sistema inmune, estrés y digestión del camarón blanco
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA
EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
Supervivencia, crecimiento y expresión de genes del
sistema inmune, estrés y digestión del camarón
blanco (Litopenaeus vannamei) infectado con Vibrio
parahaemolyticus y tratado con ajo y Bacillus
licheniformis BCR 4-3
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
Patricia López León
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO; DICIEMBRE DE 2015.
I
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Acuacultura del Centro Interdisciplinario
de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto
Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección del Dr. Antonio Luna González y el M. en C. Jesús
Arturo Fierro Coronado. El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del Proyecto
SIP multidisciplinario (Con número de registro 20140605). La alumna Patricia López León fue
apoyada con una beca CONACYT con clave de registro de CVU 560940.
La autora agradece el apoyo brindado por el Instituto Politécnico Nacional como becaria de la
Beca de Estimulo Institucional de Formación de Investigadores (BEIFI) y el apoyo brindado a
través de la beca de tesis de maestría del Programa de Beca Institucional de Posgrado.
DEDICATORIA
A mis padres, Atanasio y Angélica, por enseñarme a fijar mis metas, alcanzarlas y no
olvidar que tengo el deber de ser feliz, porque solamente así, podré dar felicidad a
quien me rodee. Por ser las personas que me han acompañado en todo momento
brindándome un bello mensaje: que la verdadera riqueza la llevo en mi mente, corazón
y en la perfecta maquinaria de mi cuerpo sano. Porque gracias a ellos soy la persona
que hoy escribe estas palabras. ¿Qué sería yo sin ustedes? ¡LOS QUIERO MUCHO!
A mis hermanos, Cruz Angélica, Pedro y Carlos, por su ejemplo de superación
constante y brindarme momentos de felicidad desde pequeños porque al ser la menor
de la familia siempre han sabido cuidarme y han procurado ser mi ejemplo a seguir. Y a
mi cuñado y compadre Leo quien también se ha convertido en un hermano para mí.
¡Muchas gracias por todo! ¡Los quiero!
A mis sobrinos, Lya y Nachito, son el regalo más grande que mis hermanos me han
dado hasta el momento, mis días de bioensayos no hubieran sido igual sin haber quién
preguntara ¿Cómo estaban mis camarones? ¡Los adoro!
A un ángel que me acompaña desde el cielo, a ti Mamá Chayito. Porque después de
que te fuiste me has acompañado a lo largo de este camino. ¡Te extraño! y siempre te
recordaré.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por acompañarme a lo largo de mi vida y ser la fortaleza en los momentos de
debilidad y darme una vida llena de aprendizajes y cosas nuevas por experimentar.
A mis padres nuevamente, por ser mi razón de vivir, apoyarme en todo momento y por
todos los valores que me han inculcado.
Un reconocimiento y especial agradecimiento a usted Dr. Antonio Luna González por
brindarme su apoyo, confianza y conocimiento para la realización de mi tesis de
maestría, ya que gracias a usted he aprendido que la investigación es todo un arte.
¡Muchas gracias!
A mi comité tutorial: M. en C. Jesús Arturo Fierro Coronado, Dr. Píndaro Álvarez Ruíz,
Dr. Héctor González Ocampo y Dra. Norma Elena Leyva López; por sus conocimientos
y acertados consejos que me brindaron durante los tutoriales.
De nuevo al Dr. Píndaro y Arturo Fierro quienes me ayudaron en las clases y en las
técnicas de laboratorio. Recordar que las preguntas de Arturo siempre me ponían a
pensar el por qué y para qué de las cosas. Al igual que Píndaro hizo despertar mi gusto
por las reacciones de PCR en tiempo real y que hacer 6 o 7 placas por día fuese algo
muy entretenido.
No podían faltar en primera lista mis grandes amigas “las bells” Marisol y Gaby, porque
desde hace siete años emprendimos un camino juntas, ¿Qué haría sin ustedes? ¿Qué
harían ustedes sin mí? (Quizá lo mismo) pero no creo que la vida fuera igual de
interesante, feliz y emocionante si no estuviéramos las tres juntas, ¡Las amo! Cada una
me ha brindado su apoyo incondicional. Tú, ¡mami! junto a tu compañero de vida Yeyo
y tu hermoso hijo tetus han ocupado un gran lugar en mi corazón. Y a ti Botri, ¿Qué
puedo decir? junto a tu familia y por supuesto mi gran amigo Ernesto se han encargado
de recordarme siempre que existen personas que aunque no lleven tu sangre ni tus
mismos genes pueden formar parte de tu familia y tú de la suya. ¡Mil gracias hoy y
siempre!
A usted mi amiga, compañera y maestra Dra. Ruth Escamilla, por esas largas horas de
campana que se convirtieron en rutina y despertaron en mí el gusto por la
microbiología, de ir y venir al espectro (al menos logramos un poco de condición)
muchas gracias por todo su apoyo, creo que mejor equipo no pudimos haber formado.
A mi amiga Viridiana Peraza, quien siempre me brindó su amistad y apoyo
incondicional, porque al principio de ser tu ayudante pasaste a ser mi mandadera
decías y la verdad que me he dado cuenta que para mandar soy muy buena. Porque
tampoco, al igual que tú, nunca olvidaré esos 15 min de campana. ¡Te quiero y te
admiro mucho Viri!
A los integrantes de mi laboratorio en Acuacultura: Maestra Carina, Vladimir, Arturo
Rubio (Toro), Genaro, quienes al momento están presentes; y también a quienes
estuvieron de paso y formaron parte de mi camino por CIIDIR: Sarahí. Blanca, Carmen,
Teo y Tomás, muchas gracias por su apoyo.
A mis compañeros de maestría: Cinthya, Socko, Fernando y Pepe Tejeda, quienes
formando parte de Acua compartimos clases y pláticas de pasillo que hicieron más
amena mi estancia de maestría.
A mis tíos y tías, quienes de alguna manera han contribuido al sentirse orgullosos de
que su sobrina obtenga un grado más para seguirse superando. A ti tía Marisa, eres
para mí un gran ejemplo de perseverancia y ganas de vivir, siempre te admiraré, ¡Te
quiero mucho tía! Tía Rosarito: porque eres mi segunda madre, ¡te adoro! Tía Almita:
porque los días de cobrar la beca no hubieran sido igual sin ti.
A ti, Christhian, mi amigo incondicional, consejero y al principio enojado porque durante
la maestría me convertí en Cidiriana, muchas gracias por estar siempre a mi lado y
mostrarme que las cosas siempre se pueden lograr si te lo propones, ¡te quiero!
A mis compañeros de generación, personal docente y administrativo que formaron parte
de mi formación. Gracias por compartir su valioso tiempo y conocimientos.
Finalmente a todas las personas que de alguna manera contribuyeron directa o
indirectamente para la realización de este trabajo.
¡MUCHAS GRACIAS!
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL ...................................................................................................................................... I
ABREVIATURAS ...................................................................................................................................... IV
GLOSARIO ................................................................................................................................................. VI
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................... IX
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................. X
RESUMEN .................................................................................................................................................. XI
ABSTRACT ............................................................................................................................................... XII
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 1
1.1. Enfermedades del camarón .......................................................................................................... 1
1.2. Sistema inmune del camarón ........................................................................................................ 3
1.3. Enzimas de digestión ..................................................................................................................... 4
1.4. Estrés en camarón ......................................................................................................................... 4
1.5. Proteínas de choque térmico ........................................................................................................ 5
1.6. Alternativas para tratar enfermedades en el camarón ................................................................. 5
2. ANTECEDENTES ..................................................................................................................................... 7
3. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................................... 10
4. HIPÓTESIS ............................................................................................................................................ 11
5. OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................. 11
5.1. OBJETIVOS PARTICULARES .......................................................................................................... 11
6. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................... 12
6.1. Aislamiento de colonias presuntivas de V. parahaemolyticus .................................................... 12
6.2. Extracción de ADN bacteriano .......................................................................................................... 12
6.3. Preselección de los aislados de Vibrio e identificación molecular de los aislados ...................... 13
6.3.1. Detección con primers AP3 ................................................................................................. 13
6.3.2. Detección con primers 89 F/R ............................................................................................. 13
6.3.3. Identificación con hemolisinas totales (primers tlF/R, tdhF/R y trhF/R) ............................. 14
6.4. Caracterización de los aislados .................................................................................................... 14
6.4.1. Actividad hemolítica en agar sangre ................................................................................... 14
6.4.2. Prueba de formación de biopelículas .................................................................................. 15
6.4.3. Adhesión microbiana a solventes (xileno) ........................................................................... 15
6.4.4. Autoagregación ................................................................................................................... 16
II
6.4.5. Cinética de crecimiento y conteo de aislados presuntivos de Vibrio sp. ............................ 16
6.4.6. Determinación de actividad enzimática extracelular .......................................................... 17
6.5. Preparación de la dieta ............................................................................................................... 18
6.5.1. Preparación de alimento con ajo y B. licheniformis BCR 4-3 ............................................... 18
6.6. Bioensayos para determinar la concentración letal media de Vibrio sp. en postlarvas de L.
vanamei ................................................................................................................................................... 18
6.6.1. Determinación de la CL50 ..................................................................................................... 19
6.7. Bioensayos para determinar el efecto del ajo y B. licheniformis BCR 4-3, adicionados en el
alimento, en la supervivencia, crecimiento, sistema inmune, digestión y estrés en el camarón blanco
retado con V. parahaemolyticus ............................................................................................................. 19
6.7.1. Bioensayo 1 ......................................................................................................................... 19
6.7.2. Bioensayo 2 ......................................................................................................................... 20
6.7.3. Obtención de la hemolinfa .................................................................................................. 21
6.7.4. Extracción de ARN y RT-PCR ................................................................................................ 21
6.7.5. Expresión relativa de genes mediante qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real)................. 22
6.8. Análisis estadístico ...................................................................................................................... 26
7. RESULTADOS........................................................................................................................................ 26
7.1. Aislamiento de cepas presuntivas de V. parahaemolyticus ........................................................ 26
7.2. Pre-selección de cepas con primers AP3 y 89F/R........................................................................ 26
7.3. Identificación molecular con primers para hemolisinas ............................................................. 29
7.4. Actividad hemolítica de los aislados ............................................................................................ 30
7.5. Formación de biopelículas ........................................................................................................... 30
7.6. Adhesión microbiana a solventes (xileno)................................................................................... 30
7.7. Capacidad de autoagregación ..................................................................................................... 30
7.8. Actividad enzimática extracelular ............................................................................................... 30
7.9. Cinética de crecimiento ............................................................................................................... 30
7.10. Conteo bacteriano ................................................................................................................... 33
7.11. Bioensayos de desafío por inmersión ..................................................................................... 33
7.12. Determinación de la CL50 ......................................................................................................... 33
7.13. Efecto del ajo y Bacillus licheniformis BCR 4-3, adicionados en el alimento, en la
supervivencia, crecimiento y sistema inmune del camarón blanco retado con V. parahaemolyticus ... 36
7.13.1. Bioensayo 1: Supervivencia y crecimiento .......................................................................... 36
7.13.2. Expresión de genes del sistema inmune ............................................................................. 38
III
7.13.3. Expresión de genes de estrés .............................................................................................. 43
7.13.4. Expresión de genes digestivos ............................................................................................. 44
7.13.5. Bioensayo 2 ......................................................................................................................... 45
8. Discusión ............................................................................................................................................. 46
9. Conclusiones ........................................................................................................................................ 55
10. Referencias bibliográficas ................................................................................................................ 56
IV
ABREVIATURAS
α Alfa
β Beta
ϒ Gamma
AC Alimento comercial
AHPND Acute hepatopancreatic necrosis disease (Necrosis
hepatopancreática aguda)
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario
AEE Actividad enzimática extracelular
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
ARNi Ácido ribonucleico de interferencia
CL50 Concentración letal media
°C Grado Celcius
DL50 Dosis letal media
DO Densidad óptica
dNTPs Desoxirribonucleótido trifosfato
EMS Early mortality syndrome (Síndrome de mortalidad
temprana)
g Gramo
g/kg Gramo por kilogramo
h Hora
IPNGS16 Instituto Politécnico Nacional Guasave Sinaloa cepa
#16 (Vibrio parahaemolyticus)
kb Kilobase
kDa Kilodalton
kg Kilogramo
M Molaridad
mg Miligramo
V
min Minuto
mm Milímetro
µm Micrómetro
µM Micromolar
mL Mililitro
mg/L Miligramo por litro
ng Nanogramo
nm Nanómetro
µg/mL Microgramo por microlitro
µL Microlitro
ND No determinado
pb Pares de bases
PCR
Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de
polimerasa)
% Porcentaje
RT Retrotranscripción
SMT Síndrome de la mortalidad temprana
s Segundo
sp. Especie
TCE Tasa de crecimiento específico
Tl Hemolisina termolábil
Tdh Hemolisina termoestable directa
Trh Hemolisina termoestable relacionada
UFC Unidades formadoras de colonias
UFC/g Unidades formadoras de colonias por gramo
vol Volúmen
x g Fuerza centrífuga
VI
GLOSARIO
Acuacultura: Conjunto de técnicas y actividades cuyo objetivo es la cría en cautiverio
de organismos acuáticos (peces, moluscos, crustáceos, reptiles o algas), cuyo mayor o
menor carácter intensivo depende del grado de intervención del hombre en los ciclos
biológicos de los organismos en cuestión.
Alimento: Cualquier sustancia sólida o líquida que ingieren los seres vivos con el
objetivo de regular su metabolismo y mantener sus funciones fisiológicas vitales.
Bacteria: Organismo unicelular procariota, que se presenta en varias formas (esférica,
bastón o espiral). Algunas bacterias provocan enfermedades, pero muchas son
benéficas.
Camaronicultura: Es el cultivo de las diferentes especies de camarones que se lleva a
cabo en áreas costeras.
Ciclo umbral (Ct): Ciclo en el que la fluorescencia de la muestra supera el umbral. Se
calcula en escala logarítmica y es empleado para la cuantificación relativa de la
expresión génica.
Enfermedad: Alteración fisiológica de un organismo que causa un desequilibrio en sus
funciones vitales. Una enfermedad puede ser causada por (1) defectos genéticos
reflejados en una anormal estructura y función celular, (2) desbalance nutricional que
priva a las células de nutrientes esenciales, (3) agentes químicos o físicos que lesionan
las células o (4) agentes infecciosos que dañan las células por su acción fisiológica o
presencia física.
Gen: En biología molecular, segmento de ADN o ARN que normalmente contiene una
región promotora, una región que se transcribe y una región con una señal de
terminación de lectura.
Hemocito: Célula de la hemolinfa de los invertebrados.
Hemolinfa: Líquido circulatorio de los artrópodos, moluscos, etc. Análogo a la sangre
de vertebrados.
Mortalidad: Se define como un número que busca establecer la cantidad de muertes
sobre una población determinada.
Patógeno: Todo aquello que origina o puede causar un proceso de enfermedad.
Cualquier organismo que puede causar enfermedades o iniciar un proceso patológico.
VII
PCR (Siglas del inglés Polymerase Chain Reaction, Reacción en Cadena de la
Polimerasa): Metodología utilizada para producir múltiples copias de un fragmento de
ADN específico que utiliza ciclos de desnaturalización del ADN molde, anillamiento con
oligonucleótidos específicos y extensión de los mismos por medio de una ADN
polimerasa termotolerante.
PCR Múltiple: Se utiliza para amplificar simultáneamente en un único tubo distintas
secuencias específicas o secuencias blanco o dianas, lo cual necesariamente implica
que los reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para
permitir la detección de cada diana y no inhibir la de las demás
Planta medicinal: Aquella planta cuyas partes o extractos contienen principios
químicos que son utilizados como medicamentos para el tratamiento de alguna afección
o enfermedad que padece un individuo o animal.
Prevención: La adopción de medidas encaminadas a impedir que se produzcan
deficiencias físicas y sensoriales (prevención primaria) o a impedir que las deficiencias,
cuando se han producido, tengan consecuencias físicas.
Primer: Cadena pequeña de polinucleótidos que sirve de iniciadora en la síntesis
química de una molécula de ácidos nucleicos (iniciador o cebador).
Probiótico: Se considera alimento probiótico aquel que contiene microorganismos
vivos que permanecen activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos.
Se define como un suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de
microorganismos seleccionados que son adicionados con el propósito de manipular las
poblaciones bacterianas presentes en los sistemas de producción.
Profilaxis: Aquello que se lleva a cabo o se utiliza para prevenir la aparición de
una enfermedad o el surgimiento de una infección.
Salud: Estado de equilibrio dinámico entre el organismo y su medio ambiente, que
mantiene la integridad estructural y funcional del organismo dentro de los límites
normales para esa forma particular de vida y la fase particular de su ciclo vital.
Síndrome: Combinación de síntomas que dan como resultado un solo efecto que
constituye una entidad clínica diferente.
VIII
Supervivencia: Se refiere a la capacidad de sobrevivir que posee cada ser vivo. Tiene
que ver con el ansia que todos poseemos para seguir viviendo y esquivar todas
aquellas situaciones o circunstancias que puedan afectar nuestra vida.
IX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Gel con primers AP3…………………………………………..…………………………….27
Figura 2. Gel con primers 89 F/R ……………………………………….……….……………………28
Figura 3. PCR múltiple ...…………………………………………………………………...……….…29
Figura 4. Supervivencia de L. vannamei (Bioensayo 1) ………………...…...………………36
Figura 5. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei (Bioensayo 1)……………….………..37
Figura 6. Expresión relativa del gen LvToll en L. vannamei.................…………………………...38
Figura 7. Expresión relativa del gen proFo en L. vannamei ...…...............……………………….39
Figura 8. Expresión relativa del gen SOD en L. vannamei …………………………………….…..40
Figura 9. Expresión relativa del gen TGasa en L. vannamei ………………………………………41
Figura 10. Expresión relativa del gen LIS en L. vannamei ………..……………………………….42
Figura 11. Expresión relativa del gen Hsp70 en L. vannamei ……….…………………………….43
Figura 12. Expresión relativa del gen Tripsina en L. vannamei …….……...……………………..44
Figura 13. Supervivencia de L. vannamei (Bioensayo 2) ...……………….………………….……45
X
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes del sistema inmune, digestión y estrés de L. vannamei de los cuales se
cuantificó su expresión.………………………………………………………………………..…… 23
Tabla 2. Caracterización de aislados presuntivos de V. parahaemolyticus obtenidos del
hepatopáncreas de camarón blanco (L.
vannamei)…………………...……………………………………………..……………….… 31
Tabla 3. Infecciones experimentales de L. vannamei retado con cepas de V.
parahaemolyticus para determinar la concentración letal
media………………………………………………….….………………………………………....34
XI
RESUMEN
En el cultivo de camarón blanco en el noroeste de México se han presentado
mortalidades masivas provocadas por Vibrio parahaemolyticus causante del
síndrome de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) o síndrome de la
mortalidad temprana (EMS por sus siglas en inglés). El uso de antibióticos genera
resistencia en las bacterias por lo que se propuso el uso de plantas medicinales
(ajo) y probióticos (Bacillus licheniformis BCR 4-3) para prevenir el AHPND. Se
aislaron y caracterizaron cepas causantes del EMS del hepatopáncreas de L.
vannamei. Para la caracterización molecular se utilizaron los primers AP3F/R,
89F/R, tlF/R, tdhF/R y trhF/R. La caracterización bioquímica se hizo en 35 aislados
positivos, ésta incluyó la formación de biopelículas, hidrofobicidad, autoagregación,
producción de enzimas, cinética de crecimiento y conteo de unidades formadoras de
colonias. Se determinó la concentración letal media de V. parahaemolyticus en
cultivos de postlarvas y juveniles de L. vanamei y el efecto protector (supervivencia)
del ajo y bacilos, así como su efecto en el crecimiento. Se evaluó la expresión de
genes relacionados con el sistema inmune, estrés y digestión mediante PCR en
tiempo real. Se obtuvieron un total de 129 aislados, de los cuales 35 resultaron ser
V. parahaemolyticus. Los resultados indicaron que las cepas 1, 8 y 33 pertenecen a
V. parahaemolyticus que no causa EMS. Las 35 cepas resultaron con hemólisis alfa.
Ocho cepas fueron fuertemente hidrofóbicas, 22 moderadamente hidrofóbicas y 5
fueron hidrofílicas. Las 35 cepas tienen capacidad de formar biopelículas (moderada
a fuerte) y su autoagregación fue alta. Once de las 19 cepas probadas son
patógenas. Sin embargo, la cepa 16 es la más virulenta. Además, se observó que la
susceptibilidad de los organismos es inversamente proporcional a la talla. En los
experimentos de reto, el mejor tratamiento fue 6 g de ajo/kg de alimento y (1 x 106
UFC B. licheniformis BCR 4-3/g de alimento. No se presentaron diferencias
significativas en el crecimiento (bioensayo 1). Los aditivos en el alimento, modulan la
expresión de los genes relacionados con el sistema inmune (LvToll, proFO, SOD,
Tgasa y lisozima) y digestión (tripsina). Sin embargo, la expresión del gen hsp70 fue
modulada sólo por la densidad de camarones en los sistemas de cultivo.
XII
ABSTRACT
White shrimp farming in northwestern Mexico has suffered mass mortalities due
to Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of the acute hepatopancreatic
necrosis syndrome disease (AHPND). The use of antibiotics generate resistance in
bacteria, therefore, the use of medicinal plants (garlic) and probiotics (Bacillus
licheniformis BCR 4-3) was proposed to prevent AHPND. AHPND causing strains
were isolated from shrimp hepatopancreas and characterized. For molecular
characterization primers AP3, 89F/R, tlF/R, tdhF/R, and trhF/R were used. The
biochemical characterization was done only in 35 isolates that were positive by
molecular characterization. Biochemical characterization included biofilm formation,
hydrophobicity, autoaggregation, enzyme production, growth kinetics, and counting
of colony forming units. Average lethal concentration of V. parahaemolyticus in
cultured postlarvae and juveniles of L. vannamei was determined and the effect of
garlic and bacilli on survival and growth. The expression of immune-related genes,
stress, and digestion was determined with real-time PCR. A total of 129 isolates, of
which 35 were found to be V. parahaemolyticus, were obtained. Apparently, strains
1, 8, and 33 belong to V. parahaemolyticus but not to those causing AHPND. The 35
strains showed alpha hemolysis. Eight strains were strongly hydrophobic, 22
moderately hydrophobic, and 5 were hydrophilic. The 35 strains have the ability to
form biofilms (moderate to strong) and their autoagregation capacity was high.
Eleven of the 19 tested strains are pathogenic. However, the strain 16 is the most
virulent. It was also noted that small shrimp are less resistant than juveniles. Higher
survival was observed in animals fed garlic (6 g/kg feed) and B. licheniformis BCR 4-
3 (1 x 106 CFU/g feed) and shrimp challenged with V. parahaemolyticus. No
significant differences in growth (bioassay 1) were found. Additives in food, modulate
the expression of immune-related (LvToll, profO, SOD, TGase, and lysozyme) and
digestion (trypsin) genes. However, the mRNA expression of hsp70 gene was
modulated only by the stocking density in the culture systems.
1
1. INTRODUCCIÓN
El camarón es uno de los productos marinos de mayor consumo a nivel mundial
y ante el agotamiento de sus poblaciones silvestres, su cultivo satisface gran parte de la
demanda. El cultivo de camarón nunca fue una actividad tradicional de la región, pero
se convirtió en una de las industrias con más rápido desarrollo (Rodríguez-Valencia,
2010).
A nivel nacional Sinaloa y Sonora son los principales productores de camarón,
sin embargo, tras la devastación que experimentó el cultivo del crustáceo en esas
entidades por el síndrome de la muerte temprana, que apareció en 2012 y provocó una
caída de entre 30 y 40 por ciento de rendimiento, según reportes de productores
(CONAPESCA, 2013). Un análisis del Centro de Estudios para el Desarrollo Rural
Sustentable y la Soberanía Alimentaria (CEDRSSA) señala, de acuerdo con cifras
oficiales, que el declive anual fue de 3.5 por ciento entre 2010 y 2013, y afectó
principalmente a las granjas de Sonora y Sinaloa (CONAPESCA, 2015).
Enfermedades del camarón 1.1.
El cultivo de camarón frecuentemente se ha visto obstaculizado por epizootias
muy graves causadas por patógenos potenciales como protozoarios, bacterias, hongos
y virus (Gómez-Gil et al., 2001). Sin embargo, el desarrollo de estas enfermedades no
solo se debe al aumento en la intensidad del cultivo de camarón, sino también a
problemas microbianos, alteraciones en el medio ambiente y desequilibrios
nutricionales (Kautsky et al., 2000). A nivel mundial, los virus, por lo espectacular del
daño y el corto plazo en el que se observan sus efectos; son responsabilizados por
grandes pérdidas en el cultivo de camarón. Sin embargo, existen otro tipo de patógenos
como Vibrio sp. que también generan daños importantes en la producción (Aguirre-
Guzmán, 2004; Goarant et al., 2006).
Los vibrios pertenecen a la familia Vibrionaceae, son bacterias Gram negativas,
en forma de coma, móviles, tolerantes a la sal y anaerobios facultativos (París, 2005).
Las enfermedades generadas por este tipo de bacterias han sido descritas como:
vibriosis, enfermedad bacterial, septicemia bacteriana de los peneidos, vibriosis de los
peneidos, vibriosis luminiscente, enfermedad de las patas rojas (Aguirre-Guzmán, 2004)
2
y el síndrome de la necrosis hepatopancreática aguda o también llamada síndrome de
la mortalidad temprana (EMS, por sus siglas en inglés) descrita por Lightner (NACA,
2012). La enfermedades causadas por vibrios representan serios problemas en el
cultivo de camarones peneidos, registrando mortalidades masivas tanto en laboratorios
de producción larvaria como en la etapa de engorda en muchas partes del mundo. No
obstante, es poca la atención que se le ha dado a su investigación; por lo que los
conocimientos sobre estas patologías y la epidemiología de Vibrio sp. patógenos en el
cultivo de camarón son limitados (Goarant et al., 2006; Jayasree et al., 2006).
El surgimiento e impacto de estas enfermedades puede ser influenciada por
diversos factores, señalados en la llamada “triada epidemiológica”. La enfermedad es el
resultado final de una compleja interacción entre el camarón, su ambiente y el patógeno
(Lightner y Redman, 1998; Lemonnier et al., 2006). De esta manera, muchos
organismos pueden ser portadores asintomáticos de un patógeno y en condiciones
normales están protegidos por los mecanismos de defensa. Cuando el sistema de
defensa es debilitado o suprimido debido al estrés, el patógeno puede multiplicarse,
rebasar los mecanismos de defensa y en ocasiones matar al hospedero (Gómez-Gil et
al., 2001).
El EMS afecta a dos especies de camarones que se crían habitualmente en todo
el mundo, el camarón tigre (Penaeus monodon) y el camarón patiblanco (Litopenaeus
vannamei). Los signos clínicos de la enfermedad incluyen letargo, crecimiento lento, el
estómago e intestino vacíos y el hepatopáncreas pálido y atrófico, a menudo con rayas
negras. En los primeros 20-30 días de haber sembrado un estanque, puede comenzar
la mortandad a gran escala (NACA, 2012). El EMS surgió en China en el año 2009,
causando graves pérdidas en la industria camaronera en Asia desde entonces. Los
camarones son más susceptibles a la enfermedad en las etapas de larva, postlarva y
juvenil (hasta 2.0 g). En México, el EMS causado por cepas de Vibrio parahaemolyticus,
ha desplomado la producción de camarón en el noroeste (Nayarit, Sinaloa y Sonora)
desde el 2013, provocando pérdidas económicas y de empleos. Para dar una idea de la
magnitud del problema, Sonora produjo en el 2009, 81,422 t; sin embargo, debido a la
mancha blanca, en el 2010 la producción se redujo a 49,400 t; en el 2011 a 40,697 t; en
el 2012 a 35,305 t y en el 2013, ya con la presencia del EMS, la producción fue de tan
3
sólo 14,000 t. En el 2014 (primer ciclo de cultivo), el panorama no fue diferente al de
2013. Sin embargo; en el 2015, la sobrevivencia en las granjas de camarón de Sinaloa
es superior al 70%; ya que la producción en 2014 fue de 86 mil toneladas, contra las 60
mil registradas en 2013, pocos meses después de la llegada del EMS (CONAPESCA,
2015).
Sistema inmune del camarón 1.2.
La principal actividad del sistema inmune es diferenciar y eliminar todo material
extraño de sus tejidos, con el fin de cumplir su función primordial que es mantener la
individualidad biológica (Vargas et al., 1996).
En general, el camarón blanco (L. vannamei) presenta dos líneas básicas de
defensa. La primera es una barrera física constituida por una capa externa de quitina
(exoesqueleto), que impide la entrada de los patógenos al organismo. Además, todo el
tracto digestivo es la principal vía de entrada de los microorganismos, aunque también
está revestido por una capa quitinosa además de formar un ambiente ácido y lleno de
enzimas, capaz de inactivar y digerir la mayoría de los microorganismos que no son
parte de su microbiota natural (Barracco et al., 2008).
La segunda línea de defensa, como en los demás crustáceos, está basada en
efectores celulares y humorales, los cuales se conjugan para eliminar microorganismos
potencialmente infecciosos. Los componentes de defensa celulares incluyen todas
aquellas reacciones que son llevadas a cabo directamente por los hemocitos
(fagocitosis, encapsulación, formación de nódulos y citotoxicidad (Holmblad y Söderhäll,
1999; Jiravanichpaisal et al., 2006a). Los hemocitos a su vez, se encuentran agrupados
en tres tipos, acorde a su morfología. Los hemocitos hialinos, no presentan gránulos
citoplasmáticos y participan en la coagulación y fagocitosis de partículas extrañas o
células envejecidas del propio organismo. Los hemocitos semigranulosos y granulosos
poseen gránulos citoplasmáticos (mayor número en granulosos) y participan en los
procesos de encapsulación y nodulación, donde una partícula extraña, que no puede
ser fagocitada, es rodeada por capas de hemocitos, lo que provoca su muerte. Además,
sintetizan y almacenan péptidos antimicrobianos y las enzimas necesarias para el
sistema profenoloxidasa. Los mecanismos humorales parecen tener mayor actividad
4
contra patógenos bacterianos y fúngicos, que virales. La respuesta humoral es un
mecanismo capaz de inhibir algunas actividades enzimáticas y el crecimiento
bacteriano en plasma, además de liberar sustancias causantes de lisis celular,
aglutininas y precipitinas (Söderhäll y Cerenius, 1992; Bachére et al., 2000; Rendón y
Balcázar, 2003).
Enzimas de digestión 1.3.
La degradación química de los alimentos se realiza gracias a la acción de
enzimas digestivas procedentes principalmente de la glándula del intestino medio o
hepatopáncreas. Este órgano tiene tres funciones principales: secreción y síntesis de
enzimas digestivas, retención temporal y cíclica de reservas y la absorción de nutrientes
producto de la digestión (Gibson y Barker, 1979).
La tripsina, quimotripsina y catepsina B son tres de las enzimas proteolíticas más
abundantes en hepatopáncreas de los decápodos. Sin embargo, el alimento es uno de
los factores determinantes en la síntesis de estas enzimas (Le Moullac, 1994). Aunque
la información sobre la expresión de genes digestivos en el camarón blanco no es
abundante, existen algunos trabajos que resaltan su importancia en camarones (Muhlia-
Almazán y García-Carreño, 2002; Sánchez-Paz et al., 2003).
Estrés en camarón 1.4.
Durante el cultivo de camarón las variables ambientales juegan un papel
determinante en la eficiencia del cultivo en términos de supervivencia y calidad de
producto. Lo anterior se debe a que el cultivo típicamente se realiza en estanques de
tierra que están expuestos a los cambios ambientales relacionados con el clima de la
entidad, influyendo directamente sobre la condición fisiológica de los organismos. La
temperatura es un factor determinante para organismos poiquilotermos (Bayne, 1976),
ya que influye en la velocidad de procesos fisiológicos, provocando variaciones en el
metabolismo y por consiguiente, en las necesidades energéticas, la condición, el estado
de salud y el crecimiento. Adicionalmente, a diferencia de otros factores, tiene la
capacidad de penetrar barreras físicas y puede tener efectos dramáticos sobre la
estructura de macromoléculas (Hickey y Singer, 2004).
5
La acción combinada de temperaturas altas sostenidas (por arriba de 33 °C),
niveles de oxígeno por debajo de los 3 mg/L, pH desbalanceados y altos niveles de
desechos nitrogenados provocan condiciones de estrés, que afectan negativamente en
el crecimiento, alimentación, frecuencia de muda y metabolismo. La situación se
agrava, si el oxígeno desciende por debajo de los 2 mg/L, cuando los organismos se
acercan a su nivel crítico, presentándose mortalidad en el estanque.
Proteínas de choque térmico 1.5.
Las proteínas de choque térmico (HSPs, por sus siglas en inglés) son proteínas
ampliamente conservadas, conocidas por su rápida respuesta a estrés por cambios
medio ambientales (temperatura y pH) (Qian et al., 2012).
Alternativas para tratar enfermedades en el camarón 1.6.
El tratamiento de camarones presuntamente infectados con Vibrio spp. se basa
principalmente en el uso de antibióticos en el alimento, aunque la susceptibilidad de los
vibrios a los antibióticos varía ampliamente entre cepas de la misma especie. Existe
poca información publicada sobre la forma detallada de uso de los antibióticos, aun
cuando su empleo en acuicultura puede desarrollar resistencia antibiótica en aquellos
agentes patógenos que infectan animales cultivados (por ejemplo, especies de Vibrio) y
a humanos (Soto-Rodríguez et al., 2008). Sin embargo, debido a los serios daños que
provocan las enfermedades virales como bacterianas en la camaronicultura, las
prácticas de cultivo intensivo implican el uso productos químicos y antibióticos. Los
acuicultores a menudo desconocen o ignoran deliberadamente los factores importantes
y precauciones para el uso de estas sustancias, como el método de aplicación
adecuado, la dosis y los efectos secundarios (Chanu et al., 2012). El mal uso
consecuente de estos productos químicos ha dado lugar a la aparición de cepas
bacterianas resistentes a los antibióticos y a la degradación del medio ambiente, lo cual
es perjudicial para la salud humana y los animales acuáticos (Bachère, 2000;
Sotomayor y Balcázar, 2003; Chanu et al., 2012). Los crustáceos no poseen un sistema
inmunitario específico ni con capacidad de memoria (Berger, 2000), lo que impide la
utilización de vacunas.
6
El uso de productos naturales, como las plantas medicinales, constituyen una
buena alternativa en la prevención y tratamiento de enfermedades debido a que son
depósitos y fuentes de productos químicos seguros, baratos y no conducen a la
generación de resistencia en patógenos (Chanu et al., 2012). Las plantas medicinales,
al ser de origen natural, poseen otras características interesantes: son biodegradables y
biocompatibles (Yerlikaya y Unluer, 2011), por lo que su uso constituye un recurso
importante para la profilaxis y terapia de las enfermedades en los organismos acuáticos
porque no hay contaminación del agua con productos sintéticos que pueden ser no
biodegradables (Prieto et al., 2005).
Los principios medicinales de las plantas son sustancias bioactivas como
alcaloides, taninos, flavonoides, cumarinas, quinonas, terpenoides, simarubalidanos,
melicianinas, limonoides, lactosas y lignanos, entre otros (Nutton, 2004), los cuales
poseen propiedades antibacterianas, antivirales y potencializan el sistema inmune
(Citarasu et al., 2006). Las plantas medicinales se pueden adicionar a la dieta del
camarón, ya que el alimento, además de proporcionar los nutrientes esenciales para el
crecimiento y desarrollo del organismo, puede ser el medio más prometedor para influir
en la salud del organismo cultivado y la resistencia al estrés y agentes causantes de
enfermedades (Gatlin, 2002).
En los últimos años, ha crecido el interés en el biocontrol de patógenos en
acuicultura, usando microorganismos antagonistas en lugar de los antibióticos
(Westerdahl et al., 1991; Maeda, 1994; Abraham et al., 2001). La mayoría de los
microorganismos utilizados como probióticos que han sido propuestos como agentes de
control biológico en la acuicultura, pertenecen a la bacteria del ácido láctico
(Lactobacillus), Vibrio (Vibrio alginolyticus), bacilos, levaduras y hongos (Intriago et al.,
1998; Singh et al., 2001). Los microorganismos benéficos pueden ser inoculados dentro
de los sistemas de cultivo de camarón para reducir el número de patógenos como V.
harveyi, V. parahaemolyticus y V. splendens (Jameson, 2003).
En este trabajo se probaron el ajo (Allium sativum) y Bacillus licheniformis BCR
4-3 para determinar su efecto en la supervivencia, crecimiento y la expresión de genes
del sistema inmune, estrés y digestión de L. vannamei infectado con V.
parahaemolyticus.
7
2. ANTECEDENTES
La herbolaria medicinal o fitoterapia ha tenido gran auge en lo que corresponde
al tratamiento de enfermedades humanas, por lo que se tiene un mayor conocimiento
acerca de las plantas que pueden ser utilizadas; sin embargo, en organismos acuáticos
aún se desconoce el efecto que éstas puedan tener, el principal reto que se tiene es
poder combatir enfermedades de tipo bacteriano (Prieto et al., 2005). El uso medicinal
de las plantas se basa en que contienen principios bioactivos. La efectividad que éstos
puedan tener para el tratamiento de enfermedades depende en gran parte de factores
propios de la planta como de las condiciones climáticas, las características de los
suelos, la edad de la planta y la época de recolección, así como del método de
extracción de dichos principios (Prieto et al., 2005).
Extractos de las plantas Ricinus communis, Phyllanthus niruri, Leucus aspera,
Manihot esculenta y las algas Ulva lactuca y Sargassum wightii en polvo se han
encapsulado en Artemia para alimentar a juveniles de Penaeus indicus. La actividad
antimicrobiana de estos extractos fue probada en camarones infectados con V.
parahaemolyticus en donde los camarones alimentados con dietas de Artemia
enriquecida con hierbas y algas aumentaron la supervivencia (43.32-58.88 %), la tasa
de crecimiento específico (1.46-2.15 %/d) y bajó la carga bacteriana de V.
parahaemolyticus en el músculo y hepatopáncreas (Immanuel et al., 2003).
Chang et al. (2011) evaluaron el efecto de la zingerona, uno de los principios
activos del jengibre, en camarones juveniles de L. vannamei infectado con V.
alginolyticus. En los camarones alimentados con 2.5 y 5 mg/kg de alimento se observó
una inmunoestimulación ya que aumentó la actividad de la fenoloxidasa, anión
superóxido y actividad fagocítica. Además, aumento la resistencia a enfermedades por
bacterias como Vibrios.
En el 2011, Peraza-Gómez et al. hicieron una mezcla de Uncaria tomentosa (Uña
de gato), Echinacea purpurea (Equinácea) y Ocimum basilicum (Albahaca morada) en
polvo, observando al final de su bioensayo que las plantas disminuyeron la prevalencia
del WSSV de un 68 % en tratamiento control a un 23.3 % del tratamiento con la mezcla
de las 3 plantas medicinales.
8
Medina-Beltrán et al. (2012) probaron una mezcla de plantas E. purpurea y U.
tomentosa en la supervivencia del camarón y prevalencia de WSSV, el bioensayo se
llevó a cabo durante 30 días. El alimento con las plantas (4 g/kg) no aumentó el
crecimiento y la supervivencia. Sin embargo, la mezcla de plantas disminuyó la
prevalencia de WSSV en los camarones tratados (83.3, 50.0, 16.6, y 8.3 %) en
comparación con el grupo de control (100 %). Además, se observó un aumento en la
actividad de la fenoloxidasa en plasma.
El ajo (A. sativum) se ha incorporado en la dieta de la lubina asiática aumentando
su crecimiento, ganancia de peso y conversión del alimento, además de presentar una
mejora en la respuesta inmune a la infección por V. harveyi (Dad Talpur y Ikhwanuddin,
2012).
Tanekhy y Fall (2015) midieron la expresión de algunos genes relacionados con
el sistema inmune (peneidina, crustina, lisozima, receptor Toll y el factor de necrosis
tumoral) en el camarón Kuruma (Marsupenaeus japonicus) a la estimulación con alicina,
el principal compuesto del ajo. Encontraron que estos se elevaban en el intestino y
órganos linfoides después de la estimulación in vivo a las 3, 12, 24 y 48 h. Concluyeron
que el ajo se puede utilizar en el cultivo del camarón como una alternativa a los
antibióticos.
Respecto a los probióticos, en los últimos años se ha incrementado la búsqueda
de microorganismos probióticos con el fin de mejorar los cultivos de organismos
acuáticos, bajo el término de “cultivos amigables” con el ambiente (Sotomayor et al.,
2009; Pandiyan et al., 2013). Los diversos probióticos estudiados para su uso en
acuacultura incluyen tanto bacterias Gram (-) como bacterias Gram (+), bacteriófagos,
levaduras y algas unicelulares. En particular, los probióticos se han utilizado con éxito
en un amplio número de invertebrados (Gómez-Gil et al., 2000; Riquelme et al., 2000;
Chiu et al., 2007; Weber et al., 2012).
Maeda et al. (1997) aislaron una cepa de Pseudoalteromonas undina, que
presentó efectos antivirales e incrementó la supervivencia en camarón (Penaeus sp.) y
dorada (Sparus aurata) infectados experimentalmente con los virus de la necrosis neuro
Sima-aji (SJNNV), baculovirus e Iridovirus.
9
Chiu et al. (2007) demostraron que es posible eliminar V. alginolyticus en
infecciones experimentales con camarón blanco cuando se alimenta con Lactobacillus
plantarum debido al aumento significativo de la actividad fenoloxidasa (PO), el estallido
respiratorio y la superoxido dismutasa (SOD), así como la transcripción del ARNm de la
peroxinectina (PE) y la profenoloxidasa (proFO).
Sotomayor et al. (2009) determinaron que los productos extracelulares de la cepa
probiótica P62 (Vibrio) estimulan la actividad de la amilasa y tripsina en L. vananmei.
Nimrat et al. (2012) probaron dos mezclas de probióticos de Bacillus en el
crecimiento, número de bacterias y calidad de agua en L. vannamei. Los autores
concluyeron que la adición de probióticos aumenta el crecimiento y la supervivencia en
postlarvas de camarón.
10
3. JUSTIFICACIÓN
La acuacultura es una de las industrias con mayor crecimiento debido a que la
producción natural de proteínas no satisface las necesidades actuales. La
camaronicultura, en especial, tiene un alto impacto económico y social. Sin embargo, la
falta de buenas prácticas acuícolas ha generado la propagación de enfermedades,
causadas principalmente por virus y bacterias, que afectan considerablemente la
supervivencia de estos organismos y por ende la producción.
Los problemas causados por vibrios en el cultivo de camarón a nivel mundial y su
resistencia a los antibióticos, debido a su mal uso, hacen necesaria la investigación
sobre nuevos productos.
El uso de plantas medicinales y bacterias benéficas en el combate de las
enfermedades bacterianas y virales en el camarón es de vital importancia ya que estos
aditivos pueden ser incluidos en el alimento y no tienen un efecto negativo para el
ambiente por ser de origen natural.
11
4. HIPÓTESIS
La supervivencia, crecimiento y expresión de genes del sistema inmune, estrés y
digestión del camarón blanco (L. vannamei) son afectados por V. parahaemolyticus, así
como el ajo y B. licheniformis BCR 4-3, adicionados en el alimento.
5. OBJETIVO GENERAL
Determinar la supervivencia, crecimiento en peso y expresión de genes del
sistema inmune, digestión y estrés del camarón blanco (L. vannamei) infectado con V.
parahaemolyticus y tratado con ajo y B. licheniformis BCR 4-3.
OBJETIVOS PARTICULARES 5.1.
Aislar y caracterizar cepas potencialmente patógenas de V. parahaemolyticus del
hepatopáncreas de L. vannamei.
Determinar el efecto del ajo y B. licheniformis BCR 4-3, adicionados en el
alimento, en la supervivencia y crecimiento del camarón blanco retado con V.
parahaemolyticus.
Analizar la expresión de genes del sistema inmune, estrés y digestión en
camarones retados con V. parahaemolyticus y tratados con ajo y B. licheniformis
BCR 4-3.
12
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Aislamiento de colonias presuntivas de V. parahaemolyticus
Se extrajo el hepatopáncreas de camarones (L. vannamei) presumiblemente
infectados con V. parahaemolyticus obtenidos de granjas acuícolas del municipio de
Guasave. Los tejidos se maceraron individualmente con solución salina (NaCl) al 2.5 %
en tubos Eppendorf estériles. Posteriormente, se sembraron por duplicado mediante
estría cruzada (30 µL) en placas de Petri con un medio específico para virbrios Agar
Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS) con 2.5 % de NaCl, Las placas se incubaron a
37 °C por 24 h. Cada colonia verde se resembró por estría cruzada dos veces más
hasta obtener colonias individuales. Las colonias verdes aisladas se resembraron en un
medio nutritivo Tripticasa de Soya y Agar (TSA) con 2.5 % de NaCl y se incubaron a 37
°C por 24 h. Cada aislado se almacenó a -80 °C en medio Tripticasa de soya caldo
(TSC) con 15 % (v/v) de glicerol.
6.2. Extracción de ADN bacteriano
Se inocularon 20 µL de cada (stock) en medio TSC con 2.5 % de NaCl y se
incubaron por 24 h a 30-33 °C. Se colocó 1 mL de cada cultivo en un tubo Eppendorf y
se centrifugaron durante 5 min a 13,500 x g. Se decantaron y se repitió el paso anterior
dos veces más en el mismo tubo. Una vez obtenida la pastilla, se agregaron 400 µL de
búfer de lisis (NaCl 5M, Tris pH8 1M, EDTA pH8 0.5M, SDS 10 %, H2O UP) más 20 µL
de Proteinasa K® y se incubó la muestra durante 30 min a 65 °C. Una vez incubados se
le agregaron 200 µL de NaCl saturado (~6M), se agitó vigorosamente y se incubó en
hielo 10 min, luego se centrifugaron 10 min a 10,000 x g. Después se transfirieron 500-
600 µL del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf que contenía 1 mL de etanol
absoluto frio, se invirtió el tubo 1 a 2 veces y se centrifugó 10 min a 13,000 x g. Se
realizó un lavado con 1 mL de etanol al 75 % centrifugando a 13,000 x g durante 5 min.
Se secó la pastilla a temperatura ambiente de 5 a 10 min. Se resuspendió en 30 µL de
agua ultrapura y se almacenó a -20 °C.
La cantidad y calidad del ADN se determinó en un nanofotómetro (Implen) a
260/280 y 260/230 nm. El ADN se visualizó bajo luz UV en un gel de agarosa al 0.8 %,
teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/mL),
13
Preselección de los aislados de Vibrio e identificación molecular de los 6.3.aislados
6.3.1. Detección con primers AP3
Para la preselección se utilizaron los primers AP3, AP3F 5´-ATG AGT AAC AAT
ATA AAA CAT GAA AC-3´ y AP3R 5´-GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA-3´ (Flegel et
al., 2014). El tamaño esperado de los fragmento fue de aproximadamente 336 pb. La
mezcla de reacción para la PCR se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 mL en un
volumen total de 25 µL, como sigue: 2.5 µL de búfer de reacción 10X; 0.4 µL de dNTPs
(10 mM cada uno; Bioline®); 0.5 µL de cada oligo (10 µM) y 0.2 µL de Taq polimerasa (5
U/µL; Bioline®). Se añadieron entre 50 y 100 ng de ADN obtenido en la extracción, al
final se ajustó el volumen a 25 µL con agua ultrapura. La amplificación se realiza en un
termociclador T personal (Biometra®) usando el siguiente programa: desnaturalización
inicial a 95 °C por 5 min; 35 ciclos a 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min y 72 C por 45 s.
Los productos de PCR se visualizaron bajo luz UV en un gel de agarosa al 1.0 %,
teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/mL),
6.3.2. Detección con primers 89 F/R
Para la detección con primers 89 F/R, 89F 5´-GTC GCT ACT GTC TAG CTG AA-
3´ y 89R 5´-ACG GCA AGA CTT AGT GTA CC-3´ (Nunan et al., 2014). El tamaño
esperado del fragmento fue de aproximadamente 470 pb. La mezcla de reacción para la
PCR se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 mL en un volumen total de 25 µL, como
sigue: 2.5 µL de búfer de reacción 10X; 0.4 µL de dNTPs (10 mM cada uno; Bioline®);
0.5 µL de cada oligo (10 µM) y 0.2 µL de Taq polimerasa (5 U/µL; Bioline®). Se
añadieron entre 50 y 100 ng de ADN obtenido en la extracción, al final se ajustó el
volumen a 25 µL con agua ultrapura. La amplificación se realiza en un termociclador T
personal (Biometra®) usando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C
por 3 min; seguido de 40 ciclos a 95 °C por 20 s, 67 °C por 20 s y 72 C por 30 s. Los
productos de PCR se visualizaron como se indicó anteriormente.
14
6.3.3. Identificación con hemolisinas totales (primers tlF/R, tdhF/R y trhF/R)
Para la identificación de V. parahaemolitycus productoras de hemolisinas se
realizó un pcr múltiple con los siguientes primer: hemolisina termolábil (tl) tlF 5´- AAA
GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG -3´ y tlR 5´- GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC
TGC -3´; hemolisina termoestable directa (tdh) tdhF 5´- GTA AAG GTC TCT GAC TTT
TGG AC -3´ y tdhR 5´- TGG AAT AGA ACC TTC ATC TTC ACC -3´; hemolisina
termoestable relacionada (trh) trhF 5´TTG GCT TCG ATA TTT TCA GTA TCT -3´ y trhR
5´- CAT AAC AAA CAT ATG CCC ATT TCC G -3´ (Bej et al., 1999). El tamaño
esperado de los fragmentos fue de aproximadamente de 450 pb, 259 pb y 500 pb
respectivamente. La mezcla de reacción para la PCR se realizó en tubos Eppendorf de
0.2 mL en un volumen total de 25 µL, como sigue: 2.5 µL de búfer de reacción 10X; 0.5
µL de dNTPs (10 mM cada uno; Bioline®), y 0.2 µL de Taq polimerasa (5 U/µL;
Bioline®). Se añade de 100 a 200 ng de ADN obtenido en la extracción, al final se ajustó
el volumen a 25 µL con agua ultrapura. La amplificación se realiza en un termociclador
T personal (Biometra®) usando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C
por 5 min; 35 ciclos a 94 °C por 1 min, 58 °C por 1 min y 72 C por 45 s. Los productos
de PCR se visualizaron (incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de
agarosa al 1.5 %, teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/mL), bajo luz UV.
Caracterización de los aislados 6.4.
6.4.1. Actividad hemolítica en agar sangre
La actividad hemolítica de los aislados se determinó conforme a la técnica
propuesta por Cowan y Steel (1993) con algunas modificaciones. Se prepararon cajas
de Petri con medio de cultivo agar sangre (adicionadas con 5 % de sangre humana). Se
hicieron perforaciones de 6 mm de diámetro en la placa con un horadador estéril. Los
aislados se cultivaron en medio TSC a 30 ºC por 24 h. 40 µL del cultivo bacteriano se
inoculó en los pozos y las placas se incubaron a 30 ºC, utilizando medio de cultivo para
el control negativo. Después del periodo de incubación (24 y 48 h) se determinó el tipo
de hemólisis: (parcial), (total) ó (sin halo de hemólisis) y se midió el diámetro del
halo de lisis con una regla. Se seleccionaron los aislados -hemolíticos con mayor halo
15
de lisis para su posterior caracterización, los aislados restantes se esterilizaron y se
desecharon como medida de bioseguridad.
6.4.2. Prueba de formación de biopelículas
La prueba de formación de biopelículas se realizó de acuerdo a Mandhi et al.
(2010). Se inocularon 20 µL del stock bacteriano en 10 mL de medio TSC y se
incubaron durante 24 h a 30-33 ºC. Después de la incubación se pusieron 200 µL por
pozo (triplicado) de una placa de 96 pozos y se midió su densidad óptica a 595 nm. Se
hizo una dilución 1:100 en medio TSC con NaCl y glucosa y en TSC con glucosa, la
muestra diluida (100 µL) fue puesta en los pozos de las placas por triplicado y se
pusieron a incubar a 33 ºC durante 24 h. Al término de la incubación se realizaron dos
lavados con 100 µL búfer PBS y se secan los pozos en posición invertida. Después se
fijaron las bacterias con 200 µL de etanol al 95 %, se decantó y se dejó secar la placa
para después teñirla con 100 µL de cristal violeta (violeta de metilo), por 5 min, se quitó
el exceso de colorante invirtiendo la placa y se realizaron 3 lavados con agua destilada
estéril (300 µL), se desechó el agua y se dejó secar la microplaca al aire. La densidad
óptica se midió a 595 nm. La capacidad de adherencia se interpretó como fuerte (OD ≥
1), media (0.1 ≤ OD595 <1) o baja (OD595 <0.1).
6.4.3. Adhesión microbiana a solventes (xileno)
La adhesión microbiana a solventes se midió de acuerdo al método propuesto
por Rosenberg et al. (1980). Se utilizó el solvente ƥ-xileno, debido a que la adhesión
bacteriana a este solvente refleja el carácter hidrofóbico o hidrofílico de la superficie
celular. Las bacterias se cultivaron en medio TSC y se cosecharon durante la fase
estacionaria de crecimiento mediante centrifugación a 3900 rpm por 15 min. La biomasa
se lavó dos de veces y se resuspendió en búfer PBS pH 7.4 (NaCl, 137 mM; KCl, 2.7
mM; Na2HPO4, 2 mM). La absorbancia de la suspensión celular se midió a 600 nm (A0).
Se agregó 1 mL de ƥ-xileno a 3 mL de la suspensión celular. Después de 10 min de
incubación a temperatura ambiente, se obtuvo un sistema de dos fases, el cual se
mezcló en un vórtex por 2 min. La fase acuosa se removió después de 20 min de
16
incubación a temperatura ambiente y se midió su absorbancia a 600 nm (A1). El
porcentaje de adhesión bacteriana al xileno se calculó como (1-A1/A0) x 100.
6.4.4. Autoagregación
La prueba de autoagregación para las 35 cepas se realizó de acuerdo a la
metodología de Del Re et al. (2000). Las bacterias se cultivaron durante 18 h a 30-33 ºC
en medio TSC Las células se recogieron por centrifugación a 3,900 rpm durante 20 min,
se lavaron dos veces y se resuspendieron en Buffer PBS para obtener 108 UFC ml-1.
Las suspensiones celulares (4 ml) se mezclaron en un vórtex durante 10 s y luego se
incubaron a temperatura ambiente durante 5 h. Cada hora, 0,1 ml de la suspensión
superior se transfirió a otro tubo con 3,9 ml de PBS y se leyó la absorbancia (A) en un
espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 a 600 nm, se utilizó PBS como
blanco. El porcentaje de autoagregación se expresó como: 1 - (A / A0) x 100, donde A
representa la absorbancia en el tiempo t = 1,2,3,4, ó 5 h y A0 la absorbancia a t = 0.
6.4.5. Cinética de crecimiento y conteo de aislados V. parahaemolyticus.
Las fases de crecimiento de las bacterias se determinaron mediante una cinética
de crecimiento de cada una de los aislados presuntivos de vibrios -hemolíticos en 50
mL de medio TSC con 2.5 % de NaCl. La inoculación del medio se realizó con 20 µL del
stock del aislado y se incubó a 37 ºC. Se determinó la absorbancia (580 nm) a las 3, 6,
9, 12, 24 y 48 h en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo
Scientific®).
Para contar las bacterias, se sembraron individualmente en medio TSC con 2.5 %
de NaCl y se incubaron por 24 h a 30-33 ºC. Las bacterias se centrifugaron a 12,000 x g
durante 10 min y se resuspendieron en 1 mL de solución salina (NaCl 2.5 %) estéril.
La solución bacteriana se ajustó a una densidad óptica de 1 en un espectrofotómetro
Thermo Spectronic Genesys 2 a una longitud de onda de 580 nm. Se determinaron las
UFC/mL para cada aislado, utilizando el método de diluciones seriadas decimales.
17
6.4.6. Determinación de actividad enzimática extracelular
La producción de enzimas extracelulares se determinó cualitativamente (León et
al., 2000). Para ello se cultivaron los aislados presuntivos de Vibrio en medio TSC con
2.5 % de NaCl y se incubaron a 30-33 °C por 24 h. Los cultivos se centrifugaron a
12,000 x g, por 10 min, para obtener el sobrenadante.
6.4.7. Prueba de degradación de la caseína (proteasas)
Se prepararon placas con medio basal (agar 1.5 % y extracto de levadura 0.5
%) adicionado con 2 % de leche descremada, se realizaron perforaciones de 6 mm
diámetro con un horadador estéril. Los pozos se inocularon con 50 μL del sobrenadante
de los cultivos bacterianos, se utilizó como control el medio de cultivo. Las placas se
incubaron a 33 °C por 24 h. Se consideró como resultado positivo los aislados que
formaron un halo transparente alrededor del pozo.
6.4.8. Prueba de hidrólisis de la gelatina (proteasas)
Se prepararon placas con medio basal (agar 1.5 % y extracto de levadura 0.5 %)
adicionado con 1 % de gelatina. Se realizaron perforaciones de 6 mm diámetro con un
horadador estéril. Los pozos son inocularon con 50 μL del sobrenadante de los
cultivos, se utilizó como control el medio de cultivo. Las placas se incubaron a 33 °C
por 24 h. Se consideró como resultado positivo los aislados que forman un halo nuboso
alrededor del pozo.
6.4.9. Prueba de hidrólisis de Tween 80 (lipasas)
Se prepararon placas de Petri con medio basal (agar 1.5 % y extracto de levadura
0.5 %) adicionado con 1 % de Tween 80. Se realizaron perforaciones (6 mm de
diámetro) con un horadador estéril de forma homogénea. Los pozos se inocularon con
50 μL del sobrenadante de los cultivos, se utilizó como control medio de cultivo. Las
placas se incubaron a 33 °C por 24 h. Se consideró como resultado positivo los
aislados que formaron un halo nuboso alrededor del pozo.
18
Preparación de la dieta 6.5.
6.5.1. Preparación de alimento con ajo y B. licheniformis BCR 4-3
El ajo en polvo se mezcló con el alimento comercial (AC) para camarón (Purina
35 % de proteína) y se pulverizó con el fin de obtener un polvo fino. El alimento se
preparó a diferentes concentraciones de ajo (2, 6 y 10 g/kg de alimento) y con 1 x 106
UFC (unidades formadoras de colonias) de B. licheniformis BCR 4-3/g de alimento.
Para el control se utilizó celulosa. Se mezcló el alimento con el ajo y las bacterias en
una batidora, se agregó agua destilada y la pasta que se obtuvo se procesó en una
máquina para moler carne con el fin de obtener los pellets, los cuales se dejaron secar
durante 24 h y se almacenaron a 4 °C.
Bioensayos para determinar la concentración letal media de V. 6.6.
parahaemolyticus en postlarvas de L. vanamei
Los organismos se obtuvieron de una granja (Acuícola Cuate Machado) de
Guasave, Sinaloa. El peso promedio de las postlarvas de camarón estuvo en un
intervalo de 30 a 716 mg. Se utilizaron acuarios de cristal de 6 L con 3 L de agua de
mar filtrada (20 m), aireación constante, se alimentaron diariamente con Camaronina
(35 % Purina®, México) a razón del 25 % del peso corporal en 2 raciones (09:00 y 17:00
h) y ajustando de acuerdo a la biomasa de camarón. Se colocaron 10 organismos por
pecera y se aclimataron un día. Los tratamientos se hicieron por triplicado. Los
camarones fueron retados con diferentes cepas de V. parahaemolyticus a diferentes
concentraciones. Tratamientos: I) Control, Camaronina; II) Camaronina + Vibrio (100
UFC/mL); III) Camaronina + Vibrio (1,000 UFC/mL); IV) Camaronina + Vibrio (10,000
UFC/mL); V) Camaronina + Vibrio (50,000 UFC/mL); VI) Camaronina + Vibrio (100,000
UFC/mL); VII) Camaronina + Vibrio (150,000 UFC/mL); VIII) Camaronina + Vibrio
(200,000 UFC/mL); IX) Camaronina + Vibrio (300,000 UFC/mL). Durante cada
bioensayo se registró la mortalidad y al final la supervivencia. Se tomaron las variables
fisicoquímicas del agua (temperatura, salinidad y oxígeno disuelto) y los organismos
estuvieron sujetos a fotoperiodo natural.
19
6.6.1. Determinación de la concentración letal media (CL50)
A partir de los resultados de los bioensayos anteriores se determinó la
concentración de Vibrio a la cual el 50 % de los organismos bajo tratamiento mueren
(CL50) y con la que se trabajó en la segunda parte con los aditivos en retos
experimentales.
El cálculo de la CL50 se realizó mediante el análisis Probit (Finney, 1952), el cual
es un tipo de regresión utilizada para variables con respuestas binomiales, siendo su
principal uso la determinación de la CL50 y DL50 (dosis letal media). En este caso se
utilizó el paquete estadístico StatPlus 2009 para determinar la CL50.
Bioensayos para determinar el efecto del ajo y B. licheniformis BCR 4-3, 6.7.
adicionados en el alimento, en la supervivencia, crecimiento, sistema
inmune, digestión y estrés en el camarón blanco retado con V.
parahaemolyticus
6.7.1. Bioensayo 1
Se realizó un bioensayo de 43 días en el cual se evalúo el efecto de una mezcla
de plantas en el alimento para el tratamiento de la infección producida por V.
parahaemolyticus. Se utilizaron tinas de plástico con capacidad de 120 L con 20 L de
agua de mar filtrada (20 µm) y aireación constante. En cada tina se colocaron 10
organismos con un peso promedio de 0.512 ± 0.1 g. Se contó con 2 tratamientos como
controles, los cuales se alimentaron con Camaronina® + celulosa. Los organismos
tratados con ajo y bacterias se alimentaron durante los primeros 9 días con el alimento
con los aditivos. En el día 10, los organismos de los tratamientos II, III, IV y V se
inocularon con V. parahaemolyticus IPNGS16 (CL50=144,000 UFC/mL). Los
tratamientos quedaron de la siguiente manera: I) Camaronina; II) Camaronina + vibrio
CL50; III) Camaronina + ajo (2 g/kg de alimento) + B. licheniformis (1 x 106 UFC/g de
alimento) + vibrio CL50; IV) Camaronina + ajo (6 g/kg de alimento) + B. licheniformis (1 x
106 UFC/g de alimento) + vibrio CL50; V) Camaronina + ajo (10 g/kg de alimento) + B.
licheniformis (1 x 106 UFC/g de alimento) + vibrio CL50. Los tratamientos se hicieron por
triplicado. Los organismos se alimentaron al inicio a razón de 25 % del peso corporal, 2
20
veces al día (09:00 y 17:00 h). Se hizo un recambio del 50 % de agua cada 3 d. La
limpieza diaria se hizo por sifoneo y el agua desechada se recuperó inmediatamente.
Durante el experimento se registraron las variables fisicoquímicas del agua:
temperatura, salinidad y oxígeno disuelto. Además, los organismos estuvieron sujetos a
fotoperiodo natural. El análisis de los nutrientes (amonio, nitritos y nitratos) se realizó a
los 12 días y al final del experimento, se hicieron por métodos químicos ya
estandarizados internacionalmente (Strickland y Parsons, 1972), antes del recambio del
50 % de agua.
Al final del bioensayo se extrajo hemolinfa de 3 camarones por tina (9 por
tratamiento) para el análisis de la expresión de los genes del sistema inmune, digestión
y estrés (RT-qPCR).
6.7.2. Bioensayo 2
El bioensayo duró 12 días. En cada tina se colocaron 10 organismos con un peso
promedio de 0.12 ± 0.027 g. Se contó con 2 tratamientos como controles, los cuales se
alimentaron con Camaronina + celulosa. Los organismos tratados con ajo y bacterias se
alimentaron durante los primeros 6 días con el alimento con los aditivos. En el día 7, los
organismos de los tratamientos II y III se inocularon con V. parahaemolyticus IPNGS16
(CL50=62,000 UFC/mL). Los tratamientos quedaron de la siguiente manera: I) Control;
II) Control + vibrio CL50; III) ajo (6 g/kg de alimento) + B. licheniformis (1 x 106 UFC/g
de alimento) + vibrio CL50. Los tratamientos se hicieron por triplicado. Los organismos
se alimentaron al inicio a razón de 25 % del peso corporal, 2 veces al día (09:00 y 17:00
h). Se hizo un recambio del 50 % de agua cada 3 d. La limpieza diaria se hace por
sifoneo y el agua desechada se recuperó inmediatamente. Durante el experimento se
registraron las variables fisicoquímicas del agua: temperatura, salinidad y oxígeno
disuelto. Además, los organismos estuvieron sujetos a fotoperiodo natural. El análisis
de los nutrientes (amonio, nitritos y nitratos) se realizó al final del experimento, se
hicieron por métodos químicos ya estandarizados internacionalmente (Strickland y
Parsons, 1972), antes del recambio del 50 % de agua.
21
6.7.3. Obtención de la hemolinfa
Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune en el primer
bioensayo se extrajo la hemolinfa de los camarones cultivados con jeringas para
insulina (27G x 13 mm) de la parte ventral del camarón, justo en la zona del primer par
de pleópodos. La jeringa se cargó con anticoagulante pH 7.3 (27 mM de citrato
trisódico, 385 mM de NaCl, 115 mM de glucosa) previamente enfriado a 4 °C (Vargas-
Albores et al., 1993), en una proporción 2:1 (2 volúmenes de anticoagulante por cada
volumen extraído de hemolinfa). Inmediatamente después de ser extraída la muestra de
hemolinfa, ésta se colocó en tubos Eppendorf de 1.5 mL, preenfriados.
Para el estudio de expresión genética se analizaron individualmente 9
camarones por tratamiento (3 por tina). Se separaron los hemocitos del plasma
centrifugando la hemolinfa a 800 x g por 10 min a 4 °C. El plasma se eliminó y el
paquete celular se lavó con 1 vol. de anticoagulante frio. Se centrifugó nuevamente a
800 x g, 10 min a 4 °C y se desechó el sobrenadante. Al paquete celular se le
adicionarán 250 µL de Trizol (MRC®) frío (4 °C) y se almacenaron las muestras a -80
°C.
6.7.4. Extracción de ARN y síntesis de cDNA
El ARN total se extrajo de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen®) y se
guardó a -80 ºC hasta su uso en la RT-PCR. La concentración y pureza del ARN total
se determinó midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un nanofotómetro (Implen®).
Posteriormente se trató el ARN con ADNsa 1 (1 U/µL, Sigma®).
La construcción del cDNA se realizó con un kit comercial [(ImProm-II Reverse
Transcriptase (Promega)], con algunas modificaciones, como sigue:
Una vez cuantificados los RNAs se trataron con DNAsa I (Promega) de acuerdo a las
instrucciones del proveedor y se volvieron a cuantificar. Se utilizó 1 µg de cada muestra
de tejido o 500 ng de hemocitos para retro-trascribir el DNA complementario (cDNA)
como sigue:
1. En un tubo Eppendorf de 0.2 ml, se colocó el RNA total diluido en 10 µl de agua.
2. Se incubó a 70 °C por 5 min y se pasó inmediatamente a hielo.
3. Se incubó durante 5 min en hielo.
22
4. Durante el tiempo de incubación se preparó la mezcla de reactivos de la enzima.
Mezcla de reacción (µl)
Bufer 5X 4.0 MgCL2 25 mM 2.4 dNTPS 40 mM 1.0 Oligo dT 25 µM 1.0 Agua DEPC 0.6 Enzima Improm II 1.0
Total 10.0
5. Se homogenizó la mezcla con vortex a baja potencia y se adicionaron 10 µl a
cada reacción para obtener un volumen final de 20 µl.
6. Finalmente se sometieron a un ciclo de tres temperaturas (5 min a 25 °C, 60 min
a 42 °C y 15 min a 70 °C).
7. Los cDNAs fueron almacenados a -70 °C para su análisis.
6.7.5. Expresión relativa de genes mediante qPCR (PCR cuantitativa en
tiempo real)
La expresión del ARNm de algunos genes relacionados con el sistema inmune
(hemocitos) y estrés y digestión (hepatopáncreas) fue evaluada con oligonucleótidos
específicos para cada gen (Tabla 1).
Se probaron cuatro genes de referencia pero sólo se usaron los tres más
estables (β-actina y 40S-S24) como controles internos (Tabla 1). Todos los
oligonucleótidos se mandaron sintetizar a SIGMA Genosys®.
23
Tabla 1. Genes del sistema inmune, digestión y estrés de L. vannamei de los cuales se cuantificó su expresión.
Gen Secuencia del primer (5’-3’) Referencia
40S_S24 (Control interno)
Sentido
Contrasentido
5´-CAGGCCGATCAACTGTCC-3´
5´-CAATGAGAGCTTGCCTTTCC-3´
(Álvarez-Ruíz et al., 2015)
β-actina (Control interno)
Sentido
Contrasentido
5´-CCACGAGACCACCTACAAC-3´
5´-AGCGAGGGCAGTGATTTC-3´
(Wang et al., 2010)
EF1α (Control interno)
Sentido
Contrasentido
5‟-GTTGACTTGAAGGGCAATG-3„
5‟-CTTCTTGGCTTCGATTCTG-3„
(Álvarez-Ruíz et al., datos no publicados)
L-21 (Control interno)
Sentido
Contrasentido
5‟-GTTGACTTGAAGGGCAATG-3‟
5‟-CTTCTTGGCTTCGATTCTG-3‟
(Stephens et al., 2012)
Genes del sistema inmune
Receptor Toll (LvToll)
Sentido
Contrasentido
5‟-ATGTGCGTGCGGATACATTA-3‟
5‟-GGGTGTTGGATGTCGAGAGT-3‟
(Wang et al., 2010)
Profenoloxidasa (proFO)
Sentido
Contrasentido
5'-GAGATCGCAAGGGAGAACTG-3'
5'-CGTCAGTGAAGTCGAGACCA-3'
(Wang et al., 2010)
Superóxido Dismutasa (SOD)
Sentido
Contrasentido
5'-ATCCACCACACAAAGCATCA-3'
5'-AGCTCTCGTCAATGGCTTGT-3'
(Wang et al., 2010)
Lisozima (LIS)
Sentido
Contrasentido
5´-GAAGCGACTACGGCAAGAAC-3´
5´-AACCGTGAGACCAGCACTCT-3´
(Wang et al., 2010)
24
Transglutaminasa (TGasa)
Sentido
Contrasentido
5'-CCTCAGGATCTCCTTCACCA-3'
5'-TTGGGAAAACCTTCATTTCG-3'
(Wang et al., 2010)
Genes de estrés
LvHsp70
Sentido
Contrasentido
5'-CTCCTGCGTGGGTGTGTT-3'
5'-GCGGCGTCACCAATCAGA-3'
(Álvarez-Ruíz et al., datos no publicados)
Genes digestivos
Tripsina
Sentido
Contrasentido
5'-TCCAAGATCATCCAACACGA-3'
5'-GACCCTGAGCGGGAATATC-3'
(Stephens et al., 2012)
25
Las amplificaciones se realizaron en el equipo CFX96 Touch® Real-Time System
(Bio-Rad®) y se utilizó el software CFX Manage® versión 3.0 (Bio-Rad®) para la
obtención de los datos. La eficiencia de la reacción de PCR fue determinada mediante
el cálculo de una pendiente con cinco diluciones seriales (factor de dilución 5 o 10) de
un pool representativo de ADNc [E = 10(-1/slope)-1]. Para calcular la expresión de los
genes de interés, los valores de Cq fueron transformados a cantidades relativas usando
la ecuación RQij=E[(Cq promedio)−Cq(ij)], donde E es la eficiencia especifica del gen
de interés y [(Cq mean –Cq(ij)] es la diferencia absoluta entre el Cq de cada muestra y
el Cq promedio en el conjunto de datos de cada gen de interés. La expresión relativa
fue calculada con la ecuación RQgen de interés/media geométrica de RQgenes de
referencia (Vandesompele et al., 2002; Hellemans et al., 2007).
Con la finalidad de verificar la ausencia de dimeros o artefactos se realizó un
análisis de disociación (Curva de Melting) al final de cada reacción registrando la
fluorescencia de 65 a 90 °C cada medio grado.
Las amplificaciones de los genes de interés se llevaron a cabo en placas de 96
pozos con un volumen de reacción final de 15 µL conteniendo 7.5 µL de PCR Master
Mix 2x (utilizando EvaGreen 20x, Biotium®), 0.7-1.0 µL de primers (sentido y
contrasentido10 µM, SIGMA), 1.8 µL de agua ultrapura y 5 µL de templado (DNAc).
Las condiciones de amplificación para la qPCR fueron: desnaturalización a 95 °C
por 3 min, seguida de 40 ciclos a 95 °C por 10 s, 60 °C por 15 s, 72 °C por 30 s y 79 °C
por 5 s para adquirir la fluorescencia. El número de copias del gen diana y los valores
de Ct (ciclo umbral) se relacionan inversamente, por lo que una muestra que contiene
un mayor número de copias del gen diana tendrá un menor valor de Ct que el de una
muestra con un menor número de copias del mismo gen.
26
Análisis estadístico 6.8.
Los resultados de supervivencia se sometieron a un análisis de varianza
(ANDEVA) de una vía, previa transformación de los porcentajes de supervivencia por
medio de arcoseno √%/100 para normalizar su distribución (Ostle, 1965).
Para comparar los datos obtenidos en cuanto a TCE (Tasa de crecimiento
específico) y expresión de genes del sistema inmune se llevaron a cabo una prueba de
normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y homocedasticidad (Bartlett). Posteriormente, se
realizó un ANDEVA de una vía para detectar diferencias entre tratamientos (p<0.05) y
una prueba de Tukey (Prueba de Diferencia Significativa Honesta, DSH) para identificar
la naturaleza de esas diferencias (p<0.05).
7. RESULTADOS
Aislamiento de cepas de V. parahaemolyticus 7.1.
Se obtuvieron 129 aislados presuntivos de Vibrio spp. de camarones enfermos.
Todos los aislados seleccionados formaron colonias verdes en TCBS.
Selección de cepas con primers AP3 y 89F/R 7.2.
Fueron seleccionados 35 aislados positivos con primers AP3 (Fig. 1), que da un
fragmento de 336 pb y con primers 89F/R (con excepción de las cepas 1, 8 y 33) (Fig.
2), que dan un fragmento de 470 pb. La caracterización posterior se realizó para los 35
aislados seleccionados.
27
Fig.1. Se observan las bandas para algunos aislados positivos de V.
parahaemolyticus con los primers AP3 con un tamaño aproximado de 336 pb. (M)
Marcador de peso molecular, (-) control negativo y número de muestras.
336 pb
28
Fig. 2. Se observan las bandas para los aislados positivos de V.
parahaemolyticus con los primers 89F/R con un tamaño aproximado de 470 pb, (M)
Marcador de peso molecular, (-) control negativo y número de muestras (1-35).
29
Identificación molecular con primers para hemolisinas 7.3.
Todos los aislados fueron positivos para la hemolisina tl que da un tamaño de
banda de 450 pb, pero negativos para tdh (259 pb) y trh (500 pb) (Fig. 3).
Fig. 3. Se observan sólo las bandas para los aislados positivos para tl (450 pb)
con PCR múltiple. (M) Marcador de peso molecular, (-) control negativo y número de
muestras (1-35).
450 pb
450 pb
30
Actividad hemolítica 7.4.
Todos los aislados mostraron α-hemólisis con halo de un diámetro entre 1.43 y
2.18 cm (Tabla 2).
Formación de biopelículas 7.5.
La capacidad de adherencia puede ser fuerte (DO ≥ 1), moderada (0.1≤DO595
<1) o débil (DO595 <0,1). Los aislados 10, 16, 19, 29 y 33 mostraron gran capacidad
para formar biopelículas (1.04 a 1.13). El resto de los aislados mostró adherencia
moderada (0.10 hasta 0.88) (Tabla 2).
Adhesión microbiana a solventes (xileno) 7.6.
Los resultados mostraron que 8 aislados fueron fuertemente hidrófobicos (51.46
a 58.24 %). Veintidós fueron moderadamente hidrófobicos (22.7 % - 49.52 %). Cinco
aislados fueron hidrofílicos (11.6 a 19.90 %).
Capacidad de autoagregación 7.7.
Los resultados de autoagregación mostraron valores altos en todas las cepas
que van desde 96.0 % a 98.94 % (Tabla 2).
Actividad enzimática extracelular 7.8.
Los resultados mostraron que sólo los aislados 11 y 12 tenían actividad de la
proteasa (degradación de caseína) con un diámetro de lisis halo de 13 y 16 mm,
respectivamente (Tabla 2).
Cinética de crecimiento 7.9.
Se encontró que la fase exponencial de los treinta y cinco aislados estaba entre
las 6 y 12 h, mientras que la fase de decadencia se encontró entre las 12 y 96 h.
31
Tabla 2. Caracterización de aislados presuntivos de V. parahaemolyticus obtenidos del hepatopáncreas de camarón
blanco (L. vannamei).
AP3 89F/R Hemolisinas Hemolisis
(cm)
Biopelícula
(DO)
Hidrofobicidad
(%)
Autoagregación
(%)
AEE
(mm) Aislados tlh tdh trh 48 h Tipo
1 + - + - - 1.65 ± 0.33 α 0.18 ± 0.01 19.35 ± 2.41 98.73 ± 0.01 -
2 + + + - - 1.66 ± 0.26 α 0.17 ± 0.02 55.95 ± 0.77 97.89 ± 1.13 -
3 + + + - - 1.93 ± 0.33 α 0.34 ± 0.02 36.29 ± 2.29 96.98 ± 1.06 -
4 + + + - - 2.18 ± 0.33 α 0.33 ± 0.01 35.71 ± 1.79 97.11 ± 0.41 -
5 + + + - - 1.80 ± 0.20 α 0.15 ± 0.01 51.46 ± 2.97 97.88 ± 0.18 -
6 + + + - - 1.70 ± 0.06 α 0.10 ± 0.01 47.31 ± 0.33 97.29 ± 0.22 -
7 + + + - - 1.85 ± 0.05 α 0.10 ± 0.01 53.86 ± 0.24
0.99
98.19±0.13 -
8 + - + - - 1.75 ± 0.15 α 0.13 ± 0.03 37.58 ± 0.74 98.80 ± 0.35 -
9 + + + - - 1.75 ± 0.05 α 0.12 ± 0.02 21.77 ± 0.50 96.97 ± 0.17 -
10 + + + - - 1.95 ± 0.05 α 1.04 ± 0.06 55.26 ± 0.33 97.65 ± 0.21 -
11 + + + - - 1.70 ± 0.00 α 0.11 ± 0.04 26.37 ± 0.78 97.94 ± 0.12 13
12 + + + - - 1.85 ± 0.05 α 0.19 ± 0.06 40.24 ± 1.64 97.30 ± 2.26 16
13 + + + - - 1.50 ± 0.00 α 0.13 ± 0.03 48.66 ± 2.21 97.48 ± 0.27 -
14 + + + - - 1.53 ± 0.48 α 0.88 ± 0.05 29.63 ± 1.09 96.46 ± 1.64 -
15 + + + - - 1.60 ± 0.31 α 0.28 ± 0.01 30.88 ± 1.90 97.02 ± 1.97 -
16 + + + - - 1.57 ± 0.12 α 1.10 ± 0.07 55.92 ± 0.08 97.82 ± 0.44 -
17 + + + - - 1.43 ± 0.22 α 0.21 ± 0.08 27.12 ± 1.18 96.96 ± 1.87 -
18 + + + - - 1.93 ± 0.38 α 0.26 ± 0.02 43.58 ± 0.69 97.58 ± 1.84 -
19 + + + - - 1.50 ± 0.06 α 1.09 ± 0.01 55.00 ± 1.33 98.01 ± 0.83 -
20 + + + - - 1.67 ± 0.13 α 0.12 ± 0.06 37.85 ± 1.58 98.94 ± 0.16 -
21 + + + - - 1.67 ± 0.09 α 0.21 ± 0.02 35.06 ± 2.12 97.69 ± 0.14
22 + + + - - 2.03 ± 0.09 α 0.14 ± 0.04 43.97 ± 2.81 97.86 ± 0.17 -
23 + + + - - 1.90 ± 0.06 α 0.18 ± 0.06 56.01 ± 2.70 98.40 ± 0.05 -
24 + + + - - 2.0 ± 0.25 α 0.21 ± 0.04 19.90 ± 0.07 96.00 ± 0.29 -
25 + + + - - 1.55 ± 0.05 α 0.17 ± 0.05 13.30 ± 0.80 97.61 ± 0.17 -
32
AP3= Primers AP3. 89F/R= Primers 89F/R. ND=No Detectado. Biopelícula= Fuerte (DO ≥ 1), media (0.1 DO 595) o baja (DO 595<
0.1). Hidrofobicidad= Fuerte (>50 %), media (20-50 %), hidrofílica (<20 %). AEE= Actividad enzimática extracelular.
26 + + + - - 1.78 ± 0.11 α 0.17 ± 0.03 35.53 ± 1.41 97.78 ± 0.04 -
27 + + + - - 1.63 ± 0.05 α 0.10 ± 0.02 39.16 ± 1.02 96.69 ± 0.48 -
28 + + + - - 1.68 ± 0.08 α 0.28 ± 0.01 49.52 ± 0.68 96.42 ± 0.86 -
29 + + + - - 1.55± 0.05 α 1.13 ± 0.03 29.01 ± 0.34 98.11 ± 0.19 -
30 + + + - - 1.45 ± 0.05 α 0.27 ± 0.08 44.36 ± 1.16 96.68 ± 0.21 -
31 + + + - - 2.43 ± 0.23 α 0.24 ± 0.01 22.94 ± 1.41 97.19 ± 0.08 -
32 + + + - - 2.17 ± 0.12 α 0.27 ± 0.02 18.00 ± 1.97 97.71 ± 0.25 -
33 + - + - - 2.18 ± 0.12 α 1.06 ± 0.06 58.24 ± 0.35 97.79 ± 0.41 -
34 + + + - - 1.63 ± 0.19 α 0.10 ± 0.01 11.62 ± 0.25 97.66 ± 0.01 -
35 + + + - - 1.33 ± 0.33 α 0.44 ± 0.01 32.55 ± 0.91 97.35 ± 0.04 -
33
Conteo bacteriano 7.10.
El conteo se hizo sólo para 19 aislados que fueron probados en bioensayos de
desafío con V. parahaemolyticus. Cuando la suspensión bacteriana se ajustó a una
densidad óptica de 1, las UFC/mL de los aislados estuvieron entre 10.6 × 106 y 94 ×
106.
Bioensayos de desafío por inmersión 7.11.
En condiciones experimentales, las cepas 1, 8, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20 y 29
resultaron patógenos para L. vannamei; sin embargo, el aislado 16 parece ser el más
virulento. Los aislados 9, 15, 25, 28, 32, 33, 34 y 35 no resultaron patógenos para el
camarón blanco (Tabla 3).
Determinación de la CL50 7.12.
El análisis Probit dio valores de CL50 de 60 × 103 a 353 x 103 UFC/mL (Tabla 3).
34
Tabla 3. Infecciones experimentales de L. vannamei retado con cepas de V. parahaemolyticus para determinar la
concentración letal media.
Supervivencia (%)
Aislados Bioensayo Peso (mg) *1 x 10
2
*1 x 10
3
*1 x 10
4
*5 x 10
4
*1 x 10
5
*1.5 x 10
5
*2 x 10
5
*3 x 10
5
CL50
1 1 174±6 ND 100 100 ND 90 270 x 103
8 1 100±7 ND 100 100 ND 80 ND 33.3 158 x 103
9 1 716±30 100 100 100 ND 100 ND
2 40±15 100 100 100 ND 100 ND
3 174±6 ND 100 100 ND 100 ND
10 1 174±6 ND 100 100 ND 60 115 x 103
13 1 100±7 ND 100 100 ND 86.6 ND 70 353 x 103
14 1 174±6 ND 100 100 ND 84.4 198 x 103
15 1 187±9 ND 100 100 ND 100 ND ND 100 ND
16 1 200±19 100 100 80 ND 16.6 62 × 103
2 520±26 ND 100 100 100 26.6 46.6 144 x 103
3 30±9 100 100 53 ND 20 60 x 103
4 440±15 ND 100 100 ND 63.3 ND 60 23.3 175 x 103
5 80±15 100 100 90 ND 40 68 x 103
6 79±21 ND 100 100 ND 28.8 ND 11.11 71 x 103
7 114±8 ND 100 100 ND 33.3 81 x 103
8 318±25 ND 100 100 ND ND 20 96 x103
17 1 100±7 ND 100 100 ND 76.6 ND 26.6 145 x 103
18 1 114±8 ND 100 100 ND 50 100 x 103
35
ND= No determinado. CL50 = Concentración letal media (UFC/mL). UFC= Unidades formadoras de colonias.
19 1 100±7 ND 100 100 ND 73.3 ND 56.6 227 x 103
20 1 174±6 ND 100 100 ND 76.6 162 x 103
25 1 187±9 ND 100 100 ND 100 ND ND 100 ND
28 1 200±29 100 100 100 ND 100 ND
29 1 174±6 ND 100 100 ND 83.3 198 x 103
32 1 114±8 ND 100 100 ND 100 ND
33 1 200±29 100 100 100 ND 100 ND
2 187±9 ND 100 100 ND 100 ND ND 100 ND
34 1 187±9 ND 100 100 ND 100 ND ND 100 ND
35 1 187±9 ND 100 100 ND 100 ND ND 100 ND
36
Efecto del ajo y Bacillus licheniformis BCR 4-3, adicionados en el 7.13.
alimento, en la supervivencia, crecimiento y sistema inmune del camarón
blanco retado con V. parahaemolyticus
7.13.1. Bioensayo 1: Supervivencia y crecimiento
La mayor supervivencia se obtuvo en el tratamiento IV y el control I donde no
hubo diferencia significativa (93.3%) en comparación con los tratamientos II (36.6%, III
(20%) y V (30%) donde sí la hubo.
Fig. 4. Supervivencia de L. vannamei alimentado con ajo y B. licheniformis BCR
4-3 e infectado con V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control (camaronina); II)
Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis
BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50; V) ajo (10 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50.
Promedio±EE.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I II III IV V
Su
pe
rviv
en
cia
(%
)
Tratamientos
b b
a
a
a
37
No se observaron diferencias significativas en la TCE entre los tratamientos (Fig.
5).
Fig. 5. Tasa de crecimiento específico de L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado con V. parahaemolyticus Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
I II III IV V
TCE
(%/d
)
38
7.13.2. Expresión de genes del sistema inmune
Las expresiones del gen LvToll fueron de 2.97±0.28, 1.72±0.21, 0.46±0.22,
1.45±0.24 y 0.48±0.11 para el control I, control II, tratamientos III, IV y V
respectivamente. La expresión relativa del gen LvToll en L. vannamei mostró
diferencias significativas entre los tratamientos II (p<0.05), III, IV y V respecto al Control.
Hubo diferencias significativas entre los tratamientos II y IV respecto al III y V (Fig. 6).
Fig. 6. Expresión relativa del gen LvToll en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
I II III IV V
Exp
resi
ón
de
l ge
n L
vTo
ll
c
b
a a
a
39
La expresión génica fue de 3.16±0.14, 2.35±0.27, 2.12±0.58, 1.07±0.09 y
0.93±0.12 para el control I,II y los tratamientos III, IV y V, respectivamente. La expresión
relativa del gen proFO en L. vannamei mostró diferencias significativas entre el
tratamiento IV y V (p=0.00000) respecto a los tratamientos I, II Y III. Se observaron
diferencias significativas entre el tratamiento III y el control I (Fig. 7).
Fig. 7. Expresión relativa del gen proFO en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
I II III IV V
Exp
resi
ón
de
l gen
pro
FO
c
bc b
a a
Tratamientos
40
Para los tratamientos I, II, III y IV la expresión del gen fue de 2.20±0.13,
1.82±0.31, 1.01±0.33 y 1.25±0.28, respectivamente; mientras que el tratamiento V
presentó la menor expresión con 0.97±0.14. La expresión relativa del gen SOD en L.
vannamei mostró diferencias significativas entre el tratamiento V (p=0.004) y el (control
I) (Fig. 8).
Fig. 8. Expresión relativa de gen SOD en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
I II III IV V
Exp
resi
ón
de
l gen
SO
D
Tratamientos
b
ab
a ab
a
41
Para los tratamientos I y III, la expresión del gen fue de 2.40±0.14 y 1.77±0.44,
mientras que para los tratamientos II, IV y V fue de 1.56±0.10, 1.02±0.25 y 1.06±0.09,
respectivamente. La expresión relativa de TGasa en L. vannamei mostró diferencias
significativas entre los tratamientos IV (p=<0.05) y V respecto al control I y entre los
tratamientos IV y V respecto al tratamiento III (Fig. 9).
Fig. 9. Expresión relativa del gen TGasa en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
I II III IV V
Exp
resi
ón
del
gen
TG
asa
Tratamientos
c
ab
bc
a a
42
Para el tratamiento control la expresión del gen fue de 0.41±0.03, mientras que
para los tratamientos II, III, IV y V fue de 0.62±0.09, 0.1.42±0.34, 1.29±0.10 y 1.28±0.7,
respectivamente. La expresión relativa del gen lisozima en L. vannamei mostró
diferencias significativas entre los tratamientos III, IV y V (p=0.005) respecto al control I
pero no mostraron diferencias con el control II (Fig. 10).
Fig. 10. Expresión relativa del gen LIS en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
I II III IV V
Exp
resi
ón
de
l ge
n L
IS
Tratamientos
ab
a
b
b
b
43
7.13.3. Expresión del gen de estrés Hsp70
La expresión en el tratamiento control fue de 1.82±0.21, mientras que para los
tratamientos II, III, IV y V fue de 0.90±0.15, 0.73±0.17, 1.30±0.21 y 0.82±0.14,
respectivamente. La expresión relativa de Hsp70 en L. vannamei mostró diferencias
significativas entre los tratamientos II (p=0.00004), III y V respecto al control I (Fig. 11).
Fig. 11. Expresión relativa del gen Hsp70 en L. vannamei alimentado con ajo y B.
licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
I II III IV V
Exp
resi
ón
Re
lati
va H
sP7
0 b
a a
ab
a
44
7.13.4. Expresión del gen de digestión Tripsina
La expresión en el tratamiento control fue de 1.36±0.16, mientras que para los
tratamientos II, III, IV y V fue de 0.66±0.08, 1.34±0.49, 1.11±0.57 y 1.25±0.21,
respectivamente. La expresión relativa del gen tripsina en L. vannamei no mostró
diferencias significativas entre tratamientos (p=0.59) (Fig. 12).
Fig. 12. Expresión relativa del gen tripsina en L. vannamei alimentado con ajo y
B. licheniformis BCR 4-3 e infectado V. parahaemolyticus. Tratamientos: I) Control
(camaronina); II) Control camaronina + Vibrio CL50; III) ajo (2 g/kg de alimento) +
Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento) + Vibrio CL50; IV) ajo (6 g/kg
de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de alimento + Vibrio CL50;
V) ajo (10 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50. Promedio±EE. Letras distintas indican diferencias significativas
(p<0.05).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
I II III IV V
Exp
resi
ón
de
l ge
n T
ipsi
na
Tratamientos
45
7.13.5. Bioensayo 2
La supervivencia en los tratamientos control fue de 100 %, en el II del 20 % y en
el III del 53.33 %(Fig. 13).
Fig. 13. Tratamientos: I) Control (camaronina); II) Control camaronina + Vibrio
CL50; III) Ajo (6 g/kg de alimento) + Bacillus licheniformis BCR 4-3 (1 x 106 UFC/g de
alimento) + Vibrio CL50.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
I II III
Sup
ervi
ven
cia
(%)
Tratamientos
a
b
c
46
8. Discusión
Aislamiento, caracterización y CL50 de cepas de V. parahaemolyticus
En las últimas dos décadas, el cultivo de camarón se ha visto afectado por
enfermedades virales y bacterianas que ocurren debido a agua contaminada o por
canibalismo de camarones enfermos. Dentro de las enfermedades bacterianas
destacan las provocadas por Vibrio alginolyticus y V. parahaemolyticus (Supamataya y
Boonyaratpalin 1996; Lo et al., 2003; Rajasekar et al., 2011). En este estudio, se
detectaron 35 cepas de V. parahaemolyticus con potencial para causar AHPND en el
camarón blanco. La pre-selección e identificación se realizó mediante PCR con primers
AP3 (Sirikharin et al., 2014), 89F/R (Nunan et al., 2014), y para genes de hemolisina (tl,
tdh y trh) (Bej et al., 1999). Los 35 aislados fueron positivos utilizando los primers AP3.
Los aislados 1, 8, y 33 resultaron negativos con los primers 89F/R. Estos resultados
concuerdan con los de Soto-Rodríguez et al. (2014) quienes encontraron una cepa
(M0604) que dio un falso positivo con los primers AP3. Ellos mencionan que los primers
AP3 tienen un valor predictivo positivo del 90 %. La identificación bacteriana se
confirmó con el gen que codifica para la hemolisina termolábil (tl) que es específica para
V. parahaemolyticus (Bej et al., 1999; Gutierrez-West et al., 2013). Los 35 aislados
fueron positivos para tl y negativo para los genes tdh y trh que son tóxicos en humanos.
La hemolisina tl de V. parahaemolyticus no causa lisis en los eritrocitos de vertebrados
(Bej et al., 1999) como ocurre con las hemolisinas tdh y trh de la misma especie que se
consideran factores de virulencia en humanos (Shirai et al., 1990) y animales (Zhang y
Austin. 2005). Debido a lo anterior, se concluye que todas las cepas pertenecen a V.
parahaemolyticus, pero las cepas 1, 8 y 33 no son cepas causantes AHPND.
Se seleccionaron los aislados con potencial como patógenos de acuerdo con
Soto-Rodríguez et al. (2015) y Joshi et al. (2014) que mencionan que las cepas que
causan AHPND pueden diferir entre ellos en la intensidad de virulencia. La actividad
hemolítica es uno de los factores de virulencia más importantes de vibrios patógenos
(V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. anguillarum y V. mimicus) (Zhang et
al., 2005) como se mencionó anteriormente. La hemólisis puede ser consecuencia de la
actividad enzimática demostrada por algunas especies de bacterias, incluyendo la
fosfolipasa C y D o por la formación de poros (tdh) en la membrana citoplasmática de
47
los eritrocitos (Lida y Honda, 1997; Parker y Feil, 2005). En este estudio, todas las
cepas mostraron α-hemólisis (hemólisis incompleta) que concuerdan con los obtenidos
con el análisis genético ya que los genes tdh y trh [relacionadas con β-hemólisis] no
fueron encontrados. Michael et al. (1988) reportaron que mientras que la actividad
hemolítica se considera una de las características de las bacterias patógenas, no
siempre es suficiente para determinar la patogenicidad. Cepas hemolíticas y no
hemolíticas de Streptococcus son importantes patógenos humanos y Mahoney et al.
(2010) reportaron que los aislados de V. parahaemolyticus que carecen de tdh y/o trh
producen otros factores de virulencia putativos como proteasas extracelulares,
biopelículas y sideróforos. Las cepas que causan el AHPND no son patógenas para los
seres humanos como se demuestra por la ausencia de hemolisina tdh y trh. Por otro
lado, se han identificado dos proteínas en el sobrenadante de un cultivo patógeno de V.
parahaemolyticus (AHPND) de Asia (Sirikharin et al., 2014) y en su genoma en América
(Gómez-Gil et al., 2014), que tienen una alta homología con endotoxinas delta (PIrA y
PirB) de la bacteria Photorhabdus luminescens que son activas contra insectos
(Waterfield et al., 2014). Los sistemas de secreción tipo III (T3SS1) y VI (T6SS1 y
T6SS2) se han encontrado en V. parahaemolyticus, que causa AHPND (Kongrueng et
al., 2014) ya que el sistema T3SS es una estructura que permite en bacterias Gram
negativas la secreción y la inyección de proteínas efectoras bacterianas en el
citoplasma de las células eucariotas. El sistema T6SS es común en bacterias Gram
negativas y se asocia con la adhesión, la citotoxicidad, la invasión y crecimiento
intracelular o la supervivencia y persistencia en la célula (Casales, 2008).
Además de los mecanismos de patogenicidad antes mencionados, se necesitan
otras pruebas. En este trabajo, los aislados mostraron una naturaleza hidrofílica o
hidrofóbica, autoagregación, formación de biopelículas y actividad enzimática
extracelular. La capacidad de Vibrio spp. para formar biopelículas es un mecanismo de
supervivencia, patogenicidad y tolerancia al estrés (Yildiz y Visick, 2009). Las
biopelículas son comunidades microbianas complejas unidas a superficies vivas y no
vivas y embebidas en una matriz de material extracelular (polímeros) producidos por
ellas (Hall-Stoodley et al., 2004; Huq et al., 2008). Algunas propiedades de las células
bacterianas como el incremento de la hidrofobicidad y la capacidad de coagregación y
48
autoagregación son importantes para la colonización y la formación de biopelículas
(Decostere et al., 1999; Rickard et al., 2004). Autores como Yuehuei y Friedman (2000)
y Rickard et al. (2004) mencionan que las propiedades de la superficie celular, los
compuestos secretados por los microorganismos, la hidrodinámica del medio ambiente
acuático, la rugosidad superficial, la disponibilidad de nutrientes y las diferencias en la
velocidad de colonización afectan la formación de biopelículas. Además, las bacterias
que se encuentran en las biopelículas pueden ser hasta 1000 veces menos
susceptibles a la mayoría de los antibióticos y biocidas (Mah et al., 2003). Por lo tanto,
no se recomienda el uso de antibióticos contra V. parahaemolyticus para evitar la
formación de cepas resistentes. La actividad lipolítica extracelular de los aislados fue
negativa. Estos resultados coinciden con los reportados por Meyers et al. (1996)
quienes encontraron resultados negativos respecto a la actividad lipolítica de bacterias
ácido lácticas. En cuanto a la actividad proteolítica, solamente los aislados 11 y 12
fueron positivos. Algunos autores afirman que el exceso de producción de estas
enzimas es un factor de virulencia, ya que las cepas patógenas tienen actividad
proteolítica, lipolítica y hemolítica alta (Quesada-Herrera et al., 2004). Sin embargo, el
papel de la actividad enzimática extracelular como factor de virulencia no está claro ya
que la mayoría de los aislados estudiados en los bioensayos con camarones son
patógenas.
De acuerdo con estudios anteriores, de las 35 cepas, se seleccionaron 19 para
ser probadas en las infecciones de camarón blanco en función de su actividad
hemolítica, hidrofobicidad, autoagregación y la capacidad de formar biopelículas. Once
aislados fueron patogénos para el camarón blanco y ocho no lo fueron, por lo menos a
las concentraciones ensayadas. Los signos clínicos observados incluyen estómago e
intestino vacíos, letargia y hepatopáncreas atrofiado y pálido o blanco (Tran et al.,
2013). Entre los aislados patogénos, el 1 y el 8 no pertenecían a cepas causantes de
AHPND. Por lo tanto, se necesita más investigación para aclarar las diferencias
encontradas en la virulencia entre las cepas patógenas. En cuanto a las diferencias en
la virulencia, parece que la cepa 16 es la más virulenta de acuerdo con la CL50. La cepa
mencionada mostró α-hemólisis, una formación de biopelículas e hidrofobicidad altas y
una capacidad alta de autoagregación. Los resultados de la virulencia coinciden con los
49
reportados por Soto-Rodríguez et al. (2015) y Joshi et al. (2015), quienes encontraron
que las cepas que causan AHPND pueden diferir en la virulencia. La mortalidad
causada por la cepa 16 en los desafíos de inmersión comenzó en los tratamientos con
1 × 104 UFC/mL (5-72 h) en los camarones más pequeños (30 a 200 mg) como ha sido
reportado por Soto-Rodríguez et al. (2015) y Joshi et al. (2015). En camarones más
grandes (318, 440 y 520 mg) se necesitó una mayor concentración de UFC/mL de la
cepa 16 para para matar el 50% de camarones (CL50). Los resultados muestran que los
camarones más pequeños son menos resistentes a V. parahaemolyticus porque se
requiere un menor número de bacterias por mililitro de agua para matar el 50% de los
camarones (CL50).
Todas las cepas pertenecen a V. parahaemolyticus, pero las cepas 1, 8, y 33 no
son cepas causantes de AHPND. Estas diferencias en su patogenicidad y virulencia se
debieron quizás a la hemólisis alfa y a las diferencias en la formación de biopelículas e
hidrofobicidad por lo que se necesita más investigación para esclarecer estos
resultados sobre los factores de virulencia. Una vía es el uso de endotoxinas delta y/o
sistemas de secreción tipo III y VI para definir claramente porque los camarones más
pequeños son menos resistentes a la infección por AHPND.
Ajo y bacilos adicionados en el alimento contra el AHPND en camarón
blanco
Las plantas medicinales contienen una gran variedad de sustancias químicas con
propiedades terapéuticas y pueden ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades en
animales, como las causadas por patógenos de género Vibrio (Ramesh et al., 2014).
Por tal motivo, en este trabajo se usó el ajo, el cual tiene propiedades antimicrobianas y
además inmunoestimula a los organismos (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). Por otro lado,
se sabe que los probióticos, como Bacillus sp., aumentan la supervivencia, el
crecimiento, la capacidad inmune y la resistencia a enfermedades en camarones
cultivados (Farzanfar, 2006; Decamp et al., 2008).
En este trabajo se observó que la supervivencia de los camarones alimentados
con ajo y probióticos fue significativamente mayor que en los camarones cultivados con
alimento sin aditivos al ser retados con V. parahaemolyticus IPNGS16 (López-León et
50
al., datos no publicados). Los resultados son similares a los reportados por Flores-
Miranda et al. (2011) para la misma especie de camarón pero retado con cepas de
Vibrio sinaloensis y alimentado con inmunoestimulantes microbianos (bacterias ácido
lácticas y levaduras). De la misma manera, Vieira et al. (2010) encontraron que L.
vannamei resiste más la infección causada por V. harveyi cuando es alimentado con
Lactobacillus plantarum. Además, se observó que el crecimiento no fue afectado por los
aditivos. Los resultados de supervivencia y crecimiento coinciden con los reportados por
Medina-Beltrán et al. (2012) y Peraza-Gómez et al. (2014) quienes probaron plantas e
inmunoestimulantes microbianos, adicionados en el alimento, en L. vannamei retado
con WSSV. Courvalin (2006) y Peraza-Gómez et al. (2014) mencionan que los aditivos
alimenticios no deben ser dañinos para el camarón blanco y afectar su desempeño
productivo y supervivencia. Lo anterior es importante ya que, las plantas tienen factores
antinutricionales que pueden afectar la ingestión del alimento y la utilización de
nutrientes (Soetan, 2008). Los resultados de supervivencia y crecimiento sugieren que
el ajo y el bacilo pueden ser utilizados para prevenir la enfermedad de la AHPND en
camarón blanco causada por cepas de V. parahaemolyticus.
En lo que respecta a la respuesta inmune, L. vannamei fue la especie de
camarón en la que se identificó el primer receptor Toll (LvToll1) (Yang et al., 2008). Los
receptores Toll son proteínas transmembranales altamente conservadas que se
encuentran en las células del sistema inmune y reconocen patrones moleculares
asociados a patógenos (PMAP), los cuales son secuencias cortas conservadas de
aminoácidos que son únicos de microorganismos y son esenciales para su metabolismo
y su supervivencia, como por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS), peptidoglucanos,
betaglucanos, flagelinas, entre otros (Akira y Hemmi, 2003). LvToll es un importante
factor en la respuesta inmune de L. vannamei contra la infección de Vibrio harveyi pero
no contra WSSV (Wang et al., 2010). ). En este trabajo se observó una regulación de la
respuesta inmune ya que se observó una expresión significativamente menor del ARNm
del receptor en los tratamientos con vibrio y aditivos respecto al grupo control. Los
resultados contrastan con lo reportado por Wang et al. (2010), ya que encontraron una
expresión siginificativamente mayor del ARNm en camarones infectados con V. harveyi
a las 24 h, respecto al control. Las diferencias pueden deberse a la utilización de
51
metodologías diferentes ya que en este trabajo el estudio se hizo al final del bioensayo
de 43 días y además la infección con V. parahaemolyticus se hizo por inmersión. En el
estudio mencionado la infección con V. harveyi se hizo por inyección y se realizó una
serie de tiempo (0, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36 y 48 h). Es posible que en un estudio
relativamente largo (43 días), el contacto continuo de los camarones supervivientes con
V. parahaemolyticus haya causado inmunosupresión y no responda de la misma
manera como lo hace en los primeros días. Sajeevan et al. (2009) y Flores-Miranda et
al. (2011) mencionan que el uso continuo de inmunoestimulantes en Fenneropenaeus
indicus y L. vannamei, respectivamente, puede suprimir la respuesta inmune. Por
último, no se observó un efecto claro de los aditivos en la expresión del gen Toll, al
menos en las condiciones del bioensayo, aunque al parecer los aditivos contribuyen a la
inmunosupresión observada.
El sistema profenoloxidasa es un efector clave de la respuesta inmune de
camarones por la presencia de patógenos y sus componentes celulares
(lipopolisacáridos, beta glucanos y peptidoglucanos), dando como resultado la
producción de melanina (Sritunyalucksana y Söderhäll, 2000). La melanina se une a la
superficie de la bacteria e incrementa la adhesión de los hemocitos a la bacteria lo cual
contribuye a la formación de un nódulo y su posterior remoción (Cerenius et al., 2008;
da Silva, 2002). Los productos del proceso de melanización, como las sustancias
derivadas de la quinona y los intermediarios del oxígeno y el nitrógeno, tienen efecto
antimicrobiano contra bacterias y hongos (Charoensapsri et al., 2014) pero no contra
WSSV (Jiravanichpaisal et al., 2006; Ai et al., 2008; Wang et al., 2010). En este trabajo
se observó una regulación de la respuesta inmune ya que se observó una tendencia a
disminuir en la expresión del ARNm de proFO en los tratamientos con vibrio y aditivos
respecto al grupo control y en algunos casos, como en los tratamientos IV y V con
mayor concentración de aditivos en el alimento, las diferencias fueron significativas
respecto a los tratamientos I, II y III. Los resultados contrastan con lo reportado por Gao
et al. (2009) en Fenneropenaeus chinensis y Yeh et al. (2009) en L. vannamei, ya que
ellos encontraron una expresión siginificativamente mayor del ARNm en camarones
infectados con Vibrio anguillarum y V. alginolyticus, respectivamente. Como en el caso
del gen LvToll, es importante mencionar que las diferencias pueden deberse a la
52
duración del bioensayo, el método de infección y al agotamiento del sistema inmune.
Por último, no se observó un efecto claro de los aditivos en la expresión del gen proFO,
bajo las condiciones de este bioensayo, aunque al parecer los aditivos contribuyen a la
inmunosupresión observada, por lo que deben hacerse trabajos por escala de tiempo.
Uno de los principales mecanismos de defensa antioxidante en los organismos
aeróbicos en respuesta a estrés oxidativo es el aumento de la enzima superóxido
dismutasa. La SOD cataliza el anión superóxido a peróxido de hidrógeno formando
parte esencial de la respuesta inmune en camarones (Wang et al., 2010). En este
trabajo se observó una regulación de la respuesta inmune ya que se vió una tendencia
a disminuir en la expresión del ARNm de SOD en los tratamientos con vibrio y aditivos
respecto al grupo control y en algunos casos, como en los tratamientos III y V con
menor y mayor concentración de aditivos en el alimento, las diferencias fueron
significativas respecto al grupo control. Estos resultados contrastan con lo reportado
por Wang et al. (2010) que encontraron una expresión significativamente mayor del
ARNm en camarones infectados con V. harveyi a las 36 h respecto al grupo control. Es
posible que al igual que los genes Toll y proFO las diferencias pueden deberse a la
duración del bioensayo, el método de infección y al agotamiento del sistema inmune
(Sajeevan et al., 2009) y Flores-Miranda et al., 2011). Por último, no se observó un
efecto claro de los aditivos en la expresión del gen SOD, al menos en las condiciones
del bioensayo, aunque al parecer los aditivos contribuyen a la inmunosupresión
observada en los tratamientos III y V.
La TGasa se encuentra en el interior de las células hialinas del camarón y se
libera al plasma por daño tisular o como una repuesta inmediata de los hemocitos ante
la presencia de LPS y β-1,3-glucanos (Martín et al., 1991; Yeh et al., 1998; Montaño-
Pérez et al., 1999), es considerada un mecanismo de defensa, ya que previene la
diseminación de los patógenos por la cavidad corporal del animal (Barracco et al.,
2008). Además, la TGasa regula la expresión de otros genes del sistema inmune como
la crustina y la lisozima (Fagutao et al., 2009). En este trabajo, se observó un aumento
en la expresión de este gen en el tratamiento III (2 g de ajo/kg de alimento) respecto al
IV y V; sin embargo, la expresión fue igual que el control 1. Esto sugiere que la
concentración del ajo afectó la expresión del gen, sobre todo en las concentraciones de
53
6 y 10 g/Kg de alimento ya que los resultados no concuerdan con lo reportado por
Wang et al. (2010) quienes midieron la expresión génica de la TGasa en L. vannamei
retados contra V. harveyi, obteniendo como resultado una mayor expresión del gen. Los
autores concluyen que la TGasa juega un papel muy importante en la respuesta inmune
del camarón durante las infecciones con vibrios.
La lisozima destruye la pared celular de bacterias y es una enzima bactericida
contra bacterias Gram(+) y Gram(-) como V. alginolyticus (Fagutao et al., 2009). En este
trabajo se obtuvo un aumento en la actividad de la lisozima en los tratamientos con
aditivos 2, 6 Y 10 g de ajo/kg de alimento. Los resultados concuerdan con los obtenidos
por Talpur et al. (2012) quienes observaron un aumento en la actividad de la lisozima
en peces adicionando ajo en la dieta, incluso después de ser infectado con V. harveyi.
Al parecer el ajo funciona como inmunoestimulante en el alimento ya que la
concentración del bacilo fue fija y no parece contribuir a la mayor expresión del gen al
igual que el vibrio.
Las proteínas de choque térmico son conservadas y son bien conocidas por su
rápida respuesta al estrés ambiental (Qian et al., 2012). Son proteínas constitutivas e
inducibles por estrés y juegan roles esenciales en el metabolismo de proteínas bajo
condiciones normales y de estrés (Randford y Henderson, 2002; Multhoff, 2007).
Algunos autores como Zhou et al. (2010) encontraron un aumento en este tipo de
proteínas en L. vannamei retado con Staphylococcus aureus y Vibrio alginolyticus, los
autores mencionan que la transcripción de la hsp60 y hsp70 aumentó
significativamente, lo cual supone su papel en la respuesta inmune del camarón blanco
ante infecciones bacterianas; sin embargo, concluyen que la expresión se da como una
respuesta temprana a la infección lo cual no concuerda con nuestro trabajo donde la
expresión se midió al final del experimento. Por lo tanto, si se analiza su rol como
proteínas de estrés, se puede decir que los camarones de los tratamientos con aditivos
y Vibrio estaban menos estresados que el control I, con excepción del IV, cuya
expresión fue igual que el control I y los tratamientos II, III, y V. La menor expresión del
ARNm de la hsp70 en los tratamientos II, III y V pudo deberse a la menor densidad
respecto al control I y al tratamiento IV ya que en estos tratamientos la supervivencia
fue mayor.
54
En la glándula digestiva de L. vannamei las principales enzimas que son
sintetizadas son la tripsina y quimotripsina (Muhlia-Almazan y García Carreño, 2002) y
son proteinasas encargadas de hidrolizar las proteínas de la dieta del organismo. En el
presente trabajo se midió la expresión de la tripsina al final del experimento no
encontrando diferencias significativas entre el tratamiento control, alimentado con
alimento comercial, y los tratamientos adicionados con ajo y B. licheniformis BCR 4-3, lo
que indica que los aditivos no alteraron el sistema digestivo de los camarones al ser
incorporados a la dieta comercial. Sin embargo, en el tratamiento II infectado con el
Vibrio, la expresión del gen tripsina fue significativamente menor que el control, lo que
indica que posiblemente V. parahaemolyticus afectó la capacidad digestiva del camarón
blanco.
55
9. Conclusiones
Las 35 cepas caracterizadas pertenecen a V. parahaemolyticus, 32 pertenecen a
las cepas causantes de AHPND y tres no (1, 8 y 33).
Existen diferencias en la patogenicidad y virulencia entre las cepas que causan
AHPND.
Las cepas de V. parahaemolyticus con formación de biopelículas (moderada a
fuerte) e hidrofobicidad (moderada a fuerte) son patógenas para las postlarvas y
juveniles de L. vanammei.
La cepa 16 es la más virulentapara las postlarvas y juveniles de L. vanammei.
Los camarones más pequeños son menos resistentes a la infección con V.
parahaemolyticus en bioensayos de reto por inmersión.
La incorporación del ajo y B. licheniformis BCR 4-3 en la dieta protege al
camarón blanco de la enfermedad de la mortalidad temprana y no afectan su
crecimiento.
El ajo y B. licheniformis BCR 4-3, adicionados en el alimento, modulan la
expresión de los genes relacionados con el sistema inmune (LvToll, proFO, SOD,
TGasa y LIS) y digestión (tripsina).
La expresión del ARNm del gen hsp70 fue modulada por la densidad de
camarones en los sistemas de cultivo.
56
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