasa 1 mg/90 mL (tipo XIV de Sigma-Aldrich)
a esta misma solución y continuar la perfusión durante 5 a 8 min más. La enzima
perfundida fue recirculada con una bomba y mantenida a 36 0.5 °C.
Después de la digestión enzimática inicial, el corazón fue lavado por 3 a 5
min con solución de almacenamiento (solución Kraftbrϋhe modificada) para
neutralizar la enzima. La solución de almacenamiento estaba compuesta como
sigue (mM): taurina 20, ác, glutámico 80, creatina 0.5, ác. succínico 10, glucosa
10, KH2PO4 10, MgSO4 5, KCl 40, HEPES 10, EGTA 0.2, ajustando el pH a 7.4
con KOH y burbujeando con O2.
Al final, el corazón fue retirado del sistema de perfusión retrógrada tipo
Langendorff y conservado en esta solución (Kraftbrϋhe modificada) para la
disección del NSA. El procedimiento de disección fue el mismo descrito para los
experimentos realizados en preparaciones multicelulares. La porción de tejido
nodal correspondiente a la región central del NSA (señalada como D y E en la
Figura 8B), fue disecada y colocada en 5 mL de medio de digestión constituido
por solución Tyrode sin Ca2+ al cual se agregaron colagenasa 8 mg/30 mL y
elastasa 2 mg/5 mL (tipo II-A de Sigma-Aldrich) incubado en un calentador
32
multiblock a una temperatura de 36 0.5 °C. El medio de digestión fue
burbujeado constantemente con carbógeno. Cada 3 a 5 min, el NSA fue retirado
del medio de digestión y colocado en solución de almacenamiento para ser
sometido a dispersión mecánica. La dispersión fue observada al microscopio con
el fin de determinar el mejor tiempo para detener la digestión enzimática. Los
miocitos aislados, fueron conservados en solución de almacenamiento a ~4°C
hasta el momento de su registro.
Registro de corrientes iónicas en miocitos aislados del NSA de conejo.
Los registros en miocitos aislados se hicieron usando un amplificador
Axopatch 200B (Axon Instruments Co.). Los protocolos de fijación de corriente y
voltaje, la adquisición de datos y análisis de los mismos se realizó usando una
computadora personal (Compaq, Pentium IV), utilizando una tarjeta digitalizadora
Digidata 1322A (Axon Instruments) y los programas de adquisición y análisis
pClamp 9.0 (Axon instruments) y Origin 7.0. Las micropipetas para registro se
prepararon a partir de capilares de borosilicato con un diámetro externo de 1.5
mm e interno de 1.12 mm (World Precision Instruments, Inc.), usando un estirador
horizontal de micropipetas modelo P-97 (Sutter Instruments).
Las micropipetas, mostraron resistencias de 2-3 M al llenarse con
solución interna. La solución interna de registro estaba compuesta como sigue
(mM): L-aspartato 80, KH2PO4 10, MgSO4 1, KCl 40, HEPES 5, EGTA 10, GTP-
Na 0.2, ATP-Na2 3, adicionado con fosfocreatina 5. El pH fue ajustado a 7.25 con
KOH. Los registros se realizaron a 36.5 0.5 °C. En nuestros registros, la
capacitancia de la membrana (Cm) se calculó utilizando la ecuación Cm = Q / V,
donde Q es el movimiento de carga total que fue determinada integrando el área
del transciende capacitivo generado en respuesta a un cambio de voltaje de -10
mV, desde un potencial de mantenimiento de 0 mV. La capacitancia de la
membrana (Cm) y la resistencia en serie fueron compensadas para disminuir al
máximo los transientes capacitivos. Para reducir el error en la medición del
voltaje, la resistencia en serie fue compensada rutinariamente al menos un 80 %.
Las corrientes registradas fueron filtradas con un filtro pasabajas a 1 Hz y fueron
capturadas a una frecuencia de 4 KHz, y almacenadas en el disco duro de la
computadora para su análisis.
33
Para los registros, los miocitos aislados se colocaron en el interior de una
cámara de lucita con un volumen aproximado de 0.3 mL montada sobre la
plataforma de un microscopio invertido (Nikon, ECLIPSE, TE200). Después de un
tiempo de reposo aproximado de 10 min, los miocitos fueron perfundidos con
solución externa normal la cual estaba compuesta como sigue (mM): NaCl 136,
KCl 4, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 10 y glucosa 11, ajustando el pH a 7.4 con
NaOH. En estas condiciones, se registró potenciales de acción espontáneos, en
modo de fijación de corriente en la configuración de célula completa.
Inmediatamente después de observar la actividad espontánea de los
miocitos, se cambió la solución de perfusión por solución Ca2+-Co2+ bajo para
registrar If y la corriente activada por pilocarpina, en el modo de fijación de voltaje.
La solución de registro Ca2+-Co2+ bajo tenía la siguiente composición (mM): NaCl
136, KCl 4, CaCl2 0.1, CoCl2 0.5, MgCl2 1, HEPES 10, y glucosa 11: el pH fue
ajustado a 7.4 con NaOH. Para determinar, en condiciones control, si los miocitos
expresaban la corriente marcapaso, If, aplicamos un pulso de prueba
hiperpolarizante a -100 mV de 2 s de duración.
Delimitar la dispersión de miocitos a la región donde previamente, en
preparaciones multicelulares registramos potenciales de acción centrales, no
garantizó únicamente la presencia de miocitos procedentes de esta región en
particular; por esta razón, en nuestros experimentos fueron utilizados aquellos
miocitos que como máximo de capacitancia de la membrana (Cm) tuvieran 50 pF
(comúnmente considerados como miocitos centrales), con características
morfológicas propias de los miocitos típicos previamente observados en el NSA
de conejo (miocitos alargados como espigas con un cuerpo celular delgado).
Además, estos miocitos debían expresar la corriente marcapaso, If, y mostrar la
actividad espontánea propia de los miocitos nodales.
Fármacos
El CsCl y la 4-AP (Sigma-Aldrich) se disolvieron directamente en las
soluciones de registro para obtener las concentraciones finales deseadas.
Después de disuelta la 4-AP (5 mM), el pH de la solución fue nuevamente
ajustado a 7.4 usando HCl al 10%. Soluciones stock (10 mM) de E-4031 (Eisai
Pharmaceutical Co.), atropina, pilocarpina y propranolol (Sigma-Aldrich) se
prepararon en agua y se almacenaron a -20°C. Alícuotas de estas soluciones
34
fueron diluidas en las soluciones de registro para obtener las concentraciones
utilizadas en nuestros experimentos.
Las soluciones que contienen cromanol 293B (Sigma-Aldrich) fueron
preparadas en el momento diluyendo una solución madre 40 mM en dimetil-
sulfóxido (DMSO). La tertiapina Q (Tocris Bioscience) fue disuelta en agua a una
concentración de 300 μM, y almacenada a −20°C hasta su uso. La reserpina
(Sigma-Aldrich) fue utilizada a partir de una solución madre de 10 mg/mL en
dimetil-sulfóxido (DMSO).
Análisis estadístico.
Nuestros resultados son presentados como media ± error estándar para el
número de registros indicados (n). El análisis estadístico se hizo con un análisis
de varianza y la prueba de Dunnet. Un valor de p < 0.05 fue considerado
estadísticamente significativo.
35
RESULTADOS
Efecto cronotrópico negativo de la pilocarpina sobre preparaciones
multicelulares centrales del NSA de conejo.
En la primera serie de experimentos, estudiamos los efectos de la
pilocarpina sobre los potenciales de acción espontáneos de preparaciones
multicelulares de la zona central del NSA (zonas 2D y E y 3E y D en la Figura 8).
Los registros de potenciales de acción se realizaron utilizando la técnica de
registro con microelectrodos. Cuando un empale fue estable, se registraron los
potenciales espontáneos en condiciones control (solución Tyrode), y después de
la exposición a 3, 10 y 30 µM de pilocarpina. Cada concentración fue administrada
durante 10 min, después de los cuales se lavó con solución control por 15 min
(tiempo suficiente para revertir los efectos de pilocarpina), administrando entonces
la siguiente concentración de pilocarpina. Los resultados que se utilizaron para el
análisis estadístico fueron aquellos en los cuales el mismo empale se mantuvo
estable durante el experimento completo.
En la Figura 9A se muestra un registro obtenido en condiciones control, y
también se muestran sobrepuestos los potenciales de acción registrados durante
un mismo empale en presencia de pilocarpina 3, 10 y 30 µM. La pilocarpina a una
concentración 3 µM produjo un aumento en la longitud del ciclo (LC), reflejada en
la disminución de la frecuencia de disparo, debido principalmente al aplanamiento
de la fase de despolarización diastólica. Pilocarpina 10 µM produjo, además, un
pequeño pero significativo aumento en el potencial diastólico máximo (PDM), sin
afectar significativamente la duración (DPA50) y la amplitud (Amp.) del PA. La
pilocarpina 30 µM produjo un aumento aún mayor en la LC, mayor incremento en
el PDM; disminución en la DPA50 y en el sobretiro (ST) (Figura 9A y Tabla 1).
Los efectos de pilocarpina sobre los PA espontáneos del NSA fueron
también estudiados en presencia del bloqueador de la corriente marcapaso, If,
cesio (Cs+), a una concentración de 2 mM. En la Figura 9B se muestran registros
de PA espontáneos en presencia de Cs+ como trazo control, mostrándose
también trazos sobrepuestos, durante el mismo empale, en presencia de
pilocarpina 3, 10 y 30 µM, respectivamente. Un resumen de los efectos de
pilocarpina a concentraciones 3, 10 y 30 µM, en presencia de Cs+, sobre los
36
diferentes parámetros del PA es mostrado en la Tabla 1. Podemos observar que
los efectos de pilocarpina 3 – 30 µM, en presencia de Cs+, no fueron
significativamente modificados (Tabla 1 y Figura 10).
En la siguiente serie de experimentos, se estudiaron los efectos de la
pilocarpina, ahora en presencia del bloqueador específico de IKACh, tertiapina Q.
IKACh es activada por la estimulación de los receptores muscarínicos M2. En la
Figura 9C se mostraron registros sobrepuestos de los PA, registrados durante el
mismo empale, en presencia de tertiapina Q 300 nM (trazo control) y después de
administrar pilocarpina 3, 10 y 30 µM. Los efectos de pilocarpina 3, 10 y 30 µM
fueron significativamente atenuados por tertiapina Q (Figura 9C y Tabla 1).
Figura 9. Efectos de la pilocarpina (Pilo) sobre los potenciales de acción registrados en
preparaciones multicelulares de la región central de NSA de conejo. A, registros sobrepuestos de
potenciales de acción obtenidos en condiciones control y en presencia de Pilo 3, 10 y 30 μM. B,
registros obtenidos en presencia de 2 mM de Cesio (trazo control) y en presencia de 3 μM, 10 μM
y 30 μM de Pilo. C, potenciales de acción sobrepuestos, registrados en presencia de 300 nM de
tertiapina Q (control), y en presencia de Pilo 3 μM, 10 μM y 30 μM. D, registros obtenidos en
presencia de atropina 1 μM (trazo control) y en presencia de pilocarpina 30 μM.
37
Los efectos producidos por la concentración más alta de pilocarpina
probada en nuestros experimentos (30 μM), fueron completamente inhibidos por
el antagonista inespecífico de receptores muscarínicos, atropina, a una
concentración de 1 µM (Figura 9D y Tabla 1).
Tabla 1. Efectos de la pilocarpina sobre los potenciales de acción registrados en la región central
de preparaciones multicelulares del NSA de conejo.
Pilocarpina (Pilo) 3, 10 y 30 µM; cesio (Cs) 2 mM; tertiapina Q (Tert Q) 300 nM. PDM = potencial
diastólico máximo; Amp. = amplitud del potencial de acción; D.MAX = derivada máxima (velocidad
de despolarización del potencial de acción); DPA50 = duración del potencial de acción al 50 % de
su repolarización; FC = frecuencia de disparo del potencial de acción. Datos mostrados como M.E.
E.E.; (n = número de experimentos). * Estadísticamente diferentes de su propio control, p ≤ 0.05.
Haciendo un pequeño resumen de los resultados hasta ahora obtenidos,
podemos decir que pilocarpina produce un efecto cronotrópico negativo sobre la
38
actividad espontánea del NSA de conejo, acompañados de otras modificaciones
en diferentes parámetros del PA y que estos efectos son mediados por receptores
muscarínicos. El bloqueo de IKACh por tertiapina Q, inhibe significativamente los
efectos de la pilocarpina sobre la frecuencia de disparo de los potenciales de
acción, siendo más marcados los efectos a las concentraciones de 10 μM y 30 µM
(Figura 10 y Tabla 1).
Figura 10. Consecuencia del bloqueo de If (por Cs+ 2 mM), e IKACh (por tertiapina Q 300 nM) sobre
el efecto cronotrópico negativo producido por la pilocarpina sobre la actividad espontánea del NSA
de conejo. Para su comparación, los datos son graficados como valores normalizados al máximo
de frecuencia registrada en condiciones control para cada grupo experimental (n = 5).
La pilocarpina activa a IKACh en miocitos de NSA de conejo.
En esta serie de experimentos en miocitos de NSA, los registros se
realizaron en presencia del bloqueador de IKr, E-4031 (1 µM), del bloqueador de
IKs, cromanol 293B (50 µM) y del bloqueador de If, Cs+ (2 mM). Desde un potencial
de mantenimiento de -40 mV, se aplicaron pulsos de voltaje hiper y
despolarizantes entre -100 y +40 mV de 2 s de duración, registrando las
corrientes de cola a -40 mV. La Figura 11 muestra trazos de corriente obtenidos
antes de la administración de pilocarpina (Figura 11A, control) y en presencia de
pilocarpina, 3, 10 y 30 µM (Figura 11B, C y D respectivamente); en la Figura 11E
podemos ver la relación entre el voltaje aplicado y la corriente (pA/pF) activada
por pilocarpina (IPilo – IControl), medida al final del pulso, en miocitos de NSA de
conejo.
39
Figura 11. Corriente activada por pilocarpina en miocitos aislados de NSA de conejo. Trazos
representativos de corrientes registradas en condiciones control (A) y en presencia del agonista
pilocarpina (Pilo) 3 (B), 10 (C) y 30 μM (D), donde puede verse la activación de una corriente de
una manera dependiente de voltaje y de concentración. La relación entre el voltaje y la corriente
activada por pilocarpina (3, 10 y 30 μM) se muestra en (E). Protocolo de pulsos de voltaje (inserto);
(n = 4).
Cuando se aplicaron pulsos hiperpolarizantes (entre -100 y -60 mV), la
pilocarpina activó una corriente de fondo, de una manera dependiente de la
concentración, y con un potencial de inversión entre -80 y -90 mV (Figura 11E).
Cuando los pulsos aplicados fueron despolarizantes (entre -20 y +40 mV),
pilocarpina activó una corriente saliente dependiente de tiempo y de voltaje: la
amplitud de la corriente activada y la velocidad de activación fueron mayores
cuanto más positivo fue el voltaje (Figura 11). El antagonista de receptores
muscarínicos, atropina (1 µM), abolió la corriente activada por la pilocarpina
(datos no mostrados de 4 experimentos).
En un trabajo previo de nuestro laboratorio, en miocitos de aurícula de
gato, se mostró que el betanecol, también agonista de receptores muscarínicos,
40
induce corrientes de K+ similares a las activadas por pilocarpina. Estas corrientes
activadas por betanecol fueron completamente inhibidas por el bloqueador de
IKACh, tertiapina Q (Benavides-Haro et al., 2003).
Figura 12. Efecto de tertiapina Q (Tert Q) sobre la corriente activada por pilocarpina (Pilo) en
miocitos aislados de NSA de conejo. Trazos representativos obtenidos en condiciones control, en
presencia de pilocarpina 3 µM (A), 30 μM (B) y pilocarpina + tertiapina Q 300 nM (A y B). C,
resumen del efecto de la tertiapina Q (300 nM) sobre la corriente activada por 3, 10 y 30 μM de
Pilo de la corriente medida al final del pulso a +40 mV. (n = 4).
En la Figura 12, mostramos trazos de corriente registrados por la aplicación
de un pulso despolarizante a +40 mV, desde un potencial de mantenimiento de -
40 mV, de 2 s de duración, en condición control (en presencia de E-4031 1 µM y
cromanol 293B 50 µM), en presencia de pilocarpina 3 µM y 30 µM y en presencia
de pilocarpina + tertiapina Q 300 nM (Figura 12). Como se puede observar,
tertiapina Q bloqueó casi totalmente la corriente activada por pilocarpina 3, 10 y
30 µM. A pesar de que tertiapina Q no bloqueó completamente la corriente
activada por pilocarpina, nuestros resultados sugieren fuertemente que dicha
corriente es IKACh.
41
Efecto de la pilocarpina sobre la corriente marcapaso, If, en miocitos de NSA
de conejo.
En los experimentos en los que se estudió el efecto de la pilocarpina sobre
If, se utilizó Ba2+ 1 mM en la solución de registro, con el fin de bloquear la IKACh
activada por pilocarpina. En la Figura 13A y B se muestran registros de If
registrada en miocitos de NSA. En estos experimentos se utilizó un sistema de
perfusión rápida que permite el cambio de solución en aproximadamente 100-200
ms (Doupnik et al., 2004). Desde un potencial de mantenimiento de -40 mV, se
aplicó primero un pulso hiperpolarizante de 2 s de duración a -80 mV, seguido de
otro pulso hiperpolarizante a -120 mV. El primer pulso a -80 mV activa
aproximadamente un 30 a 40 % de If, mientras que a -120 mV se alcanza la
activación completa de If. Primeramente, se registró la corriente en condición
control, y en seguida se administró la pilocarpina (3, 10 y 30 µM) durante 30 s,
para evaluar su efecto sobre If. Inmediatamente después, se lavó la pilocarpina y
los registros de lavado se tomaron 60 s después de iniciado el lavado. Las
corrientes mostradas en cada panel fueron registradas de miocitos diferentes. Los
resultados muestran que el efecto de la pilocarpina fue dependiente de la
concentración y que el efecto inhibitorio fue más evidente sobre la corriente
activada a -80 mV que a -120 mV.
Figura 13. Efecto de pilocarpina (Pilo) 3, 10 y 30 μM sobre la corriente marcapaso, If registrada en
miocitos de NSA de conejo con el protocolo de pulsos de voltaje inserto. Trazos representativos de
If en condiciones control y en presencia de pilocarpina 3 μM (A) y 30 μM (B). La disminución de If
por pilocarpina 3, 10 y 30 μM analizada a -80 y -120 mV se resume en C (n = 4).
42
Los resultados obtenidos de cuatro miocitos diferentes para cada
concentración (3, 10 y 30 μM) se muestran resumidos en la Figura 13C. Estos
resultados sugieren que la pilocarpina actúa de manera similar a la ACh:
produciendo un corrimiento de la curva de activación de If hacia potenciales más
negativos.
Efecto de la 4-AP sobre los potenciales de acción espontáneos registrados
de preparaciones multicelulares de la región central del NSA de conejo.
De los resultados obtenidos en un trabajo previo acerca del efecto
bloqueador de 4-AP (5 mM) sobre IKr e IKs en NSA de conejo y gato (Aréchiga-
Figueroa et al., 2010), se planteó la posibilidad de que la 4-AP produzca efectos
similares a los que produce el E-4031, bloqueador específico de IKr, sobre los
potenciales de acción de NSA de conejo (Verheijck et al., 1995; Kodama et al.,
1999). De esta manera, en el presente trabajo, repetimos los experimentos
anteriormente citados y estudiamos los efectos de E-4031 sobre los potenciales
de acción de NSA de conejo. E-4031 (1 μM) produce una disminución en la
frecuencia (alargamiento de la longitud del ciclo, LC); un incremento en la
duración del potencial de acción (DPA); una despolarización significativa del
potencial diastólico máximo (PDM) y finalmente una abolición de la actividad
espontánea (Figura 14).
Figura 14. Efecto de E-4031 1 μM sobre potenciales de acción espontáneos registrados en la
región central de preparaciones multicelulares de NSA de conejo. Se muestran trazos
sobrepuestos de potenciales de acción registrados en condiciones control (trazo a), y después de
5 min (trazo b) y 9 min (trazo c) de haber aplicado E-4031 a la preparación. El efecto del bloqueo
de IKr es completamente reversible después de aproximadamente 30 min de lavado (trazo d). La
actividad espontánea cesó, manteniéndose el potencial de membrana en aproximadamente -32
mV.
43
Ante la expectativa basada en los antecedentes respecto al bloqueo de IKr
sobre la actividad espontánea del NSA y en los datos de la Figura 14, en la
siguiente serie de experimentos se estudió el efecto de 4-AP (5 mM) sobre los
potenciales de acción de preparaciones multicelulares de la región central de NSA
de conejo (zonas 2D y E y 3E y D de la Figura 8), utilizando el método tradicional
de registro con microelectrodos. Cuando se consiguió un empale estable, se
registraron los potenciales de acción en condiciones control y después de la
aplicación de 4-AP durante 40 min. El efecto de la 4-AP fue completamente
reversible después de 60 min de lavado (datos no mostrados). En la Figura 15A
se muestra un registro obtenido en condiciones control, y en presencia de 4-AP
durante el mismo empale. Los resultados obtenidos de 5 experimentos son
resumidos en la Tabla 2. Se encontró un efecto muy similar al reportado
previamente por Kodama et al. (1999): la 4-AP produjo un aumento significativo
en el sobretiro del potencial de acción, debido al bloqueo de Ito, y también produjo
un aumento en la frecuencia de disparo. Por otro lado, la 4-AP no provocó
cambios significativos en la duración del potencial de acción (DPA50) ni en el
potencial diastólico máximo (PDM).
Ya que previamente fue mostrado que la 4-AP activa IKACh a través de
receptores muscarínicos en miocitos auriculares de gato (Navarro-Polanco y
Sánchez-Chapula, 1997) y en miocitos de NSA de conejo y gato (Aréchiga-
Figueroa et al., 2010), en el presente trabajo se estudió el efecto de 4-AP sobre
los potenciales de acción espontáneos de NSA de conejo, evitando la activación
de IKACh, para lo cual la 4-AP fue administrada en presencia del antagonista de
receptores muscarínicos, atropina 1 µM (trazo control). En estas condiciones, la 4-
AP produjo una disminución del PDM, sin embargo sus efectos no fueron
estadísticamente diferentes a los obtenidos en ausencia de atropina (Figura 15B,
Tabla 2).
44
Figura 15. Efectos de la 4-AP (5 mM) sobre potenciales de acción espontáneos registrados en la
región central de preparaciones multicelulares de NSA de conejo. A, potenciales de acción
sobrepuestos registrados en una preparación multicelular de conejo no reserpinizado, bajo
condiciones control y 40 min después de la adición de 4-AP. B, registros obtenidos de una
preparación de conejo no reserpinizado, en presencia de atropina 1 μM (trazo control), y 40 min
después de la adición de 4-AP (4-AP). C, potenciales de acción registrados en una preparación de
conejo no reserpinizado, en presencia de propranolol 1 μM (trazo control), y después de 5 min (4-
AP 5„) y 12 min (4-AP 12„) de la adición de 4-AP. D, registros de una preparación de conejo
reserpinizado, obtenido bajo condiciones control (trazo control) y después de 5 min (4-AP 5„) y 15
min (4-AP 15„) de la adición de 4-AP. E, Registros obtenidos en una preparación de conejo
reserpinizado, en presencia de 4-AP, y 10 min después de la adición de isoproterenol 1 nM (Iso), 3
nM y 10 nM.
En la siguiente serie de experimentos, se estudió el efecto de la 4-AP en
presencia de propranolol (1 μM), bloqueador de receptores -adrenérgicos. En
estas condiciones experimentales, los efectos de la 4-AP fueron
significativamente diferentes de los encontrados en ausencia del antagonista de
receptores -adrenérgicos (Figura 15C y Tabla 2). Los efectos se desarrollaron
con un curso temporal lento, la 4-AP produjo una disminución marcada del
potencial diastólico máximo y un pronunciado aumento de la duración del
45
potencial de acción. En 6 de 10 experimentos, la 4-AP produjo la abolición de la
actividad espontánea despolarizando el potencial de membrana, hasta un
potencial entre -15 y -30 mV. Una probable explicación para estos efectos es que
la 4-AP pudiera producir la liberación de noradrenalina de las terminales
simpáticas del NSA y que, a través de la estimulación de receptores -
adrenérgicos, estuviera enmascarando los efectos bloqueadores de la 4-AP sobre
IKr e IKs. De tal manera que, cuando los receptores -adrenérgicos son
antagonizados, ahora sí se observa el efecto bloqueador de 4-AP sobre canales
de potasio.
Tabla 2. Efectos de la 4-AP sobre potenciales de acción registrados en la región central de
preparaciones multicelulares de NSA de conejos reserpinizados y no reserpinizados.
Las drogas utilizadas fueron 4-aminopiridina (4-AP), 5 mM; atropina, 1 µM; propranolol, 1 µM.
PDM = potencial diastólico máximo; ST = sobretiro; Amp. = amplitud del potencial de acción;
DPA50 = duración del potencial de acción al 50 % de su repolarización; LC = longitud del ciclo
entre potenciales de acción. Datos mostrados como M.E. E.E.; número de experimentos (n). *
Estadísticamente diferentes de su propio control, p ≤ 0.05. ** Estadísticamente diferentes de 4-AP
aplicada sola, p ≤ 0.05.
Con el fin de probar esta hipótesis, en la siguiente serie de experimentos
utilizamos preparaciones de NSA de conejo obtenidas de animales que fueron
reserpinizados 22-24 h antes de ser sacrificados. Como se ha reportado, la
reserpina produce una depleción de neurotransmisores de las terminales
simpáticas (Muscholl y Vogt, 1957; Burn y Rand, 1958). Bajo estas condiciones
experimentales, la 4-AP produjo efectos similares a los obtenidos en presencia de
46
propranolol (Figura 15D y Tabla 2): la 4-AP disminuyó el PDM, aumentó la
duración del potencial de acción y, en 7 de 11 experimentos, abolió la actividad
espontánea. Los efectos fueron completamente reversibles después de 60 min de
lavado de la 4-AP. La Figura 15E muestra los efectos de la 4-AP sobre la
actividad espontánea de una preparación obtenida de un animal reserpinizado;
después de 12 min, la 4-AP produjo despolarización de la preparación y cese de
la actividad espontánea. Posteriormente, en presencia de la 4-AP, se aplicó el
agonista específico de receptores -adrenérgicos, isoproterenol (Iso) a
concentraciones 1, 3 y 10 nM. De una manera dependiente de la concentración,
isoproterenol produjo hiperpolarización del potencial de membrana, con
recuperación de la actividad espontánea, disminución de la duración del potencial
de acción y aumento de la frecuencia de disparo (Figura 15E). Estos resultados
sugieren que nuestra hipótesis es acertada y que la liberación de noradrenalina si
se produce de las terminales simpáticas del NSA en animales no reserpinizados.
Efecto de la 4-AP sobre los potenciales de acción espontáneos registrados
de preparaciones multicelulares de la región periférica de NSA de conejo.
En trabajos previos del grupo de Boyett y Kodama, se han mostrado
evidencias de que las regiones periféricas de preparaciones de NSA de conejo
son más resistentes a la despolarización inducida por el bloqueador de IKr, E-
4031. En esta serie de experimentos, estudiamos el efecto de la 4-AP sobre la
actividad espontánea de preparaciones periféricas de NSA (región craneal,
cercana a la vena cava superior, zonas 1D y E en la Figura 8), obtenidas de
animales reserpinizados y no reserpinizados. La Figura 16A muestra registros
obtenidos en condiciones control y en presencia de 4-AP en una preparación de
conejo no reserpinizado. La 4-AP produjo un aumento significativo en la duración
del potencial de acción, en el sobretiro y en la frecuencia de disparo, mientras que
el potencial diastólico máximo no se afecto significativamente (Tabla 3). El efecto
de la 4-AP fue completamente reversible. Cuando la 4-AP fue aplicada en
presencia del bloqueador de receptores -adrenérgicos, propranolol (Figura 16B),
la 4-AP produjo una disminución significativa del PDM y un mayor incremento en
la DPA, comparando la frecuencia de disparo en presencia de propanolol 1 μM
con el control no hubo diferencia significativa. En ninguno de los experimentos la
4-AP produjo abolición de la actividad espontánea.
47
Figura 16. Efectos de la 4-AP (5 mM) sobre potenciales de acción registrados en preparaciones
multicelulares de la región periférica de NSA de conejo. A, potenciales de acción sobrepuestos
registrados en una preparación de conejo no reserpinizado, obtenido bajo condiciones control y
después de 40 min de exposición a 5 mM de 4-AP. B, potenciales de acción registrados en una
preparación de conejo no reserpinizado, en presencia de propranolol 1 μM (trazo control) y 40 min
después de la adición de 4-AP 5 mM. C, registros de una preparación multicelular de conejo
reserpinizado, obtenido bajo condiciones control y 40 min después de la adición de 5 mM de 4-AP.
En la última serie de experimentos se estudió el efecto de 4-AP en
preparaciones periféricas del NSA, obtenidas de animales reserpinizados. En
estas condiciones, los efectos que produjo la 4-AP fueron similares a los
obtenidos en preparaciones de animales no reserpinizados en presencia de
propranolol (Figura 16C, tabla 3). Estos resultados muestran que las
preparaciones obtenidas de regiones periféricas del NSA de conejo, son más
resistentes a los efectos de la abolición de la actividad espontánea que produce la
4-AP en la región central del NSA.
48
Tabla 3. Efectos de la 4-AP sobre potenciales de acción registrados en la región periférica de
preparaciones multicelulares del NSA de conejo reserpinizados y no reserpinizados.
Los fármacos utilizados fueron 4-aminopiridina (4-AP), 5 mM; atropina, 1 µM; propranolol, 1 µM.
PDM = potencial diastólico máximo; ST = sobretiro; Amp. = amplitud del potencial de acción;
DPA50 = duración del potencial de acción al 50 % de su repolarización; LC = longitud del ciclo
entre potenciales de acción. * Estadísticamente diferentes de su propio control, p ≤ 0.05. **
Estadísticamente diferentes de 4-AP aplicada sola, p ≤ 0.05.
49
DISCUSIÓN
Efecto cronotrópico negativo de la pilocarpina en NSA de conejo.
En el presente trabajo, hemos encontrado que el agonista de receptores
muscarínicos, pilocarpina, produjo un efecto cronotrópico negativo en
preparaciones multicelulares de la zona central de NSA de conejo. Los efectos
producidos por la pilocarpina sobre los diferentes parámetros del potencial de
acción fueron similares a los producidos por otros agonistas muscarínicos, como
el carbacol, en la misma preparación (Lyashkov et al., 2009). La pilocarpina, de
una manera dependiente de la concentración, produjo un aumento en la longitud
del ciclo (disminución en la frecuencia de disparo) y en el potencial diastólico
máximo, y disminuyó la duración y el sobretiro del potencial de acción. Estos
efectos fueron significativamente atenuados por el bloqueador de IKACh, tertiapina
Q. El bloqueador de If, Cs+, no modificó significativamente los efectos de la
pilocarpina.
En miocitos de NSA de conejo, la pilocarpina produjo efectos similares a
los producidos por el agonista fisiológico, acetilcolina, en esta misma preparación:
activó IKACh e inhibió la corriente marcapaso, If. Sin embargo, el efecto de
activación de IKACh fue dependiente de voltaje, mostrando mayor activación a
potenciales más positivos. Otro hallazgo experimental que debemos enfatizar, es
que la tertiapina Q, a la concentración administrada (300 nM), atenuó
significativamente (~ 80%) la IKACh activada por la pilocarpina, aunque no la abolió
del todo.
La regulación parasimpática del automatismo cardiaco es mediada por la
acetilcolina liberada de las terminales nerviosas vagales, a través de receptores
muscarínicos M2. Los mecanismos iónicos y de señalización que subyacen a la
activación de los receptores M2 y la regulación cardiaca, son aún controversiales.
Ambos, la hiperpolarización del potencial diastólico máximo y la disminución de la
pendiente de la despolarización diastólica espontánea, son observadas cuando la
regulación muscarínica de la actividad de marcapaso es estudiada en miocitos
aislados de NSA que exhiben actividad espontánea. De hecho, en miocitos de
NSA de conejo, la acetilcolina (1 µM) hiperpolariza el PDM y eventualmente cesa
la actividad de marcapaso, debido a la activación de IKACh (DiFrancesco et al.,
50
1989; Vinogradova et al., 1998). En contraste, concentraciones bajas de
acetilcolina (1 – 10 nM) enlentecen la actividad de marcapaso al disminuir la
pendiente de la despolarización diastólica, sin producir otros cambios en los otros
parámetros del potencial de acción. Esto es porque la unión de la acetilcolina a
los receptores muscarínicos activa diferentes vías de señalización en los miocitos
del marcapaso. Estas vías involucran una activación directa de los canales KACh,
una regulación negativa en la producción de AMPc y una regulación positiva en la
hidrólisis de AMPc. Los receptores muscarínicos M2 activan la subunidad de la
proteína Gi/o, la cual se acopla negativamente a la actividad de adenilato ciclasa
(Levitzki, 1986; Schimerlik, 1989). La regulación negativa de AMPc puede afectar
la actividad de canales iónicos dependientes de voltaje involucrados en la
actividad de marcapaso y revertir el proceso de señalización involucrado en la
estimulación simpática de la frecuencia cardiaca. Además, la activación de las
subunidades de la proteína Gi/o produce directamente la apertura de los
canales KACh (Wickman et al., 1994; Wickman y Clapham, 1995).
Como ya se mencionó anteriormente, existe mucha controversia sobre el
mecanismo del efecto cronotrópico negativo provocado por bajas concentraciones
de acetilcolina. DiFrancesco et al. (1989) han estudiado la sensibilidad relativa a
la acetilcolina de If e IKACh en miocitos de NSA de conejo. Estos autores han
comparado la dependencia de concentración del corrimiento que produce la
acetilcolina sobre la curva de activación de If, la activación de IKACh, y el
enlentecimiento de la actividad de marcapaso. En ese estudio, concentraciones
bajas de acetilcolina corrieron significativamente la curva de activación de If y
disminuyeron la frecuencia de disparo, en un rango de concentraciones que
supuestamente no afectó IKACh. Utilizando un razonamiento similar, se ha
comparado la sensibilidad de ICaL e If a la acetilcolina (Zaza et al., 1996). Estos
autores encontraron que la sensibilidad de If, a concentraciones bajas del
neurotransmisor, era mayor que la de ICaL. Sin embargo, cuando se estudia el
efecto de la acetilcolina sobre la actividad automática de miocitos de NSA de
conejo en presencia de bloqueadores de If, como Cs+ y zatebradina, no se abolen
los efectos de la acetilcolina sobre el NSA (Boyett et al., 1995). Por otro lado, el
Ba2+, un bloqueador inespecífico de IKACh, sí reduce significativamente el efecto
cronotrópico negativo de la acetilcolina. En estudios in silico, Boyett et al. (1995)
han sugerido que el enlentecimiento de la frecuencia de disparo producido por la
51
acetilcolina sobre el NSA de conejo es primariamente debido a la activación de
IKACh.
Recientemente, ha surgido una nueva hipótesis para explicar los efectos de
los agonistas muscarínicos sobre la actividad espontánea y rítmica del NSA de
conejo. Lyashkov et al. (2009) proponen que el reciclaje de calcio (liberación y
recaptura) por el retículo sarcoplásmico, llamado “reloj de calcio” en el NSA de
conejo, genera una liberación local de calcio rítmica y espontánea que es
dependiente de la adenilato ciclasa (AC) y de la proteína cinasa A (PCA). Esta
liberación local de calcio activa al intercambiador Na+-Ca2+, el cual genera una
corriente transmembrana, con entrada de calcio que a su vez activa otras
corrientes iónicas como ICaL e If (“reloj de membrana”). Estas acciones
concertadas modularían la actividad rítmica y espontánea del NSA, la cual
depende de la activación de proteínas Gi/o, acopladas a la AC y PCA y a la
activación de IKACh. De acuerdo a estos autores, el carbacol (CCh), no produce
activación evidente de IKACh a bajas concentraciones, y su efecto cronotrópico
negativo ha sido atribuido principalmente a la inhibición en la señalización de
Ca2+, inducido por la disminución del AMPc y la consecuente disminución de la
actividad de PCA. Sin embargo, a concentraciones altas de CCh, tanto, la
inhibición de AC-PCA como la activación de IKACh serían responsables del efecto
cronotrópico negativo. Estos autores también encuentran evidencias que les
permiten proponer que el efecto de CCh sobre If no participa en el efecto
cronotrópico negativo (Lyashkov et al., 2009).
Nuestros datos de los experimentos registrando los potenciales de acción
espontáneos en preparaciones multicelulares y de los experimentos de fijación de
voltaje en miocitos aislados, sugieren que los efectos cronotrópicos negativos
producidos por la pilocarpina pueden ser íntegramente explicados por la
activación de receptores muscarínicos M2 y la subsecuente activación de IKACh. El
corrimiento de la curva de activación de If, que produce la pilocarpina hacia
potenciales negativos, no parece participar en sus efectos cronotrópico negativos,
ya que la administración de Cs+ no afectó significativamente los efectos de
pilocarpina sobre la actividad espontánea del NSA. Por otro lado, los efectos
cronotrópicos negativos de pilocarpina fueron sólo parcialmente atenuados por
tertiapina Q, sobre todo a concentraciones bajas del agonista (3 µM). La
explicación más loable a estos resultados es que tanto la activación de IKACh como
52
la inhibición de la vía AC-PCA y el llamado “reloj de calcio-reloj de membrana”
estuvieran participando en los efectos cronotrópicos negativos de pilocarpina. Sin
embargo, para probar esta hipótesis deberán realizarse otros experimentos. Lo
que sí es claro a partir de nuestros experimentos de fijación de voltaje en miocitos
de NSA de conejo, es que la pilocarpina actúa principalmente sobre receptores
M2, activando proteínas Gi/o. Esto se manifiesta activando IKACh y produciendo un
corrimiento de la curva de activación de la corriente If hacia potenciales negativos,
aún cuando aparentemente este último efecto no incide sobre el cronotropismo
negativo.
Por otro lado, no encontramos evidencia alguna de que la pilocarpina esté
activando una corriente rectificadora tardía a través de receptores muscarínicos
M3 como se ha sugerido (Wang et al., 1999).
La diferencia más importante que hemos encontrado entre el efecto
activador de IKACh producido por los agonistas muscarínicos acetilcolina y
pilocarpina, es que este último la activa en una forma dependiente de voltaje,
mayor activación cuanto más positivo es el potencial de membrana. Previamente,
ha sido reportado que el voltaje de membrana modula la actividad de los
receptores muscarínicos M2: la despolarización de la membrana reduce la afinidad
de los receptores por acetilcolina (Ben-Chaim et al., 2003). La capacidad
intrínseca de los receptores muscarínicos para sensar el potencial de membrana
fue confirmado por los registros de corrientes de “gating”, las cuales reflejan la
reorientación de las cargas dentro del receptor en respuesta a cambios en el
voltaje (Ben-Chaim et al., 2006). Recientemente, en miocitos auriculares de gato,
ha sido reportado que acetilcolina tiene menor potencia para activar IKACh a
potenciales positivos, mientras que el agonista pilocarpina lo hace con mayor
potencia y eficacia (Moreno-Galindo, 2008; Navarro-Polanco et al., 2009).
Además, se encontró que los cambios conformacionales en los receptores M2,
inducidos por cambios en el voltaje (medidos como corrientes de “gating”) fueron
modificados dependiendo del ligando: la acetilcolina redujo el desplazamiento de
la corriente de “gating”, mientras que la pilocarpina incrementa la cantidad de
carga desplazada (Navarro-Polanco et al., 2009).
53
Efecto de la 4-AP en preparaciones multicelulares de NSA de conejo.
La probable participación de la corriente de potasio Ito en los potenciales de
acción espontáneos de NSA en preparaciones multicelulares, ha sido estudiada
aplicando concentraciones milimolares de 4-AP durante 2 min (Boyett et al.,
1998). En el presente trabajo, se estudió los efectos de la 4-AP a tiempos de
exposición mayores, 30 a 40 min. Los resultados en preparaciones obtenidas de
conejos no reserpinizados mostraron efectos similares a aquellos reportados por
Boyett et al. (1998). En presencia del antagonista muscarínico, atropina, la 4-AP
produjo un decremento en el PDM y una disminución aún mayor en la longitud del
ciclo (LC) sin embargo, no fueron significativamente diferentes a aquéllos
producidas por la 4-AP en ausencia de atropina. Estos resultados, en
preparaciones multicelulares, sugieren que, los efectos muscarínicos de la 4-AP
son enmascarados por sus efectos bloqueadores sobre distintos canales de K+ y
los efectos adrenérgicos.
En condiciones fisiológicas, la corriente de potasio de rectificación tardía,
IKr, contribuye de manera importante a la repolarización y la generación de la
actividad marcapaso en los miocitos de NSA de conejo. Durante la meseta del
potencial de acción espontáneo, la activación de IKr juega un papel importante en
la repolarización de la membrana hacia el potencial de equilibrio del K+, mientras
que, una gradual y lenta desactivación de la corriente a potenciales negativos,
durante la repolarización, junto con la activación de corrientes entrantes, son
responsables de la generación de la despolarización diastólica lenta (potencial de
marcapaso) (Mangoni y Nargeot, 2008).
En preparaciones multicelulares de NSA de conejo, ha sido mostrado que
el bloqueador específico de IKr, E-4031, produce inicialmente un aumento en la
duración del potencial de acción, una lenta despolarización del potencial diastólico
máximo y finalmente abole la generación de los potenciales de acción
espontáneos (Kodama et al., 1999). Una pregunta lógica que nos ha surgido es: sí
la 4-AP bloquea las corrientes cardiacas repolarizantes de K+, Ito, IKr e IKs, como
fue encontrado por Aréchiga-Figueroa et al. (2010), ¿por qué, al igual que el E-
4031, no abole la actividad espontánea? Nosotros sugerimos que en
experimentos con preparaciones multicelulares de NSA de conejo, un efecto
indirecto de la 4-AP podría estar enmascarando los efectos bloqueadores sobre
54
las corrientes de K+. Proponemos que este efecto es la liberación de
catecolaminas desde las terminales nerviosas simpáticas cardiacas.
En preparaciones auriculares aisladas de diferentes especies de mamífero,
ha sido encontrado que la 4-AP induce efectos inotrópicos y cronotrópicos,
positivos y negativos, posiblemente debido a la liberación de neurotransmisores
parasimpáticos y simpáticos de las terminales nerviosas (Yanagisawa et al., 1978;
Glover, 1981; Furukawa et al., 1985). Diferentes autores han documentado la
liberación de [3H]noradrenalina en preparaciones auriculares de mamífero
(Furukawa et al., 1985; Sugimori et al., 1987), y en preparaciones no nerviosas ni
cardiacas como músculo liso vascular, no vascular y bazo de gato (Johns et al.,
1976; Kirpekar et al., 1977; Kun et al., 2002).
En el presente trabajo, en preparaciones centrales de NSA de conejo no
reserpinizado, la presencia del antagonista de receptores -adrenérgicos,
propranolol, desenmascaró los efectos bloqueadores de la 4-AP sobre las
corrientes cardiacas de potasio Ito, IKr e IKs, produciendo un aumento en la
duración de los potenciales de acción, una disminución del potencial diastólico
máximo y eventualmente aboliendo la actividad espontánea. Estos resultados
sugieren la participación de receptores -adrenérgicos en los efectos de la 4-AP
en preparaciones multicelulares de NSA de animales no reserpinizados, siendo el
mecanismo probable, la liberación de noradrenalina desde las terminales
nerviosas simpáticas. Esta hipótesis se refuerza por el hallazgo de que en conejos
previamente reserpinizados, lo cual induce una depleción de las catecolaminas
almacenadas en las terminales nerviosas, la administración de 4-AP, produjo
efectos similares a los obtenidos en presencia de propranolol en animales no
reserpinizados. En el estudio de Boyett et al. (1998) probaron la posibilidad de
que en el NSA de conejo los efectos de la 4-AP fueran, en parte, resultado de la
liberación de neurotransmisores desde las terminales nerviosas autonómicas.
Estos autores compararon los efectos de la 4-AP en ausencia y en presencia de
tetrodotoxina (TTX) a una concentración de 10 nM, y encontraron que los efectos
fueron similares en ambas condiciones. Estos resultados parecerían
contradictorios a los del presente trabajo. Sin embargo, ha sido previamente
demostrado que los efectos cronotrópicos e inotrópicos de 4-AP en aurícula
aislada de mamífero son sólo parcialmente inhibidos por TTX (Furukawa et al.,
1985). En arterias de conejo, se encontró que TTX (300 nM) solo atenuó
55
parcialmente los efectos mecánicos debidos a la liberación de noradrenalina por
4-AP. Además, la 4-AP a concentraciones 1 - 10 mM, produce la liberación de
noradrenalina en rebanadas de bazo, esta liberación es espontánea, sin
estimulación eléctrica e insensible a TTX y a la concentración externa de Ca2+
(Ceña et al., 1985).
Estudios previos han demostrado diferencias regionales dentro del NSA al
bloqueo parcial de IKr por el E-4031 (Boyett et al., 1998). En el presente trabajo,
entre las preparaciones obtenidas de las zonas centrales y las periféricas de NSA
también encontramos diferencias cuantitativas en el efecto de la 4-AP sobre el
potencial diastólico máximo en conejos reserpinizados o no reserpinizados en
presencia de propranolol. En la región superior periférica del NSA, la 4-AP
disminuyó el potencial diastólico máximo pero no abolió la actividad espontánea,
como sí lo hizo en preparaciones de la zona central. La diferencia en la
sensibilidad al E-4031 de las dos regiones, ha sido atribuida a una menor
densidad de IKr en la zona central del NSA respecto a la zona periférica, lo cual
explica la mayor sensibilidad a concentraciones sub-máximas de E-4031 (Boyett
et al., 1998). Una explicación similar podría aducirse en el caso de mayor
sensibilidad a la 4-AP en la zona central comparada con la periférica. Además,
existen diferencias en densidad de Ito e IKs entre las dos regiones (Honjo et al.,
1999; Lei et al., 2001), que pueden explicar las diferencias en sensibilidad a la 4-
AP. Aréchiga-Figueroa et al. (2010) encontraron que la 4-AP (5 mM) produce sólo
un bloqueo parcial de IKr (~ 52%) e IKs (~ 60%).
De los experimentos del presente estudio se puede establecer que en
preparaciones reserpinizadas los efectos bloqueadores de la 4-AP sobre
corrientes de K+ predominan y explican el incremento marcado en la duración del
potencial de acción y la disminución del potencial diastólico máximo que
eventualmente lleva a la abolición de la actividad espontánea. Por otro lado, la
disminución de la velocidad de subida del potencial de acción, es un efecto
indirecto que resulta de la inactivación dependiente de voltaje de las corrientes de
Na+ y Ca2+, responsables de la fase de subida del potencial de acción. La
disminución en la frecuencia de la actividad espontánea causada por la 4-AP es
un efecto indirecto causado por el aumento en la duración del potencial.
En miocitos de NSA ha sido demostrado que la estimulación de los
receptores -adrenérgicos producen un incremento en las corrientes entrantes,
56
como la de Ca2+ tipo-L, ICaL, la corriente catiónica no selectiva, IST, la corriente
marcapaso, If, y también en las corrientes salientes, la rectificadora tardía lenta,
IKs, así como la bomba Na+-K+, INa-K (Himeno et al., 2008). En los experimentos en
los cuales después de parar la actividad espontánea del NSA con 4-AP, al
administrar isoproterenol a concentraciones bajas (1 – 10 nM), éste estaría
produciendo inicialmente un incremento en las corrientes salientes IKs (Matsuura
et al., 2002) e INa-K (Himeno et al., 2008), lo cual produciría una repolarización del
potencial diastólico máximo, con reactivación de las corrientes de Na+ y Ca2+ y
activación de If, lo cual a su vez reactivaría la actividad espontánea.
El uso de la 4-AP como bloqueador de la corriente transitoria de salida de
células cardiacas (Ito) y no cardiacas (IA) ha sido muy importante en la
caracterización de estas corrientes. Recientemente, en preparaciones cardiacas,
han sido caracterizadas corrientes sensibles a 4-AP (50 – 100 µM) como IKur
(Sridhar et al., 2007), y a concentraciones 1 - 5 mM como medida de Ito (Boyett et
al., 1998; Banyasz et al., 2007). Sin embargo, ya previamente se había
encontrado evidencia de la inespecificidad del efecto de 4-AP en preparaciones
cardiacas. van Bogaert y Snyders, (1982) encontraron, en fibras de Purkinje de
oveja, que 4-AP 1 mM producía un incremento en la duración del potencial de
acción, despolarización de la preparación y aumento en la actividad automática
debido, además del bloqueo de Ito, a un bloqueo de la corriente rectificadora
entrante, IK1.
57
CONCLUSIONES
Los datos obtenidos en los experimentos del presente trabajo, registrando
los potenciales de acción espontáneos en preparaciones multicelulares y en los
experimentos de fijación de voltaje en miocitos aislados, sugieren que los efectos
cronotrópicos negativos producidos por la pilocarpina pueden ser explicados por
la activación de IKACh, debido a la interacción del agonista con receptores
muscarínicos M2 a través de proteínas Gi/o.
Al igual que el agonista fisiológico, la acetilcolina, y utilizando la misma vía
receptor muscarínico M2-proteínas Gi/o, la pilocarpina, además de la activación de
IKACh, produce una disminución de If. Sin embargo, la disminución de If, no parece
participar en los efectos cronotrópicos negativos de la pilocarpina.
La diferencia más importante encontrada entre el efecto activador de IKACh
producido por la acetilcolina y la pilocarpina, es que este último la activa en una
forma dependiente de voltaje, mayor activación cuanto más positivo es el
potencial de membrana.
En lo que respecta a 4-AP, no obstante su gran utilidad como bloqueador
de Ito e IKur, se debe tener cuidado ya que produce múltiple efectos sobre las
preparaciones cardiacas. En el rango de concentración utilizada como bloqueador
de Ito (1 – 5 mM), la 4-AP además de inhibir a Ito, IKr, IKs y activar a IKACh, en
preparaciones multicelulares de NSA produce liberación de neurotransmisores
(catecolaminas) desde las terminales nerviosas autónomas, que enmascara los
efectos inhibitorios de la 4-AP sobre las corrientes de K+.
58
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