seminología-2011-d-3-técnicas de criopreservación seminal

34 • Documentos de la SEQC - abril 2011

Técnicas de criopreservación seminal

Composición de la ComisiónM.C. Sánchez Pozo (presidenta), J.A. Castilla Alcalá, M.I. Jiménez García, I. Sánchez Prieto, I. García Cobaleda, J. de Montserrat Vallvé, J.M. Moreno Cebeira, M.G. Serrano Olmedo, M. Marcos García, M. Alemán, P. Pascual Usandizaga

ÍNDICE

1. Introducción2. Objeto y campo de aplicación3. Principios fundamentales de criobiología4. Técnicas de criopreservación de semen 4.1. Muestras 4.1.1. Semen fresco 4.1.2. Espermatozoides recuperados 4.1.3. Muestras testiculares/epididimarias 4.2. Material y equipamiento necesario 4.2.1. Medios de congelación 4.2.2. Material fungible y equipamiento 4.3. Métodos de congelación 4.4. Evaluación de la criopreservación5. Seguridad en el laboratorio de criopreservación 5.1. Riesgos físicos y químicos 5.2. Riesgo de contaminación cruzada 6. Consideraciones legales sobre la criopreservación seminal 6.1. Ambito de aplicación 6.2. Condiciones del varón 6.3. Destino de los gametos criopreservados 6.4. Medidas de seguridad exigibles y responsabilidad de

los centros 6.4.1. Medidas de seguridad 6.4.2. Documentación requerida7. Recomendaciones 8. Bibliografía

1. INTRODUCCIÓN

La criopreservación seminal consiste en la congelación y alma-cenamiento de espermatozoides con fines reproductivos.

Es una herramienta fundamental en reproducción asistida pues permite optimizar los tratamientos de esterilidad y preservar la fertilidad en pacientes que, potencialmente, pueden perderla.

Los espermatozoides humanos presentan bajo contenido en agua por su pequeño tamaño, matriz viscosa con alto contenido en pro-teínas y azúcares, y una estructura compartimentalizada.

Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComisión de Seminología y Técnicas de Reproducción AsistidaDocumento D. Fase 3. Versión 3.

Preparado por:M.I. Jiménez, M.G. Serrano y J.M. Moreno

El daño producido en el espermatozoide por la congelación y posterior descongelación tiene lugar a distintos niveles estructu-rales y/o funcionales, por lo que todavía no existe un método de criopreservación espermática universalmente aceptado que logre mejores tasas de criosupervivencia (1).

El proceso de congelación afecta sobre todo a la movilidad espermática, no existiendo parámetros espermáticos en el análisis inicial que nos permitan correlacionarlos positivamente con la supervivencia (2).

2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

La finalidad de este documento es aportar información sobre aspectos básicos del proceso de criopreservación seminal y propor-cionar al profesional del laboratorio clínico la información técnica y legal necesaria para instaurar el proceso de criopreservación seminal en su centro.

3. PRINCIPIOS FUNDAMENTALES DE CRIOBIOLOGÍA

El objetivo principal de la criopreservación de espermatozoides es mantener su viabilidad y funcionalidad a bajas temperaturas (-196ºC) durante largos periodos de tiempo frenando los procesos de envejecimiento y degeneración celular.

Las dificultades de la congelación derivan de los procesos de enfriamiento y calentamiento, y no de la permanencia a bajas tem-peraturas, puesto que a éstas no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo reacciones químicas.

Los movimientos de agua y de solutos a través de la membrana del espermatozoide vienen determinados por el tamaño celular (área de membrana disponible para intercambiar agua con el medio exterior) y su permeabilidad (a menor temperatura menor permeabilidad y mayor probabilidad de formación de hielo intracelular).

El parámetro crítico en cualquier protocolo de congelación de semen es la velocidad de enfriamiento (3):

• El descenso de la temperatura de 37ºC a 0ºC produce shock por frío y daño por enfriamiento: en esta fase se produce alteración de la bicapa lipídica con aumento de la permeabilidad de solutos a su través. Para minimizar los efectos nocivos del choque térmico es necesario utilizar agentes crioprotectores (CPA), fosfolípidos y una velocidad lenta de enfriamiento.

• El descenso de 0ºC a temperaturas inferiores a -132ºC origina formación de hielo: durante el descenso se produce salida de agua

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del medio intracelular al extracelular produciendo deshidratación del espermatozoide. La existencia de solutos en el agua disminuye el punto de congelación (punto crioscópico entre -5ºC y -10ºC), produciéndose la cristalización del agua a temperaturas menores a la del punto de congelación del agua pura (0ºC). Los cristales de hielo actúan como lanzas destruyendo los orgánulos y membranas celulares espermáticas.

Las células poseen una velocidad de enfriamiento óptima donde los daños producidos son mínimos: a velocidades de enfriamiento lentas se produce daño celular por deshidratación debida a la elevada concentración de solutos en el medio extra-celular mientras que a velocidades de enfriamiento elevadas el daño es producido por la formación de hielo intracelular. Esto hace que cada célula requiera un protocolo optimizado según sus propiedades biofísicas (4).

Durante la descongelación acaecen cambios osmóticos inversos a los de la congelación. Las velocidades de calentamiento lentas ocasionan cristalización, por lo que son necesarias velocidades de recalentamiento rápidas para minimizar los daños.

Los CPA son sustancias hidrosolubles de baja citotoxicidad que evitan o disminuyen la formación de cristales de hielo al bajar la temperatura mínima a la que una solución se encuentra en estado líquido (punto eutéctico).

Los efectos beneficiosos de los CPA se deben a (3):

• Dilución de la concentración de electrolitos en la solución, limitando su citotoxicidad.

• Disminución de la concentración de agua, evitando la formación de hielo intracelular.

• Aumento de la viscosidad: que disminuye la movilidad de las moléculas y la formación de cristales.

• Descenso del punto crioscópico de la solución: al añadir CPA se necesita una temperatura más baja para el cambio de fase disminuyendo el estrés osmótico que sufren las células.

Los principales efectos adversos de los CPA aparecen al ser utilizados a altas concentraciones:

• Toxicidad: los CPA son sustancias químicas que, en condicio-nes normales, no se encuentran en el interior de las células siendo sustancias tóxicas para ella. En general, la acción tóxica de los crioprotectores está disminuída debido a que a temperaturas tan bajas el metabolismo celular es muy lento.

• Estrés osmótico: la adición de CPA al medio aumenta su osmo-laridad. Los cambios en el volumen del espermatozoide (contracción e hinchazón) pueden causarle un daño irreversible.

4. TÉCNICAS DE CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN

En los protocolos de criopreservación debe tenerse en cuenta fundamentalmente:

• La utilización de medios que protejan al máximo los esperma-tozoides del daño que puedan causar las bajas temperaturas.

• La definición de etapas de enfriamiento estrictamente controladas en velocidad y duración.

• El uso de recipientes de almacenaje adecuados para que las muestras se mantengan en condiciones óptimas durante todo el periodo de conservación.

4.1 Muestras4.1.1. Semen fresco

La muestra de semen debe recogerse siguiendo las recomenda-ciones de la fase preanalítica previamente publicadas (5).

Pasados 30´ de la eyaculación, separar una alícuota para su valo-ración siguiendo las recomendaciones de la OMS (6).

4.1.2. Espermatozoides recuperadosPueden congelarse espermatozoides previamente seleccionados.

No hay un acuerdo generalizado acerca de la técnica que debe usarse para procesar este tipo de muestras o si este proceso previo a la congelación tiene algún efecto en la tasa de criosupervivencia (7).

4.1.3. Muestras testiculares/epididimariasSe congelan usando los protocolos estandarizados para semen.

Cuando se identifican espermatozoides maduros en la disección del tejido testicular o en el aspirado epididimario, estas muestras se tratan, del mismo modo que el semen, con el medio de congelación; pueden usarse, previamente a la adición del mismo, una solución tamponada de lisado de eritrocitos para lograr una recuperación de espermatozoides más eficiente (8).

4.2 Material y equipamiento necesarioTodo el material fungible empleado así como los medios de cultivo

y de congelación deben ser estériles y manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar; además deben estar testados para toxicidad espermática y tener certificación CE (9) (10).

4.2.1. Medios de congelación

Los medios de congelación tienen como objetivo proteger a las células del choque producido por el enfriamiento a temperaturas por debajo de 0ºC, que es uno de los factores más importantes que afecta a la supervivencia espermática. Son medios formados fundamentalmente por:

• Agentes crioprotectores: potencian la deshidratación celular y reducen el agua disponible para la formación de cristales internos; pueden ser penetrantes o no penetrantes, siendo los primeros los más utilizados.

a) Penetrantes: sustancias de bajo peso molecular con permeabi-lidad a través de la membrana espermática, lo que permite el des-plazamiento del agua celular; glicerol (más utilizado), etilen-glicol (mejores tasas de criosupervivencia).

b) No penetrantes: sustancias de alto peso molecular, no per-meables que favorecen la deshidratación gracias a la creación de un gradiente osmótico; glucosa y sacarosa.

• Tampones: los más utilizados en los medios de congelación son TRIS (tris (hidroximetil) amino metano), HEPES (Ácido N-2-Hidroxietilpiperacina-N’-2’-etanesulfónico) o TES (acido N-tris-(hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfónico).

• Quelantes: disminuyen el gradiente de concentración de iones calcio a través de la membrana plasmática; los más frecuentes son EDTA y citrato.

• Moléculas estabilizantes de la membrana espermática: albúmina o lecitina son las más empleadas actualmente, sustituyendo a la yema de huevo que tiende a dejar de utilizarse por ser de origen animal (1).


Los medios de congelación se añaden a las muestras en distinta proporción según su composición y deben añadirse a la muestra lentamente, a razón de 1 gota cada 5 segundos, homogeneizando suavemente la mezcla, para conseguir un equilibrio osmótico eficiente sin provocar alteraciones abruptas en la osmolaridad celular (7).

4.2.2. Material fungible y equipamiento • Sistemas de almacenamiento: el uso de pajuelas CBS (Cryo Bio

System) de alta seguridad, fabricadas con resina ionomérica, es el método disponible más seguro en la actualidad ya que presentan varias ventajas sobre otros sistemas de congelación (criotubos o pajuelas de PVC):

- La estanqueidad (selladas por sus extremos, lo que no permite el contacto entre el nitrógeno líquido y su contenido ni pérdidas del mismo)

- La rápida transferencia de temperatura que permiten y la distribución homogénea en los cambios de la misma, debido a su pequeño diámetro (1).

• Sistemas de llenado y cerrado de pajuelas: existen sitemas automáticos para este fin aunque pueden utilizarse boquillas de llenado y un termosellador para cerrar las pajuelas herméticamente (SYMS, Cryo Bio System, París, Francia).

• Unidades de almacenamiento: visotubos (margaritas), gobelets, etc. • Sistema de identificación de pajuelas: impresora de etiquetas

adhesivas resistentes a bajas temperaturas con el número de identi-ficación, equipos que imprimen directamente sobre la pajuela (ej.MAPI CryoBioSystem) ó incluso existen métodos de identificación por radiofrecuencia (RFID tag).

• Sistemas de congelación: congelador de velocidad programable o congelador de fase vapor controlado mecánicamente.

• Tanques de almacenamiento criogénicos: pueden utilizar nitró-geno líquido o vapor de nitrógeno. Para pajuelas de alta seguridad se recomienda el uso de contenedores de fase líquida por su capacidad de mantener la temperatura estable a -196 ºC a pesar de aperturas frecuentes; es conveniente que estén dotados de un sistema de alarma que detecte un aumento de la temperatura (Tª) o una disminución del nivel del nitrógeno líquido ( si la Tª aumenta por encima de -132 ºC, las muestras almacenadas pueden sufrir recristalización que produce daño en las células congeladas).

• Pinzas para manipulación de pajuelas (Rocket Medical Watford, UK).

• Bombona de suministro de nitrógeno líquido.• Instrumento para cortar pajuelas: tijeras de sutura esterilizables.

4.3. Métodos de congelación Dependiendo de la velocidad de congelación pueden diferenciarse

varios métodos de congelación: - Congelación lenta: la velocidad oscila entre 0,5 ºC y 10ºC/min. - Congelación rápida: la velocidad oscila entre 50-400ºC/min. - Congelación ultrarrápida: la velocidad es aproximadamente

2500ºC/min. -Vitrificación: la velocidad oscila alrededor de 20000 ºC/min.

Los métodos de descongelación más utilizados son: la descongela-ción lenta (a Tª ambiente:10-20 ºC/min) y la rápida (a 37ºC: 400 ºC/min.); actualmente está demostrado que el método de descongelación

más efectivo es mantener la muestra durante 2-3 minutos en un baño de agua a 37ºC y posteriormente incubarla durante 5´a Tª ambiente.

Con el objetivo de cumplir la normativa que establece el RD 1301/2006 (trazabilidad en todos los procesos que conlleva la con-gelación y almacenamiento de semen), es fundamental el control exhaustivo de la velocidad y la temperatura de la muestra en cada momento, por lo que actualmente se recomienda la utilización de congeladores programables más que otros métodos clásicos como la congelación en vapores de nitrógeno líquido o la congelación en píldoras en molde de hielo seco (1).

La vitrificación de espermatozoides tiene la limitación del pequeño volumen empleado, por lo que sólo permite la criopreservación de un número reducido de espermatozoides (muestras para microin-yección intracitoplasmática, ICSI, exclusivamente).

A continuación, se exponen dos ejemplos de protocolos de conge-lación para espermatozoides, uno con congelador programable y otro manual, dado que existen muchas alternativas a estos procedimientos (6).

4.3.1. Protocolo de congelación con congelador programable

1. Mientras la muestra completa la licuefacción (no más de 30 minutos), atemperar el medio de congelación a Tª ambiente.

2. Separar una alícuota de muestra para el análisis.3. Medir el volumen de la muestra de semen que se va a congelar

y transferir a un tubo de poliestireno; este proceso será el mismo con muestras de espermatozoides previamente seleccionados, pro-cedentes de biopsia testicular o aspirado epididimario.

4. Calcular el número de pajuelas que serán necesarias, teniendo en cuenta la dilución con el medio recomendada por el fabricante (ej. 1+1 o 3+1) .

5. Etiquetar las pajuelas con el código de identificación correspon-diente, elegir el color adecuado (visotubo, manchón, bandera, etc.) de las unidades de almacenamiento y etiquetarlas. Las pajuelas deben identificarse individualmente; de esta manera, si se retiran dos dosis del banco y se descongelan al mismo tiempo, no hay posibilidad de error. El clásico método de código de barras que utiliza líneas con un rotulador de punta fina no se recomienda.

6. Agregar el medio de congelación lentamente, gota a gota, con movimientos suaves pero continuos del tubo para asegurar el mezclado completo (1 gota cada 5 segundos).

7. Llenar las pajuelas conectándolas al dispositivo de succión (por ejemplo a una jeringa de 1 ml o una bomba del vacío), dejando 1 cm de aire en el extremo final de la pajuela. Usar una boquilla de llenado para evitar que el exterior de la pajuela entre en el contacto con el semen o las paredes del tubo.

8. Sellar los extremos de cada pajuela mediante un termosellador (SYMS, Cryo Bio Sistema, París, Francia).

9. Desinfectar el exterior de cada pajuela mediante alcohol 70% (v/v) u otra solución descontaminante, enjuagar seguidamente con agua estéril y secar.

10. Transferir las pajuelas al sistema de bandejas del congelador programable y comenzar el ciclo de congelación. Un ejemplo de curva genérica de congelación sería el siguiente:

- Etapa 1: Reducir la Tª desde la Tª ambiente a +4ºC con una velocidad moderada de enfriamiento de –5ºC/min. El esperma se deshidrata en un tiempo muy limitado.

- Etapa 2: Reducir la Tª de +4ºC a –80ºC a una velocidad rápida de enfriamiento de –10ºC/min. La solución de espermatozoides comienza a solidificarse.



- Etapa 3: Reducir la Tª de –80ºC a –160ºC tan rápidamente como permita el sistema de congelación. El protocolo de congelación debe congelar a menos de –160ºC para minimizar el riesgo de daño por recristalización durante la transferencia de las pajuelas desde el con-gelador hasta el recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido.

- Etapa 4: Finalmente, reducir la Tª de –160ºC a –196ºC sumer-giendo las pajuelas en nitrógeno líquido. Este paso debe hacerse muy rápidamente.

11. Sumergir la unidad de almacenamiento (visotubo, gobelet, etc), previamente identificada, en el nitrógeno líquido hasta que no se formen burbujas.

12. Transferir rápidamente, con la ayuda de unas pinzas, las pajuelas de semen congelado a la unidad de almacenamiento, que debe estar llena de nitrógeno líquido.

13. Para verificar la criosupervivencia, poner una pajuela aparte para la valoración de la movilidad post-descongelación. Esta veri-ficación puede realizarse inmediatamente o más tarde.

14. Colocar el visotubo o gobelet con las pajuelas en el lugar de almacenamiento apropiado del banco (número de tanque y canister, nivel del recipiente, etc).

15. Elaborar una tarjeta índice para los códigos de identificación de la pajuela, código de identificación de la muestra de semen, fecha de congelación, lugar de almacenamiento y número de referencia de laboratorio del análisis de semen.

16. Anotar toda la información en un libro de registro o en un programa informático específico (7).

4.3.2. Protocolo de congelación en vapores de nitrógeno líquido

Tiene la ventaja de no necesitar congelador programable, pero las condiciones del proceso están poco estandarizadas.

Realizar todo el proceso como el protocolo anterior hasta el paso 9, y una vez rellenadas y desinfectadas las pajuelas, colo-carlas en un contenedor con nitrógeno líquido aproximadamente a 10 cm. de la superficie del mismo durante 30 minutos (un contenedor con una rejilla para depositar horizontalmente las pajuelas es adecuado).

Una vez terminado el proceso de congelación, seguir el protocolo anterior desde el paso 11 para introducir las pajuelas en la unidad y en el sistema de almacenamiento.

4.4 Evaluación de la criopreservación1. Descongelar la pajuela transfiriéndola a un baño de agua a

37ºC durante 2-3 minutos y dejar a Tª ambiente durante 5 minutos.2. Desinfectar el exterior de la pajuela de modo que pueda abrirse

sin riesgo de contaminación. Limpiar el extremo de la pajuela donde está la zona de aire con una solución estéril de hipoclorito, aclarar con agua destilada y secar con una gasa estéril. Cortar este extremo, insertar la pajuela en un tubo, y, entonces, cortar el otro extremo (justo por debajo del filtro) para que el contenido de la pajuela se vierta en el tubo. Los extremos de la pajuela deben cortarse con un instrumento estéril, por ejemplo, tijeras de sutura.

3. Evaluar cuantitativa y cualitativamente la movilidad espermática y determinar la concentración total de espermatozoides, siguiendo las recomendaciones de la OMS (6).

La eficiencia de la criopreservación de semen puede evaluarse de diferentes maneras:

• Calculando el factor de criosupervivencia (CSF), como:

• Calculando el número total de espermatozoides con movilidad progresiva en la pajuela post-descongelación: mediante la evalua-ción de la concentración espermática y la movilidad progresiva por pajuela (teniendo en cuenta el volumen de la pajuela).

Se considera una eficiencia de criopreservación óptima un valor de CSF$50% junto con una movilidad total de $ 30% con $ 25% de movilidad progresiva.

El número de espermatozoides móviles requerido por pajuela depende de la intención de uso

que quiera darse a la misma, desde inseminación artificial (IA) a fecundación in vitro con inyección intracitoplasmática de esper-matozoides (FIV-ICSI).

• Criopreservación en pacientes oncológicos: como la calidad de las muestras de semen de pacientes que van a seguir tratamientos oncológicos suele ser baja, la mejor opción terapéutica es la FIV-ICSI. En este caso, pajuelas que contengan pocos espermatozoides móviles son a menudo suficientes para dar lugar a tasas adecuadas de fecundación mediante esta técnica; en estos casos, es conveniente congelar sólo un pequeño número de espermatozoides por pajuela (ej. 40.000) para así maximizar el número de intentos de ciclos por muestra criopreservada (7).

• Donantes de semen: Aunque es una situación que queda fuera del alcance de este documento queremos reseñar que, respecto a los donantes, debe conseguirse un número mínimo de espermatozoides con movilidad progresiva post-descongelación para cada donante para decidir si la congelación es factible.

- Para inseminación intrauterina (IUI): Pajuelas que contengan menos de 4 millones de espermatozoides móviles (mínimo gene-ralmente aceptado) pueden ser usadas para IUI pues este proceso implica la eliminación de plasma seminal y medio de congelación y la concentración de los espermatozoides antes de la inseminación. Sin embargo, se ha demostrado que el número mínimo de esperma-tozoides necesario para la realización de IUI con semen de donante es de 1,5 millones (11).

- Para fecundación in vitro (FIV-ICSI): El número de espermato-zoides móviles por pajuela de semen de donante no se correlaciona ni con la tasa de fecundación ni con la de embarazos en FIV, lo que refleja la óptima selección de los espermatozoides criopreservados.

5. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE CRIOPRESERVACIÓN

La Directiva 2004/23/CE exige que los establecimientos de los estados miembros que trabajen con tejidos y/o células humanas sigan un sistema de gestión de calidad y establece los requisitos técnicos a aplicar para garantizar una buena práctica; en España esta directiva se adecuó mediante el Real Decreto 1301/2006 (10).

Los riesgos en el laboratorio de criobiología pueden diferenciarse en físico-químicos y de contaminación.

5.1. Riesgos físicos y químicosLos más importantes son los derivados del manejo del nitró-

geno, tanto en fase líquida como gaseosa, como consecuencia

% spz móviles post- descongelación% spz móviles pre- congelaciónCSF = x 100


del desplazamiento de oxígeno que provoca (riesgo de anoxia) y de las quemaduras ocasionadas por las bajas temperaturas que alcanza.

Por ello, las recomendaciones más importantes son:

• Instalar los contenedores de nitrógeno, a ser posible, en áreas específicas que dispongan de buena ventilación; se recomienda disponer de un oxímetro que indique cuando se produce una bajada crítica de la concentración de oxígeno.

• Disponer de una protección adecuada a las salpicaduras del nitrógeno durante su manipulación: uso de pantallas faciales o gafas cerradas, guantes criogénicos y ropa de algodón que cubra brazos y piernas.

• Procurar que la exposición a los vapores de nitrógeno sea breve, ya que puede provocar lesiones en tejidos delicados, sobre todo ojos y piel de la manos.

• Debido a la evaporación constante del nitrógeno líquido los contenedores deben ser recargados periódicamente, por lo que es recomendable utilizar sistemas automatizados para el control y rellenado de los contenedores de nitrógeno líquido; si no se dispone de ellos, para medir el nivel de nitrógeno, deben usarse reglas de plástico resistentes a temperaturas extremas.

• La emisión de vapores produce hielo en la boca del conte-nedor, por lo que es necesario vaciarlos y limpiarlos (con agua destilada y una solución desinfectante) al menos una vez al año; cuando el contenedor vaya a ser llenado de nuevo de nitrógeno, debe rellenarse despacio para conseguir un enfriamiento gradual del recipiente.

• Se recomienda disponer de un contenedor o tanque de emer-gencia o limpieza, que se utilizará en caso de accidente o cuando algún contenedor deba ser limpiado.

• Los contenedores destinados al transporte de muestras deben llenarse de nitrógeno el día anterior a su utilización y rellenarse antes de introducir las mismas, para asegurar el mantenimiento de la temperatura óptima durante el transporte.

• Es necesario utilizar siempre materiales resistentes a las bajas temperaturas y pinzas largas para el almacenamiento y manejo del material sumergido en los contenedores.

5.2. Riesgo de contaminación cruzadaEl nitrógeno líquido puede constituir una fuente de conta-

minación, ya que ciertos hongos (aspergillus), virus (hepatitis, VIH, herpes, adenovirus) y bacterias pueden sobrevivir a la exposición directa a este producto y ser causantes de conta-minación cruzada.

• Se ha demostrado que lo más importante para evitar la con-taminación cruzada es el correcto envasado de las muestras a congelar, por lo que se recomienda el uso de pajuelas CBS selladas herméticamente.

• La manipulación de las muestras debe realizarse con la pre-caución de no contaminar exteriormente las pajuelas y el sistema de almacenamiento que se utilizará para su congelación; es impor-tante limpiar y desinfectar las pajuelas antes de introducirlas en el nitrógeno líquido.

• Es obligatorio según el RD 1301/2006 realizar previamente cribado de enfermedades infecciosas (VIH,VHB y VHC) en los pacientes o donantes que van a congelar semen y utilizar conte-nedores de almacenamiento diferentes según la situación de las muestras.

6. CONSIDERACIONES LEGALES SOBRE LA CRIOPRESERVACIÓN SEMINAL

6.1. Ámbito de aplicaciónSe ha excluido expresamente del ámbito de aplicación de este

documento la criopreservación seminal en donantes de semen, dirigiéndose únicamente a los casos de uso dentro de la pareja.

En el territorio del Estado Español la criopreservación seminal está definida, en la Ley 14/2006 sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida, como una técnica específica de los establecimientos acreditados para Reproducción Humana Asistida, y dentro de ellos los que lo estén como Banco de Gametos (12).

Cualquier laboratorio que quiera criopreservar semen deberá soli-citar la correspondiente acreditación como banco de gametos. Es una actividad que requiere acreditación específica, no siendo suficiente con la solicitada para las actividades habituales de laboratorio (13).

Las Comunidades Autónomas tienen transferida la capacidad de Homologación y Acreditación de los centros y actividades sanitarias.

6.2. Condiciones del varón para criopreservar sus gametos

En el Real Decreto 1301/2006 se establecen los criterios que hay que cumplir para poder criopreservar el semen. Son medidas de protección para con la futura madre (transmisión horizontal) y su descendencia (transmisión vertical), así como para otros gametos crioconservados en los mismos contenedores de nitrógeno líquido (contaminación cruzada) (10).

No existe normativa respecto al número de muestras a criopreser-var. El plan de criopreservación en pacientes oncológicos dependerá de la urgencia en la instauración del inicio del tratamiento y de la calidad seminal. Deberá establecerse en colaboración con el paciente y el médico responsable de este.

6.3. Destino de los gametos criopreservados El semen podrá crioconservarse en bancos de gametos autorizados

durante la vida del varón de quien procede.El marido podrá prestar su consentimiento, en el documento de

consentimiento informado para las técnicas de reproducción asisitida, en escritura pública, en testamento o documento de instrucciones previas, para que su material reproductor pueda ser utilizado en los 12 meses siguientes a su fallecimiento para fecundar a su mujer. Tal generación producirá los efectos legales que se derivan de la filiación matrimonial. El consentimiento para la aplicación de las técnicas en dichas circunstancias podrá ser revocado en cualquier momento anterior a la realización de aquéllas.

Se presume otorgado el consentimiento a que se refiere el párrafo anterior cuando el cónyuge supérstite hubiera estado sometido a un proceso de reproducción asistida ya iniciado para la transferencia de preembriones constituidos con anterioridad al fallecimiento del marido.

El varón no unido por vínculo matrimonial podrá hacer uso de la posibilidad prevista en el apartado anterior; dicho consentimiento servirá como título para iniciar el expediente del artículo 49 de la Ley del Registro Civil, sin perjuicio de la acción judicial de recla-mación de paternidad.

Los diferentes destinos posibles que podrán darse a los preem-briones crioconservados, así como, en los casos que proceda, al semen, ovocitos y tejido ovárico crioconservados, son:



a) Su utilización por la propia mujer o su cónyuge.b) La donación con fines reproductivos.c) La donación con fines de investigación.d) El cese de su conservación sin otra utilidad.

La utilización del semen crioconservado, para cualquiera de los fines citados, requerirá del consentimiento informado correspon-diente debidamente acreditado.

El consentimiento para dar a los gametos crioconservados cual-quiera de los destinos citados podrá ser modificado en cualquier momento anterior a su aplicación.

Los centros de fecundación in vitro que procedan a la criocon-servación de gametos deberán disponer de un seguro o garantía financiera equivalente que asegure su solvencia, para compensar económicamente a las parejas en el supuesto de que se produjera un accidente que afecte a su crioconservación (12).

6.4. Medidas de seguridad exigibles y responsabilidad de los centros6.4.1.Medidas de seguridad y responsabilidad

Para salvaguardar la persistencia temporal de los gametos crio-preservados, su capacidad fecundante, la intimidad de los pacientes que se someten a estos procedimientos, y en su caso, compensar las posibles pérdidas, la legislación establece la necesidad de usar medios antirrobo y, establecer pólizas de responsabilidad civil. Asimismo hace hincapié en los requisitos de confidencialidad (10) (12) (14).

El Real Decreto 1301/2006 también especifica claramente los datos exigibles para garantizar la identificación de muestras y su trazabilidad al donante, la receptora y los hijos (10).

6.4.2. Documentación requerida Previa a la criopreservación seminal se requiere la firma de un

documento de autorización y compromiso por parte del paciente. El consentimiento informado más extendido en nuestro país es el de la Sociedad Española de Fertilidad: http://nuevo.sefertilidad.com/consentimientos/pdf2008/04.pdf.

7. RECOMENDACIONES

• En las muestras muy viscosas puede ser extremadamente difícil obtener una buena mezcla de semen y medio de congelación. Deben diluirse con solución tamponada y pipetear la muestra; si la muestra no se dispersa en los dos primeros minutos de pipeteo, incubar durante 10 minutos a 37ºC y volver a mezclar. También puede recogerse la muestra en frascos recubiertos de quimiotripsina MARQTM (Laboratorios Embriotech, Wilmington, MA, EE.UU).

• Cuando se congelan muestras sucesivas, de un paciente o un donante, es siempre recomendable revisar los resultados de los test de descongelación de especímenes previos para evitar posibles problemas que puedan afectar al procesamiento de la muestra actual.

• Es conveniente evitar centrifugaciones para concentrar muestras de volumen alto y bajo recuento para obtener el mínimo necesario de espermatozoides con movilidad progresiva; con estas muestras deberían usarse técnicas de recuperación espermática.

• Muestras procedentes de pacientes oncológicos, biopsias testiculares y otras muestras difíciles de obtener, pueden volver a congelarse si es necesario.

• Debido a la alta osmolaridad de los medios de congelación y al daño sufrido en los procesos de congelación y descongelación, los espermatozoides criopreservados presentan una gran fragilidad, por lo que se recomienda que la manipulación de las muestras descongeladas sea muy cuidadosa.

8. BIBLIOGRAFIA

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