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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOSFacultad de Ciencias de la Alimentación

Ingeniería en Alimentos

Trabajo Práctico Nº 10

Fotosíntesis. Reacción de HillLa fotosíntesis es un proceso en virtud del cual los organismos con clorofila, como las plantas verdes, las algas y algunas bacterias, capturan energía en forma de luz y la transforman en energía química que la almacenan en las uniones de las moléculas orgánicas que sintetizan. La fotosíntesis posee una fase lumínica y una fase oscura (aunque también se produce en presencia de luz)La fase luminosa, fase clara, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera etapa, en la cual se obtiene energía química en forma de ATP y NADPH, a partir de la disociación de moléculas de agua, formando oxígeno e hidrógeno. La energía creada en esta fase, será utilizada durante la fase oscura, para la sintetizar glucosa y otros carbohidratos a partir del CO2La fase luminosa se realiza en la cadena transportadora de e- del cloroplasto, en los complejos clorofila-proteína que se agrupan en unidades llamadas fotosistemas que están en los tilacoides (membranas internas) de los cloroplastos

Objetivo: comprobar la generación de poder reductor durante la fase luminosa de la Fotosíntesis. Como aceptor final de los electrones de la fotólisis del agua se empleará un oxidante artificial, 2,6 diclorofenolindofenol (DPIP). Se evaluará el efecto de diferentes factores (oscuridad, inhibidor de la fotólisis y calor) sobre la reacción Fundamentos: La Reacción de Hill es la reacción fotoquímica en la que los electrones provenientes de la fotólisis del agua producen la reducción de un oxidante natural (NADP+) o artificial (2,6 diclorofenolindofenol, sales férricas, etc.)En este Trabajo Práctico se pondrá de manifiesto la reacción de Hill, que ocurre en los cloroplastos, para lo que utilizaremos DPIP como oxidante artificial, que en su forma oxidada es azul y en la forma reducida es incolora. Adicionalmente pueden observarse burbujas, debido al oxígeno liberado en la reacción

Material:Material de laboratorio

Muestra Reactivos

Cátedra de Biología 1



Mortero Hojas de espinacas

Solución de sacarosa 0,5 M

Baño de Hielo Buffer Fosfato pH 7

Cuchillo Inhibidor

Embudo 2,6 diclorofenolindofenolCentrífuga con tubos GasaArena (lavada)Portalámpara con lámpara de 75 wHieloPipeta PasteurPapel aluminio

Buffer Fosfato: 0,167 grs K2HPO4 + 0,209 grs KH2PO4, disueltos en 100 ml de aguaDPIP: 0,2 grs de diclorofenolindofenol disueltos en 100 ml de agua, dejar reposar 24 hs y filtrar

2 DPIP + 2 H2O 2 DPIPH2 + O2

Procedimiento:A. Aislamiento de cloroplastos

1. Utilizar aproximadamente 8 hojas medianas de espinaca (deben estar bien verdes y turgentes ), eliminar los pecíolos y la nervadura central y cortarlas en pequeños trozos. Este procedimiento, así como todos los demás pasos en los que se utilice la suspensión de cloroplastos, deben realizarse en baño de hielo y con soluciones frías para conservar la estructura de las organelas de interés

2. En un mortero colocado en baño de hielo poner las hojas cortadas junto a una cucharadita de arena (previamente lavada) y 50 ml de solución fría de sacarosa 0,5 M. Triturar por 2 o 3 min hasta lograr un extractivo de color verde oscuro

3. Filtrar a través de gasa para eliminar restos vegetales groseros4. Centrifugar el filtrado en 4 tubos durante 5 min a 2000 rpm para

eliminar el material celulósico. La mayor parte de los cloroplastos quedarán en suspensión en el sobrenadante

5. Colectar los sobrenadantes y centrifugarlos durante 10 min a 3000 rpm. Descartar los sobrenadantes y resuspender suavemente los sedimentos que contienen los cloroplastos en 3 ml de buffer fosfatos de Ph 7 frío, usando una pipeta Pasteur. Reunir las suspensiones de cloroplastos en un único tubo ( suspensión A ) mantenido en frío hasta el momento de usar


Luz, cloroplastos



B. 1. Colocar una suspensión de la suspensión A entre porta y

cubreobjetos y observar al microscopio2. Tomar 3 ml de la suspensión A y calentar hasta ebullición durante 2

minutos ( Suspensión B)3. Rotular cinco tubos ( números 1 al 5 ) para ser utilizados según el

esquema siguiente

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 (*)

Tubo 4 Tubo 5

Buffer Fosfato 0,1 M pH 7

7 ml 7 ml 7 ml 7 ml 7 ml

Inhibidor - - - 1 gota -Suspensión A 1 ml - 1 ml 1 ml 1 mlSuspensión B - 1 ml - - -DPIP 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota -Luz + + - + +

( * ) El tubo 3 debe estar recubierto con papel aluminio antes de colocar los reactivos

4. Colocar cada uno de los reactivos en el orden listado, manteniendo los tubos en baño de hielo5. Mezclar bien el contenido de los tubos por inversión de los mismos 2 veces. Para tapar se puede emplear un trocito de polietileno6. Para exponer los tubos a la luz colocar la gradilla frente a una lámpara de 75 w durante 10 min7. Observar si se produjeron cambios de coloración8. Justifique lo ocurrido en cada tubo

Cuestionario1. ¿Cuáles son los primeros auxilios en caso de accidente con 2,6

diclorofenolindofenol?


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