Practica 11Test inmunoenzimatico1) Objetivo

Entender el concepto de test inmunoenzimatico o enzimoinmunoanalisisAplicar la tcnica inmunoenzimatica para determinacin de anticuerpos contra agentes infecciones como tripanosoma cruzi.

2) Fundamento

El Test ELISA para Chagas III es un ensayo inmunoenzimtico en fase slida para la deteccin cualitativa de anticuerpos contra T. cruzi. Se realiza en placas cuyos pocillos han sido activados con extractos totales de las cepas de T. cruzi Tulahun y Mn (6), incluyendo antgenos de membrana altamente inmunognicos. El recubrimiento de los pocillos se realiza mediante una novedosa tecnologa consistente en la utilizacin de un adhesivo biolgico que facilita la inmovilizacin de los antgenos y aumenta la estabilidad de la placa activada (7). Si las muestras analizadas contienen anticuerpos especficos para T. cruzi, stos formarn un complejo estable con los antgenos que recubren los pocillos. El material unido en forma inespecfica ser eliminado por medio del lavado. Durante la incubacin con el conjugado, los anticuerpos anti-IgG humanas marcados con peroxidasa se unirn al complejo formado. Finalmente, en la etapa de incubacin con el sustrato cromognico, la peroxidasa unida al complejo producir una coloracin que permitir detectar las muestras reactivas para T. cruzi. La reaccin enzimtica se detendr por la adicin de cido sulfrico, midindose luego la intensidad del color en un lector colorimtrico para placas de ELISA.

3) Procedimiento

1.Antes de comenzar el ensayo, permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente.

2.Diluya la solucin de lavado 25X con agua destilada o desionizada. Si va a utilizar una tira de 8 pocillos, prepare 50 mL de solucin de lavado tomando 2 mL de la solucin 25X y agregando 48 mL de agua. La solucin diluida es estable por dos semanas almacenada a 4C.

3.Ponga en el soporte los pocillos correspondientes al nmero de muestras a analizar. Incluya dos pocillos para el control positivo y dos para el control negativo.

4.Agregue a cada pocillo 200 L de diluyente de muestra.

5.Agregue 20 L de cada muestra o control. Al agregar las muestras, el diluyente de muestra virar de color de acuerdo a la Tabla II.

Tabla II: viraje del color del diluyente de muestra.Tipo de muestraSin muestraSuero o plasmaControl positivoControl negativo

ColorVioletaAzulTurquesaVerde

Advertencia:Muestras hemolizadas o turbias alterarn el color final sin afectar el resultado.El cambio de color es proporcional al volumen de muestra agregado. Un viraje de menor intensidad, indicar que se dispens un volumen inferior o que la muestra no se encuentra en las condiciones adecuadas.

6.Selle la placa con el autoadhesivo provisto, para impedir la evaporacin de los reactivos, e incube por 30 minutos a 37 1C.

7.Saque el adhesivo y lave la placa. Para sto elimine el contenido y agregue a cada pocillo 350 L de solucin delavado diluida. Elimine la solucin y repita esta operacin 4 veces ms.

Protocolo recomendado para lavador automtico de tiras:

Realice cinco ciclos de lavado dispensando 350 L de la Solucin de Lavado diluida.Asegrese cuando sea posible que:

a)el pocillo se llene con la Solucin de Lavado.

b)la Solucin de Lavado no rebalse en ningn momento.

c)el tiempo de remojo sea 30 segundos.

d)no quede lquido remanente en los pocillos al final del lavado. Para esto se recomienda, si es posible, realizar un aspirado cruzado (crosswise) en el ltimo paso.

Nota:siempre mantenga limpio el equipo enjuagando con abundante agua destilada al final de cada jornada de trabajo.Realice un mantenimiento peridico de acuerdo a las instrucciones de su proveedor.

8.Despus de lavar invierta la placa y golpela suavemente sobre papel absorbente para eliminar cualquier exceso de lquido en los pocillos. Si la base de los pocillos se moja, limpie con papel absorbente para evitar la formacin de precipitados que podran interferir con la lectura.

Advertencia:No permita que la placa se seque.

9.Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue 100 L de conjugado a cada pocillo.

Advertencia:No pipetee el conjugado directamente del frasco original.No devuelva el conjugado sobrante al frasco original.

10.Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue 100 L de conjugado a cada pocillo.

11.Lave de manera similar a lo descrito en los puntos 7 y 8.

12.Agregue 100 L de sustrato a cada pocillo e incube la placa en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente.

13.Detenga la reaccin agregando 100 L de Solucin de Detencin a cada pocillo.

4) Resultados

5) Conclusin

Logramos entender el concepto del test inmunoenzimatico aplicando la tcnica Elisa para determinar anticuerpos contra agentes infecciosos enzimticos

6) Cuestionario

1. Qu aplicacin tiene los test inmunoenzimaticos?

El uso de la tcnica inmunoenzimtica Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) est ampliamente difundido para el diagnstico serolgico de las enfermedades.El ensayo inmunoenzimtico ELISA se basa en el uso de antgenos o de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica pudiendo ser revelada mediante la adicin de un substrato especfico que, en contacto con la enzima, producir un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de Densidad ptica.

2. Explique que es la lnea de corte o cut off?

Ley de corte o cut-off: Es la concentracin mnima que debe tener un elemento en un yacimiento para ser explotable, es decir, la concentracin que hace posible pagar los costes de su extraccin, tratamiento y comercializacin. Es un factor que depende a su vez de otros factores, que pueden no tener nada que ver con la naturaleza del yacimiento, como por ejemplo pueden ser su proximidad o lejana a vas de transporte, avances tecnolgicos en la extraccin, etc.

3. Qu es el western blotting?

El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas.Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,y consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

4. Qu caractersticas deben tener las enzimas utilizadas en los ELISAS?

Debe ser econmica y obtenerse con un alto grado de pureza Elevada actividad especficaEstable en condiciones de almacenamiento y pruebaSoluble, Sencilla, sensible y medible con gran rapidezNo debe estar presente en el medio analizadoSustratos inhibidores no deben interferir con el ensayoNo perder actividad cuando se conjugaDebe conservar la actividad en condiciones de ensayo

5. Qu es el conjugado en el test de Elisa y que caractersticas debe tener?

Anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugada con peroxidasa 6. Qu caractersticas debe tener un sustrato?

Para el monitoreo serolgico rutinario de bandadas, se sugiere recolectar al azar al menos 30 ms sueros por bandada a intervalos estndar de tiempo (cada 4 semanas). Se requieren procedimientos adecuados de recoleccin de muestras, de recoleccin de sueros y de almacenamiento de muestras sricas (4C por hasta 4 das a 20C para periodos ms largos) con el fin de obtener resultados confiables. Para lograr una mayor especificidad y para minimizar reacciones posibles de falsos positivos, deben excluirse de la prueba las muestras de suero que estn contaminada con bacterias o que estn muy grasas.7. Qu ventajas y desventajas ofrecen los test rpidos o test inmunocromatogrficos?

La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test. Cada vez son ms las aplicaciones de esta tcnica, como test de campo debido a que no es necesario reactivos ni instrumentacin adicional, como en el campo clnico. Pueden dar falsos negativos o resultar invlidos.

7) Bibliografa http://www.bionote.co.kr/File/Upload/2011/04/08/2011-04-08.pdfhttp://www.vircell.com/productos/tests_rapidos/?tx_gtkvircell_pi1%5Buid%5D=82 7&cHash=7fbf8aca497ca5fc07f59e06c674651ehttp://www.fundacionio.org/docs/cursos/emergentes_granada_malaria.pdf