TRABAJO PRÁCTICO N° 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Objetivos:

-Conocer las metodologías actuales de control y eliminación demicroorganismos.

-Obtener dominio de los métodos básicos de esterilización y desinfección.

-Conocer los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio y lasdiferentes metodologías para el cultivo de microorganismos.

-Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo demicroorganismos de interés agropecuario.

-Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin defomentar una eficiente labor grupal.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Definición: mezcla balanceada de los requerimientosnutritivos que tienen los microorganismos aconcentraciones tales que permiten el buencrecimiento de los mismos.

Composición química: base mineral, fuente decarbono, fuente de energía, fuente de nitrógeno yfactores de crecimiento si son necesarios.

Medios de cultivo

• Líquido (caldo)

• Semisólido (0,2 % agar)

• Sólido (1- 2 % agar) Por el estado físico:

• Sintético o químicamente definido

• Complejo o químicamente indefinido

Por su composición química:

• Generales

• Selectivos o inhibitorios

• Diferenciales

Por su uso en el laboratorio (función):

Clasificación de los medios de cultivos

Medio general Medios diferenciales y selectivos

Ejemplos de tipos de medios de cultivos

Medio líquido Medio sólido Medio semisólido

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD

Fuente de

C y

energíaSucrosa 20 g

Base

mineral

Fosfato di potásico 0,05 g

Fosfato

monopotásico

0,15 g

Cloruro de calcio 0,01 g

Sulfato de

magnesio

0,2 g

Molibdato de sodio 0,002 g

Cloruro férrico 0,01 g

Carbonato de

calcio

0,1 g

Agua Agua destilada 1000 mL

pH = 7

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD

Fuente de C

y energía

Almidón 12 g

Fuente de N NaNO3 0,5 g

Base

mineral

K2HPO4 1,0 g

MgSO4 7 H2O 0,5 g

Agente

solidificante

Agar 15 g

Agua Agua destilada 1000 mL

pH = 7

Medio selectivo: Fijadores de NitrógenoMedio general

Medios de cultivo: composición

encendercolocar recipiente

para pesartarar

colocar el componente a pesarregistrar la lectura

Preparación de un medio de cultivo:1. pesar los componentes sólidos

componentes sólidos agregar agua destilada

Preparación de un medio de cultivo:2. hidratar

soluciones reguladoras encendido y lavado lectura

lavado del electrodoprotección del electrodo

Preparación de un medio de cultivo :3. Regular pH

agregar agar fundir al calormedio líquido

medio agarizado

Preparación de un medio decultivo sólido: clarificación

Preparación de un medio de cultivo:Fraccionar en tubos, acondicionar y esterilizar

Fraccionamiento y acondicionamiento

Esterilización en autoclave

Medios de cultivo estériles

Medio líquido Medio sólido en

caja de petri

Tubo pico de

flauta

ESTERILIZACIÓN

Esterilización es el proceso por el cual se destruyen o remueven las células vivas, esporas de hongos,

endosporas bacterianas, virus y viroides mediante el uso de agentes físicos o químicos.

Desinfección es un proceso que destruye o inhibe solo los microorganismos más sensibles.

Esterilización y desinfección

Métodos de esterilización más comunes:

• Calor húmedo

• Calor seco

• Filtración

• Radiaciones

Métodos físicos

• Sustancias líquidas y gaseosasMétodos químicos

Métodos físicos: Calor húmedo

• Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica

• Vapor de agua a presión atmosférica

Calor húmedo

Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica

Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica

Vapor de agua a presión atmosférica (Tindalización)

Funcionamiento:

Consiste en exponer el material aesterilizar, a los vapores del agua enebullición. Este proceso se puede llevar alcabo en el autoclave dejando la válvula deescape abierta (espita).

Combinación temperatura-tiempo:

80-90ºC / 30 minutos durante tres díasconsecutivos. Se incuba a 37ºC durante 24hs entre cada calentamiento.

Métodos físicos: Calor seco

• Hornos o estufas de esterilización

• Flameado

• Calor al rojoCalor seco

Hornos o estufas de esterilización

Combinación temperatura-tiempo:

160ºC / 2 horas o 180 ºC / 1 hora

Características:

Recipiente rectangular, de doble pared,entre las cuales puede haber aireestático u otro material aislante como lalana de vidrio.

Hornos o estufas de esterilización

Material que se puede esterilizar:

Cajas de petri, pinzas, material deporcelana, material de vidrio resistente alcalor, etc.

Funcionamiento:

Convección. La acción letal es resultadodel calor conducido por el material quetoma contacto con los microorganismos.

Flameado

Consiste en sumergir en alcohol el material a esterilizar(puntas de bisturís, varillas de vidrio, espátulas de vidrio,cucharas, etc.) y luego pasarlo por la llama de mecheros.

Calor al rojo

Consiste en colocar materiales metálicos sobre la llama deun mechero hasta que alcancen color rojo vivo. Se utilizapara esterilizar instrumental metálico (puntas de ansas,agujas, pinzas, etc.).

Métodos físicos: Filtración

logra en base al pequeño tamaño de los

poros del filtro y en parte a la adsorción de

las paredes del poro debido a la carga

eléctrica del mismo y de losmicroorganismos.

Métodos físicos: Radiación

- Porción UV del espectro (200 y 300 nm).

- Se utilizan lámparas de vapor de mercurio.

- Radiaciones con escasa capacidad para poder penetrar

los materiales.

- Mecanismo de esterilización: formación de dímeros de

timina, causando alteraciones importantes en la transcripción

y replicación del ADN.

- Rayos gamma: radiaciones emitidas por isótopos

radiactivos, como el cobalto (60Co) o el Cesio (137Cs), ambos

productos colaterales de la fisión nuclear.

- Mecanismo de esterilización mediante acción letal contra los

microorganismos al alterar el ADN.

- Se utiliza para esterilizar y descontaminar materiales de uso

médico y de la industria alimentaria.

Radiaciones no ionizantes Radiaciones ionizantes

Métodos químicos

• Modo de acción: a) lesión de la membrana celular (detergentes), b) desnaturalización de proteínas (alcohol), c) modificación de grupos funcionales de las proteínas (agua oxigenada) y / o daño en los ácidos nucleicos, entre otros.

Productos químicos

Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes

actividades:

1. Preparación de medios de cultivo generales

- preparar 50 mL de medio de cultivo sólido general (agar

nutritivo) y 25 mL de medio de cultivo general líquido (caldo

nutritivo).

- fraccionar el medio de cultivo sólido: 15 mL de medio en cada

tubo de ensayo (para cajas de petri) y 5 mL en cada tubo de

ensayo (para tubos pico de flauta).

- rotular

- acondicionar para esterilizar

- esterilizar

Trabajo de Laboratorio:

2. Preparación de cajas de petri y picos de flauta

- Colocar el medio de cultivo sólido preparado en cajas de petri

y colocar los tubos para pico de flauta inclinados sobre la

mesada hasta su solidificación.

3. Siembra de microorganismos del suelo

Trabajando en condiciones de asepsia:

- colocar un gramo de suelo (utilizando el suelo oreado y

tamizado en el práctico anterior) en 25 mL de medio de cultivo

líquido general (preparado en el práctico) y en 25 mL de medio

diferencial líquido (para fijadores de nitrógeno) provisto por el

profesor.

- rotular

- Incubar a 28-30°C.

Trabajo de Laboratorio:

3. Actividad extra para trabajar en el Práctico Nº 3

Utilizando el suelo oreado y tamizado en el práctico anterior

realizar la siguiente actividad:

- Colocar la muestra de suelo en un vaso de plástico.

- Regar al 60% de la capacidad de campo (es el contenido de

agua o humedad que es capaz de retener el suelo luego de

saturación).

- Colocar dos portaobjetos dentro del vaso, dejando dos

centímetros libres (sin enterrar) por encima de la muestra de

suelo y con una separación de 3 centímetros entre ellos.

- Cerrar el vaso con polietileno (lo más herméticamente

posible) para evitar la pérdida de humedad.

- Incubar a 28-30ºC.

Trabajo de Laboratorio: