Validación y verificación de métodos  de examen cuantitativos

Ignacio Reyes Ramírez

entidad mexicana de acreditación, a.c.

Temas selectos de Calidad en Serología

(aplicación en el banco de sangre)

Introducción

• Se describirán los puntos a considerar para la  validación y verificación de los 

procedimientos de examen cuantitativos,  para el cumplimiento y evaluación del punto 

5.5.2

de la norma NMX‐EC‐15189‐2008. 

• Conforme a las directrices establecidas en la  “Guía para la validación y la verificación de los 

procedimientos de examen cuantitativos  empleados por el laboratorio clínico”.

Alcance de la Guía

• La deben aplicar los laboratorios clínicos que  se encuentran en alguna etapa del proceso de  acreditación ante la entidad mexicana de 

acreditación, a.c.

a todos los procedimientos  de examen cuantitativos del alcance de la 

acreditación

Descripción

• Ya que existen diversos tipo de métodos  analíticos

disponibles en el mercado.

• Es importante que el laboratorio evalúe

los  diferentes métodos y seleccione aquel que  mejor se adecue a las necesidades y recursos.

Validación

• Se define como:• La Confirmación mediante el suministro de 

evidencia objetiva de que se han cumplido  los requisitos del método para una 

utilización o aplicación especifica prevista. (NMX‐CH‐152‐IMNC‐2005)

• Los datos de la  validación del método 

los informa el  fabricante en sus 

instructivos y estos  pueden comprender 

por su aplicación:

• Linealidad.• Precisión.• Veracidad.• Limite de detección.• Selectividad.• Sensibilidad analítica.• Intervalo de trabajo.• Especificidad analítica.• Incertidumbre.

• Si se utilizan métodos  desarrollados por el 

laboratorio o alguno  fue modificado, se 

debe realizar la  validación completa y 

presentar las  evidencias 

correspondientes.

• Linealidad.• Precisión.• Veracidad.• Limite de detección.• Selectividad.• Sensibilidad analítica.• Intervalo de trabajo.• Especificidad analítica.• Incertidumbre.

• La validación

comprueba la aptitud de los  procedimientos de examen

y refleja las 

condiciones reales de la aplicación de los  mismos.

Verificación

• La confirmación mediante la aportación de  evidencia objetiva de que se han cumplido los 

requisitos especificados para un método. (NMX‐CC‐9000‐IMNC‐2005)

• La verificación consiste en evaluar el  desempeño del método

para demostrar que 

cumple con los requisitos para el uso previsto,  que fueron especificados como resultado de 

su validación. (NMX‐CH‐152‐IMNC‐2005)

VE= Valor Esperado del Reactivo.VO= Valor Observado del Reactivo.

Parámetros de desempeño

• El laboratorio debe  realizar la verificación 

de los métodos y  evidenciar si cumplen 

con las características  de desempeño en las 

condiciones del  laboratorio.

• Linealidad.• Precisión.• Veracidad.• Incertidumbre.

Evaluación de los Parámetros

• Linealidad • Evaluar el intervalo  analítico del método 

en el laboratorio.

• El comportamiento  lineal.

• La verificación debe  tomar en cuenta los  puntos de decisión 

clínica.

• Precisión.• Valor de la magnitud.

• Estimación del valor  del mensurando.

• Error de medida  (aleatorio y 

sistemático).

• Veracidad.• Concordancia entre la 

media aritmética y el  valor verdadero o 

aceptado como  referencia.

• Error sistemático  (sesgo).

• Error sistemático.

Media que resulta de un  número infinito de mediciones del mismo 

mensurando, efectuado bajo condiciones de  repetibilidad, menos un valor verdadero del  mensurando.

(NMX‐Z‐055‐IMNC)

• Exactitud de medición.

proximidad de la  concordancia entre el resultado de una 

medición

y un valor verdadero del  mensurando. (NMX‐CH‐152‐IMNC‐2005)

• Ejemplo de Exactitud de medición.

EXACTITUD

ERROR DE MEDIDA

PRECISIÓN VERACIDAD

ERROR ALEATORIO ERROR SISTEMATICO

Relación entre los distintos tipos de error y los correspondientesconceptos cualitativos

• Incertidumbre. • Intervalo dentro del cual se espera 

que se encuentre la cantidad 

medida, teniendo en cuenta todas 

las fuentes de error.

• Incertidumbre estándar (u).

1 DS

• Incertidumbre expandida (U). 

U= u

x k

Incertidumbre Combinada (Uc).

Error cuadrático medio (ECM).

• Incertidumbre de medición.

Parámetro  asociado al resultado de una medición que 

caracteriza la dispersión de los valores que  podrían razonablemente, ser atribuidos al 

mensurando. (NMX‐CH‐152‐IMNC‐2005)

• Incertidumbre de medición.

media

VRS

VRI

OO

O

O

O O O

O O O OO

O

Aplicación de la verificación

• ObjetivoVerificar el desempeño del método analítico 

para la cuantificación de Ac. úrico

en un  equipo automatizado conforme a lo 

establecido en la Guía de Validación de  métodos cuantitativos.

Características del reactivo

Intervalo Biológico de Referencia:2,0 a 7,0 mg/dL

(hombre).

2,0 a 5,0 mg/dL

(mujeres).Reproducibilidad:Nivel: 3,7 mg/dL, DS: ± 0,23 mg/dL, CV%: 0,61Nivel: 6,2 mg/dL, DS: ± 0,37 mg/dL, CV%: 0,60Nivel: 10,0 mg/dL,  DS: ± 1,60 mg/dL, CV%: 1,60Recuperación:Entre 97 a 101 % para un nivel de Uricemia

de 10 

mg/dL.

Límite de detección:

En espectrofotómetro el estándar de 10,0 mg/dL proporciona una lectura aproximada de 0,290 

D.O.

Lo que significa que el cambio mínimo de  concentración detectable en esas condiciones 

para 0,001 D.O. será

aproximadamente de 0,03  mg/dL.

Linealidad:

La reacción es lineal hasta 20 mg/dL

Linealidad

VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL AC. URICO

No. Dilución %

Concentración minima y maxima (mg/dL)

Valor obtenido

mg/dL

Valor Teorico (X)

mg/ dL Sesgo % Error

1 0 20 17.83 20 2.17 0.11

2 25 8.66 10 1.34 0.13

3 50 4.57 5 0.43 0.09

4 75 2.28 2.5 0.22 0.09

5 100 1.25 1.21 1.25 0.04 0.03

Promedio 0.08

Grafico de Linealidad

1.21 2.284.57

8.66

17.83

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

0 20 40 60 80 100 120

Dilución

[ ] m

g/ d

L A

c. U

rico

Ensayo de Linealidad

Datos de la 

Correlación Lineal Regresion LinealValor obtenido

mg/dL

Constante [A] 0.060

coeficiente de regresion [b] 0.884

coeficiente de correlación [r] 0.999

coeficiente critico de correlacion [r2] 0.999

Ecuación de la recta y = (0.884)x + (0.60)

r2 = 0.999

Grafico de Linealidad

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

0 5 10 15 20 25

Valor asignado [ ] mg/dL Ac. Urico

Valo

r ob

teni

do [

] m

g/dL

Ac

. Uri

co

Ensayo de Linealidad

y = (0.884)x + (0.60)r2 = 0.999

Criterios de aceptabilidad

• Calcular la pendiente (1) y la ordenada al  origen (0).

• Comparar el sesgo o el porcentaje de  error para cada dilución y comparar con 

el fabricante.

• Tomar la decisión de aceptar o rechazar.

Decisión

• El método analítico en las condiciones del  optimas del laboratorio presenta un rango  lineal confiable de 1,12 a 17,83 mg/dL.

• El coeficiente de correlación lineal ( r2) de  0,999

lo que indica que el intervalo 

evaluado, la función de calibración es  lineal.

VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL AC. URICO

No.Dilución

% Valor 1 Valor 2 Valor 3 Media DS1 0 17.50 18.00 18.00 17.83 0.242 25 8.50 9.00 8.50 8.66 0.243 50 4.50 4.70 4.50 4.57 0.094 75 2.30 2.25 2.30 2.28 0.025 100 1.25 1.20 1.17 1.21 0.03

Promedi o 0.08

• Al comparar la desviación estándar de cada  dilución se observa un promedio de 0,08.

• El % Error no supera el 0,08 %.• Por lo que el rango evaluado para el método 

es lineal según lo establecido por el  fabricante, ya que a concentraciones bajas 

permite una desviación de ± 0,23 mg/dL y  altas a ± 1,60 mg /dL.

Precisión

• Suero Control de Ac.  Úrico de 5,25 y 9,01 

mg/dL.• 20 datos corrida 

intradía.• Se calcula:

mediadesviación estándar% del coeficiente de 

variación

No. de Lectura

Ac. Urico (mg/dL) Normal

Ac. Urico (mg/dL) Patologico

Valor Asignado 5.25 0.91

x 5.1587756 8.98855357

DS 0.082078268 0.11357817

CV% 1.591041645 1.26358669

%Error relativo 1.737607617 0.23802924

%Recobro 98.26239238 99.7619708

• De acuerdo con CLIA para imprecisión  intraserial o intradía, la DS obtenida debe ser 

igual o menor a ¼ del Error Total permitido.• Para Ac. Úrico el error total permitido ± 5%.• DS Intradía ≤

0,25 ET, ≤

1,25 % 

• SustituyendoSuero Normal:        0,082 ≤

1,25%

Suero Patológico:  0,113 ≤

1,25 %

Veracidad

• La veracidad del método se puede estimar por medio del 

error relativo.

% de Error relativo = [ Valor real – Valor de la medición

] x 100

Valor real• Criterio:

El valor del error relativo sea menor o igual al reportado.

Resultados:Suero Normal:         1,73 %Suero Patológico:    0,23 %

La veracidad del método se puede estimar por medio del calculo del porcentaje de recuperación.

% Recuperación = [___Valor obtenido___] x 100Valor de referencia

Criterio:El % de recuperación sean menor o igual al

reportado por el fabricante.

Resultados:Intervalo del fabricante de 97 al 101 %

Suero Normal: 98,26 %Suero Patológico: 99,76 %

Incertidumbre

• Método enzimático para la cuantificación de  ácido úrico espectrofotométrico con uricasa.  Empleando un calibrador con un valor de 10 ± 0.005 mg/dL con un factor de cobertura k = 2  para un nivel de confianza del 95%.

Componentes de la incertidumbre

• Variabilidad premetrológica.

• Incertidumbre del valor del calibrador.

• Magnitudes influyentes endógenas.

• Imprecisión interdiaria.

Variabilidad premetrológica

• El conjunto de actividades realizadas desde la  toma de la muestra hasta que la muestra de 

suero esta lista para la medición provoca un  coeficiente de variación premetrológica de 

0,8 %. Esta variabilidad aplicada al resultado  obtenido (5,25 mg/dL) corresponde a una 

incertidumbre estandar de 0,04 mg/dL. 

Incertidumbre del valor del calibrador

• El valor del calibrador es de 10 mg/dL y la  incertidumbre expandida es de 0,005 mg/dL. 

Por lo tanto, la incertidumbre estándar  relativa del valor asignado al calibrador es 

0.05 %, que aplicado al resultado obtenido  (5,25 mg/dL) corresponde a una 

incertidumbre estándar de 0,002 mg/dL.

Magnitudes influyentes endógenas

• Según el fabricante de los reactivos el criterio  para aceptar que una concentración de 

bilirrubinas, ácido ascórbico o bromuro de  hioscina en el plasma produzca una interferencia 

significativa es que no altere el valor del  mensurando en ± 10 %.

• Los posibles cambios del valor verdadero del  mensurando estarán en el intervalo [0%; 10%] ó

[‐10%; 0%], aunque es más probable que esté más cerca de 0% que del 10 % ó del ‐0%.

Considerando una distribución triangular  rectangular: u = [(b‐a)2/18]0,5

donde a y b son, respectivamente, los limites  inferior y superior del intervalo; en este caso:

u = [ (10‐0)2/18] 0,5

= 2,4 %

que aplicado al resultado de 5,25 mg/dL,  corresponde a 0,126 mg/dL; y como esto es 

aplicable a tres magnitudes influyentes:

Uc

= [ 3 X (0,126 mg/dL)2

]0,5 = 0,027 mg/dL

Imprecisión interdiaria

• Este procedimiento de medida tiene un  comportamiento heterocedástico con un 

coeficiente de variación metrológico,  aproximadamente constante a lo largo del 

intervalo de medida, igual al 1,6 %. Esta  imprecisión interdiaria aplicada al resultado 

5,25 mg/dL y  expresada como incertidumbre  estándar, corresponde a 0,08 mg/dL.

Estimación de la incertidumbre

• uc

= (0,042

+ 0,0022 + 0,0272

+ 0,082)0,5 =  0,047 mg/dL

• U = uc

x k = 0,047 mg/dL x 2 = 0,094 mg/dL

• Resultado:5,25 ±

0,094 mg/dL

Intervalo:

5,15  a 5,34   mg/dL

Datos de la verificación

Verificación del Método enzimático de  uricasa para la determinación de ácido úrico.

• Linealidad:El método es lineal de 1,2 a 17.8 mg/dL

• Precisión:Suero Normal: DS = 0,08; CV = 1,59 %

Suero Patológico: DS = 0,11; CV = 1,26 % 

• Veracidad:Error Relativo

Suero Normal: 1,73 %

Suero Patológico: 0,230  %

Recuperación

Suero Normal: 98,26 %

Suero Patológico: 99,76  %

• Incertidumbre:

U = 0,094 mg/dL

Resultado de la  muestra:

5,25 ±

0,094 mg/dL

Intervalo:

5,15 a 5,34 mg/dL

Criterios de evaluación de la  norma NMX‐EC‐15189‐IMNC‐ 2008 / ISO 15189:2007

MP-FE009-00Entrada en vigor 2009-05-08

Requisitos técnicos

Requisitos técnicos

Requisitos técnicos

Requisitos técnicos

MUCHAS GRACIAS