sin título de diapositiva - unr

Inhibidores enzimáticos

Descubrimiento de Drogas

Compuesto Líder:

Prototipo a mejorar.

Tienen características indeseadas: Toxicidad, insolubilidad, inestabilidad, pobre

absorción oral, etc.

Cómo se llega a ese Compuesto Líder?

Ensayos

“in vivo” ej: ensayo directo en ratones

“in vitro” ej: inhibición de una enzima


Descubrimiento de Compuesto Líder

1.- Screening al azar (Random screening)

Screening

al azarcompuestos síntéticos

Productos naturales

Ej: muestras tomadas del suelo llevaron al descubrimiento de

antibióticos como streptomicina y tetraciclinas.



2.- Screening racional

Menos indiscriminado. Ej: compuestos de estructura parecida a otro

compuesto muy débilmente activo, compuestos con diferentes grupos

funcionales, evitando grupos que produzcan toxicidad.

3.- Estudio del metabolismo de las drogas conocidas

Metabolitos de drogas son los productos de degradación de las drogas

“in vivo”.

Se estudia si éstos o la droga en sí misma es la causante de la

actividad



4.- Observaciones clínicas

Drogas para una enfermedad pueden ser finalmente útiles para otra a

partir de los efectos secundarios.

Ej:

Primero antihistamínico, ahora se utiliza para

prevenir mareos

Primero antibacteriano, ahora antidiabético



5.- Diseño racional

Primero se deben conocer las causas bioquímicas de la enfermedad

Reconocido el sistema bioquímico interviniente, el diseño racional tomará el

sustrato natural de la enzima o el agonista del receptor como primer compuesto

líder.

• Invasión organismo externo (inhibidores o

interferencia en la biosíntesis)

• Crecimiento desproporcionado de células

(objetivo: ADN)

• Desbalance de un determinado compuestos químico

(corregido por un inhibidor o antagonista)



5.- Diseño racional

Ej:

progesterona 17b-estradiol

La hormonas esteroidales progesterona y 17b-estradiol fueron

compuestos líderes hacia el descubrimiento de los contraconceptivos

norgestrel y 17a-etinilestradiol

norgestrel

17a-etinilestradiol

http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Progesterone.png

http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Progesterone.png

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Ethinylestradiol-2D-skeletal.png

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Ethinylestradiol-2D-skeletal.png


6.- Diseño de fármacos asistido por computadora

Screening virtual basado en el ligando


6.- Diseño de fármacos asistido por computadora

“Docking”


7.- Química Combinatoria


Resistencia a los fármacos

Mecanismos de resistencia:

1.- Evitar la llegada de la droga al sitio de acción

Ej: cambio en la carga de la membrana plasmática

Sinergismo de fármacos

Antes de entrar de lleno a tratar el tema de los inhibidores enzimáticos

debemos detenernos a analizar dos puntos de importancia en cuanto al

diseño y acción de fármacos son:




2.- Sobreproducción de la enzima

Resistencia causada por alteración de la

dihidrofolato reductasa (el sustrato se sigue

uniendo…)

La droga induce copias extras del gen que codifica la enzima

3.- Alteración de la enzima o sitio de acción

Efecto: unión más debil enzima-inhibidor

Ej: antibacteriano trimetoprima

Ej: dihidrofolato reductasa

trimetoprima

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Trimethoprim.svg

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Trimethoprim.svg



4.- Producción de una enzima destructora de la droga

Las b-lactamasas destruyen los compuestos b-lactámicos y evitan su acción

Ej: b-lactamasas



5.- Supresión de la enzima que activa la prodroga

Especialmente en el caso de antitumorales….

Resistencia a la 6-mercaptopurina, droga contra la leucemia, por supresión de

la enzima que lo activa (hipoxantina fosforibosil transferasa)

Prodroga:

Compuesto farmacológicamente inactivo

que se activa por transformación

metabólica en el organismo



6.- Superproducción del sustrato de la enzima

Es una forma común de resistencia a las sulfas.

Las bacterias aumentan la producción del ácido p-aminobenzoico, que es el

sustrato de la dihidropterato sintetasa.

7.- Nuevo camino para la obtención del producto que cataliza la enzima

objetivo

El organismo sintetiza el metabolito por un camino alternativo…..

Inhibidor reversible, por lo tanto varía el equilibrio enzima-inhibidor


Sinergismo:

Dos o más drogas suministradas en combinación producen un efecto mayor

que la suma de cada una usada individualmente

Ejemplos de sinergismo

Ej: Acido clavulánico y amoxicilina

1.- Inhibición de la enzima que destruye la droga:

El sinergismo es una herramienta frente a los problemas de resistencia…


Sinergismo:

Inhibición de más de un paso del camino metabólico.

Se usa con inhibidores reversibles. Se evita el uso de gran exceso de droga que

podría ser tóxico (disminuye las posibilidades de resistencia)

2.- Bloqueo secuencial

Cuando hay más de una ruta metabólica para un mismo metabolito

3.- Inhibición de enzimas de diferentes caminos metabólicos

Para células tumorales o bacterias mutantes.

En promedio 1 de cada 107 bacterias resisten una droga,

1 de cada 1014 resisten dos drogas y

1 de cada 1021 resisten tres drogas…

4.- Varias drogas para el mismo objetivo

Minimiza la posibilidad que bacterias mutantes resistentes proliferen…..


Sinergismo:

Para células tumorales o bacterias mutantes.

En promedio 1 de cada 107 bacterias resisten una droga,

1 de cada 1014 resisten dos drogas y

1 de cada 1021 resisten tres drogas…

4.- Varias drogas para el mismo objetivo

Minimiza la posibilidad que bacterias mutantes resistentes proliferen…..

Antituberculoso

Inhibición Enzimática

Porqué inhibir una enzima?

Los inhibidores enzimáticos son los más prometedores en cuanto al

diseño racional de drogas se refiere:

• Enzimas fáciles de purificar (más fáciles que los receptores)

• Generalmente la estructura del inhibidor similar al sustrato

• Conocimiento del mecanismo de acción de enzimas puede

usarse para diseñar distintos tipos de inhibidores

Inhibidor ideal: es aquel que sólo inhibe la enzima requerida.

En la realidad no existe el inhibidor ideal, se buscan inhibidores de alta selectividad

Alta selectividad → enfermedades infecciosas (diferentes metabolismos del

organismo extraño y el hospedador). Ej: penicilinas

Baja selectividad → células tumorales (diferenciación difícil)


Clasificación de inhibidores

Existen varias clasificaciones según qué se toma en cuenta.

Generalmente los límites entre las diferentes clases de inhibidores no son muy

claros

1.- Reversibilidad

Reversibilidad

Irreversibles (generalmente covalentes)

Reversibles (generalmente no covalentes)



2.- De acuerdo a la competitividad (reversibles)

No competitivos: Cuando el inhibidor induce cambios

conformacionales en la enzima que hacen que ésta no

se pueda unir correctamente al sustrato

Competitivos: compiten con el sustrato por el sitio activo

No se puede diseñar un inhibidor no competitivo….



3.- Fuerza y velocidad de la interacción (reversibles)

1.-Clásicos (unión rápida)

2.- Unión fuerte

3.- Unión lenta

4.- Unión lenta y fuerte

4.- Por analogías (reversibles)

Análogos del estado de transición

Análogos del multisustrato



5.- Clasificación de inhibidores irreversibles

Marcadores de afinidad (compuestos de afinidad marcada)

Basados en el mecanismo


Inhibidores reversibles competitivos

Los más comunes. Compiten con el sustrato por el sitio activo

El equilibrio depende de la [E], [S] y [I], como [E] es constante y baja, depende

de [S] y [I].

[I] alta: equilibrio hacia

[I] baja: equilibrio hacia

Efecto farmacológico: [I] alta (saturación del sitio activo).

Requiere administración repetida


Inhibidores reversibles competitivos

El diseño de un inhibidor es típicamente de un inhibidor reversible competitivo,

tomando como compuesto líder al sustrato natural de la enzima.

Si se conoce la estructura tridimensional de la enzima (cristalografía de rayos

X), la propia enzima se puede tomar como el “líder”, utilizando el diseño de

fármacos asistido por computadora


Inhibidores reversibles competitivos. Ejemplos

Drogas antihipercolesterolémicas:

● Inhibidores de la absorción de colesterol adquirido en la dieta.

● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol

(Compactina y Mevinolina)

Colesterol Aterosclerosis colesterol




El paso determinante de la biosíntesis del colesterol es la conversión de la 3-hidroxi-3-

metilglutaril coenzima A (HMG-CoA, 5.68) en ácido mevalónico (5.69). Esta reacción es

catalizada por la HMG-CoA reductasa

colesterol


Ki (Compactina) = 1.4 x 10-9 M

Ki (Mevinolina) = 6.4 x 10-10 M

Km (sustrato) = 10-5 M



En 1976 en Japón se descubrieron, luego de analizar compuestos obtenidos de 8000

cepas de microorganismos (screening al azar), dos inhibidores de la HMG-CoA

reductasa: la Compactina (5.18) y luego otro más activo mevinolina (o lovastatina)

(5.19)

Mecanismo de acción:

Potentes inhibidores reversibles competitivos:

Km= cte. disociación del

complejo enzima-sustrato

Afinidad 7000 a 16000 veces

mayor que el sustrato


● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol (Compactina y Mevinolina)

El inhibidor real es 5.20 (producto de la

hidrólisis de 5.18 o 5.19)

Esta gran afinidad tiene que ver con la similitud entre

etapas del proceso biosíntético y el inhibidor 5.20

(comparar con 5.70)



La forma activa 5.20 se asemeja al

intermediario 5.70 por lo que algunos

autores clasifican a estos inhibidores como

análogos del estado de transición

La forma activa de la compactina tiene

DOS sitios de unión:

●Parte superior: se une al dominio HMG

(hidroximetil glutaril)

●Parte inferior (decalina): se une a un

bolsillo hidrofóbico de la enzima.

Scheme 5.4



MODIFICACIONES ESTRUCTURALES (SAR)

Debe abrirse la lactona, formarse el carboxilato y el OH

debe tener configuración eritro

Puente lactona-decalina no mayor de dos carbonos

Modificación de decalina baja la potencia (salvo bifenilos

análogos)

SH o NH2 dan menor potencia que OH

Agregado de metilo alfa al éster aumenta la potencia

(compuesto comercial)

Epímero en C-5 es inactivo

C-5 ceto es activo (reducción a compactina por la

enzima)


● Inhibidores reversibles competitivos. ANTIHIPERTENSIVOS

Sistema Renina-Angiotensina

Captopril, Enalapril, Lisinopril (inhibidores de la enzima ACE)

B. Houssay


● Inhibidores reversibles competitivos. ANTIHIPERTENSIVOS

Captopril, Enalapril, Lisinopril

La angiotensina II es responsable del incremento de la presión arterial por diversos

mecanismos:

• Actúa como hormona, siendo un potente vasocontrictor

• Estimula la liberación de Aldosterona (retención de líquidos)

Además. la enzima ACE metaboliza un vasodilatador, la bradiquinina

Inhibidores de la ACE son

objetivos terapéuticas de mucha

importancia



Nueve péptidos aislados del veneno de víboras yarará (Brasil)

Estructura determinada por (M.A. Ondetti – Squibb)

Primer inhibidor de ACE comercial: nonapéptido llamado TEPRÓTIDO (problema:

mala absorción oral).

Descubrimiento del Líder:

Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro

Estudio (modificaciones y mecanismo)

•Tripéptidos N-acilados son sustratos de la enzima

•Aminoácidos preferidos: Prolina en posición C-terminal, Alanina en la penúltima posición,

aminoácido aromático en la antepenúltima

•Metaloenzima (cofactor Zn++)

Miguel A. Ondetti

(1930-2004)



Se decidió tomar el acido (R)-2-bencilsuccínico como modelo y la

prolina como aminoácido C-terminal

Sitio activo hipotético de la carboxipeptidasa AHipótesis del inhibidor que contienen todos

los productos



Se decidió tomar el acido (R)-2-bencilsuccínico como modelo y la

prolina como aminoácido C-terminal

En función de esto surgió los compuestos tipo

5.22 que demostraron ser inhibidores de la

enzima ACE, aunque débiles

Cambiando el carboxilato por un SH se

mejora grandemente la actividad (mejor coordinación con el Zn++)



De esta manera surge el CAPTOPRIL como el compuesto más activo de la serie, el

primer inhibidor de la ACE de administración oral

(suministrado con un diurético)

Efectos secundarios del captopril: pérdida del gusto y picazón

ENALAPRILAT tenía un IC50 veinte

veces menor que Captoril, sin embargo

no tenía buena absorción oral. Por ello

se desarrolló el ENALAPRIL


Estudio (modificaciones y mecanismo)

•Tripéptidos N-acilados son sustratos de la enzima

•Aminoácidos preferidos: Prolina en posición C-terminal,

Alanina en la penúltima posición, amiinoácido aromático

en la antepenúltima

•Metaloenzima (cofactor Zn++)


Lisinopril: nueva droga basada en el Enalapril.

Ventajas:

●No es un profármaco

●Alta vida media (administración una vez por día)


Inhibidores de unión lenta y fuerte

Inhibidores de unión lenta: el equilibrio E∙I es lento

Inhibidores de unión fuerte: la inhibición se produce a [I] y [E] comparables

(necesita poco inhibidor)

Inhibidores de unión lenta y fuerte: combinan ambas propiedades

Es una inhibición dependiente del tiempo: Cinética bastante similar a los inhibidores

irreversibles.

Análogos del estado de transición exhiben cinética de unión lenta y fuerte

Inhibidores análogos del estado de transición1959. Berhnard y Ogel teorizaron que un inhibidor que se pareciese al estado de transición de

la reacción E-S debería estar más fuertemente unido a la enzima que el propio sustrato.

Para diseñar inhibidores análogos del estado de transición es necesario conocer el

mecanismo de reacción de la enzima para saber cual es el estado de transición a imitar.

Muchas reacciones catalizadas por enzimas tienen estados de transición similares (Ej: serin-

proteasas), por lo tanto, un análogo del estado de transición de una enzima puede ser

modificado para obtener análogos de otra enzima del mismo tipo.

Biosíntesis de colesterol


Ejemplos de Inhibidores de unión lenta y fuerte - Análogos del estado de transición

Peptidil trifluormetil cetonas – Inhibidores de la HLE

Mecanismo de acción

de la enzima:

HLE: enzima liberada por el

sistema inmune en el

pulmón. Asiste defensas

antinflamatorias.

Degradación proteolítica de

microorganismos invasores y

tejido muerto.

Desbalance con inhibidores

naturales hace que la HLE

destruya proteínas

estructurales (colágeno,

fibronectina, elastina)

EFISEMA PULMONAR,

FIBROSIS QUÍSTICA,

ARTRITIS


Peptidil trifluormetil cetonas – Inhibidores de la HLE

Ejemplo de inhibidor

covalente reversible

imita estado de transición


Ejemplos de Inhibidores de unión lenta y fuerte - Análogos del estado de transición

Pentostatina (5.58)

Potente inhibidor análogo del estado de transición

Inhibe el enzima Adenosina deaminasa

2’-desoxiadenosina

2’-desoxiinosina



3.- Fuerza y velocidad de la interacción (reversibles)

1.-Clásicos (unión rápida)

2.- Unión fuerte

3.- Unión lenta

4.- Unión lenta y fuerte

4.- Por analogías (reversibles)

Análogos del estado de transición

Análogos del multisustrato


Análogos del Multisustrato

N-fosfonoacetil-L-aspartato (5.67, PALA)

Carbamil fosfato

El PALA se une a la enzima tres veces más fuerte de lo que se unen los dos sustratos en

conjunto

N-carbamil-L-aspartato


Inhibidores Irreversibles

Marcadores de afinidad

(o compuestos de afinidad marcada)

(compuestos reactivos)

Basados en el mecanismo

(compuestos no reactivos activados

por la misma enzima)

Inhibidores Irreversibles


Inhibidores Irreversibles - Marcadores de Afinidad

Kinact = constante de inactivación

KI = constante de formación del complejo E-I

Los marcadores de afinidad son compuestos que contienen un grupo químicamente reactivo

que reacciona con el sitio activo de la enzima dado un aducto irreversible. Luego de formarse

el complejo reversible E∙I, se produce la reacción con algún nucleófilo del sitio activo para

formar la unión covalente y estable con la enzima

Si el grado de disociación del complejo E∙I es relativamente rápido respecto a la formación

del enlace covalente (kinact), éste último paso es el determinante de la velocidad de reacción.

En estos casos, la cinética es dependiente del tiempo, tal como los inhibidores reversibles de

unión lenta y fuerte.

Problema de los agentes marcadores de afinidad:

Muy reactivos poca selectividad potencialmente tóxicos

Sin embargo HAY marcadores de afinidad NO TÓXICOS…..


Marcadores de Afinidad NO TÓXICOS (Ejemplos)

Antibióticos β-lactámicos

Inhibidores de transpeptidasa (cataliza el entrecruzamiento de cadenas

del peptidoglicano constituyente de la pared celular de las bacterias)


Marcadores de Afinidad NO TÓXICOS (Ejemplos)

Antibióticos β-lactámicos

Mecanismo acción transpeptidasa

Los antibióticos β-lactámicos actúan inhibiendo la última etapa de la biosíntesis de

la pared celular: el entrecruzamiento de las cadenas de peptidoglicano


Marcadores de Afinidad

NO TÓXICOS (Ejemplos)

Inhibición de transpeptidasas

por antibióticos β-lactámicos


Marcadores de Afinidad

NO TÓXICOS (Ejemplos)

Antibióticos β-lactámicos: Han sido consideradas drogas maravillosas, altamente

selectivas y sin problemas serios de toxicidad. En algún momento se consideró utilizarlas

como un complemento dietario…

Problema de los antibióticos β-lactámicos: La aparición de cepas resistentes lo que se

agrava con el uso intensivo de estos antibióticos…..


Inhibidores basados en el mecanismo (Irreversibles)

Un inhibidor (o inactivador) basado en el mecanismo es un compuesto inactivo que, al

unirse con el sitio activo de la enzima, se transforma en un producto altamente reactivo que,

en la mayoría de los casos, reacciona con la enzima para unirse covalentemente e

inactivarla.

Cinética: Tiene un paso adicional respecto a los marcadores de afinidad:

Tiene dos complejos E∙I, uno que lleva al compuesto reactivo y el segundo que produce la

unión covalente E-I.

Relación de partición: k3/k4 (relación producto liberado/inactivación)

Lo ideal (aunque casi nunca se logra) es: relación de partición 0 (no se

forman metabolitos potencialmente tóxicos)


Inhibidores basados en el mecanismo (Irreversibles)

Ventajas para el diseño de fármacos:

NO son reactivos de por sí● Baja toxicidad

● Pocos efectos secundarios

Estos inactivadores son muy buenos candidatos a fármacos. Por ejemplo: la Eflornitina

(antiprotozoario) se puede administrar en dosis de hasta 30g por día sin efectos

secundarios.

Sin embargo, no hay en la actualidad en el mercado fármacos diseñados racionalmente

para ser inhibidores basados en el mecanismo. Sólo luego de su descubrimiento por otro

método se determinó que se trataba de inhibidores basados en el mecanismo


Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos

Vigabatrin (anticonvulsivante)

Epilepsia: Toda enfermedad del sistema nervioso central caracterizada por convulsiones

● Idiopática: No se conoce la causa

● Sintomática: Debida a tumores, sílifis, esclerosis múltiple,

mal de Alzheimer, intoxicación con plomo, etc.

No se conoce el mecanismo que lleva a la epilepsia. Se cree que son muchos los

mecanismos involucrados. Se sabe de la importancia del ácido gama-amino butírico (GABA)

Epilepsia:

La concentración de GABA en el cerebro está regulada por dos enzimas: una lo sintetiza

(glutamato

decarboxilasa, GAD)

y otra lo degrada

(GABA amino

transferasa, GABA-AT)

Disminución del nivel de

GABA en el cerebroConvulsiones




Inhibidor de GABA amino transferasa, GABA-AT

Ácido 4-amino-5-hexenoico

Mecanismo de inactivación:




Ácido 4-amino-5-hexenoico

El Vigabatrin atraviesa la barrera hematoencefálica mientras que el GABA no.

El agregado de un grupo vinilo al GABA aumenta el carácter lipofílico de la molécula ya que

éste es un atractor de electrones, disminuye la basicidad del grupo amina y, por lo tanto, es

menor la contribución en el equilibrio de la forma iónica (zwitterion).



Inhibidores de β-lactamasas

Inactivación de penicilinas por β-lactamasas

Gran número de β-lactamasas descriptas, cada año se descubren nuevas:

La resistencia por β-lactamasas es un problema no resuelto:

•Heterogeneidad

•Descubrimiento de nuevas β-lactamasas

•Transferencia genética



Inhibidores de β-lactamasas

sin título de diapositiva - unr

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