UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARiA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BIOTECNOLOGíA de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO

Dra. KEIKO SHlRAl MATSUMOTO

"DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS (AMINAS BIOGÉNICAS) PRESENTES DURANTE LA FERMENTACIÓN LÁCTICA DE DESPERDICIOS DE CAMARÓN DEL GÉNERO Penaeus sp"

932301 16

JUNIO 8, 1998 A JUNIO 24, 1999

ALUMNA JUÁREZ GRIMALDO LETlClA M ATRíC U LA LICENCIATURA INGENlERíA EN ALIMENTOS PERIODO

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a seis de septiembre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N T E, TASA ABIERTA AL TIQMPO"

1 SECRETARIO ACADÉMICO

anmi* UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México D.F., 23 de junio de 1999

Or. José Luis Arredondo Figueroa. Director de la División de Ciencias Biologicas y de la Salud Presente

Por este conducto nos permitimos informarle a usted que después de revisado el documento del informe final del servicio social "Determinación de cornpuerbos tóxicos presentes durante la fermentaci6n k c k a de desperdicios de camarón" presentado por la alumna Juárez Grimaldo Leticia con matricula 93230116 de la carrera de Ingeniería en Alimentos, le comunicamos que su contenido cubre de manera satisfactoria los objetivos planteados por el Servicio Social indicado.

Asimismo, nos pemitimos señalar que causas ajenas a nuestra voluntad en los meses de Octubre a Diciembre, ocasionaron que la conclusión del estudio sufriera un ret& de seis meses con relación a la kctra detemiinacián originalmente designada. Por tal motivo, soiicitamos atentamente que sea aceptado el informe final en el presente mes del ano en curso

Agradecemos de antemano la atención brindada al presente

Profesor titular C -

c

Dk. Edith Ponce Alquicira Profesor titular C

UNIDAD IZTAPAUPA Av. Michoacán y la Pudsima. Col. Vicentina. 09340 México, D.F., Tel.: 724-4600, Telefax: (5) 612-0885

i

INDICE

Introducción

Objetivos

Metodología

Actividades realizadas

Objetivos y metas alcanzadas

Resultados y discusiones

Anexo A {Curvas estándar)

Anexo 8 (Cálculos de resultados)

Anexo C (Resultados obtenidos)

conclusiones

Recomendaciones

Bib I iograf Ía

Pagina 1

4

5

9

10

11

19

24

30

34

35

-36

.. .

México se encuentra dentro de los principales productores de camarón a nivel mundial (70, O00 a 80, O00 ton/atio). El 34 al 45 YO de la producción corresponde a las cabezas, as cuales generalmente se tiran ocasionando problemas ecológicos. Como consecuencia de la expansión que a experimentado en los últimos años la explotación de mariscos debido al incremento de alimentos congelados y enlatados hay un aumento en productos de desecho. Estos desperdicios constituyen un serio problema ecológico debido a que por ser un material muy perecedero con un valor agregado relativamente bajo y a que el espacio en los congeladores es muy limitado y reservado para productos con mayor valor agregado, se hace poco costeable su conservación para su posterior utilización, comúnmente como harina.@

Casi en su totalidad los desperdicios de camarón sufren alteraciones por falta de métodos de conservación. Durante su descomposición se observa un incremento del pH y de sustancias vólatiles, acompañado frecuentemente de decoloración debida a la oxidación de pigmentos y a las reacciones enzimaticas endógenas Empleando el ensilado como método de conservación es posible evitar estas alteraciones. 8

Durante el ensilado es producido ácido I ~ I situ, por fermentación Iádca adictonando una fuente de rarbohidratos, siendo los microorganismos responsables de la fermentación microflora natural o bien cultivos iniciadores 8

El pnnupal prop6sito de la fermentación de alimentos es el de mejorar la digestibilidad. valor nutritivo, textura y aroma de los mismos; sin embargo la fermentación Iáctica de alimentos a sido desarrollada como un método de preservación, tomando la ventaja que tienen las bactenas Iácticas de producir una gran cantidad de ácido láctico en corto tiempo. además de permitir la producción de una Gran variedad de aromas, sabores y consistencia.8

La fermentación áciddáctica consiste en un proceso microbiano complejo en el cualtniapoblackh de bacterias Iácücas llega a ser la microflora dominante. Estas bacterias se caracterizan corno Gram (+), no esporuladas, fermentadoras de carbohidratos, su metabolismo de azucares las divide en dos grupos: homolácticas (ha de hexosa-fosfato) y heterolácticas (ruta de la pentosa fosfato), productoras de ácido láctico, ácido tolerantes, proliferan en habitats anaerobios, catalasa negativas, no m6vviies y no reductoras de nitratos. Requieren numerosos factores de cr&imiento. B

Su rápido crecimiento permite que sean en poco tiempo la población dominante, tienen propiedades antagónicas que les permite competir exitosamente con otros microorganismos.. Dicho predominio dependerá de la velocidad con que proliferen

y produzcan ácido. La reducción del pH y la remoción de carbohidratos por fermentación son las acciones principales de conservación; sin embargo, las bacterias Iácticas son capaces de producir otras sustancias inhibitorias en pequeñas cantidades. Estas sustancias son peróxido de hidrógeno, diacetilo, bactenocinas y otros productos secundarios. O

De esta manera la fermentación Iáctica representa un proceso alternativo para la conservación de desperdicios de camarón, ofreciendo paralelamente la posibilidad de recuperar otros productos de mayor valor agregado tales como proteínas, enzimas, quitina y pigmentos a partir de los mismos residuos. Sin embargo, durante está, pueden llegar a desarrollarse compuestos tóxicos y la acumulación de estos compuestos hacen al ensilado no apto para su utilización en la elaboración de alimentos balanceados para animales (pollos y animales acuáticos )8 , por lo que resulta indispensable que se determinine la producción de aminas biogénicas durante la fermentación ISctica de desperdicios de camarón.

El término aminas biogénicas se refiere a las aminas volátiles y no volátiles como: putrescina, cadaverina, histamina, tiramina. Tnmetilamina y triptamina. Químicamente las aminas biogénicas se definen como bases orgánicas de bajo peso molecular alifáticas, aliciclicas o heterociclicas y poseen actividad biológica, son formadas y degradadas como resultado de la actividad metabolica normal en animales, plantas y microorganismos. 8

Las aminas biogenicac son compuestos básicos nitrogenados fonnados principalmente por descarboxilación de aminoácidos. El proceso de descarboxilación puede proceder a traves de dos trayectorias bioquimicas: vLa descarbixilación por enzirnas endogenas (que ocurre de manera natural) 'I Por acción de enzimas exbgenas de descomposición liberadas por la microflora

Los pre-requisitos para la formación de aminas biogénicas en alimentos son:

J La disponibilidad de aminoácidos libres J La presencia de microorganismos productores de descarboxilasas J Las condiciones que permitan el crecimiento bactenano y la actividad de la

asociada con los productos del mar. O

dexcarboxilasa. Q

Los precursores de las principales aminas biogénicas involucradas con el envenenamiento en alimentos son: Histidina Q Histamina Tirosina Q Tiramina Lisina Q Cadavenna Omitina Pu!rescha Triptofano e Triptamina Q

2

Las aminas biogénicas se presentan en una amplia variedad de alimentos tales como: vinos, queso, cerveza, carne, pescado y mariscos. O 0

En el presente estudio se llevó a cabo la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón y se determinó ei efecto que tuvó la adición de un cultivo iniciador (Lactobacillus sp.) sobre la formación de compuestos tóxicos (aminas biogénicas).

3

-

s,,.w, 7

OBJETIVO GENERAL

k. Determinación e identificación de los compuestos tóxicos (aminas biogénicas) que se desarrollan durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón del género Penaeus sp por HPLC

OBJETiVOS PARTICULARES

‘b Evaluar la evolución del pH y A T (expresada como porcentaje de acido láctico) como variables de respuesta durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón.

%. Determinar el contenido de aminoácidos libres y de proteína soluble en unidades experimentales tomadas a diferentes tiempos de la fermentación láctica de desperdicios de camarón

‘b Analizar por HPLC el contenido de aminas en unidades experimentales tomadas a diferentes tiempos de la fermentación Iáctica de despeKiicios de camarón

‘b Identficx el tipo de amina presente y su concentración en unidades expenmentales tomadas a diferentes tiempos de la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón

(b Evaluar el efecto que tiene la fermentación Iáctica utilizando un cuitivo iniciador (Laclobaci/ius sp.) sobre la formación de compuestos tóxicos (aminas biogénicas).

4

MATERIA PRIMA

El desecho consistió en cabezas de camarón del género Penaeus sp., el cual fue adquirido en la central de abastos la Nueva V g a (Ciudad de México). Dicho desperdicio fue molido en un molino para came (Sanitary, E.U.A) y se almacenó en congelación (-20°C) hasta su uso posterior.

FERMENTACI~N LÁCTICA

Cultivo iniciador: Lactobacillius sp. Aislado de camarón de zonas frías, este iniciador fue inoculado en medio APT hasta una concentración de 3 g I L en peso seco (D.0 = 2.0 a 540 nm) y se inocul6 a una concentración de 5% v/p a las cabezas de camarón previamente descongeladas y adicionadas con glucosa (10% pip), se incubó a 30°C durante 96 horas.

MUESTRE0

El muestre0 se realizó tomando unidades experimentales durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarhn por 96 horas a intervalos de 24 horas, las cuales fueron almacenadas en refngeración hasta su análisis.

ANÁUSISDE LAS MUESTRAS

pH (Shirai,l999)

La detenninación de pH fue efectuada w n iairrserción directa del electrodo a las muestras utilizando un potenciómetro Conductronic pH 20 previamente estanda&adacon una solución amortiguadofa de fosfatos a pH 4 y 7.

Acidez total titulable (ATT) (Shirai.1999)

La acidez total titulable se determinó a partir de una dilución 1 : l O de la-muestra por medio de titulación potenciométrim.con NaOH 0.1 N hasta llegar a un-pH final de 8.0 - 8.2. La ATT fue expresada en porcentaje de ácido láctico

Cuantificación de aminoácidos libres por el Método de Ninhidrina (+) (Shirai,l999)

Fundamento Se basa en la reacción del grupo aamino con dos moléculas de ninhidrina Se efectua una descarboxilación oxidativa El amoniaco y la ninhidrina formados reaccionan con una segunda molécula formando un compuesto colortdo

Reactivos

Buffer de citratos pH = 5

a) 21 .O1 g de ácido citnco en 500 mL de agua

b) 29.41 g de citrato de sodio en 500 mL~de agua Se mezclan 20.5 mL de A + 29.5 mL de B y se afora a 100 mL con agua destilada., ajustar pH

c) Pesar 0.8 g de SnClz y aitadir 500 mL de buffer de citratos

d) Disolver en 500 mL de metil celosolive (etilenglicol monornetil eter) 1 O g de ninhndrina. Debe llevarse a cabo en la oscuridad.

Se mezclan las solución C y D al momento de utilizarse

f) n-propanol al 50 %

PROCEDIMIENTO

I. 1 mL de muestra I I . Aiiadir 2 mL del reactivo Ninhidnna, citratoslSnC12 50% v/v III.Agitar con vortex y calentar a baa0 maria por 20 min. IV.Adicionar 5 mL de n-propanol al 50 % rápidamente V. Mezclar y dejar reposar durante 15 min. VI.Leer a 570 nrn contra blanco

Cuantificaci6n.de proteínasoluble por el método de LowryPeterson (1977)

Fundamento: Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu para dar un complejo COloRdo azul, debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La intensidad del d o r depende del número de aminoácidos aromáticos

6

presentes y enlaces peptidicos y cambiara según la clase de proteina. solución azul muestra una absorbancia maxima a 750 nrn.

La

Preparación de las soluciones

Reactivos

a) CTE (Carbonato-tartrato de Cobre) 25 g de Carbonato de sodio 0.25 g de Sulfato de cobre O 5 g de Tartrato de Sodio y Potasio. Disolver lentamente en 250 mL de agua destilada

b) Solución de dodecil-sulfato de sodio (SDS) 25 g de SDS en 250 mL de agua destilada

c) NaOH 8 g de NaOH en 250 mL de agua destilada

Reactivo A

Mezclar a, b y c y aforar a 1 L de solución con agua destilada.

Reactivo B Un volumen del reactivo Folin-Ciocalteu con cinco volumenes de agua destilada al momento de utilizarse.

Procedimiento

I. 1 mL de muestra II. 1 mL del reactivo A agitar en vortex e incubando a 30°C por 10 minutos 111.0.5 mL del reactivo B, agitar en un vortex e incubar a 30 "C durante 30 minutos IV.Medir la absorbancia en espectrofotómetro a 750 nm (visible) contra blanco

Determinación de aminas biogénicas según Hwang et al (1995)

Fundamento Las aminas son compuestos básicos quefwman comptejos con el cloruro de benzoilo que presentan absorbancia a 254 nm y cuya absorbancia es proporcional a la concentración de aminas.

Preparación de la muestra y extracción-de diaminas 1. Moler la muestra, tomar 5 g y hornogenizar (homogenizador marca Esge) con

20 rnL de ácido tncloroacético al 7.5 O16 durante 3 min. 2. Centrifugar (centnfuga marca Beckman) a 12000 rpm, 10 min. A 4°C

7

- 3. Filtrar a través de papel Whatman No. 2 4. Transferir el filtrado a un matraz yaforar a 50 rnL 5. Derivatizar 2mL del extracto con el procedimiento descrito a continuación

Derivatización de las muestras

1. 2 rnL de cada estandar 2. Adicionar 1 mL de Hidroxido de sodio 2M 3. Adicionar 1 0 ~ L de cloruro de benzoilo 4. Mezclar en un vortex (Super Mixer) y dejar reposar por 20 rnin. 5. Para laderivatización adicionar 2 mL de la solución saturada de NaCL. 6. Extaer la arnida con 3 mL de dietil ether. 7. Centrifugar y transferir la fase orgánica (superior) a un tubo 8. Evaporar a sequedad (en rotavapor) 9. Disolver el residuo en 500pL de metano1 1 O. Analizar alicuotas de 50@

Análisis por HPLC

El análisis de aminas se realizo por un sistema de cromatografía líquida de alta resolución marca Waters, constituido por una bomba cuaternaria modelo L-6200, con un inyector rheodyne modelo 7125, acoplado a un detector de arreglo de diodos 994 manejadc. :?or un software integrador milenium II. Todos los solventes Aeron filtrados en un sistema milipore a través de una membrana de 0.45pm y desgasificados mediante el burbujeo de Helio.

Condiciones de separación

Columna de fase reversa C-18 ( 5 ~ . mx2.5r~11) Detector 254 nm Eluyente Metanol y Agua grado HPLC Flujo 0.5 m i I min.

Gradiente:

Duración (rnin) Metanol

4 55 2 80 6 80 2 50

8

Agua

45 20 20 45

Lineal

ACTIVIDADES REALIZADAS

%. Se llevó a cabo una revisión bibliografica de los fundamentos y técnicas requeridas para la elaboración del proyecto.

%.Se aprendió el manejo de los diferentes equipos necesarios para llevar a cabo de manera satisfactorio la fase experimental del proyecto, tales como HPLC y espectrofotómetro, así como de las técnicas necesarias para realizar los análisis establecidos.

%Se llevó a cabo la fermentación láctica de desperdicios de camarón del género Penaeus sp. (por triplicado) durante 96 horas con muestreo cada 24 horas.

%De las unidades experimentales obtenidas del muestreo y conservadas en refrigeración hasta su uso posterior, se determinaron pH, A n (expresada corno porcentaje de ácido láctico), contenido de aminoácidos libres por el método.de ninhidrina (+) y proteína soluble por el método de Lowry-Peterson

%Se cuantificaron e identificaron las amitias ' biogénicas presentes durante la fermentación Iáctica a partir de seis aminas estandares (Cadaveñna, Putrescina. Histamina, Tirarnina, Triptamina y Trimetilamina)

%Se analizó la relación que existe entre las variables evaluadas y se redact6 el presente reporte final.

9

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

J Cubrir el objetivo planteado al inicio de este proyecto que fue la determinación de compuestos tóxicos presentes durante la fermentación láctica de desperdicios de camarón.

J Aplicar los conocimientos adquiridos en la carrera durante la realización del presente servicio social

J Comparar el efecto de la inoculación de Lactobacillus sp (62) en desperdicios de camarón sobre los parárnetros fisicoquímicos evaluados.

J paitidpar en un proyecto biotecndogico de impacto ambiental que propone un proceso aitemativo para la conservación de desperdicios de camarón.

. . .

I O

Acidez

En esta fase se realizó un análisis de pH y acidez Total Titulable ( A m expresada como porcentaje de ácido láctico durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón (con inoculo y sin inoculo), como variables de respuesta hasta 96 horas de fermentación, con muestre0 .cada 24 horas. Dichas determinaciones fueron realizadas por triplicado, calculándose la media y desviación estándar con la finalidad de que los resultados evaluados sean más confiables. (Tablas C1 y C2, Anexo C). Se observó que el pH y la acidez total titulable obtenidos~en las repeticiones no presentaron diferencia considerable en ambos parámetros (con inoculo y sin inoculo). Para la evaluación de estas variables de respuesta se consideraron las medias obtenidas. (ver tabla C1 y C2, Anexo C).

Los datos obtenidos fueron graficados en las figuras 1 y 2 mostrando el descenso del pH con respecto al tiempo, as¡ como la cantidad de acid0 lactim producido en las muestras inoculadas y no inoculadas.

Los desperdicios de camarón inoculados presentaron una mayor acidificación (0.3837) respecto a los no inoculados (0.1864). Esto es un indicador de que las muestras inoculadas presentaron una mayor producción de ácido láctico que las muestras no inoculadas, lo cual se ve reflejado con una disminución mayor de pH favoreciéndose la conservación de las muestras (Figuras No 1 y 2)

~. ~

.~

8

7

6

5

5 4 3

2

1

O

Figura No 1 Evaiuaci6nde pH y acidez durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón (Sin inoculo, incubado a 30'C).

1

0.s

+pH +%de acidez

Figura No 2 Evaluación de pH y acidez durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón (Con 10 % de glucosa e inoculada con 5 % de Lactobacillus sp. 82 a 30°C).

.Los nnreles de ácido láctico producidos por las bacterias Iácticas presentes en los desperdicios de camarón son insoficientes para disminuir el pH a niveles que inhiban los micmorgantsmos indeseables pnnupalmente patógenos, esto puede verse favorecido con el suministro de una fuente de carbono asimilable en la forma de mono o disacarido y la adición de un cultivo iniciador para acelerarla producción de ácido láctico. 8

Adams et al (1985) obtwieron un decremento de pH, obteniendo un pH de 5.4 en 24 horas de fermentación y hasta 4.2 con 48 horas de fermentación y 4% de glucosa, un efecto similar es el reportado en el presente trabajo, donde se alcanzó después de 48 horas de fermentación de 4.79. El pH es un factor muy importante que influye en la actividad aminodescarboxilasa, ya que si se tiene un pH óptimo para la actividad de esta enzima se pueden tener concentraciones de aminas. Varios investigadores han reportado que el pH óptimo para la actividad descarbixilante es de 5 - 5.5 . 8

Con el uso de cultivos iniciadores que garanticen una rápida disminución del pH se esperaría que la desairboxilación de aminodeidos libns para formar compuestos tóxicos tales como las aminas biogénicas en alimentos fermentados también decrecerá: ya que con esto se inhibe la actividad de microorganismos indeseables principalmente patógenos, los cuales tienen actividad descarboxilante. 8

-

12

DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS NlNHlDRlNA (+)

Las aminas biogénicas son generadas como resultado de la disponibilidad de de aminoácidos libres. Los desperdicios de camarón son ncos en proteinas y la proteolisis por la actividad enzimática aumenta el contenido de aminoácidos libres y la disponibilidad de estos puede generar la formación de aminas biogénicas, por lo tanto si se tiene la presencia de microorganismos productores de enzimas dexcarboxilantes y-se .dan las condiciones que permitan el crecimiento bacteriano y la actividad de la descarboxilasa sobre los desperdicios de camarón se promueve a la formación de aminas biogénicas lo que hace al alimento no apto para su consumo. La determinación de aminoácidos libres es un indicador de la posible actividad proteolitica generada durante la fermentación Iáctica de muestras de camarón moculadas y sin inoculo. O

El contenido de aminoácidos libres en las muestras anaiizadas se determinó mediante el método Ninhidrina (+), teniéndose 6 repeticiones de cada unidad expenmental, en las cuales se analizó la media y desviación estándar (ver tabla No C3, Anexo C). Dentro de las sustancias ninhidnna (+) se encuentran además de aminoácido libres otros compuestos nitrogenados tales mmo ácidos nucieicos, nucleótidos, urea, etc.

La concentración de sustancias Ninhidnna (+) es menor a lo largo de la fermentación en las muestras con inoculo respecto a las muestras sin inocular; esto sedebe a que en las muestras inoculadas el efecto del pH favoreció la formación de agregados de proteína de elevado peso molecular, teniéndose una menor hidrólisis de las proteinas presentes en los desperdicios de camarón , por lo tanto un menor contenido de aminoácidos libres en comparación con las muestras sin inocular, lo cual disminuye la formación de aminas biogénicas. (Figuras No. 3 y 4)

DETERMINACIÓN DE PROTEíNA SOLUBLE

Se determinó el contenido de proteína soluble por el método Lowry-Peterson (1 977). haciéndose 5 repetkiiones de cada unidad experimental con las cuales se obtwo la media y desviación estándar (ver Tabla No C4. Anexo C).

En las Fiquras 3 y 4 se puede observar que et efecto de la inoculación con Lectobacülusq (82) disminuye la concentración de aminoácidos libres presentes a lo largo de la fermentación; esto se corrobora con el contenido de proteína soluble obtenida, aminas biogénicas en las muestras con inoculo será menor en relación a las no inoculadas.

lo ma l es un indicador de que la formación de

13

o U -I E - +

ii

ul

U

9 o

E

30

% 25

60 . 20

50 - / 40 4 15

30 .

20

10

10

5

O O

o

E U -I

E O 24 48 72

Tiempo (hs)

+aminodados -cprotelna soluble

96

Figura No 3 Presenua de arninohudos libres y pcotelna saluble durante la fernentauon lhchca de desperdiuos de wrnarbn (Sin inoculo)

70 30

40 .

30 .

20 - - E s

I O 0 4

10 . e P

E 5

o L ~ . .. . .. .. o O ' 24 . ~ 48 72 96

-Po (h.)

-+aminoáudos +proteína sduble

Figura No 4-P~lsencia deaminoácidos libres y proMm sokiMe durante la fermentación láctica de desperdicios de carnar6n (Con 10 % de glucosa e inoculada con 5 % de Lactobacillus sp. 02 a 30%).

14

Un contenido mayor de proteína soluble en la determinación indica que hubo una mayor hidrólisis de las proteinas presentes en las muestras, lo cual puede aumentar el contenido de aminoácidos libres que son prec:ursores de la formación de amina biogénicas. Con base a lo anterior y en función de los resultados se observó una disminución en la concentración de proteína soluble mayor para las muestras con inoculo con respecto a las no inoculadas. (Figuras 3 y 4)

Cabe mencionar que ambas determinaciones fueron rea l i das a partir de muestras tratadas con TCA al 7.5%, ya que éste juega un papel muy importante en esta fase experimental al favorecer la precipitación de proteínas de mayor peso molecular y por lo tanto dando una mayor confiabilidad a los resultados al diminuir interferencias en las determinaciones realizadas.

DETERMINACI~N DE AMINAS BIOGÉNICAS

La concentración de aminas biogénicas se determinó por el método de Cromatografia de Liquidos de Alta Resolución (HPLC) a partir de las aminas biogénicas estándares utilizadas para su caracterización (ver Tabla No A3, Anexo A) en muestras hasta 72 horas de fermentación Iactica de desperdicios de camarón con inoculo y sin inoculo con muestre0 cada 24 horas.

En los desperdicios de camarón no inoculados se observa la presencia de histamina aunque al transcurso de la fermentación la concentración va disminuyendo, obteniéndose un valor de O. 405 mgíg al final de la fermentación, también se observa la presencia de tiramina en el tiempo 24 de la fermentación (Figura No 5).

El nivel de histarnina el cual constituye un limite tóxico es incierto, su formación es muy variable 'y depende del tiempo, temperatura, tipo y cantidad de microorganismos presentes. ' El nive! de toxicidad de histamina reportado por Arnold and Brown (1 978) es de una concentración mayor de 1 mg/g de muestra.

0.05 1 B U

Tiempo (hs)

Figura No 5 Concentración de aminas bqénicas producidas durante la ferrnentaci6n táctica de desperdicios de carnar6n (Sin inoculo).

16

Investigaciones previas han demostrado que el nivel Óptimo para la síntesis de Histamina es a un pH = 5, lo cual coincide coincide con el óptimo para la actividad histidin descarboxilasa. O

~~

0.03

al U 0.025

0.02

0.01f

0.005i A

Cadaverina

Ñtrescina

Tiempo (hs)

Figura No 6 Concentración de aminas biogénicas producidas en la fermentación láctica de desperdicios de camarón (Con 10 % de glucosa e inoculada con 5 % de Lactobacillus sp. 62 a 30°C).

En general se detectaron concentraciones más altas de histamina en las muestras sin inoculo respecto a las inoculadas, las cuales solo presentaron histamina hasta 24 horas de fermentación (Figura No. 6).

En relación a las muestras de camarón inoculadas la concentración de aminas biogénicas (putrescina, cadavenna. Triptamina y mmetitamina) a lo largo de la fermentación Iáctica fue de cero y sólo se observaron pequeñas cantidades de tiramina en el tiempo 24 horas , e histamina hasta 24 horas de fermentación. Figura No. 6

Durante la preparación de alimentos fermentados se pvede esperar la presencia de muchos tipos de rnicroorganismos, algunos de ellos pueden ser capaces de producir aminas biogénicas. La introdución de cultivos iniciadores puede afectar la producción de aminas biogénicas ya sea d i o i n d i te a través de la interacción entre las diferentes poblaciones microbianas. 8

17

s-

. . . . ,,' -. . .. .. .. . .

CURVA ESTÁNDAR DE AMINOÁCIDOC

Se preparó 250 mL de una solución de aminoácidos 0.002M de cada uno de ellos, los cuales fueron triptofano, valina, arginina, asparagina, lisina, treonina, glutamina, leucina (Sigma). Se diluyó con agua destilada para preparar una serie de muestras con diferente concentracion de aminoácidos, como se muestra en la tabla No. 1. Se procede con el método de Ninhidrina (+) que se describe en metodologia

Dilución 150 Fador de dilucion 0.02 Concentración de la solución estándar = 2.3074mghL (0.02) = 46.148 pgl mL

Tabla No A l Curva estándar de aminoácidos libres.

Solución estándar

o 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1 .o

concentración Absorbancia a 570 nrn fPg/mL,J

O O

4.6148

9.2296

13.8444

18.4592

23.0740

27.6888

32.3036

36.9184

41.5332

46.1480

O. 0664 0.0724 0.1458

0.1998 0.2182 0.2692 0.2858 0.3400 0.3603 0.3782 0.4405 0.4788 0.5166 0.5454 0.5702 0.691 1 0.651 7 0.7290 0.7005

Coeficiente de correlación (r) 0.3961 Pendiente (m) 0.0157 tklenada al origen (b) -0.0078 txitción de ia recia y = 0.0157 X + 0.0078

19

X (mg de sust. Ninhidnna (+) I rnL demuestra) =LLhrnrh.inF.ia + n MU8- 0.0157

Está ecuación se toma wm6 base para obtener la concentración en mg de sustancias Ninhidrina (+) presentes en la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón. La Figura-No. A l muestra la curva estándar obtenida por el método Ninhidnna (+).

0.8

0.7 .

E

!!L " 0.4

E 0.6 i

0.5 i

.o

m

C

-

y=o.o156x-o.w55 P? = 0.9975

-~ . ~ &.- .. .~

O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Concentacián de Aminoácidos (nghnL)

Figura No. Al Curva estándar de mezcla de aminoácidos libres obtenida por el método Ninhidnna (+).

. -

20

-I- .

-

v!7 de albumina/ ml de muestra

0 10 20 ~ 3 0 40 50 60 70 -a0 90 100

CURVA ESTANDAR DE SEROALBUMINA Bovitw

Absorbancia a 750 nm

O O 0.086 0.1092 0.1842 0.1862 0.2481 0.246 0.3165 0.3467 0.4165 0.3838 0.4825 0.4572 0.5333 0.5551 0.6922 0.6252 0.7546 0.6876 0.7501 0.8127

Se preparan 250 rnL de una solución de seroalburnina bovina, Signa (proteína de calibración) con una concentración de 100 / mL (1.25 rnc. de seroalbúrnina bovina en 250 rnL de agua destilada). Se diluye con agua destilada para preparar una serie de muestras con diferente concentración de O hasta I O0 fig i rnl. . Se procede con el método de Lowy-Peterson que se describe en rnetodoiogia

Tabla No A2 Curva estándar de proteína

co n de correlación (r) 0.9945 Pendiente (m) 7.68 x1O-j Ordenada al origen (b) 0.0213 €cuacióa.dehrecta y = 7.68 x1Q3X + 0.0213

X (pg de pm8sinplml de muestra)- - n Ul.3

7.08 x10=

A partir de esta ecuación se obtuvieron las concentraciones pg de proteína soluble presentedwante h femsentaaQn . Iáctica de desperdicios de camarón (Ver anexo E).

La figura No. A2 muestra la curva estandar obtenida con el método de Lowry- Peterson.

21

. .. ~ . , . . .. -

O8

0 7

06

O 5

- O

<. ‘3 o 4

0 3

(o O2 2 2 o 1

1 y = 0.W77x R = 0.9975 + O 0213

O ~

O 20 40 60 80 100

Conantnuón de probina uglmL

!=igura No. A2 Curva estándar de seroalbumina bovina obtenida por el método de Lowry-Peterson (1 977)

22

AMINAS BIOGÉNICAS ESTÁNDARES

Los resultados obtenidos de las curvas estándar reportadas en el reporte final del servicio social "extracción de compuestos tóxicos presentes durante la fermentación láctica de desperdicios de camarón" fueron utilizados en el presente reporte para determinar los niveles de estas aminas biogénicas durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón.

Las minas estándares utilizadas para su la caracterización durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón son:

'b Putrescina

b Cadaverina

'b Triptamina

-' 'b Titamina

'b Trimetilamina

'b Histamina

El contenido de aminas biogénicas fue obtenido directamente por interpolación a partir de la ecuación de la recta obtenida para cada amina biogénica. (TablaNo. A3)

Tabla No. A3 Aminas Biogénicas estándares utilizadas en la caracterización.

Amina I Tiempo Coeficiente 0rd.nada al Pendiente &~mción da la rscta Biogenica de de origen

retención correlación V)

Putrescina 6.43 0.9965 41 1075 29707484.42 Y =29787484AyConc)

Cadaverina 975 0.9957 1852737.794 78247595.51 YPgU7585.51 ICOne)

+ 28'1029.298

+ 1852751.794

Triptamina 1 1.57 0.9968 1183958.785 145405252.7 Y-.nwasts2.7-) Trimdluninr + lt859508.785

Histamina 13.98 0.9923 1648159.716 77630322.68 Y =T1630J2288(Conc)

Tiramina 1723 0.9967 2670292018 267024 Y =29787489.42 (Conc)

+-í#8159J16

+ 267029.2018

23

ACIDEZ

Para calcular la ATT (expresada como porcentaje de ácido láctico) en la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón, los mililitros de NaOH gastados en la titulación potenciometrica fueron evaluadas en la siguiente fórmula :

% de ácido láctico = (N) ímL qastados de NaOHl írneq) f X 100 Alícuota

Donde :

N = Normalidad de NaOH (0.102)

meq = 0.09 (para el ácido láctico)

Alícuota = muestra a titular (10 mL)

f = Factor de dilución (1 : 1 O)

El calculo para obtener la concentración de las muestras se ejemplifica en el párrafo siguiente:

% de ácido IaCticO = (1.021 (0.15 mLdeNaOH) (0.09) f10l.X 100 = 1.37% de lOrnL ácido IictiCO*

De igual forfna se hacen los cálculos para todas lasmuestras anaiizadas, estos resultados se muestran en la tabla No. B1

24

.

Memcr as ue calcuIo !nexo 5 - L2

Tabla No B l Resultados obtenidos de la evaluación de acidez durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón

Muestras sin inóculo Muestras con inoculo Tiemno fhs) ¡ mL de NaOH % de ácido láctico mL de NaOH % de ácido láctico

~ r-I -I

gastados QaStados n I O 15 0.137. o1 0.092 ....~ "

o. 1 0.091 0.1 0.092 I 0.12 0.11 o. 1 0.092

24

48

72

0.5 0.5 0.5

0.8 0.8 0.8

1.55 1.2

0.459 0.459 0.459

0.734 0.734 0.734

1.42 1 .O5 1.1

3.05 3.1 3.05

3.2 3.45 3.3

3.3 3.2 3.37

2.79 2.84 2.79

2.94 3.16 3.04

3.03 2.94 3.1

96 2 1.836 4.1 3.76 2.1 ~1.927 : . . 3.9 3.58 2. 1.836 4.15 3.837

.

25

I . , 7

.* " -

,, , Memorias de colculo Anexo 8 a

Determinación de Sustancias Ninhidnna (+)

Para calcular los aminoácidos libres presentes en la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón, las absorbancias obtenidas en la tabla B2 fueron evaluadas en la ecuación de la recta obtenida a partir de la curva estándar (Figura No. A l ) para posteriormente determinar la concentración de sustancias ninhidrina (+).

La cuantificaación de sustancias ninhidrina (+) se realizó después de que las muestras fermentadas fueron tratadas con TCA , a partir de muestras diluidas. El calculo para obtener la concentración de las muestras se ejemplifica en el párrafo siguiente:

X = 20.8971pg de sustancias Ninhidnna (+)

Factordedilución

20.8971 UQ I 2000 I 1mQ = 41.7834 mg de sustancias' mL I I 1000 pg Ninhidrina (+)ig muestra

De igual forma se hacen los cálculos para todas las muestras analizadas, estos resultados se muestran en la tabla No. B2

!%norias de :alculo Anexo H

Tabla No 62 Absorbancias obtenidas para determinar la concentración de aminoácidos libres presentes durante la fermentación láctica de desperdicios de camardn, por el método de sustancias Ninhidrina (+).

a

Tiempo (hs) Muestras sin inóculo Muestras con inóculo

Absorbancia a mg de s u d N(+)/g Absorbancia a mg de oust N(+)/g 570 nm de muestra 570 nm de muestra

24

A8

72

96

0.3824 48.4968 0.3403 44.344 I 0.3817 49.6178 0.3410 44.4332

0.5808 0.5518 0.6146 0.6081 0.5679 0.5535

0.5798 0.5694 0.6085 0.6093 0.5992 0.5647

0.4881 0.4645 0.5142 0.5164 0.4636

0.3843 0.3729

74.9808 79.2866 73.3376 71.2866 78.4886 71.5032

74.8536 73.5286 77.324 78.5096 78.61 14 72.93

63.172 66.777 60.051 66.4936 60.1656

49.949 49.707

0.4077 0.4053 0.3635 0.3977 0.3998

0.4619 0.4532 0.4051 0.4103 0.4169

0.3843 0.3705 0.3817 0.3649 0.3729 0.3596 0.2919 0.2659

52.93 51.5796 51.9236 52.6242 47.2994

59.8344 53.2612 54.102 52.5988 58.7262

49.949 48.4969 47.4778 49.6178 48.191 46.8026 38.1784 38.8662

27

Memorios ce coiculo i\ÍlPXO !3

Determinación de proteína

Para calcular la concentración de proteina soluble presente en la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón, las absorbancias obtenidas en la tabla No. B3 fueron evaluadas en la ecuación de la recta obtenida a partir de la curva estandar (Figura No. A2).

El cálculo.para obtener la concentración de las muestras se ejemplifica en el párrafo siguiente:

Utilizando la ecuación de la curva estándar

X (pg de proteína/ rnL de muestra) = Absorbancia - 0.021 3 7.68 e-3

Absorbancia = 0.2582

X = 30.84~8 de proteína soluble

Factor .de dilución = & = 500 51 1

30.8463 Da I 1000 I lmq = 30.84 rng de proteína soluble' m i 1 ~1000 pg

.De igual forma se hacen los cálculos para todas las muestras analizadas, estos resubdos semuesttan en la tabla No. 83

28

Tabla No B3 Absorbancias obtenidas para determinar concentración de proteína soluble por el método de Lov-Peterson durante la fermentación Iactica de desperdicios de camarón.

Tiempo (hs)

O

24

48

72

96

- Muestras sin inóculo Muestras con inóculo rosotoancia a 750 m g de proteína SOIUDIW tiosoroancla a m g oe proreina

750 nm soluble/ rnL de nm rnL de muestra

0.2582 0.2383 0.2629 0.2204

0.2251 0.2538 0.2460 0.2179

0.1854 0.1940 0.1847 0.1874

0.1734 0.1792 0.1916

-

0.1895 0.1829 0.1616 0.1724

30.84' 28.25 31.46 25.93

26.53 30.27 29.26 25.6

0.2327 0.2571 0.2133 0.2563

0.1847 02171 0.1895 0.1926 0.2188

21.37 O. 1946 22.48 0.1969 21.48 0.2026 21 53 0.1872

19.8 0.2007 20.56 0.1933 22.17 0.1685

0.1661 -0.1853

muestra 27.53 30.7 25 30.6

21.27 25.5 21.9 22.3 25.71

22.56 22.86 23.6 21.6

23.36 22.4 19.17 18.86 21.36

-

-

21.9 0.1413 15.62 21.04 0.1378 15.17 18.27 O. 1426 15.8 19.68 0.1540 17.28

29

, ,, d

Tiempo (hs) i 1 , 4 Mediciones üesviación Mediciones de Desnación

de pH de las Media esiandar pH de Media estándar muesfras las muestras

1 s/inocuio c / inóculo O I 7.49 7.49 O 7.5 7.515 0.0212

24

48

72

7.49

5.83 5.7 5.63 5.64

-

5.57 5.69 5.65 5.87

5.14 5.14 5.14

7.53 -

0.112 4.84 4.76 4.71 4.73

0.0493 4.31 4.44 4.53 4.49

0.1553 4.74 4.62 4.57 4.55

O 4.22 4.45 4.37

96

5.14 4.79 ''9 :i '+ :13:~

30

0.67

0.1172

0.1044

0.2955

Tabla No. C2 Resultados de la evaluación de A T durante la fennentación Iáctica de desperdicios de camarón

I ' I < I I '*. Tiempo

fhs)

O /l)'q"

24

Unidades Media Dasviacidn Unidades Medía Desviación a n d a r Luperímentales -tindar experimentales

s /inoculo c /inoculo 0.137 2.27x10-' 0.092 0.092 0.091 0.092 0.11

0.459 0.459 0.459

O 734 0.734 0.734

1.42 1 .O5 1.1

1.036 1.927

0.092

0.459 O 2.79 2.82 2.04 2.79

0.734 O 2.94 3.04 3.16 3.04

1.19 0.02 3.03 3.1 2.94 3.1

3.76 3.837 3.50

1.864 4.8 x ~ ~ - 3

O

0.002

0.01 1

0.02

0.03

. - ~ ~ , : 1 ~ ~

, ., .. ~.

. . . -- Tabla No. C3 Resultados de la determinación de sustancias Ninhidnna (+) durante la fermentación Iactica de desperdicios de camaron.

Tiernpc

48

P - 72 P

Medl8 Duvllcián eSt4nd.r

M d i s Duvircidn Muestras dinoculo edndar

Muestras siinoculo

mg suit N(+M m u u b . ig sust N(+Kg m u m 41.7834 41.8249 0.9898 63.172 62.2612 1.4605 53102 63.172

~~

39.5914 43.5414

74.9808 79.2866 73.3376 71.2866 78.4886 71.5032

74.8536 73.5286 77.324 78.5096 78.6114 72.93

63.172 66.777 60.051 66.4936 60.1656

49.949 49.707

74.8089 2.0434

7419595 2.9789

63.3318 11056

49.4427 4.1039

61.898 60.8026

52.93 51.5796 51.9236 52.6242 47.2994

59 8344 53.2612 54.102 52.5988 58.7262

49.949 48.4969 47 4778 49.6178 48.191 4 6 W 6

38.1784 38.8662

51.2714 3.1331

55.7045 2.7488

48.4225 2.9217

40.4555 0.5594

48 4968 44.344 49 6178 44 4332

.

32

. . -

Tnbla No. C4 desperdicios de camarón.

Deteminación de proteína soluble durante la fermentación Iáctica de

Tiempo íhs)

O

24

48

72

9s

ig de proteína / Media D.+viwción pg de proteína / Media ml de muestra artlndwr mi de muestra

D-viacibn d n & r

(s / inoculo) c / inoculo 30.84 29.12 2 5 4 27.53 28.46 2.73 28.25 31.46 25.93

26.53 27.91 30.27 29.26 25.6

21.37 21.69 22.48 21.28 21.63

19.8 20.84 20.56 22.17

-

21.9 20.22 21 .o4 18.27 19.68

.

30.7 25

30.6

2.2 21.27 23.34 25.5 21.9 22.3

25.71

0.54 22.56 22.65 22.86 23.6 21.6

-

1.21 23.36 21.03 22.4 19.17 18 86 21.36

1.59 15.62 15.96 15.17 15.8

17.28

2.57

0.82

1.97

0.914

1 , ~ , . . >'Ui , , I./*__

~ ..tjfir I ti511>:?~

CONCLUSI~N

Los resultados obtenidos muestran que la fermentación Iáctica controlada puede considerarse como un proceso alternativo para la conservación de desperdicios de camarón.

La inoculación de un cultivo iniciador es un factor crítico que influye favorablemente al disminuir la formación de aminas biogénicas durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón

La concentración de histamina en las muestras inoculadas con respecto a las no inoculadas, presentó una disminución considerable hasta nulificar su presencia en el ensilado después de 48 horas de fermentación, por lo que la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón aumenta su vida de anaquel y evita la formación de compuestos tóxicos (aminas biogénicas); haciendo apto al ensilado para ser utilizado en la formulación de alimentos balanceados para animales(pol1os y animales acuáticos).

34

RECOMENDACIONES

Los objetivos planteados al inicio del proyecto consideraban solamente la determinación de compuestos tóxicos presentes durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón por HPLC y la evolución de los mismos con de terminaciones tales como pH y acidez. Sin embargo, para interpretar con mejores bases estos resultados se incrernentaron dos análisis más: Determinación de arninoácidos libres y proteína soluble, ya que la presencia de estos dos constituyentes y su variación son puntos críticos en la evaluación la formación de aminas biogénicas y la influencia sobre estos parámetros de la adición de un cultivo iniciador (iacfobaci//us sp. 62) durante la fermentación Iáctica controlada.

Sin duda alguna el análisis reaiizado presenta datos bastante confiables; sin embargo, para poder ampliar la investigación y aunar más datns que corroboren los aquí expuestos podrían llevarse a cabo los siguientes estu. .s:

%Identificar los arninoácidos libres presentes durante la fermentación Iáctica de desperdicios de camarón

%Aislar e identificar los diferentes géneros de bacterds que pudieran estar presentes durante la fermentación Iáctica que -7gan capacidad descarboxilante de acuerdo a datos reportados en bibliografia

Q+EvaIuer -ei +fe& de la fermentación láctica sobre los microorganismos responsables de la formación de aminas biogénicas

'b En la determinación de aminas realizar cuidadosamente la derivatización, ya que los compuestos obtenidos son muy inestables y pueden ocasionar errores expenmentales

b Utilitaren laextracción con TCA un tarnafio de muestra más homogéneo y representativo

34

BIBLIOGRAFíA

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Nombre Matricula Licenciatura

Juárez Gnmaldo Leticia 932301 16 Ingenieria en Alimentos

i d ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ó ~ DE COMPUESTOS TÓXICOS (AMINAS BIOGENICAS) PRESENTES DURANTE LA FERMENTACI~N LÁCTICA DE DESPERDIC~OS DE CAMARON DEL GENERO PENAEUS SP"

Fecha de inicio08 de Junio de 1998 Fecha de terminación23 de Junio de 1999

Asesores Dra. ~Keiko Shirai Matsumoto Profesor Titular C Dra. Edith Ponce Alquicira Profesor Titular C

RESUMEN

Las bacterias Iácticas están presentes en forma natural en los desperdicios de camarón Su rápido crecimiento permite que sean en poco tiempo la población dominante ya quc tienen propiedades antagónicas .que les permiten competir exitosamente con otror micrwrganismos, dicho predominio dependerá básicamente de la velocidad con quc proliferen y produzcan ácido.

En el presente estúdio.se llevó a cabola fermentación Iáctica de desperdicios.de camarór del género Penaeus sp , en muestras donde fue adicionado un cukivo iniciador (5% de Lactobacillus sp 82, 10% de glucosa a 30%) respecto ~a un control (sin inoculo), sc determinaron patametros -tales como -pH. ~ATryexpresada como porcentaje de ácidc láctico). concentración de aminoácidos l i e s por el método de ninhidnna (+) concentración de proteína soluble por el método de Lowry-Peterson y presencia de aminas 5ogénicas por HPLC para deteminar~el efecto del cultivo iniciador sobr re Is formaciorr de compuestos tóxicos (Aminas biogenicas) prescntes~ ~ en la fermentaciór Iáctica de desperdicios de &marón. Estos efectos estan relacionados con el efectc antagónico de las bacterias lacticas contra micrwrganismos indeseaoles principalmente

El efecto de la inoculación de Lactobacilluis sp. Sobre los desperdicios de camarór disminuyó la formación de histamina que fue la principal amina encontrada durante e análisis. eliminando su presencia del ensilado después de 48 horas de femntación

La fenentauon Iáctica de desperdicios de camarón representa uM' buena alternativz para aumentar la vida de anaquel de los residuos de camarón, al modificar el materia proteico en condiciones poco severas formando agregados ~pmteicos 'de mayor pesc rndecutaf lo que contribuye a la pérdida de humedad y a la firmeza característica de lor alimentos fementado, además de inhibir con la disminución rápida del pH la actividad dc enzimas descarboxiiantes. De esta manera el ensilado de residuos- de camarón puede sei utilizado en la elaboración de alimentos balanceados pam-animaks (pollos yanimaler acuaticos) sin representar algún riesgo por intoxicación de aminas biogénicas.

patógenos. . .

. ~

.~

~.