tesis compuestos
DESCRIPTION
Tesis sobre compuestos aromáticosTRANSCRIPT
UNIVERSIDAD CENTROAMERICANA FACULTAD DE CIENCIA, TECNOLOGÍA Y AMBIENTE
Determinación y cuantificación mediante HPLC de los ácidos carboxílicos del mucílago de Coffea arabica a diferentes pH
durante la etapa de fermentación
Tesis para obtener el Título de Ingeniero en Calidad Ambiental
AUTOR: Roberto Rivas Hermann
Tutor: MSc. Carlos Vallejos
Asesora: Dra. Susan Jackels
Managua, Nicaragua
Septiembre, 2006
CONTENIDO
RESUMEN/ ABSTRAC
1 INTRODUCCIÓN
2 OBJETIVOS
3 MARCO TEÓRICO
4 MARCO METODOLOGICO
5 RESULTADOS
6 DISCUSIÓN
7 CONCLUSIONES
8 RECOMENDACIONES
9 BIBLIOGRAFÍA
10 ANEXOS
Índice de tablas
TABLA 1 .COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL CAFÉ VERDE TABLA 2 - COMPARACIONES ENTRE DISTINTOS TIPOS DE DETECTORES TABLA 3 - MONTAJE EXPERIMENTAL TABLA 4 - VARIABLES E INDICADORES TABLA 5 - IDENTIDAD DE LOTE PROCESADO, FECHA DE RECOLECCIÓN DE MUESTRA Y FECHA DE
CONCLUSIÓN DEL EXPERIMENTO TABLA 6 - MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS DURANTE LA FASE DE LABORATORIO (ETAPA DE EXTRACCIÓN
DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS Y DE MONITOREO RÁPIDO CON REFLECTOQUANT) TABLA 7 - CONDICIONES DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO TABLA 8 - CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS CARBOXÍLICOS UTILIZADOS COMO ESTÁNDARES TABLA 9 - CONDICIONES DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO PARA EL ANÁLISIS CUALITATIVO (TIEMPOS Y ORDEN
DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS) TABLA 10 - MUESTRAS CON QUE SE REALIZÓ EL ANÁLISIS CUALITATIVO TABLA 11 - MUESTRAS UTILIZADAS PARA EL ANÁLISIS CON HPLC TABLA 12 - INSTRUMENTO PARA LA RECOLECCIÓN DE DATOS TABLA 13 - ORDEN DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS, ANÁLISIS CUALITATIVO TABLA 14 - PICOS EN LOS CROMATOGRAMAS Y ÁCIDOS CARBOXÍLICOS A LOS QUE CORRESPONDEN TABLA 15 - TIEMPOS DE RETENCIÓN PARA LOS ÁCIDOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE
CALIBRACIÓN TABLA 16 - CONDICIONES DE DILUCIÓN DE ESTÁNDARES PARA LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE
CALIBRACIÓN TABLA 17 - LÍMITES DE DETECCIÓN DEL MÉTODO PARA CADA ÁCIDO TABLA 18 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO GALACTURÓNICO TABLA 19 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO FÓRMICO TABLA 20 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO MÁLICO TABLA 21 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO ACÉTICO TABLA 22 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO CÍTRICO TABLA 23 - MATRIZ DE RESULTADOS PARA ÁCIDO PROPIÓNICO TABLA 24 - TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO GALACTURÓNICO TABLA 25 - TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO FÓRMICO TABLA 26- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO MÁLICO TABLA 27- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO ACÉTICO TABLA 28- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO CÍTRICO TABLA 29- TABLA DE DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS, ÁCIDO PROPIÓNICO
TABLA 30 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH
(CONFIGURACIÓN ANOVA 1 VÍA) TABLA 31 - PRUEBA DE LEVENE PARA MUESTRAS A LAS QUE SE REALIZARÍA LA PRUEBA ANOVA TABLA 32 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VÍA TABLA 33- RESULTADOS DE LA PRUEBA KRUSKALL WALLIS PARA ÁCIDO MÁLICO Y PROPIÓNICO TABLA 34 - PRUEBA DE LA MEDIANA TABLA 35- DATOS PARA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS Y ENTRE EXPERIMENTOS (ANOVA 2 VÍAS) TABLA 36 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VÍAS TABLA 37 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE GRUPOS TABLA 38 - PRUEBAS DE NORMALIDAD PARA LOS DATOS DE COMPARACIONES ENTRE GRUPOS DE PH
(CONFIGURACIÓN ANOVA UNA VÍA) TABLA 39 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE UNA VÍA PARA DATOS DE REFLECTOQUANT TABLA 40 - PRUEBA DE CONTRASTES PARA ANOVA UNA VÍA, DATOS DE REFLECTOQUANT TABLA 41 - DATOS DE REFLECTOQUANT PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO ANOVA DOS VÍAS, Á. MÁLICO Y Á.
LÁCTICO TABLA 42 - RESULTADOS PRUEBA ANOVA DE 2 VÍAS PARA RESULTADOS DE REFLECTOQUANT TABLA 43- LISTA DE ARCHIVOS DE CROMATOGRAMAS DE MUESTRAS Y EL PATRÓN INTERNO QUE SE
UTILIZARON PARA DETERMINAR LOS ÓRDENES DE ELUSIÓN TABLA 44 - LISTA DE ARCHIVOS CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIÓN DE LA CURVA DE
CALIBRACIÓN TABLA 45- MATRIZ DE CONCENTRACIONES DETERMINADAS PARA LOS ÁCIDOS MÁLICO Y LÁCTICO MEDIANTE
REFLECTOQUANT ®
Índice de figuras
FIGURA 1 - SECCIÓN LONGITUDINAL DEL CAFÉ CEREZO FIGURA 2 - CONSTITUCIÓN DEL TEJIDO DE PERICARPIO DE COFFEA ARABICA VAR. TYPICA CRAMER.
EXAMINACIÓN POR MICROSCOPÍA LUEGO DE FERMENTACIÓN (20 H) FIGURA 3 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESAMIENTO DE CAFÉ POR LA VÍA HÚMEDA FIGURA 4 – ESTRUCTURA DEL MUCÍLAGO Y DEL PERGAMINO ANTES DE LA FERMENTACIÓN FIGURA 5 - COMPORTAMIENTO DEL PH EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE FERMENTACIÓN FIGURA 6 - CROMATOGRAFÍA DE ELUSIÓN FIGURA 7 - COMPONENTES DEL SISTEMA DE HPLC FIGURA 8 - DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO EXPERIMENTAL, FINCA LA CANAVALIA FIGURA 9 - SEPARACIÓN DE GRANOS DE CAFÉ DE ACUERDO A SU ESTADO DE MADUREZ FIGURA 10 - RECIPIENTES DE FERMENTACIÓN DEL CAFÉ FIGURA 11 HOJAS DE DATOS UTILIZADAS PARA EL CONTROL EXPERIMENTAL DE LOTES DE CAFÉ EN LA FASE
EXPERIMENTAL FIGURA 12- DIAGRAMA DE FLUJO DE LA FASE DE LABORATORIO FIGURA 13- MÓDULOS DEL SISTEMA HPLC UTILIZADOS EN LA PRESENTE INVESTIGACIÓN FIGURA 14 - ÁCIDO PIRAZINCARBOXÍLICO (PATRÓN INTERNO) FIGURA 15 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL ANÁLISIS POR EL MÉTODO DEL PATRÓN INTERNO FIGURA 16 - DEFINICIONES DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DEL MÉTODO (MDL) FIGURA 17 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO GALACTURÓNICO FIGURA 18 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO FÓRMICO FIGURA 19 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO MÁLICO FIGURA 20 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO LÁCTICO FIGURA 21 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO ACÉTICO FIGURA 22 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA ÁCIDO CÍTRICO FIGURA 23 - CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL ÁCIDO PROPIÓNICO FIGURA 24 - GRÁFICOS “CAJAS DE PUNTOS” O BOXPLOTS PARA DETERMINAR PUNTOS ABERRANTES DENTRO
DE LOS DATOS DE CADA GRUPO PARA CADA ÁCIDO FIGURA 25 - COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDO MÁLICO Y ÁCIDO LÁCTICO A MEDIDA
QUE AVANZA EL PROCESO DE FERMENTACIÓN, DATOS DE REFLECTOQUANT FIGURA 26- COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES PROMEDIO DE LOS ÁCIDOS ANALIZADOS EN
DEPENDENCIA DEL PH FIGURA 27 -CONCENTRACIONES DE ÁCIDOS ORGÁNICOS CONFORME AVANZA EL PROCESO FERMENTATIVO FIGURA 28 - GRÁFICOS DE CAJAS “BOXPLOTS”, ANÁLISIS ANOVA 2 VÍAS ENTRE EXPERIMENTOS
FIGURA 29 - GRÁFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN PARA ÁCIDO MÁLICO, TÉCNICA DEL
REFLECTOQUANT Y HPLC FIGURA 30 - CONCENTRACIONES DE ÁCIDO LÁCTICO A MEDIDA QUE DISMINUYE EL PH EN QUE SE
INTERRUMPE LA FERMENTACIÓN FIGURA 31 - GRÁFICA Y TABLA CON EL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN PARA ÁCIDO LÁCTICO. FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO FIGURA 32 - GRÁFICA Y TABLA DE CORRELACIÓN (PEARSON) PARA LOS DATOS DE PH MEDIDOS EN LA FASE
EXPERIMENTAL CON EL SISTEMA REFLECTOQUANT Y CON CINTAS INDICADORAS FIGURA 33- GRÁFICA Y TABLA DE CORRELACIÓN (PEARSON) ENTRE LAS MEDICIONES DE PH, FASE
EXPERIMENTAL Y FASE DE LABORATORIO FIGURA 34 - LOCALIZACIÓN DE LA FINCA LA CANAVALIA FIGURA 35- MAPA DE USO DEL SUELO EN LA FINCA LA CANAVALIA.
Dedicatoria
A mis padres Geovannie y Abelardo por el apoyo incondicional durante todos
estos años
Agradecimientos
Esta investigación no hubiera sido posible sin la motivación de los profesores
Susan Jackels (Seattle University) y Charles Jackels (University of Washington)
quienes iniciaron el proyecto solidario “Café para la justicia - Coffee for Justice”.
Agradezco al Profesor Carlos Vallejos (Universidad Centroamericana) por el
asesoramiento y el trabajo conjunto durante toda la investigación.
Todas las personas con quienes trabajé en esta larga tarea: el personal de la finca
La Canavalia - ADDAC y al personal de Seattle University.
A la Facultad de Ciencia, Tecnología y Ambiente (Universidad Centroamericana)
por mantener lazos de intercambio con Universidades hermanas, lo cual permite y
permitirá que otros estudiantes participen en proyectos como éste.
Resumen/ Abstract
En la fermentación del café (Coffea arabica) procesado por vía húmeda, la degradación por parte de la microflora (bacterias y levaduras principalmente) de azúcares constituyentes del mucílago va acompañada de un aumento progresivo de ácidos carboxílicos y por consiguiente de una caída del pH. Estos ácidos se han relacionado con la aparición por un lado de "malos sabores" o por otro lado de "notas de sabor" en las muestras catadas profesionalmente. Para conocer la influencia que tendría la interrupción de la fermentación a diferentes pH en las concentraciones de dichos ácidos se realizaron tratamientos a muestras de Coffea arabica, variedad caturra, recolectadas y procesadas en la finca La Canavalia (San Ramón, Matagalpa) durante la temporada 2005-2006, posteriormente se cuantificaron los ácidos carboxílicos mediante Cromatografía Líquida de alto Desempeño (HPLC). Se comprobó que a medida que avanza el proceso fermentativo algunos ácidos muestran tendencias de aumento en sus concentraciones, sin embargo no se identificaron diferencias remarcables entre los grupos de tratamiento, esto debido a las diferencias inherentes a cada lote experimental.
Palabras claves: Coffea arabica, procesamiento húmedo, fermentación, mucílago, HPLC, ácidos carboxílicos
The fermentation of Coffea arabica during the wet processing method is originated by the consumption of sugars within the mucilage by micro flora. As a result, the concentration of carboxilic acids increases and thus the pH falls. At some concentrations these carboxilic acids are related to the apparition of "off-flavors" or "flavor notes". With the aim of know which would be the relationship among the stage of fermentation and the concentration of these acids, coffee samples (Coffea arabica, var. caturra) of La Canavalia farm (San Ramón, Matagalpa) were processed during the harvest season 2005-2006 and their fermentation interrupted at different pH. Then the concentration of representative carboxilic acids was analyzed by HPLC. Although the statistical tests didn't show clearly differences among treatments, a pattern in the increasing and decreasing concentration of some acids was obtained. Differences among experimental batches might be a cause for such a lack of clearly defined differences among groups.
Key words: Coffea arabica, wet processing, fermentation, mucilage, HPLC, carboxilic acids
1 INTRODUCCIÓN
La reciente “crisis” originada por el colapso del mercado mundial del café ha
causado severas condiciones económicas para los productores de café en países
productores, incluyendo Nicaragua. Como resultado, muchos productores de café
desean mejorar la calidad y consistencia de su café con el propósito de tener
acceso a los mercados de café especiales.
En Nicaragua los productores cultivan Coffea arabica y lo procesan por medio del
beneficiado húmedo en el cual es crucial la etapa de fermentación. Para
determinar cuál es el punto idóneo para interrumpir la fermentación mediante el
“lavado” del café los productores utilizan un método tradicional, éste no es preciso
para determinar cuándo el café se ha sobrefermentado. El tiempo de fermentación
juega un papel crucial: una sobrefermentación produce café con sabores
desagradables, una sub-fermentación redundaría en café pergamino con
remanentes de mucílago.
El conocimiento teórico de la química de la fermentación es clave para la
propuesta de un método alternativo para predecir cuándo interrumpirla. Los
últimos estudios plantean que el mucílago es separado del café pergamino
(parénquima) principalmente por los cambios en su pH a lo largo del tiempo de
fermentación (Avallone et al, 2001a). Por esta razón se considera que el pH
tendría una funcionalidad muy importante para predecir cuándo interrumpir la
fermentación (Puerta-Quintero, 1999, 2001).
Si bien se sabe que estos cambios de pH son el resultado de un aumento gradual
en la concentración de ácidos carboxílicos producidos por microorganismos resta
por investigarse qué consecuencias tendría la interrupción de la fermentación del
mucílago a un pH específico sobre la formación de ácidos carboxílicos
característicos de sabores desagradables en el café.
El propósito de esta investigación es responder a esta pregunta mediante la
identificación y la cuantificación de algunos ácidos carboxílicos del mucílago del
café a diferentes etapas de su fermentación (grupos experimentales). Para
identificar y cuantificar los ácidos carboxílicos se utilizó la técnica Cromatografía
Líquida de alto Desempeño (HPLC1). Como técnica de control se utilizó el sistema
espectrofotométrico de campo, Reflectoquant, para medir las concentraciones de
ácido láctico y ácido málico.
Mediante HPLC se lograron identificar seis ácidos carboxílicos: galacturónico,
málico, propiónico, cítrico, acético y fórmico. El ácido láctico solamente se
identificó con el sistema Reflectoquant.
Los análisis de los resultados no arrojaron diferencias significativas de importancia
entre las concentraciones de ciertos ácidos entre los grupos. Excepciones a esto
fueron los ácidos málico y láctico.
Puesto que esta investigación se enmarca dentro del proyecto Café por la Justicia
(Coffee for Justice), los resultados de esta tesis fueron retomados por
investigadores de ese proyecto para establecer correlaciones con los puntajes
obtenidos por las mismas muestras en una catación profesional de café
(Jackels et al, 2006).
1 HPLC: siglas internacionalmente reconocidas para la Cromatografía Líquida de Alto Desempeño,
provienen del inglés High Performance Liquid Chromatography.
De forma paralela a los experimentos controlados de las muestras cuyas
concentraciones en ácidos carboxílicos se determinaron, el equipo de Café por la
Justicia distribuyó 100 kits a igual número de productores. Estos kits contenían lo
necesario para que sus usuarios experimentaran la interrupción de la fermentación
en sus lotes de café a diferentes pH: se comparó el pH con que normalmente
interrumpen la fermentación (mediante el método tradicional) con una interrupción
a un pH cercano a 4,6. Los resultados también fueron catados por un equipo
profesional (Jackels et al, 2006).
Con ambas experiencias los productores de café se beneficiarán de un método de
evaluación sencillo para lograr uniformidad en el procesamiento del café en la
finca, especialmente en el paso de fermentación. La consistencia y calidad en la
producción de café pergamino ayudará en la comercialización internacional del
café orgánico de las fincas de pequeños productores de Matagalpa.
2 OBJETIVOS
2.1 GENERAL
Identificar los principales ácidos carboxílicos del mucílago de café (Coffea arabica)
en dependencia del pH en el cual se interrumpe su fermentación.
2.2 ESPECÍFICOS
• Determinar cualitativamente la presencia de ácidos carboxílicos en las
muestras de mucílago de café (Coffea arabica) para diferentes pH de
interrupción de la fermentación.
• Cuantificar las concentraciones de los ácidos carboxílicos identificados en
el mucílago de café (Coffea arabica) para diferentes pH de interrupción de
la fermentación.
• Establecer las relaciones estadísticas entre los ácidos carboxílicos
cuantificados en el mucílago de café (Coffea arabica) y las diferentes
etapas en que se interrumpe su fermentación.
3 MARCO TEÓRICO
3.1 EL MERCADO INTERNACIONAL DEL CAFÉ
3.1.1 De la producción a la oferta en el mercado internacional del café
El café es una bebida “moderna” cuya masificación surgió a raíz de la revolución
industrial (Daviron y Lerin, 1990). Secunda al petróleo en cuanto al producto
comercial con más intercambios a nivel mundial ya que los ingresos por sus
ventas exceden anualmente los 70 billones de dólares estadounidenses. Se
estima que el 75 % de sus 25 millones de productores, están catalogados como
pequeños productores (Brown, 2004).
Dos especies de café se cultivan para ser comercializadas: (a) El Arábica (Coffea
arabica) principalmente en Brasil, Colombia, México, Centroamérica, Perú y al
este de África. Tiene un sabor menos amargo que Robusta, más acidez y más
cuerpo. (b) El Robusta (Coffea canephora) principalmente en Brasil, Indonesia,
Uganda, Costa de Marfil e India. Tiene un sabor fuerte, amargo y menos acidez
(Nestlé, 2004).
Desde el año 2000, la producción mundial de café alcanza anualmente más de
110 millones de sacos de 60 kg. Geográficamente la producción se reparte de la
siguiente forma: 47% en América del Sur, 25 % en los países de Asia/ Pacífico,
15% en América Central y un 13% en África. Nicaragua aporta el 1,23 % de la
producción mundial. La mayor parte del café producido se exporta hacia los países
occidentales. (Voituriez, 2005).
3.1.2 La crisis internacional del café
La sobreproducción mundial de café, la puesta en el mercado de grandes
cantidades de café de baja calidad y las ligeras caídas en la demanda de café han
sido causas importantes de la crisis económica más grande del comercio mundial
de café. Al momento más fuerte de su caída, los precios perdieron el 64% de su
valor en dos años. Entre 1996 y el 2001, la libra de café “verde” pasó de 130 a 42
centavos de dólar. Esto no había acontecido en más de 30 años (Voituriez, 2005;
Brown, 2004; OI, 2002).
Esta crisis ha debilitado las economías de los países que dependían en gran
medida de los ingresos por la venta de café. En América Central el café puede
aportar entre el 2% y el 8% del PIB y representa cerca de un millón de empleos
(Varangis et al, 2003). En Nicaragua, alrededor de 30 000 familias poseen fincas
de café, esto redunda en empleos para 150 000 – 200 000 familias (IICA, 2004;
Gómez, 2005).
Además de importantes consecuencias para los grandes y los medianos
productores, la precariedad ha recaído principalmente sobre los pequeños
productores de café, quienes han tenido que disminuir sus gastos en salud,
educación y en la canasta básica (Varangis et al, 2003; OI, 2002, 2003).
3.1.3 Perspectivas y recomendaciones para afrontar posibles futuras crisis
Luego del año 2004, los precios están en alza: un 36% con relación a los del 2001
y 20% con relación a los del 2003 (Voituriez, 2005). La constitución de reservas
importantes de café en los países importadores, muestra que hay una tendencia
de alzas en los precios. Sin embargo todo el optimismo se debe dejar a un lado
puesto que el mercado de café a mostrado a lo largo del tiempo que es
susceptible a fluctuaciones imprevisibles y a consecuencias catastróficas (Brown,
2004; OI, 2003).
Como estrategias para evitar que crisis similares impacten nuevamente a los
pequeños productores, se han propuesto: la promoción del consumo del café en
países productores y países de economías emergentes, la diversificación de
producción agrícola y la producción de cafés especiales (Scholer, 2004; Varangis
et al, 2003; OI, 2002, 2003).
Se ha planteado que en Nicaragua, la producción de cafés especiales y la
posterior certificación de estos (Café orgánico, Café Comercio Justo, Café de
Sombra, Café producido amigablemente con las aves) por parte de los pequeños
productores podría mejorar sus condiciones de vida en las zonas cafetaleras de
Matagalpa y Jinotega (CRS, 2004, Varangis et al, 2003). Sin embargo, grandes
esfuerzos deben hacerse para mejorar la calidad del café producido y obtener
dichas certificaciones (van Hilten et al, 2002).
3.2 EL CAFÉ: UN GRANO COMPLEJO
3.2.1 Botánica
La planta de café pertenece al género Coffea de la familia Rubiacea. De acuerdo a
Belitz y Grosch (1999) y a Wood (1998) se han censado alrededor de 70 especies
de café, sin embargo solamente tres se cultivan: Coffea arabica, la cual provee el
75% de la producción mundial, C. canephora, alrededor del 25% y C. liberica y
otros, con menos de 1%.
A pesar que la presencia de estas especies está confinada a las regiones
tropicales (Daviron y Lerin, 1990), Coffea arabica se cultiva en altitudes
comprendidas entre 800 y 2000 m bajo temperaturas templadas, al contrario de C.
robusta la cual puede crecer a altitudes inferiores a los 800 m.
Luego del cultivo en viveros, las plantas jóvenes son sembradas al inicio de la
época lluviosa. Además de recomendarse un suelo fértil y con pH superior a 5.5,
otros factores ambientales afectan al cafeto: la disponibilidad de agua, la
iluminación, la ventilación, los fuertes vientos y las sequías (Wood, 1998).
Luego de la siembra hay que esperar hasta 3-4 años para que los frutos empiecen
a producirse, se espera un rendimiento de productividad máximo de 10-15 años.
En edad adulta, la altura de la planta puede variar entre 3 a 12 m dependiendo de
la especie, sin embargo se trata de mantenerla entre 2-2.5 m para facilitar la
recolección (Sánchez-Martín, 2005).
3.2.2 Estructura del grano de café
La planta del café produce flores blancas y a partir de ellas se forman los frutos en
una drupa de 1.5 cm aproximadamente (Figura 1). La drupa está recubierta por un
exocarpio o piel que es verde en un inicio, posteriormente cambia a color amarillo,
algo más tarde se torna roja, paso previo al color carmesí que adquiere en la
madurez completa (esta es la razón por la que se le conoce como cereza o uva),
algunas variedades maduran a color amarillo (Guharay et al, 2000). De acuerdo a
Avallone et al (1999) el exocarpio consiste en una capa de pequeñas células
epidérmicas (~10 x 30 µm).
De acuerdo a Belitz y Grosch (1999), el pericarpio exterior encierra un mesocarpio
(15 a 25% masa/masa de la fruta). Este mesocarpio se divide en un mesocarpio
exterior de color amarillezco (pulpa) y un mesocarpio interior (mucílago) con un
contenido de pectinas 1,9 veces inferior al de la pulpa (García et al, 1991).
El endocarpio también se conoce como pergamino, es de color amarillezco o de
color grisáceo-verdoso (cascarilla), en el interior de estas estructuras se encuentra
el grano de café propiamente dicho, este consiste por lo general de dos
hemisferios elípticos, pegados por su parte plana. Cada grano está recubierto por
una fina membrana de tonalidad plateada. Otras veces, 10-15% de las cerezas
solamente tienen un grano esférico (caracolillo).
Una presentación más clara sobre la estructura de este conjunto de capas
(pericaripio) así como sus anchuras promedio y la forma de las células que las
conforman se presenta en la Figura 2.
Figura 1 - Sección longitudinal del café cerezo
Adaptado de: Avallone et al (2000). Figura 2 - Constitución del tejido de pericarpio de Coffea arabica var. typica cramer. Examinación por microscopía luego de fermentación (20 h).
Las células que conforman la piel tienen una anchura de 10 x 30 µm, la pulpa tiene un espesor de 1 mm, el mucílago 300 µm. El pergamino por su parte tiene una anchura de 50-110 µm, este último está conformado por esclerénquimas transversales (~25 µm) y esclerénquimas longitudinales (~150 x 25 µm). Adaptado de: Avallone et al (1999).
3.2.3 Composición química del café verde
Flament (2001) compila los resultados más importantes en la investigación sobre
los constituyentes del café. Tal como lo comentan Merrit et al (1970) la
composición del grano de café verde es muy compleja, pero básicamente consta
de celulosas, lignina, grasas, cenizas, sacarosa, ácido clorogénico y proteínas.
Importantes investigaciones se han hecho para identificar compuestos químicos
precursores del sabor en el café verde, sin embargo las investigaciones más
importantes se han realizado en el café tostado (Belitz y Grosch, 1999).
Los constituyentes químicos del grano del café, son los que en última instancia
determinarán la calidad de la taza de café. Los factores que determinan estas
diferencias en composición todavía no se comprenden en su totalidad, sin
embargo es un hecho que entre estos factores se pueden nombrar: las variedades
cultivadas, el proceso post-cosecha, la sombra y la altitud (Decazy et al, 2003).
Belitz y Grosch (1999) consideran que el café verde está compuesto por una
buena parte de extracto soluble en agua, lípidos, azúcares, sacarosa, fibra cruda,
ácidos cítrico, málico, oxálico y clorogénicos, cafeína, trigonelina y minerales
(Tabla 1).
Tabla 1 .Composición química del café verde.
COMPONENTE CANTIDAD (% en extracto seco)
Extracto acuoso 29.0-36.2 Proteína bruta 8.7-12.2 Grasa 8.3-17.0 Azúcares reductores (Expresados como glucosa) 0-0.5 Azúcares reductores (Expresados como sacarosa)
2-9
Sacarosa 6-7 Fibra bruta 10-11.7 Acido cítrico 0.5-1.15 Acido málico 0-0.5 Acido oxálico < 0.2 Ácidos clorogénicos 4.5-11-1 Cafeína 0.9-2.6 Trigonelina 0.24-1.2 Minerales 3.0-5.4 Fuente: Belitz y Grosch (1999).
3.2.4 Características organolépticas del café
Puerta-Quintero (1996) explica que en la evaluación sensorial de la calidad de los
alimentos se usa el método de calificación por medio de escalas que describen las
categorías para cada característica del producto, esto se denomina método
descriptivo cuantitativo. Los laboratorios de catación de café analizan en base a
estas escalas una serie de parámetros complejos (aroma del café molido, aroma
de la bebida, la acidez, el amargo, el cuerpo, impresión global o sabor),
posteriormente a estos parámetros se les aplican técnicas de estadística: análisis
multivariado, distribución de frecuencias y perfiles de la taza de café para obtener
una valoración global del lote de café.
La relación entre la calidad de la taza de café y los constituyentes químicos del
grano pasan por la línea del análisis sensorial (Ojijo, 1993). Lo importante es que
evaluaciones de ese tipo se realizan gracias a técnicas sensoriales cuya base
envuelve tanto la percepción del aroma en el epitelio olfativo gracias a los
constituyentes químicos notablemente olorosos, como el sabor que se detecta en
la cavidad oral por los constituyentes físico-químicos de la bebida.
El objetivo de esta sección no es la mera compilación de listas, sino relacionar los
compuestos censados por la literatura en el café verde como precursores a otros
sabores en el café tostado, aquellos sabores que imparten las notas de sabores
claves en las evaluaciones de calidad de la taza.
Se hace énfasis en las contribuciones de los ácidos carboxílicos, por ser estos el
objeto de investigación en esta tesis.
3.2.4.1 Notas aromáticas comunes en el café y sus orígenes químicos o sustancias asociadas
Es importante destacar que la mayoría de las investigaciones con base en la
química sensorial del café se han realizado teniendo en cuenta el café tostado
(Holscher et al, 1990). Sin embargo, no hay que olvidar que los compuestos
químicos del café tostado tienen su origen en el café verde, por ello,
Merrit et al (1970) clasifican los compuestos precursores de compuestos volátiles
en el café tostado en los siguientes grupos: hidrocarburos, aldehídos, cetonas,
éteres, compuestos heterocíclicos, sulfurosos y aromáticos.
En el café, la complejidad de diferentes sustancias químicas se combinan de
formas diferentes para crear una armonía natural de notas distintivas del aroma.
En el argot del café, estas notas se reconocen de acuerdo a sus similitudes con
sensaciones o percepciones con odores similares de sustancias más familiares en
la vida ordinaria: “olor a madera”, “tierroso”, “mohoso”, “frutoso”, “floral”.
A continuación se presentan algunas de las notas aromáticas más importantes en
el café tostado, los compuestos químicos precursores en el café verde y cómo se
originan durante el procesamiento o las operaciones poscosecha.
Frutoso (Fruity): Este es un aroma que recuerda a frutas maduras. En
concentraciones moderadas, el aroma frutal es deseable puesto que acentúa la
percepción de fineza o acidez. Holscher et al (1990) atribuyen este aroma a
compuesto cetónico β-damascenona, este es un producto de carotenoides.
Otros compuestos que acentúan este aroma son los ácidos alifáticos de cadena
corta, especialmente el Ácido 2-ethil butírico (Ojijo, 1993).
Caramelo (caramelly): sensación aromática producida por un conjunto de
compuestos formados por azúcares con radicales carbonilo medianamente
volátiles, que encontramos en el olor del café y producen sensaciones que
recuerdan los dulces o jarabes. Es una nota apreciada y Holscher et al (1990) lo
asocian al furaneol (2,5 dimethil-4-hidroxi-3(2H)-furanona) el cual es un producto
de la degradación de carbohidratos. Otros compuestos que tienen influencia en el
aroma a caramelo son: alcohol furfural, ácido furancarboxílico, hidroximetilfurfural
(HMF), etilfuraneol, cicloteno, isomaltol, maltol, 5-hidroximaltol y 5-hidroxil-5, 6-
Hidromaltol (Dart y Nursten, 1985).
Otras notas aromáticas importantes son listadas por Sánchez-Martín (2005):
Fruto seco (nutty): Sensación aromática producida por una gama de aldehídos y
cetonas medianamente volátiles que recuerda a los frutos secos tostados.
Malteado (malty): sensación aromática producida por una gama de aldehídos y
cetonas moderadamente volátiles que producen sensaciones que recuerdan los
granos tostados.
Chocolatado (chocolaty): sensación aromática, producida por un conjunto de
compuestos, moderadamente volátiles, presentes en el retrogusto del café
(aftertaste), que producen sensaciones que recuerdan el chocolate amargo o
vainilla.
Especiado (spicy): sensación aromática producida por una gama de compuestos
hidrocarbonatos ligeramente volátiles presentes en el retrogusto del café, que
producen sensaciones que recuerdan a la corteza de la canela o del clavo de olor.
Terpénico (turpeny): sensación aromática producida por un conjunto de
hidrocarburos y nitrilos que aparecen en el retrogusto del café y produce una
sensación similar a las resinas, los productos terpénicos o medicinales parecidos
al alcanfor.
3.2.4.2 El café sobrefermentado y sus defectos asociados
Algunos de los defectos organolépticos más objetables son introducidos a los
productos de café por los llamados granos sobrefermentados o “malolientes”. Por
lo general la ocurrencia de estos granos se asocia a sabores frutosos, putrefactos
o desagradables, por lo general conllevan a la discriminación de los lotes
afectados en el comercio de café.
En su trabajo Bade-Wegner et al (1997) estiman que los compuestos ácido
2-metilbutanóico etilester (2-MBEE), ácido 3-Metilbutanóico (3-MBEE) y ácido
ciclohexanóico (CHEE), son responsables por el sabor sobrefermentado en cafés
arabica y robusta.
Algunas de las notas de sabor características al sabor sobrefermentado se notan a
continuación:
Herbal (Green): Es una nota aromática sugestiva de un verdor intenso como el
pasto. De acuerdo a Puerta-Quintero (1996) esta nota redunda en una evaluación
media para el aroma. Según Holscher et al (1990) su origen puede ser el resultado
del compuesto químico 2, 6 (E,Z-) nonadienal. El mismo autor también revela que
el compuesto n-hexanal imparte un odor similar. Ambos compuestos son
generados por la fracción lípida del café verde.
Maderoso (Woody): Ojijo (1993) estima que este es un defecto atribuido a la
sustancia nerolidol, un terpeno. Presumiblemente los terpenos del café tostado se
originan por diterpenos en el café verde (Arnaud, 1988). Otros autores (Viani,
1988; Parliment et al, 1973) han asociado al compuesto 2(E)-nonenal con esta
nota.
Carbonizado (carbony): sensación aromática originada por un conjunto de
compuestos heterocíclicos ligeramente volátiles, presentes en el retrogusto del
café, que producen sensaciones fenólicas similares a un cresol o la piridina, que
recuerdan las sustancias quemadas.
Uno de los defectos más nombrados en la literatura es el de los granos “rio”, este
se caracteriza por tener notas fenólicas, medicinales o mohosas.
Spadone y Liardon (1987) atribuyen al compuesto químico 2, 4, 6- Trichloro-
methoxi-benceno (TCA) como el responsable de este defecto. En otra
investigación Holscher et al (1995) concluyeron que posibles causas de la
generación de este compuesto pueden ser metabolitos de algunos pesticidas,
aunque antes, Dentan (1987) estimaba que los granos que exhiben estas
características son ricos en Aspergillus fumigatus.
Finalmente Cantergiani et al (2001) relacionaron el defecto mohoso/tierroso a los
compuestos geosmin, 2-metilisoborneol, 2, 4,6-tricloroanisol y en menor medida a
tres metoxi- pirazinas (2-metoxi-3-isopropil/-3-sec-butil-/-3-isobutil-pirazina). Como
posible causa incluyeron al secado durante la poscosecha.
3.2.4.3 Ácidos carboxílicos
Los ácidos carboxílicos pueden encontrarse de forma natural en las semillas de
café verde tanto de arabica como de robusta y aportan entre el 1.1-3.1%, en
porcentaje (m/m). Illy y Viani (1995), desglosan este aporte de la siguiente
manera: ácido fórmico (0.14%), acético (trazas), oxálico (trazas-0.2%), málico (0.3-
0.7%), succínico (trazas-0.15), cítrico (0.5-1.5) y quínico (0.3-0.6% en arábicas).
Al parecer la producción de ácidos carboxílicos en el café verde es un aspecto
determinante para la obtención de granos tostados balanceados en acidez (Illy y
Viani, 1995). En el café tostado han sido identificados cerca de 34 ácidos, 15 de
los cuales son volátiles y están presentes en pequeñas cantidades en el aroma.
En el tueste hay una reducción en la suma de cítrico y málico y aumenta en alguno
de los otros, como el quínico y ácidos volátiles.
Los ácidos acético, málico y cítrico son importantes para percibir la acidez. Los
ácidos presentes actúan sinérgicamente y sus efectos en el aroma son más
importantes que aquellos en su relación con el pH. La percepción de la acidez es
el resultado de un conjunto de efectos de todos esos ácidos juntos. De hecho, es
agradable si un ácido no prevalece, mientras comienza a ser desagradable si uno
de ellos predomina. Esto es debido a los efectos combinados de gusto, aroma y
sensaciones táctiles tales como cuerpo y astringencia.
Los datos cuantitativos de los ácidos carboxílicos del café tostado varían
dependiendo de la especie y variedad del café, del grado y condiciones de tueste.
Los aspectos negativos de los ácidos carboxílicos también han sido recopilados
por distintos investigadores, con especial énfasis en sus formaciones durante las
etapas de procesamiento (café verde).
Wootton (1966) mencionaba la relación entre algunos ácidos carboxílicos, el pH, la
degradación del mucílago y la formación de aromas desagradables en el café.
Hacía hincapié en los ácidos láctico y acético, los cuales parecen aparecer en
etapas tempranas de la fermentación. Los ácidos propiónico y butírico aparecen
en etapas más tardadas y posiblemente son los responsables por el aroma
defectuoso a “cebolla”. También reportaba la presencia de ácido fórmico.
Dinu (2001) estima que el ácido galacturónico es un constituyente fundamental de
los polímeros que forman las pectinas, las pectinas como se mencionará más
adelante son polisacáridos esenciales de las paredes celulares de las plantas.
López et al (1989) investigaron con más detalle la formación de ácidos
carboxílicos con relación al tiempo de fermentación, aunque no confirmó una
relación causal entre las concentraciones de estos ácidos y la degradación de la
calidad del café a lo largo del tiempo, este estudio sirve de guía para otras
investigaciones en esta línea. Encontraron los siguientes ácidos: galacturónico,
málico, láctico, cítrico y propiónico. El equipo de Avallone et al (2001b) utilizó
solamente ácido acético y ácido láctico como indicadores de progreso de la
fermentación, llegaron a la conclusión que estos ácidos tienden a aumentar a
medida que avanza el tiempo de fermentación y disminuyen los azúcares
(glucosa, fructosa y sacarosa).
3.3 DEL CAFÉ CEREZO AL CAFÉ PERGAMINO: UN PRODUCTO SENSIBLE
3.3.1 Cosecha
En su investigación, Guharay et al (2000) plantean que en Nicaragua la recolecta
inicia a mediados de octubre y finaliza a mediados de marzo. El estado de
madurez de las cerezas (o uvas) de café durante la recolecta es determinante en
la calidad final del café. Estas están maduras cuando el pericarpio es de color rojo
brillante, las sobremaduras son de color violeta a negro y las no maduras todavía
verdes. Para producir café de calidad Gutiérrez et al (2005) recomiendan
recolectar solamente cerezas maduras.
La cosecha puede ser mecánica, se han propuesto interesantes y sofisticados
mecanismos para la recolección de cerezas de café, por ejemplo: la cosecha
mediante el impacto a las ramas por medio de un equipo especial que también
desprende y recoge los frutos (García et al, 2001), o el sistema descrito por
Campillo et al (2001) en el cual un sistema de ventosas se encarga de agarrar y
desprender los frutos de café.
En la investigación de Tulet et al (1994) se presenta que tanto los costos, las
características inherentes del sistema de cultivo del café, como la mejor calidad de
los granos obtenidos hacen que el sistema de recolección manual sea el más
utilizado. En Nicaragua la cosecha se realiza de forma manual. Úbeda Aguilar
(1997) recomienda hacerla en tres etapas: el graniteo, el corte pleno y la repela.
La primera consiste en eliminar los primeros frutos maduros, brocados (afectados
por la broca del café: Hypothenemus hampei), sobremaduros, enfermos o
defectuosos, esto se hace para que el resto de la cosecha quede libre de estos
frutos y así evitar una calidad inferior de la cosecha. En la segunda etapa se corta
entre el 80% y 85% de la cosecha, poniendo atención en cortar solamente el café
maduro. Finalmente se debe hacer una repela cuando no quede más que un 9 a
13% de cosecha, aquí se debe de dejar libre la planta y el suelo de toda clase de
frutos para evitar que plagas como la broca se refugien en ellos.
El cómo optimizar la recolección manual es motivo de investigación en centros
como Cenicafé (Centro Nacional para la Investigación del Café, Colombia), el
trabajo de Vélez et al (1999) es una guía completa de cómo el recolector debe
realizar sus movimientos en el zurco, alrededor de la planta, con su cuerpo y con
sus manos.
3.3.2 Procesamiento post-cosecha
La transformación del café cereza en café pergamino se denomina beneficio del
café, este puede realizarse por medio de dos variantes: la vía húmeda y la vía
seca (Illy, 2000).
Puerta-Quintero (1999) plantea que el proceso por vía seca se utiliza para
procesar la mayoría del café robusta de África (con la excepción de Zaire),
también plantea que en Brasil se procesa por el mismo método tanto café arábica
como café robusta. En el proceso seco, luego de recolectadas, las cerezas de café
son secadas inmediatamente bajo el sol y se extienden alrededor de 30 kg/ m2.
Muchas veces es difícil conseguir que las muestras alcancen un contenido ideal
de humedad (12%) tan solo con el secado bajo el sol, por lo tanto un secado
artificial se realiza con la ayuda de secadores mecánicos (Soccol, 2003). Como
variante dentro del beneficiado en seco Belitz y Grosch (1999) indican que algunas
veces las cerezas frescas son apiladas y dejadas a merced de su propio calor
durante 3-4 días para que la pulpa se fermente, luego se llevan a un proceso
similar al anteriormente comentado. Los cafés aquí recolectados se conocen como
cafés naturales, marcados por su cuerpo.
El beneficiado húmedo es utilizado principalmente para procesar café Arábica en
América Central, Colombia y África. Muchos autores convienen que el café
producido por este método es el de mejor calidad (Flament, 2001; Belitz y Grosch
1999, Puerta-Quintero, 1999).
Con este método el fruto del café es transformado en tres etapas:
- La eliminación de la pulpa por fermentación y lavado.
- El secado y la obtención del café pergamino.
- El secado hasta un 12% de humedad, trillado, clasificado, selección y
ensacado.
Como se verá en el siguiente párrafo lo planteado por Daviron y Lérin (1990) no
siempre es aplicable a todos los países, ellos infieren que por lo general con los
cafés procesados por la vía húmeda, el productor organiza la recolecta y vende su
café en cerezas, raramente como pergamino, el cual se obtiene por lo general en
pequeñas unidades conocidas como beneficios húmedos. El descascarillado y la
clasificación se realizan en unidades más grandes (beneficios secos), los cuales
exigen inversiones más importantes, como por ejemplo en la utilización de
selectores electrónicos de granos.
3.3.2.1 El procesamiento del café en Nicaragua
El café procesado en Nicaragua es 100% Arábica (Gómez, 2005), razón por la
cual es de esperar que la vía húmeda sea la más utilizada por los productores en
detrimento de la vía seca (Berríos et al, 2005). Por su parte, Parrilli (1997) estima
que en la zona cafetalera de Carazo, por la cercanía entre las fincas y las plantas,
se realizan ambos procesos (beneficiado húmedo y beneficiado seco), mientras
que en Matagalpa, Jinotega y Nueva Segovia, por lo general las plantas sólo
hacen el beneficiado seco, dejando a los productores el proceso húmedo, con esta
división del procesamiento se obtiene mayor ventaja competitiva ya que muchas
veces los beneficios secos están relacionados con una comercializadora
exportadora.
En las recomendaciones para procesar cafés especiales, Berríos et al (2005) y
Gutiérrez et al (2005), consideran que el procesamiento del café por la vía húmeda
debe comprender las etapas fundamentales que se resumen en la Figura 3 y se
explican posteriormente.
Figura 3 - Diagrama de flujo del procesamiento de café por la vía húmeda
Normalmente el café es procesado mediante la vía húmeda, la cual consta de dos fases: el beneficiado húmedo y el beneficiado seco, por lo general el primero se realiza en las fincas de los productores y el segundo en un beneficio construido para este propósito. Adaptado de Soccol (2003).
• La recepción y la clasificación:
El café debe transportarse inmediatamente al beneficio húmedo. Se procura
eliminar los granos verdes, pintos o secos colocando cada tipo de grano en un
contenedor diferente.
Un registro de los envíos de café cerezo al beneficio húmedo es de suma
importancia para determinar el tiempo que ha transcurrido desde el corte del café
hasta su llegada al beneficio húmedo.
Una clasificación por medio de la prueba de flotación debe realizarse: esta
consiste en verter el café en una pila con agua. Los frutos y el material que flota
(frutos secos, brocados, enfermos, palos, hojas) deben ser retirados.
La mezcla de frutos con diferentes calidades disminuirá la calidad del café
obtenido.
• El despulpado
Después de la limpieza y clasificación, los frutos del café se procesan para
eliminar la pulpa. Esto se realiza por lo general con máquinas despulpadoras,
estas pueden ser de tambor o de disco (Sánchez-Martín, 2004).
En el caso de las despulpadoras de tambor, hay un cilindro giratorio con las
paredes interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un
tercio de su superficie. Los frutos se alimentan directamente desde los tanques de
clasificación al despulpador, resultando estrujados al entrar en el hueco,
rompiéndose el fruto y expulsando suavemente los granos recubiertos con la piel
apergaminada.
En los otros tipos de despulpadores, un disco vertical con una cara rugosa gira
junto a una placa lisa casi vertical, de modo que la abertura entre los dos,
ajustable, es menor en la dirección de rotación del disco.
Carpio Zavala (1998) reporta que cuando la despulpadora mecánica está mal
calibrada o cuando hay mezclas de variedades de cerezas, se dan heridas o
cortes en el grano verde que lo desvalorizan. También las diversidades en las
texturas y diámetros de las cerezas dificultan al trabajador elegir la calibración más
adecuada para el equipo. Una solución a esto es ajustar la despulpadora de
acuerdo al tamaño del grano, con granos más grandes al inicio de la cosecha y
más pequeños al final (Gutiérrez et al, 2005).
A pesar que Puerta-Quintero (2001) recomienda no utilizar agua ni para el
despulpado ni para transportar las pulpas o los granos despulpados, Sánchez-
Martín (2005) enfatiza que normalmente se utiliza en la práctica. Por otro lado es
de suma importancia limpiar diariamente la despulpadora, para evitar que se forme
suciedad y para retirar los granos que puedan estar atrapados, también se
recomienda revisar diariamente el funcionamiento del despulpador: en el caso que
se observe grano mordido, quebrado o machacado, se debe ajustar y corregir
cualquier problema (Berríos et al, 2005; Gutiérrez et al, 2005;
Carpio Zavala, 1998).
• La fermentación
En el transcurso del procesamiento del café por la vía húmeda, el café despulpado
debe someterse a una etapa importante para su preparación: el desmucilaginado
o fermentación. Aunque es posible utilizar máquinas para retirar el mucílago
(Oliveros y Roa, 1995), la verdad es que el método de la fermentación o
desmucilaginado natural es el que más se utiliza en Nicaragua.
El objetivo de esta fermentación es degradar el mucílago que se encuentra
adherido a la cascarilla del grano para obtener café pergamino que será
consecuentemente secado. En Nicaragua la fermentación se realiza en pilas de
concreto, madera o plástico, todas deben poseer desniveles apropiados y filtros en
las salidas. Carpio Zavala (1998) indica que la ventaja de utilizar pozas de
concreto es que es más fácil higienizarlas.
Como se verá más adelante (Sección 3.4.1.2) los tiempos de fermentación varían
de un sitio a otro dependiendo de un sinnúmero de factores y no debe ser
interpretado como un parámetro perfecto para determinar cuándo interrumpir la
fermentación (Carpio Zavala, 1998; Berríos et al, 2005).
Los productores utilizan como parámetro para determinar cuando la fermentación
se ha completado el llamado método tradicional o punteo, en este los productores
introducen hasta el fondo un trozo de madera grueso y limpio en diferentes partes
de la masa del café fermentado y luego lo retiran. Si al retirar el objeto de la masa
de café en fermentación quedara bien hecho el hueco dejado por el mismo, quiere
decir que el café ya está listo, entonces se debe proceder a lavar inmediatamente
el café (Jackels y Jackels, 2005).
Berríos et al (2005) recomienda el método de la muestra, el cual consiste en tomar
una muestra de café con la mano, si al apretarla está áspera y suena a cascarilla,
el café ya puede lavarse, si por el contrario el café está aún muy pegajoso, no
debe lavarse todavía. Se puede agregar un poco de agua para verificar si
desprende el mucílago o no.
• El lavado y la clasificación
El lavado se efectúa con el fin de eliminar del grano de café los productos de la
fermentación que ocasionan sabor agrio a la bebida de café, si no se retiran
rápidamente (Carpio Zapata, 1998; Puerta-Quintero, 1999), dentro de estos
productos se incluyen los restos del mucílago degradado (Belitz y Grosch, 1999).
Zambrano e Isaza (1994) reportan un consumo de agua de entre 20 y 30 L por
cada kg de café pergamino lavado.
Después del lavado la apariencia del grano pergamino debe ser limpia y de olor
agradable. El café que resulta del lavado se conoce como pergamino, al tacto este
debe ser limpio y al frotarlo entre los dedos y chocarlos entre sí deben sonar.
Por lo general el lavado se realiza en canales de concreto (o de correteo)
aledaños a las pilas de fermentación. Estos canales prueban ser muy eficientes
para clasificar los granos de café: por lo general los granos de inferior calidad son
arrastrados en primera instancia por la corriente, los granos de superior calidad
permanecen en la parte trasera del canal.
Wootton (1963a, b, c) hace énfasis en la influencia que puede tener la calidad del
agua durante el proceso de la fermentación y el lavado, otros autores, entre ellos
Puerta-Quintero (2001), alertan sobre la posibilidad de obtener café sobre-
fermentado o de muy mala calidad si se utiliza agua sucia o contaminada.
Gutiérrez et al (2005) previenen que el agua de lluvia captada por lagunas de
tierra o en pilas de agua puede ser otra causa de sabores y olores desagradables
en el café.
Puerta-Quintero (1999) plantea que café de excelente calidad se puede obtener
siempre y cuando se proceda a secar el café recién lavado. López et al (1989)
también consideran que los cafés que son sujetos a almacenamiento y contienen
una humedad cercana a 14% son susceptibles a desarrollar malos sabores y
aromas.
La etapa final del beneficiado húmedo, es decir antes de que el café abandone la
finca, es el secado en cajas de cedazo o zarandas, aquí los granos deberán de
moverse constante, evitando que hayan granos con diferentes grados de humedad
en un mismo lote. Muchas veces el tiempo de permanencia en estas zarandas es
como máximo tres días, tratando de cubrir el lote durante las noches o los días
lluviosos. Cuando hay condiciones para transportar el café hasta el beneficio seco,
se considera que el grano está “oreado”.
Es posible que en muchas fincas se requiera mano de obra para un preclasificado
en las cajas de cedazo, sin embargo un clasificado más eficaz se logra por medio
de los canales de correteo.
• El secado
Es la etapa del procesamiento húmedo en la cual se busca que el grano de café
pierda humedad. El contenido en agua de 65% que inicialmente tiene una cereza
de café, se reduce hasta un 10 a 12% (Illy, 2002).
El secado se realiza en los llamados beneficios secos, los cuales se encuentran
(caso generalizado en los departamentos de Matagalpa y Jinotega) en otro sitio
diferente al del área de cosecha y de beneficiado húmedo (Parrilli, 1997). De
acuerdo a Belitz y Grosch (1999) los granos pueden secarse al sol en pisos de
concreto (o como se puede apreciar en Sébaco, en otras superficies como el pasto
o sobre plásticos), también se suelen utilizar secadores mecánicos.
Roa et al (2000) presentan una variedad considerable de secadores: entre ellos
Wilken, Guardiola, Torres y Moreira. Todos comparten la peculiaridad que el gasto
de energía se centra en el poder calentar una masa de aire, la cual transmitirá el
calor a los granos de café. La eficiencia radica en el conseguir un secado
uniforme.
Algunos manuales de producción hacen mucho énfasis en las condiciones de
secado en patios (Roa et al, 2000). Este tipo de secado es el que se realiza en
Solcafé, la cooperativa que procesa la mayoría del café exportado como orgánico
o como comercio justo. Entre las recomendaciones principales que debe cumplirse
para procesar esos tipos de café, así como los cafés de calidad en general figuran
las siguientes:
- Darle prioridad al secado en patios de ladrillo o cemento, en detrimento del
secado sobre plástico. Estos patios deben de mantenerse limpios y libres de tierra.
- Se recomienda esparcir el café en capas que no sobrepasen los 5 cm y debe de
moverse constantemente con el propósito de obtener un punto de secado
uniforme.
-Durante las noches se amontonan y se cubren con láminas impermeables al agua
o con plásticos.
El indicador físico más importante para comprender la evolución del secado de los
granos es la humedad (Sánchez-Martín, 2005), sin embargo, Berríos et al (2005)
resumen una serie de indicadores alternativos o empíricos.
Con relación a la humedad, se debe tener en cuenta que inicialmente es de 53%
aproximadamente, cambios en la coloración del grano pueden ser de utilidad para
diagnosticar el contenido de humedad: un cambio de color de blanquecino a casi
negro surge cuando la humedad es cercana al 30%. El café está listo cuando se
tiene un color gris verdoso, característico de granos con un 12% de humedad o
con un color gris azulado que posee un 10% de humedad (Valencia, 1978).
• La trilla y la clasificación
Luego del secado los granos se llevan a unas máquinas de trilla para eliminar el
pergamino y finalmente se da brillo al grano y se eliminan los restos de cascarilla,
obteniéndose el café verde.
Sánchez-Martín (2005) comenta que los granos de café verde varían de tamaño y
forma, la razón de esto la da Illy (2005), al indicar que se busca uniformidad en el
producto, para asegurar la homogeneidad del tostado y de molido. La clasificación
se realiza con tamices perforados que funcionan mecánicamente y que separan
los granos según el tamaño. También se utilizan chorros de aire para eliminar los
fragmentos de granos y las sustancias extrañas.
La selección de los granos de color defectuoso se realiza a mano en la mayoría de
los casos, aunque se ha dado un gran desarrollo en los instrumentos de detección
fotoeléctrica para detectar y eliminar granos sobrefermentados (Gibson y Butty,
1976). Cada zona productora tiene sus propios números o nombres de
clasificación y distintos tamices de determinación.
• El almacenamiento
La susceptibilidad del café para obtener malos sabores y olores durante el
almacenamiento ha sido ampliamente descrita en la literatura sobre el tema,
algunos autores como Spadone y Liardon (1989) y López-Garay et al (1987)
sistematizaron los cambios en la calidad del café a lo largo del tiempo de
almacenamiento. Una conclusión importante de ambos estudios es que
independientemente de lo bien almacenado que se encuentre el café siempre va a
ver una degradación a lo largo del tiempo. Muy a pesar de esto, pueden
emprenderse algunas acciones para evitar dicha degradación en la calidad.
Dentro de estas recomendaciones, Berríos et al (2005) y Puerta-Quintero (2001)
recomiendan que la humedad de los granos se debe mantener con un 11% razón
por la cual la humedad relativa no debe sobrepasar el 65%.
Los aromas de sustancias químicas, fertilizantes, comidas, combustibles u otros
productos pueden contaminar fácilmente al café, razón más que suficiente para no
almacenar dichos compuestos cerca del café.
Berríos et al (2005) también recomienda almacenar el café en sacos de yute o en
sacos bien limpios y de preferencia nuevos. Al parecer el piso y las paredes de la
bodega pueden contaminar los granos, razón por la cual se debe evitar el contacto
con estos sacos.
3.4 LA FERMENTACIÓN DEL CAFÉ
De acuerdo a Tchana et al (1985) la forma en que se desarrolle la fermentación
tiene una gran influencia en la calidad final del café. Si el mucílago no es
eliminado, impide el proceso de secado y la superficie de los granos se vuelve
pegajosa, creando problemas de manipulación (Sánchez-Martín, 2005), también
se previenen las post-fermentaciones en el secado al sol y se evita un posible
deterioro de la calidad del café, que podría ocurrir como consecuencia de
fermentaciones indeseables (Berríos et al, 2005).
Si el mucílago debe ser eliminado, bien se podrían utilizar máquinas
desmucilaginadoras (Oliveros y Roa, 1995), sin embargo en Nicaragua el 89.5%
de los productores tienen fincas menores de diez manzanas y muchos de ellos
realizan el beneficiado húmedo en sus fincas (Gómez, 2005), la relación
producción-procesado no es lo suficientemente elevada para hacer una inversión
elevada en tecnología de este tipo (Parrilli, 1997) y Avallone et al (2002)
consideran la fermentación como el método más barato.
Por lo tanto al ser la fermentación tan importante en Nicaragua, se debe tener un
conocimiento adecuado de los mecanismos que se interrelacionan en la
degradación del mucílago, lo contrario puede llevar a sobrefermentaciones o
subfermentaciones, ambas son responsables de defectos en la bebida (Puerta-
Quintero, 1999; Wootton, 1963a).
En 1998, Wood planteaba que la fermentación en el café era el resultado de la
degradación de las pectinas del mucílago. Esta sección trata de poner en relieve la
validez de anteriores teorías con respecto a investigaciones más recientes y desde
esa base cimentar la aproximación teórica de esta tesis.
3.4.1 Principios básicos de la fermentación
3.4.1.1 Microorganismos
Muchas de las investigaciones sobre la microbiología de la fermentación del café
están orientadas a determinar las posibilidades de utilizar inóculos para optimizar
la fermentación mediante la disminución del tiempo que toma degradar el
mucílago (Wootton, 1963a). Otras investigaciones han tenido como objetivo
identificar los microorganismos responsables de malos aromas y sabores luego de
la fermentación (Vanos, 1987). Últimamente Avallone et al (2001b) han
demostrado que la forma más adecuada de controlar la fermentación no es
mediante el inóculo de colonias que produzcan enzimas pectolíticas, si no que una
fermentación controlable debería de buscar la optimización de la relación bacterias
y levaduras.
En la opinión de Silva et al (2000) hay tres roles importantes de los
microorganismos en el procesamiento del café: (i) producción de enzimas
pectinolíticas para degradar el mucílago (ii) generación de aromas y sabores
indeseables y (iii) producción de micotoxinas debido al pobre drenaje y
almacenamiento. Debido a las particularidades del procesamiento por vía húmeda,
existen posibilidades de contaminación por la máquina durante el despulpado.
Avallone et al (2001b) investigaron la relación entre la formación de
microorganismos (bacterias y levaduras) con parámetros bioquímicos
(degradación de azúcares y producción de ácidos carboxílicos). De acuerdo a
estos investigadores, las colonias que se aislaron con mayor frecuencias eran
coniformes comúnmente encontradas en el ambiente e identificados como
Klebsiella (73%) y Erwinia (28%). Otras especies que producen pequeñas
cantidades de ácidos carboxílicos (Erwinia, Aeromonas) también fueron censadas.
Es posible que el agua utilizada en el proceso de despulpado contenga cargas
superiores de microflora aeróbica mesofílica (enterobacterias). Por esta razón
Puerta-Quintero (1999) no recomienda utilizar agua durante el despulpado. Silva
et al (2000) identificaron 63 colonias de bacterias en cerezas de café.
Este equipo aisló muestras de bacterias lácticas (Ln. Mesenteroides dextranicum,
Lb brevis), ambas especies demostraron ser heterofermentativas, es decir podían
generar ácido acético y ácido láctico. Lb brevis se reporta como consumidora de
ácido galacturónico. Vanos (1987) identificó dos grupos de bacterias lácticas en
muestras de café sobrefermentado: Lactobacilli y Streptocci.
El equipo de Avallone et al (2001b) estimó la presencia de levaduras (Kloeckera,
Candida) con capacidades importantes para la producción de etanol.
Silva et al (2000) identificaron por su parte 15 géneros de levaduras en las
cerezas. Masoud et al (2004) subrayaron la importancia de las levaduras en el
proceso fermentativo: en su investigación estimaron un aumento importante en el
número de levaduras con predominancia de Hanseniaspora uvarum durante la
fermentación, sin embargo durante el secado dicha especie tendió a disminuir.
Con relación a los mohos, la investigación más extensa fue realizada por Silva et
al (2000) quienes aislaron 292 colonias e identificaron 282 a nivel de género:
Cladosporium (39.7%), Fusarium (34.2%), Penicillium (28.8%) y Aspergillus
(2.7%).
Los datos revelados por las investigaciones de Silva et al. (2000) indican la
predominancia de una fermentación dominada por bacterias, sin embargo, estiman
que los cambios de pH (la disminución de éste debido a la producción de ácidos
carboxílicos) conllevarían a un cambio en la relación entre bacterias y levaduras.
Estas últimas podrían perfectamente disminuir el pH en la ausencia de bacterias,
tal y como lo reportan Serrat et al (2002).
3.4.1.2 Tiempos de fermentación
Como ya se comentó, la interrupción de la fermentación viene determinada por el
punto el que el mucílago ya se ha degradado y debe lavarse. Se comentó sobre
los distintos indicadores para determinar el punto de lavado.
Uno de los indicadores es el tiempo de fermentación, aunque esto ya ha sido
desaconsejado debido a las particularidades medioambientales de cada “terroir”
(Decazy et al, 2003). Por esta razón, existe mucha variabilidad en cuanto a los
tiempos de fermentación reportados por distintos autores.
Jackels y Jackels (2005) reportan tiempos de 20 a 25 horas de fermentación en
fincas cafetaleras del norte de Nicaragua. Esto concuerda con lo que López et al
(1989) reportan como café correctamente fermentado (19 horas), por el contrario a
las 144 horas indicaban que el café estaba sobrefermentado.
En cafés del este africano, Wootton (1963c) reportaba que el mucílago se
despegaba completamente del pergamino en un tiempo de 36 a 84 horas, sin
embargo hacía mención de las opiniones divergentes en cuanto a la oportunidad
de disminuir o aumentar este tiempo mediante la adición de enzimas, la
fermentación bajo agua o la adición de soda cáustica (Tchana et al, 1985). En otro
artículo Wootton (1966) realiza una sistematización interesante sobre la relación
entre calidad del café obtenido en dependencia de pequeñas variaciones a la
fermentación tradicional (pre-lavado, agitación durante la fermentación), concluye
que a pesar de algunas cualidades visuales que pudieran adquirir los granos,
mediante tales variaciones, existen riesgos de alargar durante más tiempo la
fermentación y por lo tanto aumentar los costos. Quizás por estas razones aún se
considera la fermentación en seco o tradicional como la más utilizada (Avallone et
al, 2002).
Avallone et al (1999) realizaron sus experimentos con muestras de café arabica
que fueron fermentadas durante 20 horas.
Tchana et al (1985) reportan tiempos de fermentación de 16 a 72 horas en las
zonas caficultoras de Camerún, sin embargo en sus experimentos demostraron
que cuando se sobrepasaban 36 horas, los granos obtenidos eran susceptibles a
tener gustos indeseables.
Puerta-Quintero (1999) exponía que la fermentación se realizaba durante 12 a 18
horas y hacía énfasis en lo crítico que suponía este parámetro (el tiempo), puesto
que existe un riesgo real de obtener cafés sobrefermentados, también hacía
énfasis en el riesgo que supone mezclar cafés despulpados durante diferentes
tiempos. Sin embargo en otra publicación, Puerta-Quintero (2001) recomendaba
no dejar fermentar el café por más de 16 horas, justamente para evitarse riesgos
de obtención de cafés sobrefermentados.
Una de las razones por las cuales se inició el proyecto café por la justicia es para
determinar un parámetro más adecuado para determinar cuándo la fermentación
puede interrumpirse. Como se ha visto el tiempo de fermentación no parece ser un
parámetro apropiado.
3.4.2 Sobre la degradación del mucílago
3.4.2.1 El mucílago
En la opinión de Belitz y Grosch (1999) el mucílago está constituido por 84.2% de
agua, 8.9% de proteína, 4.1% de azúcares, 0.91% de sustancias pectínicas y por
0.7% de cenizas. Previos reportes acerca de la estructura del mucílago asumían el
mucílago como un hidrogel sin estructura celular (García et al, 1991).
En Avallone et al (1999) se plantea que el mucílago posee una estructura
convencional de tejido y posee paredes celulares constituidas por celulosa,
sustancias pectolíticas y polisacáridos. El espesor puede ser cercano a 300 µm y
las células que lo conforman son de dos a tres capas de células alongadas (largo
~160 µm; ancho de 15-50 µm), no se han observado paredes celulares
secundarias. La presencia de sustancias pécticas fue confirmada por Avallone et
al (2000) y en García et al (1991).
El mucílago que permanece luego del despulpado industrial y antes de la
fermentación está conformado principalmente por células alongadas que se
encuentran unidas al pergamino esclerenquimatoso por sus bases (Figura 4).
Figura 4 – Estructura del mucílago y del pergamino antes de la fermentación.
3.4.2.2 Gradiente osmótico y cambio de pH
Wootton (1963a, b) plantea que durante la fermentación, enzimas microbiológicas
o endógenas del café se encargarían de degradar las sustancias pectínicas del
mucílago, cambiando su textura de un hidrogel a un hidrosol (Carbonell y
Vilanova, 1952; Wilbaux, 1956; Rolz et al. 1982). Otros investigadores han
reportado la presencia de Kluyveromyces marxianus en aguas residuales del
lavado de café, esta levadura es productora de poligalacturonasa, una enzima
capaz de degradar las pectinas del mucílago (Serrat et al, 2002).
Esta hipótesis ha sido rebatida por Avallone et al (1999) quienes compararon la
estructura celular del mucílago antes y después de la fermentación (20 horas). Por
medio de técnicas microscópicas y por estudios bioquímicos de los constituyentes
polisacáridos del mucílago (Avallone et al, 2001a) se apreció que las sustancias
M-cw: Paredes celulares del mucílago, Pa: Pergamino, IE: Epidermis interior, Sc: Esclerénquima. Adaptado de: Avallone et al (1999)
pectolíticas no son fraccionadas durante la fermentación por enzimas endógenas o
bacteriales, en caso que fuesen fraccionadas sucedería a niveles muy bajos o no
detectables.
Un trabajo adicional presentado por Avallone et al (2002) sobre microorganismos
pectolíticos detectados durante la fermentación del mucílago demuestra que estos
producen la enzima pectateliasa a niveles óptimos de pH 8.5 (hay que tener en
cuenta que la fermentación se realiza en condiciones ácidas pH 5.3-3.5), por otro
lado, dicha enzima es incapaz de depolimerizar pectinas esterificadas del
mucílago sin previa de-esterificación.
Al inicio de la fermentación, poco antes del despulpado, el mucílago forma un
tejido continuo que cubre el pergamino. Cuando el mucílago está expuesto al aire
ambiental, la flora microbiológica natural empieza a desarrollarse en la superficie
del mucílago (Ver Sección 3.4.1.1). Estos microorganismos parecen ser
responsables de la disminución importante (∼60% luego de 20 horas) de la
concentración del total de azúcares simples (glucosa, fructosa y sucrosa) a
medida que la fermentación avanza en el tiempo, contrariamente la microflora
produce ácidos láctico y acético, lo cual induce una acidificación de un pH de 6.3 a
4.1 (Avallone et al, 2001b). Cuando las azúcares son metabolizadas, se induce un
gradiente de presión osmótica desde afuera hacia adentro del mucílago. Esto se
compensaría con un flujo de agua y posteriormente turgencia en las células. Es
muy probable que este gradiente de presión osmótica ejerciera suficiente presión
como para romper las paredes celulares en el sitio en que se unen al pergamino.
Simultáneamente, ácidos carboxílicos se producen e inducen un gradiente de pH,
al parecer la disminución del pH induce alteraciones fisico-químicas en las
paredes celulares, por ejemplo activación de enzimas en las paredes celulares,
alteración del gel péctolítico (Avallone et al, 1999).
En términos prácticos, estas nuevas hipótesis sobre la fermentación del mucílago
inducen a proponer la utilización de inóculos con buenas características
fermentativas. En Wootton (1966) se discute sobre bacterias lácticas como una
posibilidad, todo ello en detrimento de los microorganismos pectolíticos.
3.4.3 Hacia la propuesta de un indicador químico apropiado para la interrupción de la fermentación
Jackels y Jackels (2005) publicaron los resultados de un estudio de campo sobre
los cambios químicos que acompañan la fermentación del café in situ en cuatro
fincas del departamento de Matagalpa, Nicaragua. En ese estudio instrumentos
alimentados por baterías se utilizaron para medir temperatura, la concentración del
ion hidrógeno (pH), glucosa, etanol y ácido láctico a lo largo de siete lotes de café
en fermentación en tres fincas pequeñas y en una finca cafetalera grande. A pesar
que las condiciones como temperatura, altitud, infraestructura y tiempo de
fermentación variaron entre los lotes, se observó un patrón en el cual el pH se
presentaba inicialmente en el rango de 5.5-5-7 y posteriormente decaía de forma
abrupta a un pH de 4.6 cerca del fin de la fermentación. Un gráfico de este
comportamiento en el pH se muestra en la Figura 5:
Figura 5 - Comportamiento del pH en función del tiempo de fermentación.
Elapsed Time (h)
0 5 10 15 20
pH
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
Fuente: Jackels y Jackels (2005)
Inmediatamente después de despulpar el café y al inicio del proceso de
fermentación, el pH era de 5.5 o arriba y permanecía en este rango hasta 3-4
horas antes de completarse la fermentación (aproximadamente 16 horas en esta
figura). En ese momento empieza a decaer linealmente hasta al menos dos horas
después de completarse la fermentación. En los casos estudiados, el tiempo en
que se completaba la fermentación variaba desde nueve horas hasta casi veinte
horas. Basados en una comparación de siete perfiles de pH, se determinó que la
fermentación concluía a un pH de aproximadamente 4.6 (cuando se midió con
agua purificada que contenía sustancias amortiguadoras).
Este perfil de pH tiene una gran utilidad práctica para los productores de café
porque implica que una simple medida de pH de la masa de granos en
fermentación puede tener un valor predictivo para determinar cuando la
fermentación estará completada y también puede detectar si el lote se ha
sobrefermentado. Con una medición de pH el productor puede predecir si el lote
de café estará listo en 3 -4 horas y por lo tanto podría planear un lavado al
momento oportuno. Por otro lado, los productores también pueden determinar si
los granos se han sobrefermentado cuando realizan una primera valoración en la
mañana, en tal caso puede reajustar su horario diario de lavado para evitar tal
sobrefermentación en posteriores lotes. En cualquier caso este método tendría
más utilidad que el método tradicional (Sección 3.3.2.1).
Durante el estudio de campo, también se perfilaron los niveles de glucosa, etanol y
ácido láctico. Se observó que la concentración de glucosa disminuyó en el
transcurso de la mayoría de los lotes en fermentación, por el contrario las
concentraciones en etanol o ácido láctico aumentaron considerablemente
(aproximadamente de forma exponencial) cerca de completada la fermentación.
Estos indicadores, así como los eventuales estudios que se realizarían con otros
ácidos carboxílicos se relacionarían más con la calidad del sabor de café, como lo
evidenciarían las presencias de compuestos precursores de sabores
desagradables en la mezcla fermentativa que eventualmente influenciarían el
sabor en el café tostado (Holscher et al, 1990; Puerta-Quintero, 1999).
3.5 FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPEÑO (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una que es estacionaria (fase estacionaria)
mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección determinada. De
acuerdo a la naturaleza de las fases, Toshihiko (1999) clasifica la HPLC dentro
de la cromatografía líquido-líquido, la fase móvil la constituyen disolventes
orgánicos o acuosos con o sin modificadores, la fase estacionaria está formada
por moléculas unidas mediante enlaces covalentes a un soporte de sílica.
El objetivo de la técnica cromatográfica es la obtención de un cromatograma que
permita el análisis cualitativo y cuantitativo de todos y cada uno de los analitos
presentes en una muestra
Por la metodología de trabajo, la HPLC se clasifica como cromatografía de elusión
porque la muestra se introduce en un momento determinado y la fase móvil circula
continuamente. Los componentes de la muestra salen de la columna como zonas,
que en el caso ideal presentan una distribución gaussiana de concentración y
están separadas unas de otras (Figura 6).
Figura 6 - Cromatografía de elusión
Los siguientes componentes hacen parte de la HPLC:
- Eluyentes
- Sistema de impulsión
- Sistema de inyección de muestra
- Columna
- Detector
- Sistema de control y adquisición de datos.
El cromatograma que resulta cuando la fase móvil ha transportado al analito y este se manifiesta como un señal (respuesta del detector al analito que es graficada en dependencia del tiempo), esta señal forma picos, posteriormente se integra el área bajo los mismos (Adaptado de Willard, Merrit, Dean y Settle, 1988).
Figura 7 - Componentes del sistema de HPLC.
La HPLC puede ser de fase normal y de fase inversa.
La HPLC de fase normal posee una fase estacionaria polar, los componentes
más comunes son: gel de sílice, alúmina, gel de sílice modificado con grupos
amino, diol y ciano. La fase móvil por su parte es apolar (ciclohexano, CCl4,
tolueno, CHCl3, CH2Cl2, THF, dioxano).
En este tipo de cromatografía y como resultado de las interacciones analito- fase
estacionaria, en el cromatograma los compuestos menos polares aparecerán
antes que los compuestos más polares.
La HPLC de fase inversa está constituida por una fase estacionaria no polar cuyos
componentes más comunes son: sílica modificada con grupos C2, C8 y C18., sílica
modificada con grupos fenilo, o polímeros orgánicos poco polares (estireno-
divinilbenceno). La fase móvil es polar (agua, metanol, acetronitrilo).
Adaptado de Sadek (2000).
En el cromatograma los compuestos más polares y de menor tamaño aparecerán
antes que los compuestos menos polares y de mayor tamaño.
Existe una disponibilidad variada de detectores en HPLC, los más comunes son:
- Absorción Ultravioleta / Visible
- Índice de refracción
- Fluorescencia
- Conductimétrico
- Electroquímico
- Másico (dispersión de luz)
- Espectrómetro de masas
La Tabla 2 adaptada de Skoog et al (1998) compara las características de
estabilidad, selectividad, gradiente y sensibilidad para seis diferentes detectores.
Si se compara el detector de absorción UV-VIS, con los otros tipos de detectores
se puede notar que sus ventajas radican en su alta estabilidad, sin embargo su
selectividad es media y su sensibilidad es variable.
Tabla 2 - Comparaciones entre distintos tipos de detectores
Detector Estabilidad Selectividad Gradiente SensibilidadAbsorción UV-VIS Alta Media Si Variable (alta)
Índice de refracción Baja No No 500 ngFluorescencia Alta Si Si Variable (0.1 ng)
Conductimétrico Baja Si No 5 ngElectroquímico Baja Si Si 0.01 ng
Másico Media No Si 50 ng
Fuente: Skoog et al (1998)
4 MARCO METODOLOGICO
4.1 DISEÑO EXPERIMENTAL
4.1.1 Tipo de estudio
La investigación consistió en un estudio experimental en el cual se aplicó un
diseño con grupos aleatorizados y posprueba únicamente. Esto conllevó a la
formación de tres grupos. Un cuarto grupo: “inicial”, se utilizó como control.
4.1.2 Universo de estudio
Se estableció como el Universo de estudio el total de lotes de café recolectados
y procesados a razón de un lote por día en el beneficio húmedo de la finca La
Canavalia (San Ramón, Matagalpa, Nicaragua) entre el 1º de diciembre del 2005
al 30 de enero del 2006.
4.1.3 Muestra
La investigación se realizó con 10 muestras de café despulpado. Cada una de
estas muestras provino de un lote diferente de café procesado en la finca La
Canavalia. Para seleccionar los lotes se utilizó un muestreo no estadístico, más
bien resultante del criterio de los investigadores: cada muestra provenía de una
fecha diferente y de acuerdo al plan de recolecta de café de la finca, esto brindó
mucha variabilidad al café tomado como muestra. Por otro lado, para seleccionar
la muestra representativa de cada lote (60 kg) se utilizó un muestreo aleatorio
simple.
4.1.4 Montaje experimental
Para cada muestra se formaron tres grupos (G1, G2, G3), con dos repeticiones de
10 kg cada uno. A la variable independiente de estos grupos se aplicó un
tratamiento (X1, X2, X3). Las consecuencias del tratamiento se observaron en la
variable dependiente (O1, O 2, O 3). Ver Tabla 3.
Tabla 3 - Montaje experimental
RG1 (duplicado) X1 (Interrupción de fermentación pH= 4,8-4,5) O1 RG2 (duplicado) X2 (Interrupción de fermentación pH= 4,4-4,1) O2 RG3 (duplicado) X3 (Interrupción de fermentación pH= 4,0-3,6) O3
R= Formación aleatoria de los grupos (de Random, en inglés)
4.1.5 Variables e indicadores
La Tabla 4 presenta la operacionalización de las variables independiente y
dependiente. Debido a la complejidad de esta última, se ha decidido dividirla en
seis subvariables: estas son los ácidos cuyas concentraciones se analizaron de
forma similar (por eso es el mismo indicador).
Tabla 4 - Variables e indicadores
Variable
Sub variable Indicadores Escala de medida
Tipo de variable
Tipo de escala de medida
pH de interrupción de fermentación (Independiente)
Valor de pH pH Cuantitativa Continua
Escala de proporción o razón
Á. Acético Á. Fórmico A. Propiónico A. Láctico A. Cítrico A. Málico
Concentración de ácido orgánico. (Dependiente)
A. Galacturónico
Altura y área de pico del analito en el cromatograma (Cromatografía líquida de alto desempeño)
Concentración (masa /Volumen)
Cuantitativa continua
Escala de proporción o razón
4.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
La Figura 8 resume las etapas que se realizaron en la fase experimental. A
grandes rasgos se puede dividir en: (a) una etapa de procesamiento previo de las
muestras, muchas tareas fueron realizadas por el personal de la finca, razón por la
cual se puede considerar que las muestras eran representativas de las
condiciones de procesamiento locales. (b) Una etapa experimental en la cual las
muestras fueron monitoreadas y se les aplicó el tratamiento.
Figura 8 - Diagrama de flujo del proceso experimental, Finca la Canavalia.
Nótese que solamente 200 g de la muestra se destinaron para los análisis cromatográficos. La mayor parte de las muestras se utilizaron para una investigación (Jackels et al, 2006) sobre las cualidades de las bebidas producidas por los distintos lotes de café.
4.2.1 Recolección de las muestras
La fase experimental se realizó en la finca cafetalera La Canavalia (Figura 35,
Anexos, Sección 10), esta se localiza en la Comunidad Yasica Sur, Municipio de
San Ramón, Matagalpa (Figura 34, Anexos, Sección 10) . La altitud de la finca es
de 747 m.s.n.m. Posee una temperatura que oscila entre los 20º a 26º C. y una
pluviosidad que varían entre los 2000 a 2400 mm (INIFOM, 2001).
En Nicaragua predomina el cultivo de la especie Coffea arabica, por tanto esa fue
la especie que se tomó para realizar los experimentos y específicamente la
variedad caturra, la cual predomina en las plantaciones de La Canavalia.
Se hizo coincidir la realización de los experimentos con la época de cosecha de
café. De esta forma, la proveniencia de los lotes de café estaba en dependencia
del plan de corte de la finca.
La Tabla 5 presenta las fechas en que se recolectaron las muestras así como el
día en que se concluyó el experimento. Es de notar que los experimentos
concluyeron normalmente un día después de recolectadas las muestras, más
adelante se discute el porqué.
Tabla 5 - Identidad de lote procesado, fecha de recolección de muestra y fecha de conclusión del experimento.
Día ID experimento
Fecha de recolección de muestras
Fecha de conclusión del experimento
1 B 29-dic-06 30-dic-06 2 C 30-dic-05 31-dic-05 3 D 31-dic-05 01-ene-06 4 E 02-ene-06 03-ene-06 5 F 03-ene-06 04-ene-06 6 G 04-ene-06 05-ene-06 7 H 06-ene-06 07-ene-06 8 J 07-ene-06 08-ene-06 9 K 08-ene-06 09-ene-06
10 L 09-ene-06 10-ene-06
Antes del despulpado, el café se separó por categorías: los granos rojos, los
granos verdes y los granos oscuros (Figura 9). Posteriormente, los granos se
vertieron en un tanque lleno de agua, allí se identificaron y eliminaron aquellos que
flotaban (clasificado).
Figura 9 - Separación de granos de café de acuerdo a su estado de madurez
Las muestras de café que se utilizaron para los experimentos siguieron el mismo tratamiento que el café recolectado en la finca. Se procuró realizar una selección de granos rojos y se descartaron granos verdes y sobrefermentados (de color más oscuro) Cortesía de S. Jackels.
4.2.2 Despulpado
El despulpado de las muestras de café se realizó con una despulpadora de
tambor, este tipo de despulpadora consiste en un cilindro giratorio con las paredes
interiores rugosas y con una cubierta estacionaria o coraza que cubre un tercio de
su superficie. El espacio entre el tambor y la coraza es ajustable y disminuye en el
sentido de giro del tambor. Los frutos se alimentaron mediante un sistema de
tuberías directamente desde los tanques de clasificación al despulpador,
resultando estrujados al entrar en el hueco, rompiéndose el fruto y expulsando
suavemente los granos recubiertos con la piel apergaminada. La capacidad media
de este despulpador fue de 1200 a 1500 Kg/h de frutos.
La finca adquirió este despulpador gracias al apoyo de CRS en fechas recientes,
por lo tanto al ser relativamente nuevo y estar bien ajustado, se obtuvieron granos
con calidad aceptable de despulpado (pocos granos presentaba pulpa adherida).
4.2.3 Fermentación
Luego de despulpados, los granos de café se depositaron en un tanque de
fermentación. Se procedió a seleccionar 60 kg de forma aleatoria, procurando
obtener una cantidad representativa de todo el lote. Los 60 kg se distribuyeron a
razón de 10 kg en cada uno de los seis recipientes exclusivamente diseñados para
los experimentos (Figura 10).
Figura 10 - Recipientes de fermentación del café
(a) El conjunto de fermentación de café consistió en cuatro elementos: dos baldes, una tapa de filtro de lixiviados y un aislante. El recipiente de recolección de lixiviados permitió reproducir las condiciones de buenas prácticas de fermentación recomendadas por Gutiérrez, Medina y Gómez (2005) y Aguilar (1997) sobre la instalación de drenajes en las pilas de fermentación con el fin de evacuar esos lixiviados. (b) El sistema de fermentación en funcionamiento: 10 kg de café recién despulpado es vertido en los baldes experimentales.
a
b
Cortesía de S. Jackels.
4.2.4 Control experimental
4.2.4.1 Matriz para el control de datos
Con el fin de monitorear las condiciones experimentales, se ideó un instrumento
de trabajo opcional: una ficha de laboratorio para registrar los cambios surgidos en
la variable independiente (pH) a lo largo del tiempo. Esta ficha se presenta en la
Figura 11, consta de dos filas con los datos generales: el código del experimento
(ID, el mismo código que se mencionó en la Tabla 5), las fechas (la fecha en que
inició y la fecha en que concluyó), la hora en que se realizó el despulpado. La
columna de las Mediciones contiene información sobre los datos que se debían
de registrar cada vez que se indagaba sobre el estado de la fermentación: la hora
en que se realizaron las mediciones, la temperatura de los granos en
fermentación, el pH medido con Reflectoquant ®, el pH medido con cintas de
color, la concentración en parámetros químicos (etanol, ácido láctico, glucosa).
Cabe destacar que el pH medido con Reflectoquant fungía como control, ya que
normalmente los productores utilizarán el método de las cintas de color. Teniendo
en cuenta los factores de incertidumbre ligados a la lectura de las cintas de color,
el método cuantitativo de Reflectoquant ayudará a precisar el grado de exactitud y
validez de las lecturas cualitativas.
La columna de los números de baldes señala que a cada uno de los seis baldes
se les dio un código distinto (ver última fila: código del lote) y por lo tanto se
trataron como mediciones independientes.
Se puede notar que existen algunas columnas especiales que contienen la
inscripción “Lavado del set #”, esto indica que cuando alguno de los lotes
presentes en los baldes alcanzara el pH indicado (≈4.6, ≈ 4.1, o ≈ 3.9), se
procedía a interrumpir la fermentación y era necesario lavar las muestras para
eliminar el mucílago remanente.
Figura 11 Hojas de datos utilizadas para el control experimental de lotes de café en la fase experimental.
(a) En la primera hoja se indican los datos generales, el inicio de la fermentación, datos intermedios y se registra si se tomaron muestra para el primer lavado (pH≈ 4.6).
(b) En la segunda hoja se incluyen los datos relevantes sobre las muestras a las que se ha de hacer la segunda interrupción de la fermentación (pH≈4.1) y en la tercera interrupción (pH≈3.9).
4.2.4.2 Medición de la temperatura
La temperatura se registró mediante un termómetro digital. Este se introdujo
durante unos segundos (hasta que los datos fueran constantes) en la masa de
granos en fermentación.
4.2.4.3 Medición del pH
Los granos de café se obtuvieron de la masa de café en fermentación. Con una
cuchara grande se hizo un hoyo en el centro de la masa, se levantaron granos del
centro de la masa (20 gramos) y se llenó hasta la marca del vaso marcado
“granos”. Se llenó de agua pura (20 mL) el vaso marcado “agua” hasta la marca.
Luego el agua se agregó al vaso “granos” y se revolvió por 15 segundos.
Posteriormente el pH se midió por uno de dos métodos:
(a) Cintas de pH, colorpHast ® de EMD Chemicals. Se disponía de un set de
cintas que marcaban en el rango de 4.0-7.0 (Catálogo EM-9582-1) y otro en el
rango de 2.5-4.5 (Cat. EM-9581-3).
Se introdujo la cinta de pH en la solución de la taza “granos” y se mantuvo
sumergida por 5 segundos. Se sacó la cinta y se removió el exceso de líquido.
Inmediatamente se comparó la cinta de pH con la tarjeta de colores para
determinar el valor de pH. Si el color concordaba con la tarjeta, se anotaba el
número. Si el color estaba entre dos bloques de colores se anotaba el número
entre los dos bloques de colores
(b) Cinta de Test pH en el rango de 1.0- 5.0 (Cat. EM-16894-1) para el Sistema de
Análisis Reflectoquant ® (Cat. EM-16950-1) de EMD Chemicals.
Ambos datos se registraron en la anterior hoja de datos.
4.2.4.4 Medición de ácido láctico
Solamente se midió la concentración de ácido láctico antes de lavar las muestras
cuyo pH hubo alcanzado el valor deseado. Esto se hizo con la misma solución de
granos y agua a las que se midió el pH.
Para ello se utilizó el mismo sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de
ácido láctico (Cat. EM-16127-1) cuyo rango de medición oscila entre 1-60 mg/mL.
Este test determinó la presencia de ácido láctico total (suma de D-Láctico y L-
Láctico),
4.2.4.5 Medición de Glucosa
La concentración de glucosa se midió solamente antes de lavar las muestras cuyo
pH hubo alcanzado el valor previsto en el diseño experimental. Se utilizó el
sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de glucosa (Cat. EM-16720-1)
cuyo rango de detección oscila entre 1-100 mg/mL. Los datos se agregaron a la
matriz de registro de datos.
4.2.4.6 Medición de etanol
Al igual que los otros dos parámetros, los registros se hicieron solamente cuando
las muestras alcanzaron un pH deseado para su lavado. También se utilizó el
sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de etanol (Cat. EM-16130-1) con
un rango de detección entre 20-200 mg/mL).
4.2.4.7 Medición de ácido málico (Fase de laboratorio solamente)
Solamente se midió la concentración de ácido málico durante la fase de
laboratorio (Sección 4.3). Esto se hizo con la misma mezcla de granos y agua a
las que se midió el pH.
Se utilizó el sistema Reflectoquant ® con cintas de medición de ácido málico cuyo
rango de medición oscila entre 1 – 60 mg/mL. En la fase de laboratorio por lo
general las muestras se diluyeron a un factor 1:10.
4.2.5 Interrupción de la fermentación
4.2.5.1 Toma de muestra y refrigeración para posterior análisis cromatográfico
Cuando la muestra alcanzó el pH requerido, y antes de proceder al lavado del café
contenido en determinado balde, se procedió a tomar alrededor de 500 g de forma
representativa del café contenido en dicho balde.
Estas muestras de café se empacaron en bolsas plásticas con cierre hermético y
se guardaron apropiadamente en el congelador de la finca (que tenía temperatura
cercana a los 0ºC).
Para transportar las muestras hasta Managua y posteriormente hasta el
laboratorio en Seattle, se utilizaron hieleras portátiles con congelantes químicos,
para mayor seguridad se mantuvo la temperatura cercana a 0ºC dentro de estas
hieleras.
Las muestras permanecieron en un congelador a una temperatura constante y
cercana a 0ºC hasta que se realizaron los análisis cromatográficos.
De acuerdo a Masoud et al (2004) la temperatura cercana al punto de
congelamiento es un método para interrumpir la fermentación, ya que se logra
disminuir el crecimiento de la microflora a niveles en los cuales la producción de
subproductos metabólicos no es considerable.
4.2.5.2 Lavado de muestras para posterior catación
Luego que se separaron 200 g para congelamiento, el resto de la muestra de café
dentro de cada balde se utilizaría para una catación profesional.
Esta catación permitiría tener una idea de las diferencias entre las calidades
obtenidas para los distintos lotes, como complemento al análisis cromatográfico de
los ácidos carboxílicos (Jackels et al, 2006).
Para interrumpir la fermentación, se realizó un “lavado” a pequeña escala de la
muestra contenida en el balde. En condiciones normales, los productores utilizan
grandes cantidades de agua y grandes tanques para realizar este lavado.
Para lavar cada una de las muestras se utilizaron seis barriles de agua limpia y un
cucharón de aluminio. El objetivo era remover el mucílago que pudiera quedar
adherido a las paredes.
Con ayuda de un colador se retiraron todos los materiales flotantes y de forma
manual se retiraron los restos de pulpa.
4.3 PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO
La fase de laboratorio se realizó en tres etapas sucesivas (Figura 12):
primeramente, una etapa de extracción de los ácidos carboxílicos con el fin de
obtener una solución diluida del mucílago presente en cada una de las muestras.
Esta solución fue posteriormente analizada mediante HPLC.
De forma paralela se realizó un monitoreo rápido mediante la técnica de las cintas
de pH, ácido láctico y ácido málico del sistema Reflectoquant ® (Ver
Sección 4.2.4).
4.3.1 Protocolo de extracción de ácidos carboxílicos.
El protocolo indicado en la Figura 12, estaba diseñado para analizar cada una de
las muestras por separado. Por esta razón, antes de iniciar con el
descongelamiento se levantó un registro de las muestras que había en existencia
y posteriormente se decidió realizar las extracciones en el orden correspondiente a
cada experimento. De esta forma, cada día se realizaron solamente extracciones
para las muestras de un día de experimentos.
Puesto que el objetivo era realizar las diluciones de acuerdo al mismo factor de
dilución con que se realizaron durante la fase experimental (en ese entonces se
llenó un vaso plástico con granos de café hasta la marca de 50 mL), de cada una
de las muestras descongeladas se tomó el equivalente a 30 g de café y se agregó
un volumen de 50 mL de agua destilada con calidad HPLC.
Figura 12- Diagrama de flujo de la fase de laboratorio.
A grandes rasgos la fase de laboratorio se dividió en tres etapas importantes: la extracción de los ácidos carboxílicos, la medición de parámetros químicos (pH, ácido láctico y ácido málico) para tener una impresión inicial de la muestra antes de realizar el análisis cromatográfico y la cuantificación cromatográfica.
Las muestras se agitaron durante 45 minutos con un agitador magnético,
experimentalmente se determinó que este era el tiempo más conveniente para
extraer el mucílago que permanecía adherido a los granos de café. Se llegó a esta
conclusión tras realizar análisis de muestras variando el tiempo de agitación
sucesivamente en 30, 45 y 60 minutos.
Luego de la agitación, se extrajo líquido sobrenadante con la ayuda de una pipeta
Pasteur y se distribuyó en cuatro viales de 1 mL. Con la ayuda de una micro
centrífuga se procedió a centrifugar a una velocidad de 10 000 revoluciones por
minuto durante cinco minutos.
Se decantó la solución sobrenadante de los viales con ayuda de la pipeta Pasteur
en un filtro de micro fibra de vidrio de 0.45 µm. Posteriormente la solución filtrada
se vertió en una jeringa y se hizo pasar por un filtro de 0.2 µm de nylon.
La solución obtenida estaba lista para ser analizada por medio de HPLC antes de
mezclarla con un patrón interno (Ver la Sección 4.3.4) bajo determinadas
condiciones cromatográficas y a un factor de dilución específico
(Ver Sección 4.3.2).
Los volúmenes de la muestra (1400 µL) y el del patrón interno (200 µL) se
midieron con una micro pipeta (rango de 100 a 1000 µL), estos se vertieron en
viales de 1.5 mL para HPLC y se sellaron con un tapón de caucho. Una vez
sellados se agitaron fuertemente y se colocaron en el auto inyector del HPLC.
La Tabla 6 resume los materiales y equipos que se utilizaron durante la etapa de
extracción de los ácidos.
Tabla 6 - Materiales y equipos utilizados durante la fase de laboratorio (etapa de extracción de ácidos carboxílicos y de monitoreo rápido con Reflectoquant)
Etapa Material Cantidad Fabricante Pesado Balanza analítica 1 ScienTech,
Loveland, CO, USA Espátula 1 Beaker de 150 mL 1 por muestra Adición de agua Agua HPLC 50 mL Acros, New Jersey,
NJ, USA Probeta de 50 mL 1 Agitación Agitador magnético
con imanes 1 por muestra Hach, Loveland, CO,
USA Cronómetro Centrifugado Pipeta Pasteur 1 por muestra Fischer Scientific Viales de
centrifugado 4 por muestra
Micro centrífuga 1 Filtrado Microfiltro de 0.45
µm 1 por muestra Whatman Schleider
& Schuell, New Jersey
Microfiltro de 0.2 µm 1 por muestra Fischer Scientific Vial con tapa de
rosca para preservar el filtrado.
1 por muestra
Encapsulado para HPLC
Viales para HPLC 1 por muestra Agilent
micro pipeta, rango 100 a 1000 µL
1 Gilson pipetman
Puntas para micro pipeta
1 para muestra,1 para patrón interno
Medición rápida de parámetros químicos
Procesador Reflectoquant
2 EMD Chemicals
Cintas reflectoquant 1 set de 50 cintas (Ácido láctico, málico, pH)
EMD Chemicals
4.3.2 Condiciones de análisis cromatográfico
El instrumento de HPLC con el cual se realizaron los análisis está constituido por
un set de módulos individuales (Figura 13):
1. Un reservorio de solventes para la fase móvil. Como fase móvil se utilizó
una solución de fosfato de amonio dibásico (NH4H2PO4) al 0.5 % a un pH
de 2.8. Esta fase móvil la recomiendan López et al (1989) para el análisis
con HPLC de ácidos carboxílicos en el mucílago del café. Antes de
empezar a utilizar la fase móvil se desgasificó por medio de un
desgasificador de ultrasonido, el propósito era evitar que burbujas
interfirieran en el análisis.
2. La fase móvil se distribuía a la columna por una bomba, en este caso se
utilizó una bomba ISCO, modelo 2350. Esta debía ser programada para que
fluyera la fase móvil a una presión constante. Se controló la presión y el
flujo (volumen /min) porque de esta forma habrá una separación constante
basada en la presión y en el tiempo de análisis. En este caso se utilizó un
flujo isocrático (constante) de 0.8 mL/min y la presión se mantuvo en el
rango de 740 - 810 PSI.
3. Antes de la columna de separación se recomienda colocar una “columna de
protección” o “pre-columna” para prevenir la contaminación o daños en la
columna principal por partículas pequeñas presentes en la muestra o en la
fase móvil. Para este análisis se ha utilizado una precolumna Prevail para
ácidos carboxílicos (Diámetro interno de 4.6 mm y largo de 7.5 mm).
4. La columna de separación contiene el “empacado” necesario para cumplir
con la separación deseada de compuestos. En este caso se utilizó una
columna de fase inversa Alltech Prevail para ácidos carboxílicos, con 5µm
de empacado, con diámetro interno de 4.6 mm y largo de 150 mm (Alltech
Chromatography, Deerfield, IL, EEUU).
5. El inyector automático utilizado, Alltech 570, trae incorporado su
controlador. Posee un carrusel con espacio para 100 viales, en cada vial
(cuya capacidad es de 1.5 mL) se puede colocar una muestra. El
controlador solamente permite controlar para el conjunto de muestras los
parámetros de volumen de inyección (20 µL), el número de repeticiones (3),
el tiempo de análisis (20 minutos). Luego de cada inyección, para evitar
cualquier contaminación, el circuito en contacto con la muestra se enjuaga
con el mismo líquido de la fase móvil, se programó un volumen de 100 µL
para este enjuague.
6. Se utilizó un detector de absorbancia Ultravioleta/ Visible, Spectraphysics,
SP 8450. Este permitió ajustar la longitud de onda en 214 nm, tal como
recomiendan López et al (1989) para la detección de ácidos carboxílicos en
muestras de mucílagos de café.
7. Para la recolección de datos se utilizó el sistema Peak Simple, el cual está
compuesto por un hardware y un software. El detector se conecta
directamente al hardware, posteriormente la señal es enviada al sistema de
análisis por medio del software Peak Simple V. 3.29 de SRI, Inc (2004).
Este sistema permite simplificar la integración manual y automática de las
áreas bajo los picos, identificar los picos en el cromatograma (“agregando”
componentes en dependencia de sus tiempos de retención), realizar tareas
más complejas como la extrapolación de diferentes cromatogramas,
exportar los resultados hacia otros programas como Microsoft Excel ®,
guardar los cromatogramas en archivos y posteriormente abrirlos en
cualquier otra computadora, obtener reportes impresos de los datos
obtenidos.
Un resumen de las condiciones de análisis cromatográfico se presenta en la
Tabla 7.
Tabla 7 - Condiciones de análisis cromatográfico.
Compuesto Fosfato de amonio dibásico 0.5%, pH 2.5-2.8
Bomba ISCO 2350 Flujo 0.8 mL/min
Fase móvil
Presión 740-850 PSI Tipo de columna Fase inversa, Alltech Prevail para ácidos
carboxílicos. Dimensiones (diámetro interno x largo)
4.6 x 150 mm
Fase estacionaria
Diámetro del empacado 0.5 µm Modelo Alltech 570, inyector automático Volumen inyectado 100 µL Número de inyecciones 3 Tiempo de análisis 20 minutos
Inyector
Volumen de enjuague entre inyecciones
100 µL
Modelo Spectraphysics, SP 8450. Detector Longitud de onda 214 nm Hardware Sistema Peak Simple Recolección de
datos Software Peak Simple, V. 3.29, SRI, Inc (2004)
Figura 13- Módulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigación.
Los módulos del sistema HPLC utilizados en la presente investigación consisten en (a) Reservorio de solventes para la fase móvil (b)Un sistema de bombeo ISCO 2350, ISCO inc, USA acoplado a un sistema de programación por gradiente ISCO 2360 (c) Inyector Alltech 570 (d) Columna Alltech Prevail para ácidos carboxílicos, Chrom 9384 (e) Detector Ultra Violeta Spectraphysics, SP 8450 UV/Vis Detector (f) Sistema para colectar los datos Peak Simple Chromatography Data System (g) Computadora para visualización y almacenamiento de la información, se utilizó el software Peak Simple Version 3.29 de SRI, Inc (2004).
4.3.3 Análisis cualitativo
El análisis cualitativo tiene como objetivo identificar los tiempos de retención o el
orden de elusión de los compuestos en una muestra, en este caso los ácidos
carboxílicos, para esto se hicieron los siguientes ensayos:
1. Inyección de muestras estándares de los ácidos carboxílicos que se
presumía estarían presentes en las muestras de café. Se utilizaron ácidos
carboxílicos (galacturónico, málico, cítrico, láctico, propiónico, acético y fórmico)
diluidos en agua destilada con calidad HPLC, algunas características de estos
ácidos se detallan en la Tabla 8. Para cada ácido se analizaron cinco
concentraciones diferentes (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL), se registraron los tiempos y por
ende, el orden de elusión de los compuestos. Las condiciones de análisis se
presentan en la Tabla 9.
Tabla 8 - Características de los ácidos carboxílicos utilizados como estándares.
Ácido Grado de pureza
Fabricante Fórmula Peso Molecular
(g/mol)
Fase
Fórmico 95 – 97% Sigma Chemical, USA
HCOOH 46.0 Líquido
Propiónico ND ND CH3CH2COOH 74.0 Líquido Galacturónico 98% Fluka, Suiza C6H9NaO7 216.12 Sólido
Málico ND Sigma, China C4H6O5 134.09 Sólido
Láctico ND J.T. Baker Chemical, USA
C3H6O3 90.1 Líquido
Acético 100% Fisher Scientific, USA
CH3COOH 60.0 Líquido
Cítrico 99.9% J.T. Baker Chemical, USA
H3C6H5O7 192.13 Sólido
ND: No indicado en el envase pero mayor a 95% de acuerdo a los registros del inventario
en el laboratorio.
Tabla 9 - Condiciones de análisis cromatográfico para el análisis cualitativo (tiempos y orden de elusión de ácidos carboxílicos)
Sistema de bombeo: Beckmann. Sistema de inyección: Inyector automático Alltech 570. Volumen de inyección: 100 µl Columna: Alltech Prevail para ácidos carboxílicos Chrom 9384 Fase móvil: Fosfato de amonio 0.5 %, pH 2.8 Flujo: 1 mL /min Detector: Spectraphysics SP 8450 UV/Vis Detector Tiempo de elusión: 15 minutos
2. Se realizó un análisis de los tiempos y órdenes de elusión de los ácidos
carboxílicos tomando en cuenta un medio diferente al agua con calidad HPLC,
este medio fue el extracto de mucílago de café. Se utilizaron las mismas
condiciones cromatográficas con que se analizaron todas las muestras (Tabla 7).
En este caso se utilizaron ácidos carboxílicos estándares (Tabla 9), estos
estándares se mezclaron en una sola solución a una concentración de 8 mg/mL.
Posteriormente se realizaron diferentes ensayos con muestras representativas de
cada grupo experimental (Tabla 10).
Los resultados de los cromatogramas de las soluciones de mucílago más los
estándares se compararon con los cromatogramas resultantes de soluciones de
mucílago sin estándares. Esto se realizó con la sobreposición de cromatogramas
mediante el software PeakSimple ®, de esta forma fue posible apreciar los
tiempos de retención en que hubo aumento en las áreas de los picos.
Tabla 10 - Muestras con que se realizó el análisis cualitativo.
Grupo experimental /pH
en que se interrumpió la fermentación
Código Características de la solución
1400 µL muestra, 200 µL estándares a 8 mg/mL 1400 µL muestra, 200 µL ácido fórmico (1mg/mL) *
3.7 5307 D
1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL estándares
3.9 6832 K
1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL estándares
4.8 6346 E
1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) 1400 µL muestra, 100 µL estándares 1400 µL muestra, 200 µL µL estándares
6.3 8410 B
1400 µL muestra, 200 µL patrón interno (blanco) (*) Se realizó este ensayo con ácido fórmico para determinar la posición de este pico con respecto a la de un pico aledaño.
4.3.4 Análisis cuantitativo
El análisis cuantitativo permitió determinar la cantidad de analito presente en la
muestra. En los análisis cromatográficos se pueden utilizar una amplia variedad de
métodos para cuantificar al analito, Snyder (1997) menciona como más
sobresalientes a las normalizaciones tanto interna como con factor de respuesta y
a los patrones externo o interno.
En esta investigación se utilizó el método del patrón interno, Johnson y Stevenson
(1978) indican que éste sirve para minimizar los errores asociados a la
preparación de la muestra, del aparato y de la técnica.
Este método consiste en la adición de un estándar que posee un tiempo de
retención diferente, pero que estructuralmente está relacionado con la muestra. Se
prepara una mezcla de ácidos carboxílicos estándares y del patrón interno para
ser inyectada en el cromatógrafo. La composición puede determinarse a través de
las áreas de los picos del patrón interno y del compuesto de interés. Cabe
destacar que esta técnica no deja establecido que todos los compuestos han sido
elucidados y detectados en el cromatograma, en efecto, esta técnica a menudo
indica que podrían existir otros compuestos en la muestra original pero no han
sido determinados (por eso es importante realizar un análisis cualitativo de forma
paralela).
Los requisitos que debe cumplir una solución para ser considerada patrón interno
son los siguientes:
• El pico producido debe destacarse claramente del resto de los picos en la
muestra.
• Debe elucidarse cerca de los picos de interés.
• Debe ser similar en concentración y respuesta al detector que los picos de
interés.
• No debe de reaccionar con ningún compuesto en la mezcla.
• No debe de estar presente en la muestra original.
• Debe ser de alta pureza y de disponibilidad inmediata.
El compuesto que cumplió todos estos requisitos y por lo tanto se utilizó como
patrón interno es el ácido pirazincarboxílico, cuya fórmula es C5H4O2N2, su
estructura molecular se presenta en la Figura 14.
Esta técnica también requirió disponibilidad de estándares puros de los
compuestos de interés (ya se presentaron en la Tabla 8). Con los estándares se
prepararon diferentes mezclas que contenían los compuestos de interés a
diferentes concentraciones, pero todos contenían la misma cantidad de patrón
interno. Luego de realizar el análisis cromatográfico y de obtener las áreas bajo los
picos, se preparó una curva de calibración (Figura 15) al graficar la concentración
de ácido (Cm) en dependencia de Ai/ Api (donde Ai es el área de los estándares y
Api es el área del patrón interno).
Figura 14 - Ácido pirazincarboxílico (patrón interno).
Figura 15 - Curva de calibración para el análisis por el método del patrón interno.
Puesto que la cantidad de patrón interno que se adiciona a las muestras y a los estándares es la misma (Cmpi) el eje de las X se puede representar simplemente como la concentración en ácido (Cmi). Adaptado de Johnson y Stevenson (1978).
Adaptado de Smith y Martell (1989).
El patrón interno que se seleccionó, presentó un tiempo de retención de 13.633
minutos, el cual es diferente del resto de ácidos carboxílicos utilizados como
estándares. Se decidió utilizar una concentración de 0.05 mg/mL, porque se
observó que la absorbancia en UV/Vis a la longitud de onda de 214 nm brinda un
área similar al resto de estándares, el cromatograma puede verse en Anexos,
Sección 10.
4.4 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
4.4.1 Cálculo de la incertidumbre asociada a la curva de calibración
Se utilizaron las técnicas de análisis estadístico propuesto por Loconto (2006). La
curva de calibración obtenida por el método del patrón interno se analizó con el
objetivo de identificar qué tan confiable son los parámetros obtenidos por el
método de los mínimos cuadrados. Para ello primeramente se encontró la
desviación estándar de la recta de calibración sumando los cuadrados de las
diferencias entre las respuestas experimentales y calculadas del detector para los
N puntos de calibración (Ecuación 1):
Ecuación 1
Aquí Sy/x representa la desviación estándar de los residuales verticales y N-2
representa el número de grados de libertad. N es el número de números puntos de
datos x, y que se utilizaron para construir la recta de calibración, menos un grado
de libertad utilizado para calcular la pendiente y un segundo grado de libertad que
se utilizó para determinar el intercepto en y.
2)( 2
/ −−
= ∑N
yyS
ci
ei
xy
La incertidumbre tanto de la pendiente como del intercepto de la curva de
calibración se encontraron utilizando las siguientes ecuaciones, las cuales
permitieron calcular tanto la desviación estándar de la pendiente, Sm (Ecuación 2),
como la desviación estándar en el intercepto, Sb (Ecuación 3):
Ecuación 2
Ecuación 3
4.4.2 Cálculo de la incertidumbre asociada a la interpolación de resultados
Para una determinada respuesta del instrumento, y0, el valor correspondiente x0
se obtuvo por la interpolación de la curva de calibración. La desviación estándar
en x0 se obtuvo mediante la Ecuación 4:
Ecuación 4
En donde Sx0 representa la desviación estándar en el valor interpolado x0 y L
representa el número de réplicas en la medición de y0 para la calibración, teniendo
N puntos de datos x, y.
∑ −=
N
i i
xym
xx
SS /
∑∑
−=
N
i i
i ixyb
xxN
xSS
2
2/
∑ −
−++= N
i i
xyx
xxmyy
NLmS
S 22
20/
0)(11
4.4.3 Cálculo de los límites de detección del método
Una de las principales ventajas de utilizar métodos instrumentales de análisis es
que estos son capaces de detectar y determinar trazas y ultratrazas de los
analitos. En términos generales, el límite de detección de un analito puede
describirse como la concentración que brinda una respuesta del instrumento
distinta a la del “blanco” o la del “ruido”.
En esta investigación se utilizó la fórmula planteada por la Agencia de Protección
Ambiental de Estados Unidos (U.S. Environmental Protection Agency, 2004) para
calcular el límite de detección del método (MDL), este se define como la mínima
concentración de una sustancia que puede medirse y puede reportarse con un
99 % de confianza que la concentración del analito será mayor de cero. MDL no
implica ni exactitud ni precisión en el método cuantitativo.
El método de la USEPA especifica un mínimo de siete réplicas (n) de muestras
con cantidades bajas añadidas de un estándar. Estas réplicas se analizan por
medio del instrumento y su señal se registra, los datos producirán una distribución
normal. Por lo tanto este método consiste en la concentración a la cual no más
que 1% de las mediciones en blanco resultan en detecciones falsas positivas (esto
implica reportar una detección cuando la sustancia no está presente en la
muestra), para su cálculo se utilizó la Ecuación 5:
Ecuación 5
ciasignifican de nivellibertad de grados 1-ncon Student de t de valor t
n deestándar desviación s7 esn general lopor
oinstrument el mediante analizados estándares de réplicas de número n:dondeEn
===
=
α
99.0,1M =−+= αntsDL
El significado de esta definición se ilustra con más detalles en la Figura 16. La
curva A representa la distribución normal de los valores medidos de la señal del
blanco. Es posible identificar un punto y = P, en la parte más alta de esta
distribución e indicar que una señal mayor que este valor difícilmente pueda
deberse al blanco, mientras que una señal inferior a P se asume como resultado
de la muestra blanco.
Figura 16 - Definiciones del límite de detección del Método (MDL)
Finalmente se calculó el valor de concentración que corresponde a este límite de
detección mediante una sustitución en la recta de calibración obtenida por el
método de los mínimos cuadrados (Ecuación 6), los valores MDL corresponden al
límite de detección (Ecuación 5).
Ecuación 6
El método de la Agencia de protección Ambiental de Estados Unidos está diseñado para una concentración que provean un rango falso positivo de no más del 1 por ciento (s es la desviación estándar; t es el valor de la t de Student al 99 % de confianza). Adaptado de USEPA (2004)
pendienteerceptoMDLxerceptoMDL
/)int( xpendiente int
0
0
−=+=
4.4.4 Muestras analizadas
Las muestras a las que se realizó análisis cromatográfico se presentan en la
Tabla 11.
Tabla 11 - Muestras utilizadas para el análisis con HPLC
Experimento Código pH (papel) Archivo del cromatograma
5082 4.5 coffee_nic1408189 3.9 coffee_nic798410 6.3 coffee_nic883470 4.3 coffee_nic852585 4.2 coffee_nic826053 4.7 coffee_nic1492837 4.2 coffee_nic1466053 6.3 coffee_nic1521510 4 coffee_nic1435307 3.7 coffee_nic1121293 4.2 coffee_nic1185122 3.9 coffee_nic1156346 4.8 coffee_nic1343727 4.2 coffee_nic1319370 3.8 coffee_nic1287118 4.4 coffee_nic1379296 4.7 coffee_nic1596181 3.9 coffee_nic1568071 6.1 coffee_nic1685000 4 coffee_nic1719801 4.2 coffee_nic1746615 4.4 coffee_nic1802935 6.1 coffee_nic1835169 4.5 coffee_nic1862935 4.6 coffee_nic189
Beneficio coffee_nic1928507 4 coffee_nic1986319 3.8 coffee_nic1956319 6.1 coffee_nic2015583 4.3 coffee_nic2276832 3.9 coffee_nic2306174 4.7 coffee_nic2336174 6.1 coffee_nic2367060 4.2 coffee_nic2393539 3.9 coffee_nic2428548 3.8 coffee_nic245
B
C
D
E
F
K
L
G
H
J
Los nombres de los archivos listados corresponden al archivo impreso del
cromatograma, se puede ver que cada muestra se analizó por triplicado, ello tenía
el objetivo de obtener una desviación estándar y un análisis estadístico más
apropiado.
4.4.5 Instrumento de obtención de datos
Consistió en una matriz dividida en tres columnas (grupos experimentales).
Existen divisiones horizontales cada 10 filas (una fila por muestra) para un registro
separado de cada subvariable (Tabla 12). Los resultados recolectados en el
instrumento se presentan en la Sección 5.2.3.
Tabla 12 - Instrumento para la recolección de datos.
Concentración de ácido orgánico
Inicial (pH= 6.1-6.3)
1 (pH= 4,8-4,5)
2 (pH= 4,4-4,1)
3 (pH= 4,0-3,6)
Á. Acético 10 filas, 1 por muestra
A. Propiónico 10 filas
A. Láctico 10 filas
A. Cítrico 10 filas
A. Málico 10 filas
A. Galacturónico 10 filas
Grupos y duplicados
Subvariables
4.4.6 Técnicas estadísticas para el análisis de los datos
Para el análisis estadístico, se siguieron las recomendaciones de Miller y Miller
(2000). Se utilizó el software SPSS V.11.0 (Lead Software, 1991) con el fin de
realizar las pruebas estadísticas de forma más eficiente.
Se hicieron dos tipos de análisis a los datos plasmados en el instrumento de
investigación. Primeramente se hicieron comparaciones estadísticas para
identificar las fuentes de variación entre los grupos (inicial, uno, dos y tres) sin
tomar en consideración las variaciones debidas a los experimentos. En ese caso
se tomó en cuenta una configuración de ANOVA una vía.
A los datos configurados mediante ese diseño (Ver Sección 5.3.1) se realizó en
primer lugar un análisis exploratorio (Ver Sección 5.3.2) con el propósito de
determinar si seguían una distribución normal (prueba Kolmogorov-Smirnov). Con este mismo análisis exploratorio se obtuvieron gráficos de cajas o boxplots
con el propósito de evaluar de una forma rápida aspectos como la distribución de
los valores alrededor de la mediana y la identificación de potenciales puntos
aberrantes. Los puntos sospechosos de ser aberrantes se sometieron a una
prueba estadística (Prueba de Dixon para pruebas con 3 a 7 datos, o la Prueba de Grubbs para mayor número de datos) para determinar si se descartaban o no
de los datos antes de proceder con otras pruebas.
Cuando se hubo determinado si las muestras seguían una distribución normal, se
utilizó la prueba paramétrica ANOVA una vía (Sección 5.3.2.1). Una variación de
la prueba ANOVA una vía permitió realizar contrastes entre grupos para
determinar entre cuáles yacían las tendencias que hacía variar entre sí a los
grupos.
Se utilizó una prueba no paramétrica en caso que los datos no siguieran una
distribución normal: prueba Kruskali-Wallis, la prueba de las Medianas se utilizó
como una prueba no paramétrica de respaldo (Sección 5.3.2.2).
Posteriormente los datos se analizaron tomando en cuenta las variaciones tanto
entre grupos como entre experimentos, en ese caso se utilizó una configuración
experimental ANOVA dos vías (Sección 5.3.4).
Dicha configuración permite comparaciones solamente si no existen espacios en
blanco tanto para las columnas como para las filas presentes en el instrumento de
investigación. Es decir, las columnas y las filas por comparar deben poseer el
mismo número de datos.
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISIS CUALITATIVO
5.1.1 Orden de elusión de ácidos carboxílicos
El primer experimento tuvo como objetivo determinar el orden de elusión de los
ácidos carboxílicos que se deseaban identificar y cuantificar en el mucílago de
café. Como se indicó en la sección 4.3.3, esto se realizó con estándares de ácidos
carboxílicos diluidos con agua calidad HPLC, las concentraciones de trabajo
fueron de 1, 2, 3, 4 y 5 mg/mL. Los tiempos de elusión promedio para cada
concentración de cada ácido facilitaron la determinación del orden de elusión, la
Tabla 13 presenta este orden y los cromatogramas se pueden consultar en
Anexos, Sección 10.
Tabla 13 - Orden de elusión de ácidos carboxílicos, análisis cualitativo
Ácido orgánico
Tiempo de elusión promedio (min)
Orden de elusión
Galacturónico 2.0 1Fórmico 2.5 2Málico 3.0 3Láctico 3.7 4Acético 4.2 5Citríco 5.3 6Propiónico 11.1 7
Esta identificación se realizó con las condiciones de análisis cromatográfico
establecidas en la Tabla 9, pág. 66. Aunque las condiciones de análisis
cromatográfico cambiarían para la elaboración de la curva de calibración y para el
análisis de las muestras, el conocimiento de los órdenes de elusión fue
fundamental para identificar los picos en dichos análisis.
Uno de los elementos que se modificó en los posteriores análisis fue el flujo de
elusión de la fase móvil, originalmente este fue de 1 mL/min, sin embargo esto
probó ser un flujo muy alto, no suficiente como para separar los componentes de
la muestra y por ende la resolución de los picos en el cromatograma no era
adecuada. Con un flujo de 0.8 mL/min se separaron mejor los componentes y los
picos se pudieron integrar mejor.
5.1.2 Identificación de ácidos carboxílicos en las muestras
Los picos que se eluyeron en cada uno de los cromatogramas se identificaron
inicialmente por letras en orden alfabético (A-M), esto con el objetivo de agilizar el
análisis cuantitativo (determinación de áreas) y así evitar errores de adjudicación
de identidad a un determinado pico. En el diseño de impresión de cada
cromatograma se agregó un reporte en el cual se identificaban estos picos con su
tiempo de elusión, altura y área.
Los datos de cada uno de estos picos junto con su área se añadieron a una hoja
de cálculos (hoja madre), para posteriormente identificar a qué ácidos
correspondían cada uno de estos picos y luego utilizar los datos de área para
propósitos del análisis cuantitativo.
Para realizar dicha identificación, se seleccionaron tres muestras representativas
de todo el conjunto disponible y provenientes de experimentos diferentes, pero
que mostraron una resolución aceptable de los picos para cada ácido orgánico.
Cada muestra se separó en tres viales y a cada vial se añadieron diferentes
volúmenes de la mezcla de ácidos carboxílicos a una concentración de 8 mg/mL,
al tercer vial se añadió solamente el patrón interno (una descripción detallada de
este procedimiento se indicó en la Sección 4.3.3).
El propósito de añadir una mezcla de estándares era aumentar el área de los
picos de la muestra, posteriormente se sobrepondrían ambos cromatogramas (la
muestra sin la mezcla de ácidos y la muestra con la mezcla de ácidos), la
diferencia en el área de cada uno de los picos identificados previamente con las
letras de la A-M indicarían qué picos presentaron un aumento sustancial.
La seguridad o la decisión de otorgarle a un determinado pico un ácido en
particular, se basaría en los hallazgos previos del orden de elusión (ver
Sección 5.1.1).
Luego de analizados los cromatogramas para las tres muestras se encontró que
los picos que incrementaron fueron A, C, D, E, G, I, K y L. El pico M correspondía
por defecto al patrón interno: ácido pyrazincarboxílico. Los cromatogramas se
pueden consultar en Anexos, Sección 10.3.
Basado en los anteriores resultados, se concluyó que los siguientes picos en los
cromatogramas correspondían a los siguientes ácidos (Tabla 14).
Tabla 14 - Picos en los cromatogramas y ácidos carboxílicos a los que corresponden
Picos en el cromatograma Ácido orgánico al que correspondería A Galacturónico B Fórmico D Málico E ND* G Acético I Cítrico L Propiónico M Patrón interno (Pirazinecarboxílico)
* Al inicio este pico se creía que pertenecía al ácido láctico.
Una dificultad especial se presentó inicialmente con la identificación de los picos D
y E, sus tiempos de elusión eran muy similares y por lo tanto habían posibilidades
de cometer errores al otorgarle un valor en especial. Finalmente un análisis con
adición de ácido Málico permitió concluir que el pico D correspondía a dicho ácido.
El pico E por el contrario constituyó una identificación particularmente difícil y se
concluyó que no correspondía a ninguno de los siete estándares utilizados,
aunque en un inicio se creía que dicho pico correspondería al ácido láctico, como
se verá más adelante los controles realizados con el sistema Reflectoquant ® no
arrojaron resultados concordantes en cuanto a la concentración. Por otro lado al
adicionar una concentración más concentrada de la mezcla de estándares, el pico
E parece dividirse en dos, con la aparición de un segundo pico muy cerca de la
localización F.
Por esta razón el ácido láctico no pudo identificarse con la misma seguridad como
la manifestada para los anteriores picos.
5.2 ANÁLISIS CUANTITATIVO
5.2.1 Curvas de calibración
Para la elaboración de las curvas de calibración se utilizaron las condiciones de
análisis especificadas en la Tabla 7, página 63. Básicamente se cambió el flujo de
elusión de la fase móvil hacia 0.8 mL/min con el fin de definir mejor los picos del
cromatograma.
Con las nuevas condiciones de análisis, los tiempos de retención variaron
significativamente, de hecho como parámetro para definir la identidad de cada pico
se utilizaron los rangos de tiempos de retención especificados en la Tabla 15.
Tabla 15 - Tiempos de retención para los ácidos utilizados en la elaboración de la curva de calibración
Tiempo de retención (min)
Componentes
Inicio Fin
Á. Galacturónico 1.95 2.45 Á. Fórmico 2.464 2.954 Á. Málico 3.154 3.511 Á. Láctico 3.643 4.18 Á. Acético 4.287 4.747 Á. Cítrico 5.867 6.534 Á. Propiónico 10.214 11.664 Patrón Interno 14.121 15.344
Como se indicó en la sección 4.3.3, la elaboración de esta curva requirió la
disponibilidad de soluciones estándares constituidas por mezclas de ácidos
carboxílicos a una concentración específica y con una concentración igual de
patrón interno en cada una de estas soluciones estándares. En la Tabla 16 se
resumen las condiciones de dilución de los diferentes estándares con los que se
preparó la curva de calibración.
Tabla 16 - Condiciones de dilución de estándares para la elaboración de la curva de calibración.
Concentración de ácidos carboxílicos
en la mezcla
(mg/mL)
Volumen total (µL)
Volumen de ácidos
en la mezcla
(µL)
Volumen de patrón
interno 0.05
mg/mL (µL)
0.4 1.2 2.4 4 6 8
Blanco
1600 1400 200
Cabe destacar que se realizaron tres repeticiones para cada medición. Los datos
incluidos la Tabla 16 se utilizaron como factor de dilución para calcular la
concentración real de los estándares al momento de determinar sus áreas. Se
presentan a continuación los gráficos que contienen las curvas de calibración para
cada uno de los ácidos carboxílicos objetos de estudio, los cromatogramas
correspondientes se presentan en Anexos, Sección 10.4.
Como se definió en la Figura 15, el eje y corresponde al promedio del cociente del
área del estándar entre el área del patrón interno. El eje x por su parte
corresponde a la concentración del estándar tomando en cuenta el factor de
dilución.
Al sustituir y en la ecuación de la línea de regresión, se obtiene la concentración
del ácido en la muestra. Bajo cada gráfico se incluye las estadísticas siguientes:
Sy/x (Ecuación 1), xbar que corresponde al promedio del eje x, ybar corresponde
al promedio del eje y, Sslope corresponde a Sm (Ecuación 2), Sintercept
corresponde a Sb (Ecuación 3), Slope corresponde a la pendiente de la ecuación
de regresión, n al número de puntos x, y.
Para cada uno de los ácidos cuantificables en esta investigación se presenta un
gráfico en el que se incluye la ecuación de la curva y su coeficiente de determinación R2. Bajo el gráfico se incluyen dos tablas, en la primera se
incluyen los datos con que se elaboró la curva y en la segunda los estadísticos de
importancia. A continuación se listan los ácidos y el número de figura que
corresponde a su gráfico de calibración.
Ácido orgánico Figura Galacturónico Figura 17 Fórmico Figura 18 Málico Figura 19 Láctico Figura 20 Acético Figura 21 Cítrico Figura 22 Propiónico Figura 23
Es importante destacar que el coeficiente de determinación R2 no indica por sí
solo la calidad de la correlación, pero su raíz cuadrada R (coeficiente de
correlación) si es adecuado. En las gráficas se indica solamente el primero, esto
se debe a que es el que presenta por defecto el Software Microsoft Excel ®, sin
embargo la mayoría de las curvas de regresión poseen un coeficiente con un valor
superior a R2 =.99. Al calcular R, el valor obtenido es muy aproximado. Esto lleva
a la conclusión que las curvas de calibración poseen una excelente correlación.
Se puede apreciar que los valores del intercepto en y son negativos, esto se
analizó con detalle y es posible que sea el resultado de un error sistemático en la
etapa de medición de volúmenes o por parte del instrumento.
Figura 17 - Curva de calibración para ácido galacturónico
Calibration Curve for Galacturonic Acid
y = 1.2083x - 0.1343R2 = 0.997
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml) Ai/Api
Sy/x 0.190.00 0.00 xbar 2.750.35 0.41 ybar 3.191.05 1.14 Sslope 0.032.10 2.23 Sintercept 0.113.50 3.89 Slope 1.215.25 6.08 Intercept -0.137.00 8.57 n 7.00
Datos de la curva de calibración, ácido galacturónico
Datos Estadísticos
Figura 18 - Curva de calibración para ácido fórmico
Calibration Curve for Formic Acid
y = 3.1534x - 0.2802R2 = 0.9975
-5
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml) Ai/ApiSy/x 0.46
0 0.00 xbar 2.750.35 1.02 ybar 8.391.05 3.07 Sslope 0.07
2.1 6.16 Sintercept 0.263.5 10.23 Slope 3.15
5.25 15.83 Intercept -0.287 22.43 n 7.00
Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido fórmico
Figura 19 - Curva de calibración para ácido málico
Calibration Curve for Malic Acid
y = 2.9278x - 0.2847R2 = 0.9974
-5
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentration (mg/ml)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml) Ai/ApiSy/x 0.43
0 0.00 xbar 2.750.35 0.93 ybar 7.771.05 2.81 Sslope 0.07
2.1 5.67 Sintercept 0.253.5 9.46 Slope 2.93
5.25 14.67 Intercept -0.287 20.81 n 7.00
Datos de la curva de calibración, ácido málico
Datos estadísticos
Figura 20 - Curva de calibración para ácido láctico
Calibration Curve for Lactic Acid
y = 1.6744x - 0.225R2 = 0.995
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml)
Ai/Api
Sy/x 0.340.00 0.00 xbar 2.750.35 0.51 ybar 4.381.05 1.55 Sslope 0.052.10 3.14 Sintercept 0.193.50 5.27 Slope 1.675.25 8.22 Intercept -0.227.00 11.98 n 7.00
Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido láctico
Figura 21 - Curva de calibración para ácido acético
Calibration Curve for Acetic Acid
y = 1.7445x - 0.1809R2 = 0.9971
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml) Ai/Api Sy/x 0.270.00 0.00 xbar 2.750.35 0.55 ybar 4.621.05 1.67 Sslope 0.042.10 3.36 Sintercept 0.163.50 5.60 Slope 1.745.25 8.73 Intercept -0.187.00 12.41 n 7.00
Datos de la curva de calibración, ácido acético
Datos estadísticos
Figura 22 - Curva de calibración para ácido cítrico
Calibration Curve for Citric Acid
y = 4.2093x - 0.6756R2 = 0.992
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml)
Ai/Api Sy/x1.09
0.00 0.00 xbar 2.750.35 1.26 ybar 10.901.05 3.83 Sslope 0.172.10 7.73 Sintercept 0.623.50 12.86 Slope 4.215.25 20.29 Intercept -0.687.00 30.33 n 7.00
Datos estadísticosDatos de la curva de calibración, ácido cítrico
Figura 23 - Curva de calibración para el ácido propiónico
Calibration Curve for Propionic Acid
y = 1.8139x - 0.1955R2 = 0.9927
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Concentration (mg/mL)
Ai/A
pi
Ci (mg/ml) Ai/Api Sy/x 0.450.00 0.00 xbar 2.750.35 0.63 ybar 4.791.05 1.96 Sslope 0.072.10 3.28 Sintercept 0.263.50 5.63 Slope 1.815.25 8.97 Intercept -0.207.00 13.09 n 7.00
Datos de la curva de calibración, ácido propiónico
Datos estadísticos
5.2.2 Límite de detección del método (MDL o LDM)
Como se mencionó anteriormente, el LDM sirve para indicar bajo cual
concentración el método posee un gran margen de error para asegurar la
presencia o ausencia de un analito.
Para la obtención del LDM se siguieron los procedimientos estipulados en la
Sección 4.4.3. Recapitulando, se corrieron 12 repeticiones de análisis de una
muestra que contenía los siete estándares de ácidos carboxílicos y el patrón
interno a una concentración tan baja como una de las utilizadas para elaborar la
curva de calibración. Posteriormente, se determinó la desviación estándar del
cociente del área de cada ácido entre el área del patrón interno (para cada
cromatograma). Esta desviación estándar se multiplicó por el valor de la t de
student (n-1, α=0.99). Los resultados se indican en la Tabla 17.
Tabla 17 - Límites de detección del método para cada ácido.
Ácido s (Ai/Api) n t MDL X0
(mg/mL) Galacturónico 0.0130 0.0398 0.1441Fórmico 0.0288 0.0879 0.1167Málico 0.0232 0.0707 0.1214Láctico 0.0121 0.0368 0.1563Acético 0.0129 0.0393 0.1262Cítrico 0.0276 0.0840 0.1805Propiónico 0.0575
12 3.05
0.1755 0.2046
Hay que señalar que el valor de X0 se obtuvo mediante los datos de la curva de
calibración para cada ácido en particular, razón por la cual se expresa como
mg/mL.
5.2.3 Matrices de resultados con las concentraciones de ácidos carboxílicos determinadas analíticamente mediante HPLC
El diseño experimental que se explicó en la Sección 4.4.5 permite ver que cada
ácido se analizó por separado. El objetivo de esta sección es presentar de forma
general los resultados (mg/mL) obtenidos para cada ácido. Las secciones
posteriores analizarán el comportamiento de cada ácido por separado. Los
cromatogramas pueden consultarse en Anexos, Sección 10.5.
Para determinar las concentraciones en ácidos carboxílicos en las distintas
muestras, se recurrió al procedimiento del patrón interno (Sección 4.3.4), para ello
se utilizó también la curva de calibración de cada ácido orgánico, tal como se
explicó anteriormente.
Posteriormente la concentración se determinó al sustituir la media del cociente del
área del ácido (encontrado en cada cromatograma) entre el área del patrón interno
del mismo cromatograma (eje y) en la ecuación de la curva de calibración.
La desviación estándar (Sx0) se determinó mediante la Ecuación 4 y se indica con
color rojo en la columna de la izquierda de cada concentración. Las tablas de
resultados también permiten apreciar la conformación de los grupos
experimentales (el grupo beneficio fueron muestras obtenidas fuera de las
condiciones experimentales y no se incluirán en los posteriores análisis
estadísticos), el grupo inicial incluye las muestras cuya fermentación se
interrumpió entre los pH de 6.1 y 6.3. El grupo 1 por su parte incluye las muestras
cuya fermentación se interrumpió entre los pH de 4.5 y 4.8. Las muestras del
grupo 2 se interrumpieron a un pH entre 4.1 y 4.4 y las muestras del grupo 3 a un
pH entre 3.7 y 4.
A continuación se presentan los ácidos galacturónico (Tabla 18), fórmico
(Tabla 19), málico (Tabla 20), acético (Tabla 21), cítrico (Tabla 22) y propiónico
(Tabla 23).
Tabla 18 - Matriz de resultados para ácido galacturónico
B 7.35 0.16C 16.32 0.35DEF 6.15 0.14 6.37 0.14G 8.98 0.19H 8.61 0.18 12.30 0.26J 12.67 0.27K 14.24 0.30L 8.29 0.17
B 13.00 0.27C 13.58 0.29DE 9.72 0.20F 7.38 0.16GH 10.93 0.23 7.80 0.16JK 10.26 0.21L
B 9.18 0.19 11.27 0.24C 11.68 0.24D 11.59 0.24E 9.67 0.20F 12.70 0.27G 8.03 0.17H 20.14 0.44JK 10.38 0.22L 7.90 0.17
B 8.75 0.18C 14.92 0.32D 12.91 0.27 11.54 0.24E 5.67 0.13F 8.22 0.17G 7.87 0.17HJ 10.50 0.22 10.34 0.22K 12.22 0.26L 8.29 0.17
Exp.Ácido
Gal
actu
róni
co
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4 4.3 4.2
4 3.9 3.8 3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
Benef. Inicial
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
Tabla 19 - Matriz de resultados para ácido fórmico
B 0.36 0.11C 0.50 0.11DEF 0.36 0.11 0.32 0.11G 0.46 0.11HJ 0.79 0.11KL
B 0.43 0.11C 0.61 0.11DE 0.39 0.11F 0.31 0.11GH 0.43 0.11 0.33 0.11JKL
B 0.34 0.11 0.37 0.11C 0.53 0.11D 0.51 0.11E 0.34 0.11F 0.41 0.11G 0.35 0.11H 0.48 0.11JKL
B 0.37 0.11C 0.62 0.11D 0.51 0.11 0.49 0.11E 0.29 0.11F 0.33 0.11G 0.36 0.11HJ 0.41 0.11KL
Benef. Inicial
3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
4.3 4.2
4 3.9 3.8
Exp.Ácido
Fórm
ico
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
Tabla 20 - Matriz de resultados para ácido málico
B 0.32 0.12C 0.35 0.12DEF 0.21 0.12 0.26 0.12G 0.32 0.12H 0.19 0.12 0.26 0.12J 0.28 0.12K 0.28 0.12L 0.17 0.12
B 0.23 0.12C 0.35 0.12DE 0.20 0.12F 0.21 0.12GH 0.20 0.12 0.17 0.12JK 0.19 0.12L
B 0.22 0.12 0.23 0.12C 0.31 0.12D 0.22 0.12E 0.20 0.12F 0.22 0.12G 0.19 0.12H 0.27 0.12JK 0.19 0.12L 0.17 0.12
B 0.21 0.12C 0.32 0.12D 0.20 0.12 0.20 0.12E 0.17 0.12F 0.18 0.12G 0.18 0.12HJ 0.19 0.12 0.20 0.12K 0.21 0.12L 0.27 0.12
Exp.Ácido
Mál
ico
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4 4.3 4.2
4 3.9 3.8
Benef. Inicial
3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
Tabla 21 - Matriz de resultados para ácido acético
B 0.31 0.12C 0.35 0.12DEF 0.36 0.12 0.28 0.12G 0.31 0.12H 0.23 0.12 0.26 0.12J 0.28 0.12K 0.28 0.12L 0.23 0.12
B 0.38 0.12C 0.40 0.12DE 0.23 0.12F 0.34 0.12GH 0.25 0.12 0.33 0.12JK 0.29 0.12L
B 0.34 0.12 0.36 0.12C 0.36 0.12D 0.48 0.12E 0.30 0.12F 0.23 0.12G 0.28 0.12H 0.29 0.12JK 0.37 0.12L 0.20 0.12
B 0.32 0.12C 0.47 0.12D 0.41 0.12 0.40 0.12E 0.24 0.12F 0.25 0.12G 0.28 0.12HJ 0.27 0.12 0.35 0.12K 0.29 0.12L 0.26 0.12
Exp.Ácido
Acé
tico
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4 4.3 4.2
4 3.9 3.8
Benef. Inicial
3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
Tabla 22 - Matriz de resultados para ácido cítrico
B 0.26 0.21C 0.26 0.21DEF 0.21 0.21 0.22 0.21G 0.25 0.21H 0.23 0.21 0.22 0.21J 0.23 0.21K 0.24 0.21L 0.22 0.21
B 0.27 0.20C 0.31 0.20DE 0.24 0.21F 0.24 0.21GH 0.23 0.21 0.22 0.21JK 0.28 0.20L
B 0.24 0.21 0.25 0.21C 0.27 0.20D 0.29 0.20E 0.24 0.21F 0.23 0.21G 0.24 0.21H 0.25 0.21JK 0.26 0.21L 0.23 0.21
B 0.25 0.21C 0.32 0.20D 0.29 0.20 0.29 0.20E 0.22 0.21F 0.22 0.21G 0.23 0.21HJ 0.23 0.21 0.26 0.21K 0.26 0.21L 0.22 0.21
Benef. Inicial
3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
4.3 4.2
4 3.9 3.8
Exp.Ácido
Cítr
ico
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
Tabla 23 - Matriz de resultados para ácido propiónico
B 0.13 0.20C 0.13 0.20DEF 0.11 0.20 0.13 0.20G 0.12 0.20H 0.17 0.20 0.13 0.20J 0.12 0.20K 0.15 0.20L 0.16 0.20
B 0.14 0.20C 0.13 0.20DE 0.14 0.20F 0.13 0.20GH 0.13 0.20 0.12 0.20JK 0.14 0.20L
B 0.12 0.20 0.12 0.20C 0.14 0.20D 0.13 0.20E 0.14 0.20F 0.15 0.20G 0.14 0.20H 0.13 0.20JK 0.16 0.20L 0.16 0.20
B 0.12 0.20C 0.13 0.20D 0.13 0.20 0.13 0.20E 0.12 0.20F 0.13 0.20G 0.12 0.20HJ 0.13 0.20 0.13 0.20K 0.17 0.20L 0.15 0.20
Benef. Inicial
3.7
Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
6.3 6.1
4.8 4.7 4.6 4.5
4.3 4.2
4 3.9 3.8
Exp.Ácido
Pro
pión
ico
Concentraciones (mg/ ml)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1)
Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
4.4
En color rojo se presentan las desviaciones estándares de los resultados (Obtenidas mediante la Ecuación 4).
5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
5.3.1 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos
El análisis estadístico entre grupos analiza los valores de concentraciones
obtenidas para cada uno de los grupos sin tomar en consideración las diferencias
entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la constituye
la configuración ANOVA de una vía.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con
anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango. En esta sección solamente se presentan las tablas
que sirvieron de “alimentación” para las pruebas estadísticas.
A continuación se presentan los datos para los ácidos galacturónico (Tabla 24), fórmico (
Tabla 25), málico (Tabla 26), acético (Tabla 27), cítrico (Tabla 28) y propiónico
(Tabla 29).
Tabla 24 - Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido galacturónico
Inicial G1 G2 G36.3719 9.7245 12.6971 14.91557.3475 13.5783 20.1431 7.86658.9796 7.3790 9.1762 10.497912.2969 10.2629 10.3750 8.7515
12.6683 10.9316 11.2735 12.906014.2431 12.9968 11.6850 8.222416.3197 7.8049 11.5932 12.2159
8.29 9.6696 5.6711
8.0291 10.3402
7.9028 8.287911.5425
Ácido Galacturónico, grupos experimentales (mg/mL)
Tabla 25 - Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido fórmico
Inicial G1 G2 G30.3152 0.3099 0.4056 0.61550.3565 0.3330 0.4753 0.35700.4601 0.3929 0.3371 0.37210.4997 0.4269 0.3656 0.51280.7893 0.4311 0.5257 0.3254
0.6130 0.5127 0.28760.3400 0.41120.3497 0.4851
Ácido Fórmico, grupos experimentales (mg/mL)
Tabla 26- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido málico
Inicial G1 G2 G30.3172 0.2017 0.2238 0.31730.3529 0.3492 0.2670 0.18040.2631 0.2123 0.2239 0.18920.3183 0.1893 0.1879 0.20890.2607 0.1954 0.2328 0.20190.2846 0.2253 0.3096 0.18270.2751 0.1675 0.2183 0.2122
0.17 0.2049 0.16880.1943 0.20010.1673 0.2736
0.1955
Ácido Málico, grupos experimentales (mg/mL)
Tabla 27- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido acético
Inicial G1 G2 G30.3052 0.2297 0.2274 0.47270.3505 0.3971 0.2929 0.28300.2821 0.3357 0.3361 0.27210.3052 0.2862 0.3689 0.32120.2629 0.2516 0.3557 0.41380.2817 0.3761 0.3554 0.24690.2810 0.3279 0.4780 0.2874
0.23 0.3029 0.23900.2767 0.35280.2015 0.2630
0.3969
Ácido Acético, grupos experimentales (mg/mL)
Tabla 28- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido cítrico
Inicial G1 G2 G30.2588 0.2362 0.2275 0.32230.2582 0.3136 0.2469 0.22500.2156 0.2395 0.2445 0.23270.2515 0.2756 0.2564 0.25090.2205 0.2334 0.2479 0.29350.2339 0.2744 0.2703 0.21870.2421 0.2204 0.2930 0.2584
0.2429 0.22380.2404 0.26160.2330 0.2202
0.2869
Ácido Cítrico, grupos experimentales (mg/mL)
Tabla 29- Tabla de datos para análisis estadístico entre grupos, Ácido propiónico
Inicial G1 G2 G30.1251 0.1428 0.1528 0.13300.1255 0.1265 0.1276 0.12480.1262 0.1275 0.1195 0.13380.1226 0.1419 0.1592 0.12240.1257 0.1280 0.1214 0.12620.1175 0.1445 0.1382 0.12530.1528 0.1223 0.1274 0.1718
0.16 0.14480.1359 0.12040.1614 0.1266
0.1496
Ácido Propiónico, grupos experimentales (mg/mL)
5.3.2 Análisis estadístico entre grupos
El análisis estadístico entre grupos se realizó según lo estipulado en la Sección
4.4.6. Se inició con un análisis exploratorio de los datos (EDA), este permitió
determinar si las técnicas estadísticas que se utilizarían posteriormente para
comparar los grupos serían las más apropiadas.
Se realizó una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro
de cada ácido se ajustaban a una distribución normal. Con este propósito se
realizaron dos pruebas de forma paralela para los seis ácidos carboxílicos: la
prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.
Ambas prueban la hipótesis nula que los datos poseen una distribución normal. Un
nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que
la distribución de los datos difiere significativamente de una distribución normal. A
continuación se presenta una matriz resumen de la prueba que se realizó con el
software SPSS ® (Tabla 30).
En este caso se analizaron los datos para la prueba Kolmogorov-Smirnov, estos
muestran que no hay distribución normal para las concentraciones de ácido málico en dos de los grupos: G1 (pH 6.1-6.3) y G4 (pH 3.7-4). Las
concentraciones en ácido propiónico tampoco se ajustan a una distribución
normal en los grupos G1 y G4. Las concentraciones para los otros ácidos
muestran una distribución normal.
Tabla 30 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH (configuración ANOVA 1 vía)
Tests of Normality
.196 8 .200* .939 8 .606
.152 7 .200* .939 7 .633
.251 10 .074 .793 10 .012
.149 11 .200* .978 11 .956
.236 8 .200* .920 8 .429
.322 7 .027 .747 7 .012
.205 10 .200* .933 10 .479
.315 11 .003 .782 11 .006
.201 8 .200* .947 8 .678
.154 7 .200* .957 7 .797
.165 10 .200* .960 10 .783
.218 11 .149 .914 11 .272
.179 8 .200* .907 8 .336
.265 7 .146 .897 7 .313
.250 10 .078 .888 10 .160
.186 11 .200* .892 11 .146
.392 8 .001 .746 8 .007
.289 7 .079 .835 7 .088
.169 10 .200* .928 10 .426
.292 11 .010 .729 11 .001
PH_GROUP"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4
CONC_GAL
CONC_MAL
CON_ACE
CON_CIT
CON_PROP
Statistic df Sig. Statistic df Sig.Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
* .267 5 .200* .881 5 .314.284 6 .141 .879 6 .264.229 8 .200* .848 8 .091.172 8 .200* .950 8 .713
"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4
CONC_FOR
This is a lower bound of the true significance.*.
Lilliefors Significance Correctiona.
Con estos resultados se concluyó que una prueba no paramétrica para encontrar
diferencias entre grupos debía realizarse tanto a los grupos de las
concentraciones de ácido málico como a los del ácido propiónico.
Los grupos en los otros ácidos se podrían comparar mediante una prueba
paramétrica, en este caso ANOVA una vía.
Se puede apreciar que los valores obtenidos para las dos pruebas son similares y
comparables, la prueba Shapiro-Wilk es particularmente útil cuando el número de
datos es bajo.
Como parte de las pruebas EDA, se obtuvieron gráficos sobre la distribución de
los valores de los datos (boxplots o cajas de puntos) para los datos de cada uno
de los ácidos cuyos grupos se ajustaron a una distribución normal (Figura 24). El
objetivo de estos es poseer de forma gráfica una impresión sobre posibles datos
discordantes.
En estos gráficos, la línea gruesa negra dentro de cada caja marca el cincuentavo
percentil (50avo) o la mediana de la distribución. Los límites inferior y superior
dentro de cada caja marcan el veinticincoavo (25avo) y el setenticincoavo (75avo)
de cada distribución, respectivamente. Las barras que aparecen arriba y debajo de
cada caja no marcan datos discordantes, pero estos se marcan mediante “O”, el
número que aparece al lado corresponde a la línea de los datos con que se
“alimentó” a la prueba estadística, y en última instancia en donde se encontrará el
valor “sospechoso”. Los valores extremos se marcan con un asterisco (*).
Figura 24 - Gráficos “cajas de puntos” o boxplots para determinar puntos aberrantes dentro de los datos de cada grupo para cada ácido
(a) A. galacturónico, (b) A. Acético, (c) A. cítrico (d) A. fórmico. En el eje de las x se indican los distintos grupos experimentales.
111078N =
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
CO
NC
_GA
L
30
20
10
0
17
(a)
111078N =
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
CO
N_A
CE
.5
.4
.3
.2
.1
22(b)
8865N =
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
CO
NC
_FO
R.9
.8
.7
.6
.5
.4
.3
.2
10
5
(d)
111078N =
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
CO
N_C
IT
.34
.32
.30
.28
.26
.24
.22
.20
22
(c)
Se puede apreciar que para el ácido galacturónico hay un probable punto
discordante para uno de los valores del Grupo 3 (pH =4.2- 4.4). Se aplicó la
prueba de Grubbs para determinar si el punto se descartaba o no se descartaba y
se encontró que el punto correspondiente a una concentración de 20.14 mg/mL
debía eliminarse (con un nivel de significancia del 5%) para ello se comparó un
valor tabular de Grubbs de 2.29, con el valor calculado de 2.54, al ser este último
mayor que el valor tabular, se decidió no tomar en cuenta el valor para los análisis
de varianza.
El ácido acético por su parte presentó un valor discordante en el grupo 3
(marcado mediante el número 22), este valor se examinó con la prueba de Grubbs
y el valor calculado (1.85) fue inferior al valor tabular (2.29) por lo tanto no fue
necesario descartar este punto de la serie de datos.
El ácido cítrico presentó también un punto discordante en el grupo 3, al realizar la
prueba de Grubbs, se concluyó que el valor debía preservarse.
El ácido fórmico presentó dos valores discordantes, uno en el grupo 1 y otro en el
grupo 2. En ambos casos se aplicó la prueba de Dixon, ya que el número de
datos era inferior a 7. Para ninguno de los dos grupos se descartaron los puntos
aberrantes ya que los valores de Q calculada fueron inferiores a la Q tabular a un
5% de nivel de significancia.
5.3.2.1 Análisis ANOVA de una vía
Los datos que se adaptaron a una distribución normal fueron analizados mediante
la prueba ANOVA de una vía. Esta prueba la hipótesis que las medias de dos o
más grupos no son significativamente diferentes.
Antes se realizó la prueba estadística de Levene (Tabla 31) en la cual se prueba la
hipótesis nula que las varianzas entre los grupos son iguales, esto es importante
de saber antes de realizar la prueba ANOVA, porque ésta solamente se puede
realizar si las varianzas de los grupos son iguales.
Tabla 31 - Prueba de Levene para muestras a las que se realizaría la prueba ANOVA
Test of Homogeneity of Variances
.866 3 23 .4731.957 3 32 .1402.685 3 32 .063
CONC_FORCON_ACECON_CIT
LeveneStatistic df1 df2 Sig.
Test of Homogeneity of Variances
C_gal
2.566 3 31 .072
LeveneStatistic df1 df2 Sig.
Los resultados de la prueba de homogeneidad de varianzas indican que los
niveles de significancia para los grupos en los cuatro ácidos son mayores a .05,
esto sugiere que las varianzas para los distintos ácidos son iguales y que la
prueba ANOVA se podría aplicar.
Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 32),
esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales.
La variación entre grupos (Between Groups) estima la variación de las medias
de los grupos alrededor de una media general. La variación dentro del grupo
(Within Groups) representa la variación de puntajes individuales alrededor de sus
medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores
de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.
Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales no poseen
diferencias estadísticas, esto se aprecia en valores de significancia relativamente
altos.
Tabla 32 - Resultados prueba ANOVA de una vía.
ANOVA
C_gal
2.414 3 .805 .115 .951216.585 31 6.987218.999 34
Between GroupsWithin GroupsTotal
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
ANOVA
.018 3 .006 .432 .732
.324 23 .014
.343 26
.006 3 .002 .449 .719
.146 32 .005
.153 35
.002 3 .001 .720 .547
.024 32 .001
.026 35
Between GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotal
CONC_FOR
CON_ACE
CON_CIT
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
5.3.2.2 Pruebas no paramétricas para datos de ácidos sin distribución normal
Los ácidos málico y propiónico no estaban sujetos a una distribución normal, por
esta razón a ambos se les aplicaron pruebas no paramétricas, específicamente la
prueba Kruskal Wallis y la prueba de comparación de medianas. Ambas pruebas
están diseñadas para probar la significancia de las diferencias entre múltiples
grupos, básicamente cumplen el papel sustituto de la prueba ANOVA.
La prueba Kruskal-Wallis mide cuanto los rangos dentro de un grupo difieren del
rango medio del resto de los grupos, el valor chi-cuadrado se obtiene en base a
estos valores de los rangos. Los grados de libertad para la prueba estadística chi-
cuadrado son iguales al número de grupos menos uno.
La significancia asintomática estima la probabilidad de obtener un estadístico chi-
cuadrado mayor o igual al que se presenta, en el caso que verdaderamente no
hubiese diferencias entre los rangos de los grupos. Cuando el valor es inferior a
.05 hay diferencias entre los grupos.
En el caso de los ácidos málico y propiónico la prueba Kruskal Wallis no arroja
diferencias entre los grupos (Tabla 33).
Tabla 33- Resultados de la prueba Kruskall Wallis para ácido málico y propiónico
Test Statisticsa,b
7.286 2.7473 3
.063 .432
Chi-SquaredfAsymp. Sig.
CONC_MAL CON_PROP
Kruskal Wallis Testa.
Grouping Variable: PH_GROUPb.
La prueba de la mediana, tiene como hipótesis nula que las mediana de todo el
conjunto de datos es una buena aproximación con el centro de cada uno de los
grupos experimentales. Para probar esta hipótesis, cada grupo se divide en dos
subgrupos: aquellos cuyos valores se ajustan cerca o bajo la mediana, y aquellos
cuyos valores son superiores a los de la mediana. El resultado es una tabla de
frecuencias de dos vías con dos filas y un número n de columnas donde n es el
número de categorías de la variable agrupadora. En la Tabla 34- a, por ejemplo, la
primera celda es el número de valores de concentración de ácido que para el
grupo 1 son superiores a la mediana.
La prueba de la Mediana detecta diferencias en la localización y forma entre los
grupos. La mediana lista la mediana general ignorando la membresía a
determinados grupos. Si los grupos no difieren, la mediana general debería
eventualmente separar cada grupo. El estadístico chi-cuadrado compara las
separaciones observadas a las separaciones teóricas. Los niveles de significancia
inferiores a .05 indican que los grupos difieren estadísticamente.
En el caso del ácido málico el nivel de significancia (Asymp. Sig.) .023, por lo
tanto los grupos dentro del ácido málico diferirían entre sí. Por otro lado, las
concentraciones de los grupos en ácido propiónico poseen un nivel de
significancia (Asymp. Sig) de .127, por lo que se concluye los grupos no se
diferencian entre sí.
Tabla 34 - Prueba de la mediana
(a) Tabla de Frecuencias
Frequencies
7 3 6 21 4 4 92 5 7 46 2 3 7
> Median<= Median> Median<= Median
CONC_MAL
CON_PROP
"6.1-6.3" 4.5-4.8 4.2-4.4 3.7-4PH_GROUP
(b) Datos estadísticos de la prueba de la mediana
Test Statisticsb
36 36.212250 .127450
9.497a 5.704a
3 3.023 .127
NMedianChi-SquaredfAsymp. Sig.
CONC_MAL CON_PROP
4 cells (.0%) have expected frequencies less than5. The minimum expected cell frequency is 3.5.
a.
Grouping Variable: PH_GROUPb.
5.3.3 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos y entre experimentos
El análisis estadístico entre grupos y entre experimentos analiza los valores de
concentraciones obtenidos para cada grupo y toma en consideración las
diferencias entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la
constituye la configuración ANOVA de dos vías.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se identificaron con
anterioridad, para agruparlos se va a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango para cada experimento por separado. Si dentro del
rango de pH para cada experimento hay más de un valor se calculará el promedio
de esos valores. Uno de los requerimientos para las pruebas de dos vías es que
se tenga el mismo número de valores para las columnas y para las filas, en esto
se diferencia de la configuración precedente. Por tal razón no fue posible obtener
más que una matriz de 4 filas (experimentos) por 4 columnas (grupos) para los 7
ácidos en estudio
En esta sección se presentan las tablas que sirvieron de “alimentación” a las
pruebas estadísticas. A. galacturónico (Tabla 35 a), fórmico (Tabla 35b), málico
(Tabla 35c), acético (Tabla 35d), cítrico (Tabla 35e) y propiónico (Tabla 35f).
Tabla 35- Datos para análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)
(a)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 7.348 12.997 10.225 8.752C 16.320 13.578 11.685 14.915F 6.372 7.379 12.697 8.222K 14.243 10.263 10.375 12.216
Exp GruposÁcido Galacturónico
(b)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 0.356 0.431 0.351 0.372C 0.500 0.613 0.526 0.615F 0.315 0.310 0.406 0.325
Exp GruposÁcido Fórmico
(c)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 0.317 0.225 0.228 0.209C 0.353 0.349 0.310 0.317F 0.263 0.212 0.224 0.183K 0.275 0.189 0.188 0.212
Exp GruposÁcido Málico
(d)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 0.305 0.376 0.346 0.321C 0.351 0.397 0.355 0.473F 0.282 0.336 0.227 0.247K 0.281 0.286 0.369 0.287
Exp GruposÁcido Acético
(e)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 0.259 0.274 0.246 0.251C 0.258 0.314 0.270 0.322F 0.216 0.240 0.228 0.219K 0.242 0.276 0.256 0.258
Exp GruposÁcido Cítrico
(f)
Inicial (mg/mL)
G1 (mg/mL)
G2 (mg/mL)
G3 (mg/mL)
B 0.125 0.144 0.120 0.122C 0.125 0.127 0.138 0.133F 0.126 0.128 0.153 0.125K 0.153 0.142 0.159 0.172
Exp GruposÁcido Propiónico
5.3.4 Análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)
La prueba ANOVA de dos vías analiza la hipótesis que las medias de dos o más
grupos no son significativamente diferentes. Existen otros datos o pruebas que se
obtienen y realizan de forma paralela a ANOVA.
Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 36),
esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales
o fuentes de variación: la variación entre filas (rows) estima la variación entre los
experimentos. La variación entre columnas (columns) representa la variación
entre los grupos. El valor F calculado debe ser superior al valor F-crítico (F-Crit)
para considerar que existen diferencias ya sea entre filas o entre columnas. El
valor P indica el porcentaje de certeza con un .05 de nivel de significancia (en el
caso de los á. galacturónico y cítrico se trabajó con .1 como nivel de significancia)
que la diferencia entre los grupos (si las hay) no se deba al azar, por lo general
esto se manifiesta cuando el valor se aproxima a cero.
Los resultados de la Tabla 36-a muestran que para el á. galacturónico hay
diferencias claramente remarcables entre los experimentos (rows) pero no entre
los grupos (columns). Esto se manifiesta en valores de F calculado superiores a F
crítica, en este caso se utilizó un nivel de significancia de 0.1 para calcular F. Las
diferencias entre los experimentos no se deben al azar de acuerdo al valor P, en
cambio el hecho que no existan diferencias entre los grupos indican que esto se
debería al azar.
Por otro lado, la prueba para el á. málico (Tabla 36-b), presenta diferencias claras
tanto entre los grupos de pH como entre los experimentos. Los valores de P
relativamente bajos indican que las diferencias no se deben al azar.
El á. cítrico por su parte presenta diferencias entre los grupos de pH, las
diferencias entre los experimentos también es remarcable. Al igual que para el á.
galacturónico, se utilizó un nivel de significancia de 0.1 para el cálculo de F.
Ambas diferencias no se deberían al azar de acuerdo a estos resultados.
El á. fórmico presenta diferencias entre experimentos pero no entre los grupos
experimentales. Las diferencias entre los experimentos no se deben al azar, en
cambio el hecho que entre grupos no haya diferencias podría deberse al azar, en
parte debido al valor relativamente elevado del coeficiente P.
Por su parte, se pueden apreciar diferencias entre los experimentos pero no entre
los grupos tanto para el ácido acético como para el á. propiónico. En ambos casos
las diferencias entre los experimentos no serían el resultado del azar, pero sí el
hecho que no existan diferencias entre los grupos se debería al azar.
Tabla 36 - Resultados prueba ANOVA de 2 vías
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 68.52777357 3 22.84259 3.26403 0.073326 2.812863Columns 0.11817867 3 0.039393 0.005629 0.999373 2.812863Error 62.98449855 9 6.998278
Total 131.6304508 15
(a) Á. Galacturónico
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.035034891 3 0.011678 26.46682 8.49E-05 3.862548Columns 0.01299707 3 0.004332 9.818529 0.003375 3.862548Error 0.003971187 9 0.000441
Total 0.052003148 15
(b) Á. Málico
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.008659529 3 0.002887 13.35677 0.001156 2.812863Columns 0.002415798 3 0.000805 3.726215 0.054411 2.812863Error 0.001944975 9 0.000216
Total 0.013020303 15
(c) Á. Cítrico
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.1151609 2 0.05758045 23.6655458 0.001424 5.143253Columns 0.00611956 3 0.00203985 0.83837925 0.520357 4.757063Error 0.01459855 6 0.00243309
Total 0.13587901 11
(d) Á. Fórmico
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.031752 3 0.010584 4.635999 0.031792 3.862548Columns 0.004007 3 0.001336 0.585051 0.639759 3.862548Error 0.020547 9 0.002283
Total 0.056306 15
(e) Á. acético
Source of Variation SS df MS F P-value F critRows 0.002043 3 0.000681 4.957748 0.026658 3.862548Columns 0.000232 3 7.72E-05 0.561768 0.653589 3.862548Error 0.001236 9 0.000137
Total 0.003511 15
(f) A. Propiónico
5.4 MEDICIONES CON REFLECTOQUANT
Los resultados de las mediciones de reflectoquant para los ácidos málico y láctico
se han resumido en una matriz (Tabla 45, Anexos, Sección 10.6).
5.4.1 Tablas de datos para análisis estadísticos entre grupos
El análisis estadístico entre grupos analiza los valores de concentraciones
obtenidos para cada uno de los grupos sin tomar en consideración las diferencias
entre experimentos. Una prueba paramétrica típica y representativa la constituye
la configuración ANOVA de una vía.
En este caso los grupos son los conjuntos de pH que se especificaron con
anterioridad y para agruparlos se van a tomar en cuenta todos los valores que se
incluyan dentro de ese rango. En esta sección solamente se presentan las tablas
que sirvieron de “alimentación” para las pruebas estadísticas, tanto para ácido
málico como para ácido láctico (Tabla 37).
Tabla 37 - Datos de Reflectoquant para el análisis estadístico entre grupos.
Ácido Málico Ácido Láctico Inicial
(mg/mL) G1
(mg/mL)G2
(mg/mL) G3
(mg/mL) Inicial
(mg/mL)G1
(mg/mL)G2
(mg/mL) G3
(mg/mL)139 95 151 150 27 36 60 93125 145 83 72 17 42 44 108190 86 65 103 21 25 43 48198 74 61 84 15 33 46 62166 73 62 136 18 26 31 75186 128 135 73 18 36 32 69159 60 102 75 14 31 41 59
93 96 47 57 79 52 31 28 118 97 39 31 159 19 104.5 56
5.4.2 Análisis estadístico entre grupos
Se inició con un análisis exploratorio de los datos (EDA), este permitió determinar
si las técnicas estadísticas que se utilizarían posteriormente para comparar los
grupos serían las más apropiadas.
Se realizó una prueba de normalidad para determinar si los grupos de pH dentro
de cada ácido se ajustaban a una distribución normal. Con este propósito se
realizaron dos pruebas de forma paralela para los siete ácidos carboxílicos: la
prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Shapiro-Wilk.
Ambas prueban la hipótesis nula que los datos poseen una distribución normal. Un
nivel de significancia particularmente bajo (generalmente menor a 0.05) indica que
la distribución de los datos difiere significativamente de una distribución normal. A
continuación se presenta una matriz resumen de la prueba que se realizó con el
software SPSS ® (Tabla 38).
Con estos se resultados se concluyó que una prueba paramétrica podría
realizarse para encontrar diferencias entre grupos para ambos ácidos.
Los gráficos de caja (boxplots) no se presentan aquí, pero en ellos no se
encontraron datos aberrantes o fuera de rango, se concluye por lo tanto que no
era necesario eliminar ningún dato y por lo tanto se pudo realizar directamente la
prueba ANOVA una vía.
Los datos que se adaptaron a una distribución normal fueron analizados mediante
la prueba ANOVA de una vía.
Tabla 38 - Pruebas de normalidad para los datos de comparaciones entre grupos de pH (configuración ANOVA una vía).
Tests of Normality
.195 7 .200* .940 7 .642
.207 7 .200* .906 7 .368
.148 10 .200* .919 10 .346
.181 11 .200* .928 11 .391
.267 7 .143 .890 7 .274
.154 7 .200* .953 7 .757
.165 10 .200* .912 10 .295
.120 11 .200* .971 11 .899
PH_GROUP"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4"6.1-6.3"4.5-4.84.2-4.43.7-4
CONC_MAL
CON_LAC
Statistic df Sig. Statistic df Sig.Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
This is a lower bound of the true significance.*.
Lilliefors Significance Correctiona.
Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 39),
esta matriz presenta la variación para cada ácido en dos componentes principales.
La variación entre grupos (Between Groups) estima la variación de las medias
de los grupos alrededor de una media general. La variación dentro del grupo
(Within Groups) representa la variación de puntajes individuales alrededor de sus
medias respectivas. Sig. Indica el nivel de significancia para la prueba F, valores
de significancia bajos (<.05) indican diferencias entre los grupos.
Los resultados presentados muestran que los grupos experimentales si poseen
diferencias estadísticas, esto se aprecia en valores de significancia bajos.
Para ambos ácidos se realizó una prueba de contrastes para determinar entre qué
grupos se presentaban las diferencias.
Los contrastes se enlistan en la Tabla 40, a. En este caso, cuatro contrastes son
investigados, el primero compara el grupo inicio con el grupo G3 (pH=3.7 -4.0). El
segundo compara los grupos intermedios (G1, pH = 4.5 – 4.8 con G2, pH= 4.2-
4.4). El tercero compara los grupos G2 con G3. El cuarto compara los grupos G1 y
G2 con el grupo G3.
Tabla 39 - Resultados prueba ANOVA de una vía para datos de Reflectoquant
ANOVA
27011.071 3 9003.690 8.960 .00031149.971 31 1004.83858161.043 347525.948 3 2508.649 9.209 .0008444.452 31 272.402
15970.400 34
Between GroupsWithin GroupsTotalBetween GroupsWithin GroupsTotal
CONC_MAL
CON_LAC
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
Por su parte los resultados de la prueba de contrastes se enlistan en la
Tabla 40-b. En este caso el software realizó las pruebas de contrastes a ambos
casos, asumiendo tanto que hay igualdad de varianzas como que no hay igualdad
de varianzas, en la tabla se pueden apreciar los cuatro tipos de contrastes
anteriormente explicados para cada uno de los ácidos.
Puestos que los datos presentan igualdad de varianzas, se asumirán como válidos
los datos presentados en la columna “assume equal variances”.
Para el ácido málico solamente el contraste 1 ha indicado diferencias entre el
grupo inicial y el G3.
Para el ácido láctico se puede apreciar que solamente para los contrastes 1 y 4 se
han percibido diferencias entre los grupos. Es decir que el grupo inicial y el G3,
presentan diferencias, así como el G1, G2 con el G3.
Tabla 40 - Prueba de contrastes para ANOVA una vía, datos de reflectoquant
(a)
Contrast Coefficients
-1 0 0 10 -1 1 00 0 -1 10 -.5 -.5 1
Contrast1234
"6.1-6.3" 4.5-4.8 4.2-4.4 3.7-4PH_GROUP
(b)
Contrast Tests
-65.64286 15.32635 -4.283 31 .000.471429 15.62152 .030 31 .976
5.600000 13.85037 .404 31 .6895.835714 12.34329 .473 31 .640
-65.64286 14.67480 -4.473 15.103 .000.471429 15.39460 .031 13.137 .976
5.600000 14.41052 .389 19.000 .7025.835714 12.97824 .450 19.440 .658
40.337662 7.9798693 5.055 31 .0008.685714 8.1335535 1.068 31 .294
17.509091 7.2113769 2.428 31 .02121.851948 6.4266991 3.400 31 .00240.337662 8.3637379 4.823 10.792 .001
8.685714 3.6209769 2.399 14.995 .03017.509091 8.6733414 2.019 12.322 .06621.851948 8.3977674 2.602 10.981 .025
Contrast1234123412341234
Assume equal variances
Does not assume equalvariances
Assume equal variances
Does not assume equalvariances
Mal_Refl
Lac_Refl
Value ofContrast Std. Error t df Sig. (2-tailed)
Las concentraciones tanto del ácido málico como del ácido láctico para los datos
de reflectoquant se graficaron en dependencia del pH en que se interrumpió la
fermentación. Se pueden apreciar dos comportamientos diferentes tanto para el
ácido málico como para el ácido láctico. El primero (Figura 25-a) presenta un
comportamiento decreciente, a medida que avanza el proceso fermentativo su
concentración disminuye, se mantiene casi constante entre los G1, G2 y G3,
aumenta ligeramente en G3.
El ácido láctico por su parte, para el cual no se obtuvieron datos mediante el
sistema HPLC presenta un comportamiento diferente (Figura 25-b), con la
concentración aumentando de forma casi constante desde 20 mg/L al inicio hasta
alrededor de 60 mg/L hasta el G3.
Figura 25 - Comportamiento de las concentraciones de ácido málico y ácido láctico a medida que avanza el proceso de fermentación, datos de Reflectoquant.
(a) Á. málico (b) Á. láctico. Las concentraciones se presentan en mg/L, debido a que esta es la unidad de medida de Reflectoquant.
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
N_L
AC
70
60
50
40
30
20
10
(b)
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
NC
_MA
L
180
160
140
120
100
80
(a)
5.4.3 Análisis estadístico entre grupos y entre experimentos (ANOVA 2 vías)
Las siguientes tablas sirvieron de “alimentación” a la prueba estadística ANOVA
dos vías para los resultados de Reflectoquant (Tabla 41).
Tabla 41 - Datos de Reflectoquant para el análisis estadístico ANOVA dos vías, á. málico y á. láctico
(a) Ácido Málico Exp Inicial G1 G2 G3
B 139 128 63.5 84C 125 145 135 150F 190 86 151 73K 159 74 61 75
(b) Ácido Láctico Exp Inicial G1 G2 G3
B 27 36 37 62C 17 42 32 93F 21 25 60 69K 14 33 46 59
Los resultados de la prueba ANOVA se presentan en forma de matriz (Tabla 42),
se puede apreciar que para el á. málico no se determinaron diferencias ni entre los
grupos (Columns) ni entre los experimentos (Rows), esto se explica por valores F
calculada inferiores a los de F tabular. Por otro lado, los valores de P indicarían
que de cierta forma el azar sería responsable de estas similitudes entre los grupos
y experimentos.
Tabla 42 - Resultados prueba ANOVA de 2 vías para resultados de Reflectoquant.
(a) Á. Málico Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Rows 5243.922 3 1747.974 1.400836 0.304813 3.862548Columns 8167.922 3 2722.641 2.18194 0.159894 3.862548Error 11230.27 9 1247.807 Total 24642.11 15
(b) Á. Láctico Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Rows 149.1875 3 49.72917 0.354909 0.786919 3.862548Columns 5554.688 3 1851.563 13.2143 0.001201 3.862548Error 1261.063 9 140.1181 Total 6964.938 15
En el caso del á. láctico, las diferencias entre experimentos no son evidentes y por
el contrario se podría concluir que sus similitudes se deberían al azar (un valor P
relativamente alto). En el caso de los grupos, hay diferencias claras y el valor P
bajo indica que otras son las causas (no el azar) de esas diferencias.
6 DISCUSIÓN
En la Sección 5.1.2 se presentaban las aproximaciones más importantes en
cuanto a los picos identificados para distintas muestras de ácidos, se hacía énfasis
en lo acontecido para el pico E, cuyo aumento no correspondía al ácido láctico, tal
como se asumió en un principio, sino que al ácido láctico más otro pico de carácter
desconocido.
Se realizaron posteriormente una serie de experimentos para determinar a qué
ácido en particular correspondía este pico. Se utilizó como ayuda la hoja de
referencia de la columna HPLC, la cual indica que casi en el mismo tiempo de
retención que el ácido láctico se retiene el ácido ascórbico. También se consultó la
bibliografía (Belitz y Grosch, 1999), la cual indicó que el ácido ascórbico se
encuentra presente en la fruta del café. Posteriormente, se realizaron
experimentos para determinar si el pico E correspondía a dicho ácido. Los
resultados (Anexos, Sección 10.7) confirmaron esta hipótesis.
Los resultados obtenidos para el límite de detección (Tabla 17) demuestran que
dicho límite ronda los 0.12 mg/mL para el á. málico y los 0.20 mg/mL para el á.
propiónico. Como se mencionó con anterioridad esta sería la concentración
mínima bajo la cual se podría asegurar que la señal que se observa corresponde
a la muestra y no a interferencias inherentes al equipo (USEPA, 2004). Esto es
importante tenerlo en cuenta al momento de analizar hasta qué concentraciones
es capaz de analizarse con los métodos e instrumentos planteados en esta
investigación.
Otra aproximación para comprender la magnitud de los límites con los cuales la
metodología aquí utilizada es capaz de trabajar la constituyen las incertidumbres
planteadas en las tablas de resultados (Tabla 18 - Tabla 23). En dichas tablas,
para cada ácido se reportó la desviación estándar a la par de cada una de las
concentraciones calculadas para las muestras.
Se puede observar que para el ácido galacturónico (Tabla 18) las desviaciones
estándares de los resultados no implican un nivel de incertidumbre muy grande.
Esto se debe a que las concentraciones calculadas son los suficientemente
grandes como para verse afectadas por dicho valor.
El ácido fórmico por su parte (Tabla 19), posee valores de desviaciones
estándares que agregarían incertidumbre al resultado calculado. Sin embargo los
valores de incertidumbre no exceden los valores de las concentraciones
calculadas, lo que no pondría en riesgo la validez del resultado. Una conclusión
similar se desprendería de las concentraciones calculadas para el ácido málico
(Tabla 20) y para el ácido acético (Tabla 21), cuyas concentraciones y
desviaciones estándares se acoplan al mismo rango de valores.
Los valores del ácido cítrico (Tabla 22) y del ácido propiónico (Tabla 23) poseen
las desviaciones estándares más remarcables de todo el conjunto de ácidos
analizados (0.20 mg/mL). En el caso del ácido cítrico esta concentración se
compara muy de cerca con los valores obtenidos para la mayor parte de las
muestras, por lo cual se podría concluir que gran parte de los valores
determinados para dicho ácido “encajarían” dentro de un margen de incertidumbre
suficientemente importante. Algo un poco más drástico acontece con el á.
propiónico, para el cual las concentraciones determinadas son inferiores a la
incertidumbre.
Para analizar los resultados incluidos en el instrumento de investigación, se
perfilaron dos alternativas, y se plasmaron en la sección de resultados: un diseño
ANOVA 1 vía con el fin de comparar solamente los grupos de pH y un diseño
ANOVA 2 vías con el fin de identificar diferencias tanto entre dichos grupos como
entre los experimentos.
El diseño ANOVA 1 vía tiene la desventaja que asume que todos los datos dentro
del mismo grupo han sido obtenidos de una forma similar, por esa razón antes de
aplicar la prueba de análisis de varianza (ANOVA 1 vía) hubo que determinar si
dichos datos dentro de los grupos se ajustaban a una distribución normal. En
efecto, esto permitió identificar que había menos datos para los grupos Inicial y G1
que para los grupos G3 y G4.
Se utilizaron menos datos para el análisis del ácido fórmico (
Tabla 25) debido a que durante los días en que se realizó dicho experimento las
condiciones experimentales variaron un poco con relación a las que se venían
manifestando en días previos, uno de los aspectos más destacables fue la
temperatura, durante el día en que se llevó a cabo el análisis (26/06/06) la
temperatura del laboratorio y en especial en el sitio en donde se encontraba el
equipo de HPLC sufrió un incremento cercano a los 10 ºC con relación a los días
con que previamente se habían analizado otras muestras. Esto fue una de las
causas por las cuales los picos en los cromatogramas presentaron tiempos de
elusión diferentes a los que en día previos venían presentando, además, se pudo
observar que a temperaturas más altas el pico que representaba al á. fórmico se
fusionaba con el pico de á. galacturónico, razón por la cual no fue posible
identificarlo y estos datos no se pudieron incluir en el instrumento de investigación.
A pesar que en general los resultados obtenidos tanto para la prueba ANOVA 1
vía (Sección 5.3.2.1) y como los resultados de la prueba de Kruskall- Wallis
(Sección 5.3.2.2) no indicaron diferencias importantes entre los grupos, los
resultados deben analizarse con más detenimiento para identificar los
comportamientos de las concentraciones de los ácidos a medida que el proceso
fermentativo avanza (disminución del pH).
Los primeros resultados arrojados por la prueba de ANOVA 1 vía para los grupos
dentro de los ácidos que se adaptaron a una distribución normal arrojaron
comportamientos diferentes para sus medias. El ácido fórmico (Figura 26-a)
presentó un comportamiento decreciente: inicialmente su concentración se
encuentra sobre 0.48 mg/mL y desciende bajo 0.42 mg/mL a medida que el pH
disminuye, posteriormente aumenta ligeramente cuando disminuye el pH de
interrupción, sin embargo, la prueba ANOVA no indicó que estos promedios
defirieran entre sí, claramente se puede apreciar que los grupos G1, G2 y G3
poseen concentraciones muy similares.
Por otro lado, el ácido acético (Figura 26-b) parece comportarse de forma
diferente, el pH inicial arroja concentraciones cercanas a 0.29 mg/mL,
posteriormente la concentración aumenta súbitamente a 0.32 mg/mL, durante los
valores de pH con los cuales la fermentación se interrumpió, posteriormente el
aumento de la concentración de este ácido muestra solamente ligeros
incrementos. El comportamiento de este ácido fue reportado de forma similar en
el estudio de Avallone et al (2001b), Wootton (1963b) también reportó el
incremento de este ácido conforme el pH disminuye. Esto hace entrever la
influencia que definitivamente tiene este ácido tanto en la disminución del pH
como en el ser precursor del ácido acético en café tostado. De acuerdo a Flament
(2002), cuando el café se tuesta, la cantidad de á. acético aumenta por un factor
de 3. El mismo autor señala que concentraciones más altas de este ácido se
encontrarían en granos defectuosos, concentraciones más bajas se encontrarían
en granos en buen estado. La desventaja es que el olor producido es fuerte,
punzante y ácido, además de ser desagradable cuando está altamente
concentrado.
El ácido cítrico (Figura 26-c) presenta también una tendencia de aumentar su
concentración a medida que disminuye el pH en que se interrumpe su
fermentación, de forma tal que la concentración promedio en el grupo inicial es
inferior a 0.24 mg/ml, posteriormente registra un incremento cuando la
fermentación se interrumpe a un pH entre 4.5 y 4.8. Una ligera disminución en la
concentración del ácido se registra cuando el pH se interrumpe en un pH entre 4.2
y 4.4, para finalmente incrementar su concentración nuevamente cuando la
fermentación se interrumpe entre los pH 3.7 y 4. La literatura (Flament, 2002)
indica que el á. cítrico es de suma importancia para controles del sabor en el café
tostado, por ende las concentraciones de este ácido en el café verde son
precursores esenciales junto con la temperatura de tueste para obtener sabores
agradables cuando las concentraciones de este ácido se encuentran entre 0.02 a
0.08% de peso en seco.
El ácido galacturónico (Figura 26-d) por su parte registra una tendencia de
disminución de su concentración a medida que el proceso de fermentación avanza
(pH disminuye). Inicia con una concentración de ácidos por encima de 10.8 mg/mL
y progresivamente disminuye (al pH comprendido entre 4.5 y 4.8, de una forma un
poco más pronunciada a 10.4), posteriormente la concentración disminuye de
forma menos pronunciada que para la primera disminución entre los G2 y G3.
Algunos investigadores (Dinu, 2001) indican que el á. galacturónico y el á.
poligalacturónico son constituyentes importantes de las pectinas. Las anteriores
teorías sobre la degradación del mucílago presuponían que la degradación del
mucílago se debía a la digestión de las pectinas por enzimas presentes en
microorganismos (García et al, 1991).
El ácido málico por su parte (Figura 26-e) presenta una concentración decreciente
a medida que el proceso de fermentación avanza. Inicialmente la concentración
del ácido presenta valores cercanos a 0.28 mg/mL, se registra luego una
disminución pronunciada al pH de 4.5-4.8, posteriormente la concentración en este
ácido no presenta cambios perceptibles, manteniéndose constante en el rango de
los G1, G2 y G3. Ligeramente se puede apreciar que en el G3 la concentración del
ácido es inferior que en el G1 y G2. Este patrón en el comportamiento de la
concentración del ácido málico a medida que avanza el proceso fermentativo es
muy similar al que se midió mediante la técnica del Reflectoquant (Figura 25-a),
esto puede dar una indicación que ambas técnicas estarían correlacionadas y que
definitivamente el patrón observado para este ácido tiene una relación con la caída
del pH.
A pesar de estas diferencias en cuanto al carácter de la distribución, en ambos
casos hubo diferencias entre los grupos debido a las características del
comportamiento de la concentración del ácido málico en dependencia del pH y en
base a la prueba de contrastes que se realizaron a los datos de reflectoquant
(Tabla 40). La literatura (Flament, 2002) reporta que este ácido es responsable de
la acidez junto con los ácidos acético y cítrico. Por lo general el á. málico se asocia
con notas de sabores acaramelados.
Algunos de los grupos dentro del ácido propiónico tampoco se ajustaron a una
distribución normal, por lo tanto se realizó una prueba no paramétrica y los
resultados de esta indicaron que no había diferencias entre los grupos. Esto
explicaría el comportamiento presentado por dicho ácido en el transcurso de la
fermentación (Figura 26-f), se puede apreciar que a medida que el proceso
fermentativo avanza, aumenta ligeramente la concentración de dicho ácido entre
el grupo inicial y el G1, posteriormente dicho aumento se hace un poco más
pronunciado entre el G1 y el G2, finalmente disminuye entre G2 y G3. Wootton
(1963a, b) indica que este ácido solamente aparece en etapas muy avanzadas del
proceso fermentativo, no en las etapas tempranas. Por esta razón, los valores
obtenidos fueron muy bajos y con alta incertidumbre. El á. propiónico está
asociado a notas de sabores desagradables (aroma a cebollas), con los resultados
obtenidos no se puede decir categóricamente que el pH más bajo influye en el
aumento de la concentración de dicho ácido.
Figura 26- Comportamiento de las concentraciones promedio de los ácidos analizados en dependencia del pH
Vistos los comportamientos para todos estos ácidos, se puede decir que en
términos generales para la prueba ANOVA 1 vía, los resultados no arrojaron
diferencias significativas entre todos los grupos. Los gráficos de concentración en
(a) Concentraciones de á. fórmico (b) Concentraciones de á. acético (c) Concentración de á. cítrico (d) Á. galacturónico (e) Á. málico (f) Á. Propiónico
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
N_A
CE
.33
.32
.31
.30
.29
.28
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
NC
_FO
R
.50
.48
.46
.44
.42
.40
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
N_C
IT
.26
.25
.24
.23
(a) (b)
(c)
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
C_g
al11.0
10.8
10.6
10.4
10.2
10.0
(d)
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
NC
_MA
L
.30
.28
.26
.24
.22
.20
(e)
3.7-44.2-4.44.5-4.8"6.1-6.3"
Mea
n of
CO
N_P
RO
P
.140
.138
.136
.134
.132
.130
(f)
dependencia del pH en que se interrumpe la fermentación hacen indicar que en
realidad hubo ligeros cambios en las concentraciones de los ácidos.
Un análisis más detallado de estas variaciones en dependencia del avance del
proceso fermentativo fue ya estudiado por López et al (1989). En dicho estudio se
estudiaron los mismos ácidos carboxílicos que en la presente investigación y de
forma paralela se estudiaron las características organolépticas de las muestras
ensayadas. En cuanto al comportamiento de los ácidos, algunas características
importantes pueden apreciarse en la Figura 27, al igual que en el presente estudio
las concentraciones determinadas para los ácidos acético, fórmico, cítrico y
fórmico fueron inferiores a 0.5 mg/mL a lo largo del proceso fermentativo. Las
concentraciones de ácido galacturónico fueron inferiores a
3.5 mg/mL, en cambio en la presente investigación se registraron concentraciones
superiores a 10 mg/mL, análisis cualitativos posteriores mediante HPLC indicaron
que el ácido tartárico y el ácido glucorónico presentaban tiempos de retención
similares al del ácido galacturónico, lo cual hace sospechar que este aumento en
las concentraciones tenga sus causas inmediatas en la mezcla de dichos ácidos y
no exclusivamente á. galacturónico (Anexos, Sección 10.7).
Otro ácido que muestra una fuerte presencia en las muestras analizadas por
López et al (1989) es á. málico, el cual posee concentraciones de importancia en
dicho estudio, aunque en la presente investigación sus concentraciones no difieren
mucho de las que se determinaron para los otros ácidos (con excepción de á.
galacturónico). La situación de á. láctico ya se discutió con anterioridad y se
mencionaron los problemas inherentes a su separación mediante técnicas
cromatográficas.
Se aprecia que en ambos estudios las concentraciones de los ácidos, a pesar que
varían de cierta forma en el transcurso del proceso fermentativo, no siguen un
patrón claramente definido de aumento categórico en las concentraciones
promedio de los ácidos (ver última línea en ambas gráficas). Algunas
explicaciones puede encontrarse en el comportamiento individual de las
concentraciones de ciertos ácidos. Por ejemplo, el á. acético y el á. fórmico
tienden a aumentar conforme avanza el proceso fermentativo, otro ácido
(propiónico) mantiene una concentración relativamente constante mientras que el
á. galacturónico disminuye.
Los resultados de la prueba ANOVA 2 vías (Sección 5.3.4) indican diferencias
importantes entre los experimentos. Para cinco de los ácidos (con excepción de á.
fórmico) se compararon 4 experimentos (B, C, F y K) debido a que la prueba
ANOVA 2 vías solamente se puede realizar cuando el número de datos es igual
para todas las columnas y para las filas. Un análisis estadístico por medio de la
técnica gráfica de las “cajas de puntos” muestra que el experimento C presenta
diferencias remarcables con respecto al resto de experimentos (Figura 28). El
cuaderno de experimentos no registra anotaciones excepcionales para el día en
que se realizó el experimento C. Al contrario de otros días experimentales en los
que se indicaron comentarios especiales para cuando la temperatura disminuyó
sobremanera con relación a los días previos. Esto lleva a estimar que los análisis
realizados mediante la técnica ANOVA 1 vía deben analizarse con cuidado,
básicamente porque las semejanzas o diferencias entre grupos podrían estar
influenciadas por características inherentes a dichos experimentos. Wootton
(1963a) ya había comentado sobre las altas variabilidades que existen entre
diferentes lotes de café provenientes inclusive de una misma finca, otorgaba como
causas de estas variabilidades a factores como las condiciones de cada planta y al
grado de madurez de las frutas, ambos factores podrían influenciar las
características bioquímicas de los granos. En este caso se debe tener en cuenta
que cada experimento consistió en muestras provenientes de puntos distintos de
la finca.
Figura 27 -Concentraciones de ácidos orgánicos conforme avanza el proceso fermentativo
6.1-6.3
4.5-4.8
4.2-4.4
3.7-4-0
Prom
edio
Fórm
ico
Mál
ico
Acé
tico
Cítr
ico
Pro
pión
ico
Gal
actu
róni
co
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Concentración de ácidos en dependencia del pH de interrupción de la fermentación
C (m
g/m
l)
pH de interrupción de fermentación
(a) Concentraciones de á. orgánicos identificadas por López et al (1989) (b) Concentraciones de á. orgánicos identificadas en la presente investigación. En ambos casos las unidades son mg/mL.
(a)
(b)
Figura 28 - Gráficos de cajas “boxplots”, análisis ANOVA 2 vías entre experimentos
444N =
FCB
C_F
OR
MIC
.7
.6
.5
.4
.3
.2
4444N =
KFCB
C_P
RO
P
.18
.17
.16
.15
.14
.13
.12
.11
4444N =
KFCB
C_C
ITR
IC.34
.32
.30
.28
.26
.24
.22
.204444N =
KFCB
C_A
CE
TIC
.5
.4
.3
.2
4444N =
KFCBC
_MA
LIC
.4
.3
.2
.14444N =
KFCB
Gal
_Aci
d
18
16
14
12
10
8
6
4
(a) (b)
(c) (d)
(a) A. galacturónico, (b) A. málico, (c) A. acético (d) A. cítrico (e) Á. Propiónico (f) Á. Fórmico. Eje X presenta los experimentos.
(e) (f)
Las pruebas ANOVA de 2 vías solamente indicaron diferencias estadísticas entre
las concentraciones de á. málico y á. cítrico cuando se realizaron comparaciones
entre los cuatro grupos para dicho experimento, reforzando nuevamente los
resultados ya obtenidos con ANOVA 1 vía para el á. málico. Como también la
impresión que las muestras obtenidas de diferentes experimentos realmente
tenían diferencias entre sí.
Los análisis mediante reflectoquant constituyeron una valiosa fuente de
información al momento de determinar las concentraciones para el ácido láctico
(Ver Sección 5.4.2). Se puede apreciar claramente que la concentración de dicho
ácido aumenta de forma proporcional al avance del proceso fermentativo
(disminución del pH). La cuestión es hasta qué punto los datos mediante este
sistema son comparables o confiables en comparación a los obtenidos mediante la
técnica del HPLC.
Lo anterior puede analizarse mediante correlaciones entre ambas técnicas, en
este caso tomando como referencia el ácido málico para el cual hay suficientes
datos obtenidos mediante ambas técnicas (Figura 29). El resultado de las
correlaciones entre ambas técnicas indica .598, para un nivel de significancia de
0.01 (prueba de 2 colas). En parte se puede decir que es un valor aceptable, con
una correlación positiva, sin embargo indica en buena parte las variabilidades que
con anterioridad se presentaron para ambas técnicas como las diferencias en
cuanto a los límites de detección y a las distribuciones obtenidas. No debe
descartarse que la técnica HPLC implica un protocolo mucho más extenso, lleva
más procedimientos y por lo tanto las probabilidades de realizar errores en el
laboratorio aumentan.
Figura 29 - Gráfica y tabla con el coeficiente de correlación para ácido málico, técnica del reflectoquant y HPLC.
La técnica del Reflectoquant obvia la centrifugación y las continuas filtraciones,
razón por la cual hay más probabilidades que partículas mayores interactúen con
las cintas de medición y tiendan a otorgar un valor inferior en la concentración del
ácido. Asimismo en la fase de campo el tiempo de agitación fue muy inferior
(alrededor de 15 segundos, contrario a la fase de laboratorio que fueron 45
minutos más o menos.
Como se ha indicado en la Sección 4.2.4.4, página 54, el ácido láctico se midió
también durante la fase experimental. Una medición en dicha fase se vislumbra de
gran utilidad para determinar si las características de las muestras en cuanto a la
concentración de los ácidos sufren variaciones debido al procedimiento
experimental y de análisis instrumental.
Los resultados de las mediciones de las concentraciones de ácido láctico durante
la fase experimental (Figura 30) muestran un comportamiento similar a las
concentraciones de ácido láctico medidas durante la fase de laboratorio
(Figura 25-b). Se puede apreciar un incremento en las concentraciones del ácido a
El coeficiente de correlación de Pearson se presenta cuando se compara la columna M_Refl con la columna M_HPLC.
M_HPLC (mg/ml)
.4.3.2.1
M_R
efl (
mg/
ml)
.20
.18
.16
.14
.12
.10
.08
.06
.04
Correlations
1 .598**. .000
36 36.598** 1.000 .
36 36
Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N
M_Refl (mg/ml)
M_HPLC (mg/ml)
M_Refl(mg/ml)
M_HPLC(mg/ml)
Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.
medida que avanza el proceso fermentativo, este incremento fue reportado por
Wootton (1963b) y comprobado por Avallone et al (2001b).
Figura 30 - Concentraciones de ácido láctico a medida que disminuye el pH en que se interrumpe la fermentación
Si las gráficas de las medias en dependencia de los grupos indican similitudes en
los comportamientos del ácido láctico en las fases experimental y de laboratorio,
en tanto control experimental, se compararon para determinar que tan bien
correlacionados estaban los valores de concentración obtenidos en ambas fases.
El coeficiente de Pearson es de .877. Lo cual implica que la correlación es muy
importante entre ambas mediciones, y esto prueba que las características de las
muestras se mantuvieron de forma adecuada (Figura 31). Sin embargo, ligeras
diferencias se aprecian en cuanto a las concentraciones determinadas en distintas
etapas del análisis. En efecto, se puede apreciar en la Figura 31 que los valores
medidos en la fase experimental (campo) son distintos a los registrados para las
mismas muestras en la fase de laboratorio. En una investigación de este tipo, en el
que se trataron de mantener constantes las condiciones de extracción de los
ácidos en la fase experimental (Sección 4.2.4), junto con las condiciones de
En el eje de las x se indican los distintos grupos experimentales durante los cuales se interrumpió la fermentación, en el eje de las y el promedio de las concentraciones de ácido láctico para los distintos grupos experimentales.
"3.7-4""4.2-4.4""4.5-4.8""6.1-6.3"
Mea
n of
C_L
_FIE
L
120
100
80
60
40
20
0
extracción durante la fase de laboratorio (Sección 4.3.1), es de extrañar que
dichos cambios ocurrieran.
Figura 31 - Gráfica y tabla con el coeficiente de correlación para ácido láctico. Fase experimental y fase de laboratorio
Una causa de estos cambios es el factor de dilución empleado para disolver las
muestras en agua destilada, a pesar que se trató de emplear un factor de dilución
similar para ambas fases, se obviaron mediciones cuantitativas con instrumentos
volumétricos en la fase experimental, en su defecto se utilizaron recipientes de
plástico graduados para representar el límite máximo de granos o de agua
purificada (tratando de representar al máximo las condiciones en que los
cafetaleros utilizarían el método). Por otro lado en la fase de laboratorio las
mediciones se realizaron con frascos volumétricos y también se llevó un registro
más estricto de las masas y volúmenes con que se diluyó cada muestra.
El coeficiente de correlación de Pearson indica un valor de .877, esto hace entrever que los valores de concentración de ácido láctico en la fase experimental (C_L_Fiel) tienen una muy buena correlación con los valores de ácido láctico de la fase de laboratorio (C_L_Lab).
Correlations
1 .877**. .000
34 34.877** 1.000 .
34 34
Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N
C_L_FIEL
C_L_LAB
C_L_FIEL C_L_LAB
Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.
C_L_FIEL
4003002001000
C_L
_LA
B
120
100
80
60
40
20
0
En la misma línea de las comparaciones entre las mediciones de las
concentraciones de á. láctico durante la fase de campo y durante la fase
experimental, se realizaron comparaciones de las mediciones del pH durante
ambas fases, se persigue un mismo objetivo: determinar si durante el transcurso
de interrupción de la fermentación y el almacenamiento mediante congelamiento,
las muestras sufrieron cambios importantes en sus características.
De forma previa a las comparaciones de pH entre ambas etapas, se realizó una
correlación entre los pH medidos mediante la técnica del reflectoquant y aquellos
determinados mediante las cintas de pH en la fase experimental (Sección 4.2.4.3).
Los resultados de la correlación indican un valor de p = .986 (Figura 32). Esto
hace entrever la validez de las mediciones con la técnica de las cintas, a pesar de
la dificultad que implica dicha técnica cualitativa (debido a la subjetividad de los
colores y por ende las diferentes percepciones dependiendo de quien haga la
medición).
Figura 32 - Gráfica y tabla de correlación (Pearson) para los datos de pH medidos en la fase experimental con el sistema Reflectoquant y con cintas indicadoras
El coeficiente de correlación de Pearson se presenta cuando se comparan los datos de pH con Reflectoquant (pH_Ref_F) con el pH medido mediante las cintas (pH_strip). Ambos conjuntos de datos fueron obtenidos durante la fase de campo.
PH_STRIP
6.56.05.55.04.54.03.5
PH
_RE
F_F
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
Correlations
1 .986**. .000
27 27.986** 1.000 .
27 27
Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N
PH_STRIP
PH_REF_F
PH_STRIP PH_REF_F
Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.
Puesto que los grupos experimentales se formaron en base a las mediciones de
pH realizadas con el sistema cualitativo de las cintas se puede tener la seguridad
que dicho agrupamiento fue correctamente realizado.
Una segunda interrogante podría surgir cuando se analizan los datos del pH: tras
el tiempo de transporte y almacenamiento ¿las muestras preservaron su
constancia en pH?
Para responder a esta interrogante se correlacionaron los datos de pH obtenidos
mediante la técnica de las cintas cualitativas durante la fase de campo con los
datos obtenidos mediante las mediciones cuantitativas mediante Reflectoquant en
la fase de laboratorio (Figura 33). Los resultados de dicha correlación arrojan un
valor de p=.903. Es decir la relación se mantuvo constante durante ambas fases.
Figura 33- Gráfica y tabla de correlación (Pearson) entre las mediciones de pH, fase experimental y fase de laboratorio
Las mediciones de pH durante la fase de campo mediante las cintas cualitativas (pH_Field), se correlacionaron con las mediciones cuantitativas durante la fase de laboratorio (pH_lab).
Correlations
1 .903**. .000
34 34.903** 1.000 .
34 34
Pearson CorrelationSig. (2-tailed)NPearson CorrelationSig. (2-tailed)N
PH_FIELD
PH_LAB
PH_FIELD PH_LAB
Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).**.
PH_LAB
6.05.55.04.54.03.53.0
PH
_FIE
LD
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
En la Figura 33 se puede apreciar que los valores de pH medidos mediante la
técnica Reflectoquant en la Fase de laboratorio (pH_lab), tienden a arrojar valores
ligeramente inferiores que aquellos medidos en el campo con las cintas
(pH_Field). El equipo investigador discutió con anterioridad este hecho, se piensa
que el agua utilizada en la fase de campo (agua purificada comercial) posee
sustancias amortiguadoras (buffer) que tienden a otorgar valores de pH diferentes
a los que se obtienen cuando dichas mediciones se realizan con agua destilada (el
caso de la fase de laboratorio).
7 CONCLUSIONES
Los análisis cualitativos realizados mediante la técnica HPLC permitieron separar
e identificar 6 ácidos carboxílicos: á. galacturónico, á. fórmico, á. málico, á.
acético, á. cítrico y á. propiónico.
El ácido láctico se identificó mediante la técnica Reflectoquant, sin embargo no se
pudo separar mediante las condiciones de análisis cromatográfico empleadas
debido a que el á. ascórbico presentó un tiempo de retención que se extrapoló con
el del á. láctico.
Los análisis estadísticos de los datos obtenidos mediante HPLC y utilizando la
prueba ANOVA 1 vía y la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis no indicaron
diferencias estadísticas entre las concentraciones para los distintos grupos de pH
para los cuales se interrumpió la fermentación.
Cuando se configuraron los datos mediante un diseño ANOVA 2 vías y se
compararon los grupos de pH y los días experimentales, surgieron diferencias
entre los días experimentales.
Las diferencias entre días experimentales explicarían que no hubiese diferencias
al realizar un análisis ANOVA 1 vía. Es de esperar que dentro de un mismo
universo de estudio (cosecha dentro de una finca) existan diferencias en las
composiciones químicas de los granos de café.
Por otro lado, los promedios de las concentraciones de cada ácido dentro de cada
grupo (tomando en cuenta todos los valores) indican un incremento conforme
avanza la fermentación para ácidos representativos como acético, cítrico y málico.
Los datos de Reflectoquant obtenidos para el á. málico se correlacionaron con los
obtenidos con HPLC y la correlación fue altamente positiva, lo cual valida la
técnica del Reflectoquant.
Los datos de Reflectoquant también fueron útiles para conocer el comportamiento
del á. láctico, el cual, como se explicó con anterioridad, no pudo ser detectado
mediante HPLC. Para este ácido se comprobó un comportamiento de aumento de
la concentración conforme avanza el proceso fermentativo.
8 RECOMENDACIONES
De acuerdo a las pocas diferencias observadas entre grupos experimentales
mediante el diseño ANOVA 1 vía, para futuras investigaciones se recomienda
realizar un diseño experimental más centrado en la constitución de grupos y
bloques para un análisis de varianza ANOVA 2 vías.
A grandes rasgos, los resultados no demuestran diferencias muy marcadas entre
los grupos experimentales. Sin embargo, al analizar el patrón de las
concentraciones de los distintos ácidos conforme avanza la fermentación, se
aprecian aumentos de concentraciones en ácidos representativos como acético,
cítrico y láctico. Esto debe tomarse en cuenta al momento de elaborar un manual
destinado a un control más adecuado del proceso fermentativo, especialmente si
se requieren evitar concentraciones muy elevadas de estos ácidos (lo cual ocurre
por lo general en el G2 y G3, con pH entre 3.7- 4.0).
De acuerdo a los resultados presentados por Jackels et al (2006) en los resultados
de la catación profesional de las muestras utilizadas para este estudio difícilmente
se apreciaron diferencias significativas entre el grupo de pH en el cual se
interrumpió la fermentación y la calidad organoléptica del café. Sin embargo los
resultados muestran valores de calidad ligeramente superiores y con menor
incertidumbre para las muestras cuya fermentación se interrumpió en el pH del
G1.
Los resultados del mismo estudio (Jackels et al, 2006), pero con los experimentos
realizados de forma independiente por productores de café con los kit distribuidos
en sus fincas, indicaron mejoras remarcables en la calidad del café cuya
fermentación fue interrumpida en un pH cercano a 4.6. Dichas mejoras fueron
destacables en aquellos productores que midieron adecuadamente el pH y
registraron los valores de forma correcta.
Los anteriores resultados, así como el patrón identificado para determinados
ácidos (acético, cítrico y láctico) en la presenta investigación, además de la
correlación muy buena entre la técnica cualitativa de las cintas de pH y la técnica
cuantitativa de medición de pH mediante Reflectoquant, permite recomendar
futuras prácticas con el uso del kit para controlar el pH de fermentación. Un
aspecto fundamental es la utilización correcta del kit: la lectura adecuada de los
pH indicados por los colores de las cintas, anotar los datos correctos. Se ha
discutido la posibilidad de capacitar en la realización de esas tareas a los
miembros más jóvenes de las familias, tomando en cuenta que están envueltos en
el sistema educativo y que conjugan los conocimientos heredados de sus mayores
en cuanto al procesamiento del café con una apertura personal para aceptar
modificaciones a las técnicas con que procesan el café.
La longitud de onda del detector UV (214 nm) detectó interferencias en el tiempo
de retención del ác. Láctico. El ác. interferente fue ácido ascórbico, se recomienda
por tanto realizar ensayos con longitudes de onda diferentes con el fin de
comparar la detección excluyente del ácido ascórbico.
Como se apreció, la técnica HPLC tiene sus limitantes al realizarse análisis con
“café verde”. Las comparaciones de calidad basadas en las concentraciones de
determinados ácidos se podrían mejorar al utilizar “café tostado” y la técnica de
Cromatografía de Gas (GC). Ambas experiencias podrán desarrollarse con
instrumentos ya existentes en la Universidad como parte de futuros proyectos de
tesis.
9 BIBLIOGRAFÍA
Avallone, S., Guyot, B. Michaux-Ferrière, N., Guiraud, J.P., Olguín-Palacios, E. y
Brillouet, J.M. (1999). Cell wall polysaccharides of coffee bean mucilage.
Histological characterization during fermentation. In: Proceedings of the 18th
International Scientific colloquium on Coffee, 1999, Helsinki. Paris: Association
Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 145-156.
Avallone S, Guiraud J–P, Guyot B, Olguín E, Brillouet J-M. (2000). Polysaccharide
constituents of coffee-bean mucilage. Journal of Food Science 65(8):1308-
1311.
Avallone S, Guiraud J-P, Guyot B, Olguin E, Brillouet J-M. (2001a). Fate of
mucilage cell wall polysaccharides during coffee fermentation. J Agric Food
Chem 49:5556-5559.
Avallone S, Guyot B, Brillouet J-M, Olguin E, Guiraud J–P. (2001b).
Microbiological and biochemical study of coffee fermentation. Curr Microbiol
42:252-256.
Avallone S, Brillouet JM, Guyot B, Olguin E, Guiraud JP. (2002). Involvement of
pectolytic micro-organisms in coffee fermentation. Int J Food Sci Tech 37:191-
198.
Arnaud, J. (1988). The metabolism of coffee constituents. In, Coffe, Vol. 3.
Physiology. Ed. R.J. Clarke & R. Macrae. Elsevier Applied Science, London
and New York. P. 33-56.
Bade-Wegner, H., Bendig, I., Holscher, W. y Wollmann, R. (1997). Volatile
compounds associated with the over-fermented flavour defect. In: Proceedings
of the 17th International Scientific colloquium on Coffee, 1997, Nairobi. Paris:
Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 176-182.
Belitz, H.D. & Grosch, W. (1999). Food Chemistry (2nd ed.). Berlín. Springer-
Verlag. (Translation from the fourth German Edition by Burghagen, Hadziyev,
Hessel, Jordan & Sprinz, 1999).
Berríos, E., Dávila, R. y Echeverría, J. (2005). Manual práctico para cosechar y
beneficiar un café de calidad. Managua: Proyecto de café para Centroamérica.
Brown G.H. (2004). Making coffee good to the last drop: Laying the foundation for
sustainability in the international coffee trade. Georgetown International
Environmenta Law Review 16:247-280.
Campillo, P.I., Álvarez, J.R., Oliveros, C.E. y Álvarez, F. (2001). Cosecha de café
utilizando un equipo de aspiración. Cenicafé 52(3):185-194.
Cantergiani, E., Brevard, H. Krebs, Y., Feria-Morales, A., Amadò, R. y Yeretzian,
C. (2001). Characterization of the aroma of green Mexican coffee and
identification of mouldy/earthy defect. Eur Food Res Technol 212: 648-657.
Carbonell, R.J., Vilanova, M.T., (1952). Beneficiado rápido y eficiente del café
mediante el uso de soda caústica. Centro Nacional de Agronomía, Ministerio
de Agricultura y Ganadería: El Salvador. Boletín Técnico nº13: 65-66.
Carpio Zavala, N. (1998). La importancia de la operación del beneficio en la
producción de café lavado. Agroenfoque 14 (101): 9-10.
[CRS] Catholic Relief Services. (2004). Annual Public Summary of Activity. CRS
Nicaragua. p 10
Dart, S.K. & Nursten, H.E. (1985). Volatile components. In, Coffee, Vol.1,
Chemistry. Eds, R. J. Clarke & R. Macrae. Elsevier Applied Science, London
and New York. P. 223-265.
Daviron, B., et Lerin, F. (1990). Le café. In : Chalmin, P (Ed.). Cyclope 1990 : Les
grands marchés mondiaux (pp. 1-106). Paris : Economica.
Decazy, E., Avelino, J., Guyot, B., Perriot, J.J., Pineda, C. & Cilas, C. (2003).
Quality of different Honduran coffees in relation to several environments.
Journal of Food Science 68 (7): 2356-2361.
Dentan, E. (1987). Examen microscopique de grains de café riotés. In:
Proceedings of the 12th International Scientific colloquium on Coffee, 1997,
Montreux. Paris: Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp
335- 352.
Dinu, D. (2001). Enzymatic hydrolysis of pectic acid and pectins by
polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett. 6 (5): 397-
402.
Flament, Y. (2002). Coffee flavor chemistry. New York : John Wiley & Sons, Ltd.
García, R., Arriola, D., de Arriola, M.C., de Porres, E. y Rolz, C. (1991).
Characterization of coffee pectin. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 24 : 125-129.
García, E.A., Oliveros, C.E. Álvarez, F. y Montoya, E.C. (2001). Cosecha de café
mediante impacto en las ramas. Cenicafé 52(4): 231-248.
Gibson, A. & Butty, M. (1976). Overfermented coffee beans (“stinkers”), a method
for their detection and elimination. In: Proceedings of the 7th International
Scientific colloquium on Coffee, 1975, Paipa, Colombia. Paris: Association
Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 141-152.
Gómez, M. (2005). Éxito empresarial: sistematización de experiencias de
pequeños productores de café en Centroamérica. Managua: Reporte
preparado para Pueblos en Acción Comunitaria [PAC] y Central de
Cooperativas de Servicios Múltiples [PRODECOOP].
Guharay, F. Monterrey, J., Monterroso, D. y Staver, C. (2000). Manejo integrado
de plagas en el cultivo del café. Managua: CATIE.
Gutiérrez, S., Medina, P. y Gómez, R. (2005). Café de especialidad, Serie
Cuaderno de Escuela de Campo. Managua : Nitlapán.
van Hilten, H.J., Fisher, P. , Wheeler, M.A. & Scholer, M. (2002). Niche markets,
environment and social aspects. In: van Hilten, H.J. (Ed.) Coffee: An exporter
Guide (pp.64-89). Geneva: International Trade Center UNTCTAD/ WTO.
Holscher W.; Vitzthum O.G. & Steinhart H. (1990). Identification and sensorial
evaluation of aroma-impact-compounds in roasted Colombian coffee. Café,
Cacao, Thé 34 (3): 205 – 211.
Holscher, W., Bade-Wegner, H., Bendig, I., Wolkenhauer, P. & Vitzthum, O.G.
(1995). Off-flavor elucidation in certain batches of Kenyan coffee. In:
Proceedings of the 16th International Scientific colloquium on Coffee, 1995,
Kyoto. Paris: Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 174-
182.
Illy, E. (2002). The complexity of coffee. Scientific American June 2002: 88-91.
Illy, A. & Viani, R. (1995). Espresso coffee: the chemistry of quality. Academic
Press.
[IICA] Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura. (2004) Informe
anual 2004. Oficina IICA Nicaragua. p 14.
[INIFOM] Instituto Nicaragüense de Fomento Municipal. (2001). Caracterización
del Municipio de San Ramón. En: Caracterizaciones Municipales de Nicaragua,
INIFOM. CD-ROM: sin páginas.
Jackels S., Jackels, C. (2005). Characterization of the Coffee Mucilage
Fermentation Process Using Chemical Indicators: A Field Study in Nicaragua.
Journal of Food Science 70: 321-325.
Jackels, S., Jackels, C. Vallejos, Kleven, S., Rivas, R., Fraser-Dauphinée, S.
(2006). Control of the coffee fermentation process and quality of the results of
roasted coffee: Studies in the field laboratory and on small farms in Nicaragua
during the 2005-2006 harvest. Submitted to 21st International Conference on
Coffee Science, Montpellier: Association Scientifique Internationale du Café
(ASIC).
Johnson, E. L. & Stevenson, R. (1978). Basic Liquid Chromatography. Palo Alto:
Varian Associates, Inc.
Loconto, P.R. (2006). Trace environmental quantitative analysis, principles
techniques and applications. 2nd Ed. Boca Raton: CRC Press.
López Garay, C. Bautista Romero, E. y Moreno González. (1987). Microflora of the
stored coffee and its influence on quality. In: Proceedings of the 12th
International Scientific colloquium on Coffee, 1987, Montreux. Paris:
Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 758-770.
López, C.I. Bautista, E., Moreno, E. & Dentan, E. (1989). Factors related to the
formation of overfermented coffee beans during the wet processing method and
storage of coffee. In: Proceedings of the 13th International Scientific colloquium
on Coffee, 1989, Paipa, Colombia. Paris: Association Scientifique Internationale
du Cafe (ASIC). pp 373-384.
Masoud, W., Cesar, L.B., Jespersen, L. & Jakobsen, M. (2004). Yeast involved in
fermentation of Coffea arabica in East Africa determined by genotyping and by
direct denaturating gradient el electrophoresis. Yeast 21: 549-556.
Merrit, C., Robertson, D.H. & McAdoo, D.J. (1970). The relationship of volatile
compounds in roasted coffee beans to their precursors. In: Proceedings of the
Quatrième colloque International sur la Chimie des cafés verts, torréfiés et leurs
dérivés, 1969, Ámsterdam. Paris: Association Scientifique Internationale du
Café (ASIC). Pp. 144-148.
Miller, J. & Miller, J. (2000). Statistics and chemometrics for analytical chemistry,
4th Ed. London: Pretince Hall
Nestlé (2004). Rapport Nestlé sur le café : Les multiples visages du café. Vevey :
Nestlé S.A. Affaires publiques.
Ojijo, N.K. (1993). Some common aroma notes of coffee and their chemical origins
or associated substances : a review. Kenya coffee 58 (685): 1659-1663.
Oliveros, C.E. y Roa, G. (1995). El desmucilaginado mecánico del café. Avances
técnicos Cenicafé (Colombia) 216: 1-8.
[OI] Oxfam International. (2002). Mugged: Poverty in your coffee cup. p 7
[OI] Oxfam International. (2003). Walk the talk: A call to action to restore coffee
farmer’s livelihoods. p 4.
Parrilli, M.D. (1997). El procesamiento del café en Nicaragua: ¿Hay márgenes de
mejoría? Managua: Reporte preparado para el Instituto de investigación y
desarrollo Nitlapán, UCA.
Puerta-Quintero, G.l. (1996). Escala para la evaluación de la calidad de la bebida
de café verde, Coffea arabica, procesado por vía húmeda. Cenicafé, 47 (4):
231-234.
Puerta-Quintero, G.I. (1999). Influencia del proceso de beneficio en la calidad del
café. Cenicafé 50:78-88.
Puerta-Quintero GI. (2001). Strategies to guarantee the quality of the beverage in
Columbian coffees. In: Proceedings of the 19th International Scientific
Colloquium on Coffee, 2001, Trieste, Italy. Paris: Association Scientifique
Internationale du Cafe (ASIC). CD-ROM:unpaginated.
Roa, G., Oliveros, C. E., Parra, A. y Ramírez, C.A. (2000). El secado mecánico del
café. Avances técnicos Cenicafé (Colombia) 282: 1-8.
Roa, G., Oliveros, C.E. y Ramírez, C.A. (2000). Utilice energía solar para secar
correctamente el café. Avances técnicos Cenicafé (Colombia) 281: 1-8.
Rolz, C. Menchù, J.F., Calzada, F. de León y García, R. (1982). Biotechnology in
washed coffee processing. Proc. Biochem. 17:8-10.
Sadek, P.C. (2000). Troubleshooting HPLC systems: a bench manual. New York:
John Wiley.
Sánchez- Martín, O. (2005). Definició de les característiques organoléptiques del
café. Tesi de Llicenciatura no publicada, Universitat de Barcelona.
Scholer M. (2004). Bitter or better future for coffee producers? International Trade
Forum 2:9-12.
Serrat, M., Bermúdez, R.C., González Villa, T. (2002). Production, purification and
characterization of a polygalacturonase from a new strain of Kluyveromyces
marxianus isolated from coffee wet-processing wastewater. Applied
Biochemistry and Biotechnology 97: 193- 208.
Silva, C.F., Schwan, R.F., Sousa Dias, E. & Wheals, A.E. (2000). Microbial
diversity during maturation and natural processing of coffee cherries of Coffea
arabica in Brazil. International Journal of Food Microbiology 60: 251-260.
Skoog, D.A., Holler, F. J., Nieman, T. A. (1998). Principles of instrumental analysis,
Fifth Ed. Chicago: Saunders College Publishing.
Snyder, L. R. (1997). Practical HPLC development. New York: Wiley.
Smith, R. M. & Martell, A. E. (1989). Critical stability constants, Vol. 6. New York:
Plenum Press.
Soccol, C.R. (2003). New potentialities of uses of coffee industry residues in Brazil.
In: Roussos, S., Soccol, C.R., Pandey, A. y Augur, C. (Eds.) New horizons in
Biotechnology (pp. 73-88). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.
Spadone, J.C. y Liardon, R. (1987). Identification of specific volatile components in
rio coffee beans. In: Proceedings of the 12th International Scientific colloquium
on Coffee, 1987, Montreux. Paris: Association Scientifique Internationale du
Cafe (ASIC). pp 194-202.
Spadone, J.C. y Liardon, R. (1989). Analytical study of the evolution of coffee
aroma compounds during storage. In: Proceedings of the 13th International
Scientific colloquium on Coffee, 1989, Paipa, Colombia. Paris: Association
Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 145-156.
Tchana, E. Jacquet, M., Guyot, B. y Vincent, J.C. (1985). Étude de l’influence des
conditions de fermentation sur les caractéristiques d’un café arabica. In:
Proceedings of the 11th International Scientific colloquium on Coffee, 1985,
Lomé. Paris: Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC). pp 309-
318.
Toshihiko, H. (1999). HPLC : a practical guide. Cambridge : Royal Society of
Chemistry.
Tulet, J.C., Charlery, B. Bart, F. y Pilleboue, J. (1994). Paysanneries du café des
hautes terres tropicales. Paris : Editions Karthala.
Ubeda Aguilar, E. (1997). Cosecha y beneficiado húmedo del café. Matagalpa:
Agropecuaria de inversiones del café de Nicaragua [AGROCAFÉ].
[USEPA] United States Environmental Protection Agency. (2004). Revised
assessment of detection and quantitation approaches. Doc. EPA-821-B-04-005.
Washington DC: USEPA, Office of Science and Technology, Office of Water
(4303T).
Wood, B. J.B. (1998). Microbiology of fermented foods, Vol. 1 (2nd Ed.). London :
Blakie Academic and Professional.
Willard, H. H., Merrit, L.L., Dean, J. A. & Settle, F, A. (1988). Instrumental methods
of analysis. Belmont : Wadsworth Publishing Company.
Wilbaux, R. (1956). Les caféiers au Congo Belge. Technologie du café Arabica et
Robusta, Direction de l’Agriculture, des Forêts et de l’Elevage. Bruxelles, p.12.
Wootton A.E. (1963a). The fermentation of coffee- Part I. Kenya Coffee July 1963:
239-249.
Wootton A.E. (1963b). The fermentation of coffee- Part II. Kenya Coffee August
1963: 277-287.
Wootton A. E. (1963c). The fermentation of coffee- Part III. Kenya Coffee
September 1963: 317-323.
Wootton, A.E. (1966). The importance of field processing to the quality of east
African coffees. In: Proceedings of the 2e Colloque International sur la Chimie
des cafés verts torrefiés et leurs dérivés, 1965. Paris: Institut Français du Café
et du Cacao (IFCC). pp 247-258.
Valencia, A. (1978). Eficiencia de la energía solar en el secado del café,
empleando varios espesores de grano y tiempos de remoción. Cenicafé 29(1):
18-28. 1978.
Vanos, V. (1987). Preliminary microbial ecological studies in « rio taste » coffee
beans. In: Proceedings of the 12th International Scientific colloquium on Coffee,
1987, Montreux. Paris: Association Scientifique Internationale du Cafe (ASIC).
pp 353-376.
Varangis P, Siegel P, Giovannucci D, Lewin B. (2003). Dealing with the coffee
crisis in Central America: Impacts and strategies. Washington DC: The World
Bank, Development Research Group, Rural Development. Policy Research
Working Paper 2993. p 8.
Vélez, J.C., Montoya, E.C. y Oliveros, C.E. (1999). Nuevos métodos para la
recolección manual del café. Avances Técnicos Cenicafé (Colombia) 69: 1-8.
Voituriez. (2005). Café. In : Chalmin, P (Ed.). Cyclope 2005 : Les grands marchés
mondiaux (pp. 308-315). Paris : Economica.
Zambrano, D.A. e Isaza, J.D. (1994). Lavado del café en los tanques de
fermentación. Cenicafé 45 (3): 106-118.
10 ANEXOS
10.1 MAPA DE LOCALIZACIÓN DE LA FINCA CAFETALERA LA CANAVALIA Y MAPA DE LA FINCA
Figura 34 - Localización de la finca la Canavalia,
La finca se localiza en la parte alta de la cuenca del Río Grande de Matagalpa, en el Municipio de San Ramón, Departamento de Matagalpa. La zona cafetalera más importante de Nicaragua se localiza en las partes altas de las cuencas fluviales
Figura 35- Mapa de uso del suelo en la finca La Canavalia.
La fi
nca
tiene
una
pro
ducc
ión
dive
rsifi
cada
: los
caf
etal
es b
ajo
som
bra
albe
rgan
árb
oles
frut
ales
, otra
s ac
tivid
ades
ec
onóm
icas
impl
ican
la g
anad
ería
may
or (c
on á
reas
de
past
os im
porta
ntes
) y la
gan
ader
ía m
enor
. El á
rea
tota
l de
la f
inca
es
de 1
78 m
anza
nas
(125
.42
Ha)
, y
se h
an d
estin
ado
36 m
anza
nas
(26
Ha)
par
a el
cul
tivo
de c
afé
orgá
nico
.
10.2 ORDEN DE ELUSIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS
Como se indicó en la Sección 5.1.1, el primer experimento consistió en identificar
el orden de elusión de los ácidos carboxílicos durante un análisis cromatográfico.
A continuación se presentan cromatogramas para cada una de las soluciones
estándares de ácidos carboxílicos, en las cuales había solamente un ácido
presente a una concentración de 3 mg/mL.
Al final se presenta también el cromatograma del patrón interno, se puede apreciar
que bajo condiciones de análisis similares presenta un tiempo de elusión diferente
al conjunto de ácidos carboxílicos estándares, asimismo su área con una
concentración de 0.05 mg/mL se acopla al área del resto de estándares.
Tabla 43- Lista de archivos de cromatogramas de muestras y el patrón interno que se utilizaron para determinar los órdenes de elusión.
Ácido orgánico Archivo Orden (luego de esta página)
Galacturónico Roberto 05 1
Fórmico Roberto 36 2Málico Roberto 11 3Láctico Carlos 13 4Acético Roberto 30 5Citríco Roberto 17 6Propiónico Roberto 24 7Pirazincarboxílico (Patrón Interno)
Newinternal 028
10.3 IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS EN LAS MUESTRAS
En el siguiente set de cromatogramas se presentan los resultados del análisis
cualitativo cuyo fin era determinar el carácter de los picos eluidos para las
muestras de café.
Como se mencionó en la Sección 5.1.2 para el primer análisis se utilizó una
muestra de café (6832K) con un pH bajo (3.9), a esta muestra se le agregaron
100µl de mezcla de estándares (ácidos carboxílicos) a 8 mg/mL, el cromatograma
resultante (coffee_nic253) puede apreciarse de color azul en la primera página del
set de cromatogramas. A este cromatograma se le sobrepuso el cromatograma
coffee_nic254, que consiste en la misma muestra (6832K) más 200 µl de la
mezcla de estándares. Se puede apreciar claramente un incremento en las áreas
de determinados picos, esto conlleva a una primera conclusión sobre los picos que
corresponden a los ácidos carboxílicos de interés y los que no corresponden.
Lo anterior se comprueba en el segundo cromatograma del set, en el cual a la
muestra 6832K + 200 µl de la mezcla de estándares (Coffee_nic 255) se ha
comparado con el cromatograma de esta muestra más 200 µl de patrón interno
(Coffee_nic 258), un incremento en las áreas se aprecia en los picos identificados
como A, C, D, E, G, I, K y L.
Estos mismos picos muestran un incremento en la muestra de pH 4.8 (6346E), en
el tercer cromatograma del set. En ese caso se comparó el cromatograma
Coffee_nic 261 (muestra + 200 µl de estándares de ácidos carboxílicos), con los
cromatogramas Coffee_nic 264 (muestra + 100 µl de estándares de ácidos
carboxílicos) y Coffee_nic 267 (muestra + 200 µl de patrón interno).
10.4 CROMATOGRAMAS UTILIZADOS PARA LA ELABORACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN
Los siguientes cromatogramas se utilizaron para obtener los datos de la curva de
calibración (Ver Sección 5.2.1). Cabe destacar que los análisis se realizaron por
triplicado, sin embargo a continuación se presentará solamente un cromatograma
representativo.
Tabla 44 - Lista de archivos cromatogramas utilizados para la elaboración de la curva de calibración
Mezcla de ácidos (mg/mL)
Archivo Orden en el set de cromatogramas
0.4 Coffee_nic 91 1 1.2 Coffee_nic 92 2 2.4 Coffee_nic 95 3 4 Coffee_nic 98 4 6 Coffee_nic 101 5 8 Coffee_nic 105 6
10.5 CROMATOGRAMAS CORRESPONDIENTES A LAS MUESTRAS DE MUCÍLAGO ANALIZADAS MEDIANTE HPLC
Experimento Código pH (papel) archivo5082 4.5 coffee_nic1408189 3.9 coffee_nic798410 6.3 coffee_nic883470 4.3 coffee_nic852585 4.2 coffee_nic826053 4.7 coffee_nic1492837 4.2 coffee_nic1466053 6.3 coffee_nic1521510 4 coffee_nic1435307 3.7 coffee_nic1121293 4.2 coffee_nic1185122 3.9 coffee_nic1156346 4.8 coffee_nic1343727 4.2 coffee_nic1319370 3.8 coffee_nic1287118 4.4 coffee_nic1379296 4.7 coffee_nic1596181 3.9 coffee_nic1568071 6.1 coffee_nic1685000 4 coffee_nic1719801 4.2 coffee_nic1746615 4.4 coffee_nic1802935 6.1 coffee_nic1835169 4.5 coffee_nic1862935 4.6 coffee_nic189
Beneficio coffee_nic1928507 4 coffee_nic1986319 3.8 coffee_nic1956319 6.1 coffee_nic2015583 4.3 coffee_nic2276832 3.9 coffee_nic2306174 4.7 coffee_nic2336174 6.1 coffee_nic2367060 4.2 coffee_nic2393539 3.9 coffee_nic2428548 3.8 coffee_nic245
F
K
L
G
H
J
B
C
D
E
10.6 MATRICES DE RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS DETERMINADAS MEDIANTE REFLECTOQUANT
En las siguientes matrices se presentan las mediciones realizadas para los ácidos
málico y láctico mediante Reflectoquant ®.
La configuración de las matrices es igual a la utilizada para recolectar los datos
mediante HPLC, con las filas indicando las separaciones entre experimentos y las
columnas las separaciones entre pH.
Para las mediciones de estos parámetros se utilizaron las mismas muestras que
para el análisis mediante HPLC.
Tabla 45- Matriz de concentraciones determinadas para los ácidos málico y láctico mediante reflectoquant ®
Benef.6.3 6.1 4.8 4.7 4.6 4.5
B 139.00 B 128.00
C 125.00 C 145.00D DE E 95.00F 190.00 F 86.00G 198.00 GH 80.00 166.00 H 73.00 60.00J 186.00 JK 159.00 K 74.00L 159.00 L
4.4 4.3 4.2 4 3.9 3.8 3.7B 65.00 62.00 B 84.00C 135.00 C 150.00D 102.00 D 136.00 104.50E 93.00 E 52.00F 151.00 F 73.00G 79.00 G 72.00H 83.00 HJ J 103.00 97.00K 61.00 K 75.00L 118.00 L
Benef.6.3 6.1 4.8 4.7 4.6 4.5
B 27.00 B 36.00C 17.00 C 42.00D DE E 36.00F 21.00 F 25.00G 15.00 GH 37.00 18.00 H 26.00 31.00J 18.00 JK 14.00 K 33.00L 19.00 L
4.4 4.3 4.2 4 3.9 3.8 3.7B 43.00 31.00 B 62.00C 32.00 C 93.00D 41.00 D 75.00 56.00E 47.00 E 28.00F 60.00 F 69.00G 31.00 G 108.00H 44.00 HJ J 48.00 31.00K 46.00 K 59.00L 39.00 L 57.00
Grupo 2 (pH =4.4-4.1) Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
Á. Málico Concentraciones (mg/ l)
Exp.Á. Láctico Concentraciones (mg/ l)
Inicial Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
Exp. Inicial Grupo 1 (pH =4.8-4.5)
Grupo 2 (pH =4.4-4.1) Grupo 3 (pH=4.0-3.6)
10.7 CROMATOGRAMAS DE COMPONENTES ASOCIADOS AL ÁCIDO GALACTURÓNICO
El archivo “glucoronic 04” consiste en un cromatograma con los 7 ácidos
estándares, se puede apreciar que el área del ácido galacturónico es 189.5100,
con un tiempo de retención de 2.083 min, en color azul se revelan los picos para
esta mezcla se sobreponen en color rojo los picos del archivo glucoronic03. A esta
mezcla de 7 ácidos se agregó ácido glucorónico (glucoronic03) y el área en donde
se había registrado el á. galacturónico aumentó hasta 892.8160. El tiempo de
retención fue de 1.966 casi sobrepuesto con el tiempo de retención anteriormente
registrado para á. galacturónico.
En el cromatograma “tarta02” presenta los tiempos de retención y las áreas
medidas para una mezcla de 7 ácidos. En este caso el ácido galacturónico
presenta un tiempo de retención de 2.300 minutos y un área de 809.6140 min.
En el archivo “tarta01” se presenta un cromatograma en el cual a la anterior
mezcla de ácidos se ha agregado á. tartárico, como se puede ver el resultado es
la aparición de un pico con área 14323 .9145 y con tiempo de retención de 2.316
min. Con un tiempo de retención similar al del á. galacturónico.
10.8 CROMATOGRAMAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPONENTE ASOCIADO AL ÁCIDO LÁCTICO
En los siguientes cromatogramas se presentan los resultados del análisis
realizado al ácido ascórbico, en el primero de ellos (mezcladeacidos08) se
presenta el análisis de una mezcla de ácidos estándares con los siguientes
órdenes de elusión: galacturónico, fórmico, málico, láctico, acético, cítrico y
propiónico. Se puede apreciar que para el componente ácido láctico (tiempo de
retención 3.683 min) el área en este cromatograma es de 982.05, en el segundo
cromatograma, (mezcladeacidos07) en el que a la misma concentración de ácidos
en mezcla se ha añadido ácido ascórbico, se aprecia que para el mismo tiempo de
retención de ácido láctico el área ha aumentado a 1764.61.
El tercer cromatograma (mezcladeacidos09) en el que se ha analizado el á.
ascórbico en solitario, demuestra que el tiempo de retención de dicho ácido es
muy similar al del á. láctico y por ende en el previo cromatograma el aumento en el
área se debía a la inclusión de á. ascórbico.