trabajo de hplc y elisa. master.final..ppt
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MICOTOXINAS:
• Son metabolitos secundarios tóxicos ( Swanson 1987) producidos por
determinados hongos como Aspergillus, Penicillium, Fusarium sp.
• La I.A.R.C. ( Agencia Intenternacional para Investigación sobre el Cáncer) considera:
-Cancerígenas: Aflatoxina B1,M1, Ocratoxina A.
-Posibles cancerígenos: Fumonisina B1.
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HPLC
• Método físico basado en separar sustancias (analitos) de una mezcla entre dos fases miscibles ( Fase móvil y fase fija estacionaria).
• Elegido como método oficial de referencia para análisis de micotoxinas (AOAC International).
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Tipos de cromatografía líquida:
a) de reparto: separación de solutos por solubilidadb) de adsorción: separación según la afinidad de
adsorciónc) de exclusión: separación según el peso molecular d) de intercambio iónico: separación según la carga iónica
-La muestra es disuelta en una fase móvil (gaseosa o líquida).
-Esta fase móvil es forzada hacia una fase inmóvil e inmiscible llamada fase estacionaria.
-Si un componente resulta ser bien soluble en la fase estacionaria, le tomará más tiempo viajar a través de ella que un componente no muy soluble en esta fase pero si bien soluble en la fase móvil.
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• Como resultado de estas diferencias en la movilidad de los componentes, estos se separan entre sí, al pasar por la fase estacionaria.
• La separación de los componentes y los cambios de fase son generados en el interior de una columna, por donde viajan las partículas.
• La columna va unida a un detector y este último a un grabador o cromatógrafo; de esta forma las partículas se separan en la columna y viajan por ella hasta llegar al detector, y luego el grabador entrega un registro del movimiento realizado por las partículas en el tiempo.
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ELISA
• Enziyme Linked Immuno-Sorbent Assay
• Fundamento:
- Competencia entre las micotoxinas que pueden existir en la muestra y el producto enzimoconjugado (coloreado). Este producto se añade de forma controlada y marcada para su unión con el anticuerpo.
-Cuanto más contaminada esté la muestra ↑ micotoxinas ( sin marcar) se unen al anticuerpo ↓micotoxina conjugada con enzima (coloreada).
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Etapa 1. Conjugación de la toxina pura a una enzima
Etapa 2. La competencia entre este conjugado y la toxina libre del producto por los sitios activos de los anticuerpos
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Competitive Direct ELISA
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Competitive Direct ELISA
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Competitive Direct ELISA
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Características que deben reunir las enzimas para ELISA
•Debe ser económica y obtenerse con un alto grado de pureza
•Elevada actividad específica
•Estable en condiciones de almacenamiento y prueba
•Soluble
•Sencilla, sensible y medible con gran rapidez
•No debe estar presente en el medio analizado
•Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo
•No perder actividad cuando se conjuga
•Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo
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Factores Para Seleccionar un Método
•Matriz de la muestra, preparación de la muestra
•Límite de detección, Rango dínamico
•Micotoxina de interés
•Localización del análisis: elevadores de granos, planta procesadora, laboratorios analíticos
•Entrenamiento del analista
•Facilidad de uso, Costos
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Criterios para la Selección de Un Método
•Experiencia requerida del analista
• Costo del equipo
•Número de análisis
•Tiempo requerido
•Localización del análisis
•Deposición de desechos
•Seguridad
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Selección del Método
•Simple
•Rápido
•Preciso
•Barato
•Automatizado
•Sensible
•Selectivo
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Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
Ventajas:
•Precisa
•Exacta
•Sensible
•Mas eficiente
•No necesita ser validado para ceda aplicación.
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Cromatografía de Alta Eficiencia (HPLC)
Desventajas:
Alto costo del equipo y de manutención
Analiza una muestra a la vez
Exigente en las condiciones de operación
Personal entrenado
Exige una purificación exhaustiva de la muestra.
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ELISA
• Ventajas:• Rápido.• Simple.• Sencillo de usar.• Posibilidad de trabajar al mismo tiempo
con un gran nº de muestras.• Capacidad de testar micotoxinas “in situ”.• Económico.
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ELISA
Desventajas • Anticuerpos solo son producidos en centros
especializados• Anticuerpos necesitan tener propiedades
correctas• ELISA necesita ser validado para cada
aplicación• ELISA necesita estar acoplado con confirmación
de identidad. Falsos positivos.• Las respuestas tienden a ser por exceso en algunos
elisa pues detectan otros metabolitos con estructuras similares
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Conclusiones:
• Elegiría HPLC salvo en los casos en los que fuese indispensable un análisis rápido, “in situ” y barato de las muestras.
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Bibliografía
• 1. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE MICOTOXINAS EN INGREDIENTES PARA LA NUTRICIÓN ANIMAL. Ph.D. Javier Lara Arellano. 2003. Asociación Mexicana de Nutrición Animal (AMENA).
• 2. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Michael Z. Zheng, John L. Richard & Johann Binder . Mycopathologia (2006) 161: 261–273
• 3. Mycopathologia (2005) 159: 255–263: Validation of an elisa test kit for the detection of total aflatoxins in grain and grain products by comparison with HPLC - Zhongming Zheng, Craig W. Humphrey, Robin S. King & John L.Richard.
• 4. Mycopathologia (2005) 159: 265–272: Validation of an elisa test kit for the detection of ochratoxin A in several food commodities by comparison with HPLC - Zhongming Zheng, Jonne Hanneken, Donna Houchins, Robin S. King, Peter Lee & John L. Richard.
• 5. Determination of Aflatoxin B 1 in Highly Contaminated Peanut Samples Using HPLC and ELISA. R Asis, RDD Paola, MAJ Aldao - Food and Agricultural Immunology, 2002 .
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Bibliografia
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• 7. Performance of modern sample preparation techniques in the analysis of Fusarium mycotoxins in cereals. R Krska - Journal of Chromatography A, 1998 – Elsevier.
• 8. Fumonisin Concentrations in Brazilian Feeds Associated with Field Outbreaks of Confirmed and Suspected Animal Mycotoxicoses.Eric W. Sydenham,*st Walter F. 0. Marasas,Gordon S. Shephard,t Pieter G. Thie1,t and Elisa Y. Hirookat. J. Agric. F& Chem. 1992, 40, 994-997
• 9. ELISA and HPLC determination of the occurrence of aflatoxin M(1) in raw cow's milk.Fuente:Food additives and contaminants [0265-203X] Rodríguez Velasco año:2003 v:20 n:3 p:276 -80
• 10. Determination of fumonisins in corn: evaluation of competitive immunoassay and HPLC techniquesFuente:Journal of agricultural and food chemistry [0021-8561] Sydenham año:1996 v:44 p:159