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TRABAJO PRACTICO N° 5. GLICÓSIDOS.

Objetivos

- Conocer y ensayar las reacciones básicas generales que permiten identificar rápidamente los diferentes núcleos químicos de los glicósidos en el laboratorio.

- Interpretar las reacciones de reconocimiento y los métodos de cuantificación de modo de obtener suficientes elementos para poder resolver la identidad y concentración en muestras incógnitas.

Habilidades

- Capacidad para el manejo del equipamiento de laboratorio útil para la extracción de los principales componentes químicos de importancia en Farmacognosia.

- Capacidad para la identificación cualitativa de los diferentes grupos de importancia en Farmacognosia.

Actitudes

- Disposición al trabajo en equipo. - Responsabilidad durante el trabajo en equipo dentro y fuera del laboratorio. - Tolerancia. - Apertura al diálogo y a la crítica.

Introducción

Los glicósidos son compuestos que resultan de la combinación del grupo reductor de un azúcar con una sustancia de naturaleza distinta, con eliminación de una molécula de agua.

Clasificación según la naturaleza de la unión

1) O-Glicósidos

Ej: rutina en la ruda.

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2) S-Glicósidos

Ej: glicósidos de la mostaza negra

3) N-Glicósidos

Ej: bases púricas

4) C-Glicósidos

Ej: glicósidos del aloe

Nomenclatura: se los denomina como Glicósidos. Si el grupo azucarado es glucosa, solo en ese caso, se hablará de glucósidos. Generalmente el nombre de glicósido se basa en la planta de origen. Ej.: el glicósido de Ruta graveolans (ruda) se denomina “rutósido”.

Clasificación según la estructura química:

1) O-Glicósidos

a- Alcoholes simples: Ej.: cianoglicósidos (amigdalinas en almendra amargas). b- Fenoles simples derivados: Ej.: arbutina en Uva ursi. c- Antraquinonas: formado por polifenoles con núcleos antracénicos (antraquinonas

propiamente dichas, antronas, antranoles). Ej.: sen. d- Lactonas: glicósidos de la cumarina como la esculina. Ej.: castaño de indias. e- Flavonoides: derivados de la fenilbenzopirona. Ej.: rutina.

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f- Esteroides: Cardiotónicos Saponósidos Glicoalcaloides

2) S-Glicósidos: Ej.: glucosinolatos en las Brassicaceae.

3) N-Glicósidos:

a- Bases púricas: Ej.: adenina, guanina. b- Bases pirimídicas: Ej.: citosina, uracilo.

4) C-Glicósidos: resistentes por la unión C-C, estable a la hidrólisis, como las aloínas.

Caracterización y dosaje de los Glicósidos

Para la caracterización y dosaje de los glicósidos, una vez extraídos se procede primero a hidrolizarlos a través de un procedimiento ácido o enzimático y luego se analizan el hidrato de carbono (glicón o glicona) y el aglicón (o genina) por separado. Los hidratos de carbono se identifican cuali y cuantitativamente a través de métodos cromatográficos (en papel, en capa fina de celulosa microcristalina o en cromatografía gaseosa previa derivatización para que resulten volátiles), electroforesis, colorimetría. Los aglicones se pueden identificar por reacciones características de acuerdo al grupo químico, por cromatografía y, al igual que los carbohidratos, recurriendo a métodos espectroscópicos (UV-Vis, MS, IR, RMN). A continuación se detallan los principales núcleos químicos que estudiaremos y sus reacciones características:

Cardenólidos: Ej.: digital, estrofanto, laurel rosa (butenólidos)

Bufadienólidos: Ej.: escila (pentadienólidos)

Esteroides: Ej.: digital, ágave

Triterpénicos: Ej.: polígala, regaliz

Alcaloides de algunas Solanaceae. Ej.: solanidina

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Glicósido Núcleo Químico Reacción de identificación

Fundamento

Ciano

Amigadalina

Guignard Autohidrólisis enzimática con liberación de HCN, el cual reacciona con el reactivo de Guignard (picrato de sodio, amarillo) reduciéndolo a isopurpurato (rojo).

Quinonas

Bornträger Las antraquinonas generan color rojo en medio acuoso alcalino merced a la disolución debida al estado de resonancia de los –OH fenólicos. Requiere que el núcleo antraquinona esté libre. En el caso de los glicósidos, es necesario una hidrólisis previa y la posterior extracción de las agliconas en medio orgánico (generalmente benceno o tolueno) previo a la reacción.

Flavonoides

Shinoda (Zn/HClcc)

En presencia de zinc y medio ácido fuerte dado por HClcc, se genera hidrógeno, produciendo por reducción el ión flavilio de color rojo escarlata (varía desde rosa muy débil hasta rojo escarlata).

Todos los flavonoides, excepto chalconas, auronas e isoflavonas, dan positivo.

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Taninos

Reacción con gelatina o con alcaloides

Los taninos precipitan las proteínas o los alcaloides en solución. Originan desde opalescencia hasta precipitados.

Esteroides Cardiotónicos Cardenólidos

Liebermann-Burchard (L-B) Kedde (K)

-L-B: los requerimientos estructurales que debe tener el núcleo para dar la reacción son un sustituyente –OH en posición 3 (libre o glicosilado) y además un doble enlace en el anillo A o B; o bien debe poder formar un doble enlace en A o B por deshidratación generada por el H2SO4 (principalmente en C5-C6 o en C4-C5). La aparición de un color verde que varía hasta el azul petróleo indica reacción positiva. -K: en presencia de ácido 3,5-dinitrobenzoico y en medio alcalino en solución alcohólica, la aparición de color azulado, rosa hasta violáceo indica reacción positiva debido a la presencia de una lactona butenólida (α-insaturada).

Saponinas Por hidrólisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona llamada genéricamente SAPOGENINA, la cual puede tener un núcleo esteroide o triterpeno.

- Poder tensioactivo - Poder emulsificante - Liebermann-Burchard (para el núcleo químico)

Poder tensioactivo: se disuelven en agua caliente y disminuyen la tensión superficial de ésta; por lo tanto, al agitar sus soluciones, se formara una espuma abundante relativamente estable. Se considera positiva cuando la

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espuma es = o mayor a 0,5 cm, es estable hasta 5 minutos y perdura 15 minutos o más con poca disminución de la altura. Poder emulsificante: por su propiedad tensioactiva, al estar en contacto con un solvente orgánico forma emulsiones. Núcleo químico: - si la reacción de L-B da verde hasta un azul petróleo, indica reacción positiva para esteroide. - Si L-B da desde amarillo naranja hasta pardo amarronado, es positiva para triterpenos.

flavolano hidroquinona

diosgenina aureusidina

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GLICOSIDOS I. CIANOGLICOSIDOS Y QUINONAS.

OBJETIVOS

- Desarrollar destrezas en el estudio y control de drogas vegetales medicinales que contienen cianoglicósidos y de aquellas que contienen quinonas.

- Aplicar conocimientos fitoquímicos al estudio de fitoterápicos enriquecidos con quinonas.

INTRODUCCION

1- CIANOGLICOSIDOS

Existe una variedad de almendras, llamada Prunus amygdalus var. amara (Rosaceae), conocida como almendras amargas que resulta toxica para el organismo, por lo que no se deben consumir. A diferencia de las almendras dulces, poseen una sustancia llamada amigdalina. Cuando se mastica una de estas almendras se ponen en contacto dicha sustancia con la saliva y la emulsina; esta última es una enzima β-glucosidasa que actúa fraccionando la amigdalina en β-D-glucosa (hidrato de carbono), benzaldehído (responsable del sabor amargo) y ácido cianhídrico (HCN). El ácido cianhídrico es el responsable de la toxicidad, siendo la dosis mortal de unas 20 almendras para los adultos y 10 para los niños. En la siguiente figura se esquematizan las rupturas que se producen en la amigdalina por acción de la emulsina y la saliva al ingerir almendras amargas:

2- QUINONAS

Las quinonas son un grupo de metabolitos secundarios naturales que poseen un núcleo dicarbonilo con una funcionalidad o- o p-quinoide, principalmente esta última. A continuación se presentan algunos de los principales tipos de quinonas:

Amigdalina β-D-glucosa Ácido cianhídrico

Benzaldehído

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De todas las quinonas, las antraquinonas y compuestos relacionados son las de mayor distribución en los recursos naturales, siendo además de amplia utilización en Salud. Varios glicósidos relacionados con el antraceno se hallan presentes en drogas como la cáscara sagrada, frángula, aloe, ruibarbo y sen. La mayoría de estas drogas se usan como laxantes y/o catárticas. Por hidrólisis estos glicósidos dan agliconas que son en general di, tri o tetra hidroxiantraquinonas, o modificaciones de estos compuestos. En los materiales vegetales también existen glicósidos de antranoles y antronas, derivados reducidos de las antraquinonas. Estos contribuyen a la acción terapéutica de los productos naturales, aunque generan toxicidad debido a la potencia de su acción. Las agliconas antraquinónicas libres exhiben menor actividad terapéutica.

Nomenclatura. Se les denomina comúnmente con nombres vulgares con la terminación “INA” en el caso de las agliconas, u “OSIDO” en el caso de los glicósidos. La IUPAC establece que para nombrar estas sustancias se debe asignar la palabra terminal “ANTRAQUINONA”, precedida de los correspondientes substituyentes y siguiendo la enumeración mostrada en las fórmulas que se presentan más abajo. De acuerdo con esto, el nombre IUPAC por ejemplo para la aloe-emodina será: 1,8-dihidroxi-3-hidroximetilénantroquinona. Para el glucofrangulósido-A, el nombre IUPAC es: 6-O-ramnosil-8-O-glucosil-1-hidroxi-3-metilantraquinona. Clasificación de los compuestos antracénicos. Pueden clasificarse según su estado de oxidación en siete grupos estructurales:

a. Antraquinonas b. Antronas

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c. Diantronas d. Antranoles e. Oxantronas f. Naftodiantronas g. Antrahidroquinonas

Núcleo fundamental:

Formulas importantes:

Antraceno Antraquinona

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PARTE PRÁCTICA

1- Ensayar las siguientes reacciones sobre el patrón y la plantas en estudio (Fracción A, Fracción B, Infuso o drogas secas y molidas, según corresponda).

a) Reacción de GUIGNARD: reacción con papel picrosódico de Guignard. Colocar el material vegetal a estudiar, droga seca reducida a polvo, en un tubo de ensayo. Añadir 4 gotas de CHCl3 (para estimular la degradación de amigdalina en ácido cianhídrico), y en la parte superior del tubo colocar un papel de filtro previamente embebido en solución de picrato de sodio y secado, sosteniéndolo con un tapón, evitando que el papel toque las paredes del tubo. Dejar a 35 °C durante 3 h. El papel debe pasar de amarillo a rojo para que la prueba se considere positiva. Antes de informar resultado negativo, se deberá dejar la reacción durante al menos 24 h. Reactivo: picrato de sodio, que se prepara mezclando 10 ml de NaOH al 10 % con 0,5 g de ácido pícrico. Con este reactivo se embeben tiras de papel de filtro y se secan al abrigo de la luz. Se puede utilizar hasta por 4 meses.

b) Reacción de BORNTRÄGER: se trabajará con la Fracción B de la planta en estudio y

con el patrón. Se tomaran 3 alícuotas de 1 ml cada una y se procederá de la siguiente forma:

En la primera alícuota, se agregará directamente 1 ml del reactivo de BORNTRÄGER (NaOH al 5 %). Observar el color de la fase acuosa. Detecta la presencia de antraquinonas libres y oxidadas. Resultado (+): fase acuosa roja, amarilla o amarilla anaranjada con fluorescencia roja. En la segunda alícuota, agregar unas gotas de ácido nítrico fumante; a continuación, añadir 1 ml del reactivo de BORNTRÄGER (NaOH al 5 %) y dejar unos minutos para que se mezclen gradualmente. La aparición de color rojo en un tiempo no mayor a 30 minutos, indica el resultado positivo. Detecta la presencia de derivados de antraquinonas reducidos. En la tercer alícuota, agregar 1 ml de HCl y 1 ml de FeCl3 al 2 %, calentar a Baño María (100 °C) durante media hora. Posteriormente agregar 1 ml del reactivo de BORNTRÄGER (solución de NaOH al 5 %). Observar la aparición de color rojo en la fase acuosa alcalina. Detecta la presencia de dímeros (y de C-glicósidos si se tratara de un extracto o fracción de mayor polaridad). Para informar un resultado negativo dejar en reposo hasta 48 h. 2- Análisis de quinonas mediante cromatografía.

Acíbar: según Wagner – Bladt (1996), pag. 62 – 63. (Ver libro y comparar los resultados) Cromatofolio con las medidas adecuadas.

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Fase estacionaria: sílicagel 60 HF254 (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:13,5:10). Marcador: quercetina. Muestras: acíbar purificado (Ap); Fracción B de las plantas en estudio (B). Procedimiento: siembra en banda de 2-3 mm, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: 1- se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante luz visible, luz UV-365 nm y luz

UV-254 nm. 2- A continuación el cromatograma será rociado con el reactivo KOH metanólico al 10 %,

seguido de observación al visible y al UV-365 nm.

Informe de los resultados: calcular los Rf en cada revelado y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía.

3- Aplicación en la Oficina de Farmacia.

3.1- Concurre a su farmacia una mujer embarazada de 6 meses de gestación y le consulta sobre la cáscara sagrada para tratar su problema de constipación.

a- ¿Cómo actuaría ante esta situación?

b- ¿Qué consejos le daría?

3.2- El medicamento Medilaxan granulado contiene entre sus componentes: mucílago de llantén, sennósidos A y B.

a- ¿Cómo actúa cada uno de sus componentes?

b- ¿Qué cuidados, contraindicaciones y/o efectos adversos poseen?

c- Complete el origen botánico de las drogas componentes.

INFORME DE LAS ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Para cada uno de los grupos de glicósidos se deberá confeccionar un informe en el que constarán:

drogas investigadas (nomenclatura y parte usada); metodologías de extracción; reacciones, fundamento de las mismas, resultados obtenidos; resultados de cromatografías cuando corresponda; conclusiones a las que arribó.

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BIBLIOGRAFIA

- Domínguez, X.A. Métodos en Investigación Fitoquímica. México 1985. - Harborne, J.B. Phytochemical Methods, 2º Ed.; Chapman and Hall, 1991.

- Wagner; Bladt. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas”, 2° Ed.; Springer – Verlag: Berlín, Alemania, 1996.