1. criopreservaciÓn
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1. CRIOPRESERVACIÓN.
La criopreservación busca el almacenamiento por largos periodos de tiempo de
material biológico, es decir, parar el envejecimiento.
La preservación en frío es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a
muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC (el punto de ebullición del
nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y
poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas
temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que
producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.
Hay dos enfoques tradicionales para la criopreservación de material biológico,
slow freezing y vitrificación, siendo ésta última la más extensiva.
Durante slow freezing las células son enfriadas a temperaturas por debajo de su
punto de equilibrio de congelación y el hielo es formado en el medio extracelular. Al
mismo tiempo que se forma este hielo en el medio extracelular, hay un incremento
progresivo de concentración de soluto en él. Como resultado, las células se deshidratan
y la formación de hielo intracelular se evita. Aun así, surgen algunas desventajas al usar
este método: se piensa que el chilling injury es debido a los efectos de la exposición a
disoluciones intracelulares y extracelulares de muy altas concentraciones y/o a las
interacciones mecánicas entre las células y el hielo, (Mazur, 1970, 1972, 1977).
La vitrificación es la solidificación de una muestra mientras se mantiene ausente
la formación de hielo intracelular y extracelular; a partir de aquí, un sólido amorfo se
forma. Este estado vítreo puede ser inducido en la mayoría de los líquidos si el
enfriamiento ocurre lo suficientemente rápido. La vitrificación del agua pura requiere
velocidades de enfriamiento del orden de 108 ºC/min. (Johari, 1987).
La adición de agentes crioprotectores disminuye estas desorbitadas velocidades
de enfriamiento. Entre los más comúnmente usados se encuentran el dimetilsulfóxido
(DMSO), el etilenglicol (EG) y el 1,2-propanodiol (PrOH). En términos generales, para
concentraciones de crioprotector mayores que el 60 % en peso la nucleación homogénea
es evitada, permitiendo que la solución vitrifique a una velocidad de enfriamiento baja,
(Katkov, 2006). Desafortunadamente, tales concentraciones son tóxicas para la mayoría
de células y tejidos. Por esto, la cantidad de agente crioprotector necesario para
vitrificar debe ser rebajado a un nivel no tóxico, y la velocidad debe ser incrementada
para que puede ser alcanzada la deseada vitrificación.
1.1. Fundamentos de criopreservación.
Para lograr una técnica adecuada de criopreservación, en primer lugar hay que
resaltar la importancia de conocer ciertos parámetros y ciertas características de la
célula que pueden incidir en la viabilidad del producto congelado. Al ser un proceso
afectado por diferentes variables como permeabilidad celular, volumen osmoticamente
inactivo, relación superficie/área de la célula, tipo y estadío de la célula a congelar, la
estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los principales
eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación; las bajas
temperaturas afectan a la difusión y osmosis a través de las membranas y cada célula
maneja su propio perfil biofísico el cual interactúa con diferentes criopreservantes
celulares. El hallar el protocolo adecuado será lo que garantice la viabilidad y
funcionabilidad celular, (Mazur, 1984).
1.1.1. Respuesta biológica.
Las membranas plasmáticas se componen básicamente de lípidos, proteínas y un
pequeño porcentaje de carbohidratos que es variable de acuerdo al tipo y especie
celular, (Singer, 1972). Se debe tener en cuenta que el tamaño de la partícula, la
polaridad y la carga iónica determinan el paso a través de las membranas y de esa
forma, pequeñas moléculas como las de agua (PM: 18), etanol (PM: 46), glicerol (PM:
92) y oxígeno pasan a través de la membrana mientras que la glucosa (PM: 180) no lo
hace. Cuanto menos polar es una molécula más rápido puede pasar la membrana,
(Lotan, 1981).
Los lípidos (colesterol y ácidos grasos), como componentes más abundantes de
la membrana plasmática, determinan la fluidez y resistencia de la membrana durante los
procesos de criopreservación. El empaquetamiento y la posición de estas moléculas en
las bicapas determinarán la rigidez de las membranas y por tanto el transporte de las
moléculas. Este transporte a través de las membranas es el punto crítico para la
supervivencia celular posterior a la descongelación. Cuanto más larga es la cadena del
ácido graso, más fácilmente se forman uniones de van der Waals y más rígida es la
membrana. La presencia de colesterol en la bicapa le proporciona rigidez a temperaturas
fisiológicas por la unión de sus anillos a las cadenas de ácidos grasos pero impide que
las cadenas de ácidos grasos se empaqueten libremente (cristalicen) al disminuir la
temperatura, aumentando en ese momento la fluidez de la membrana, (Mathews, 2003).
Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los
procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus componente
lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una temperatura de entre 10 a
-16 ºC alterando de esta manera las funciones de la membrana y dándole un alto grado
de fragilidad. Durante la deshidratación celular que tiene lugar en el proceso de
congelación se puede presentar una pérdida de lípidos lo cual afectaría a la integridad de
la membrana plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la
rehidratación al volver a las condiciones isotónicas, (Seidel, 2006).
1.1.2. Transporte a través de las membranas.
La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la
rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos
de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de moléculas a través
de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP, adenosín
trifosfato). La disminución de temperatura desde 25 ºC a 10 ºC reduce en un 60% la
actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusión facilitada como transporte
(transporte concomitante de dos moléculas a través de la membrana dependiente una de
ellas de ATP y/o iones H+), en consecuencia, los procesos de difusión y ósmosis son los
que predominan en los momentos de estrés osmótico, (Mendoza, 2000).
La difusión es un proceso mediante el cual las moléculas de una sustancia
tienden a alcanzar una distribución homogénea en todo el espacio que les es accesible.
La magnitud de la tendencia a difundir desde una zona a otra si está presente una
membrana que separe las dos zonas está definida por la ley de difusión de Fick, que
relaciona el gradiente entre las dos zonas (gradiente químico o de concentración), con
las características de la membrana (grosor, área de sección transversal y permeabilidad
para un determinado soluto), siendo directamente proporcional a la superficie (área) de
la membrana y a la diferencia de concentración del soluto entre los dos lados e
inversamente proporcional al espesor (grosor) de la membrana.
La velocidad de la difusión es proporcional a una constante de difusión que
depende de las propiedades de la membrana y de cada soluto en particular, un equilibrio
puede conseguirse en segundos si la distancia es de micras, pero puede subir a varias
horas si la distancia de difusión se incrementa a milímetros, (Mathews, 2003).
La ósmosis es un caso especial de difusión en el que es el movimiento del
disolvente el que se estudia, y se define en función de los solutos. La ósmosis es el
movimiento del agua desde soluciones con baja concentración de soluto hasta
soluciones con alta concentración de soluto y la presión osmótica es la presión
hidrostática que se genera a través de una membrana semipermeable con un gradiente
de concentración al lado y lado, depende del número de partículas de la solución.
La presión osmótica se suele expresar en osmoles y depende exclusivamente del
número de partículas disueltas (moles) por unidad de volumen, con independencia de su
carga eléctrica, peso o fórmula química, es por tanto una propiedad coligativa (es decir
las propiedades colectivas que una solución tiene cuando estos compuestos están
presentes).
Los productos criopreservados se deben almacenar a temperaturas desde -133
°C (vapores de nitrógeno líquido) a -196 ºC (nitrógeno líquido). A estas temperaturas
no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo las
reacciones químicas y por tanto las dificultades de la congelación no derivan de la
permanencia a temperaturas bajas sino de los procesos de congelación y
descongelación.
La lesión celular crio inducida o chilling injury se explica en función de la
formación de hielo intracelular y el estrés osmótico al que se ven sometidas las
membranas celulares durante la congelación.
Meryman propone la hipótesis del volumen celular mínimo que relaciona el
efecto de la deshidratación producida durante la concentración de solutos y la muerte
celular con la vuelta a las condiciones isotónicas después de la congelación (choque
osmótico). El volumen celular mínimo se basa en que el volumen se reduce en relación
al aumento de la osmolaridad extracelular, a medida que la célula pierde volumen por
la pérdida de agua, la compresión del contenido citoplasmático aumenta la resistencia
de la célula a seguir perdiendo volumen, y al excederse la resistencia física de la
membrana se producirán cambios irreversibles en su permeabilidad, en este caso los
crioprotectores actuarían reduciendo por sus propiedades coligativas la cantidad de hielo
formado a una temperatura determinada, (Meryman, 1971).
1.2. Principios físico-químicos de la preservación en frío.
Como se ha dicho anteriormente, la criopresevación se basa en el hecho de que
las reacciones químicas (metabólicas) ocurren más lentamente a medida que desciende
la temperatura. Según esto, a temperaturas por debajo de -140 ºC toda actividad
biológica se detiene. Sin embargo, también ocurre que antes de llegar a estas
temperaturas la muestra en cuestión es incapaz de resistir el proceso de enfriamiento y
muere.
Desde que se iniciaran hace 50 años los primeros experimentos de preservación
en frío se ha avanzado mucho en el conocimiento de los procesos que tienen lugar
cuando se enfría una muestra biológica consistente en un conjunto de células aisladas en
suspensión (no tejidos ni órganos), sobre todo en células reproductoras. Esto ha
permitido diseñar estrategias de conservación que consiguen que el frío no resulte
particularmente dañino. En este caso, estas estrategias están basadas en la adición de
agentes protectores (frente al frío) a la vez que en la optimización de las velocidades de
enfriamiento y recalentamiento.
Una célula es básicamente un pequeño saco que encierra una disolución de agua
y sales. A este saco le rodea lo que se llama una membrana semipermeable, un tejido
especial que sólo deja pasar el agua a través de él, pero no las sales que tiene disueltas,
de ahí su nombre. Por ello, cuando el agua sale o entra en la célula la concentración de
las sales disueltas aumenta o disminuye.
Bastan dos principios físicos para explicar lo que le ocurre a la célula mientras
se enfría: el principio de ósmosis y el principio de descenso del punto de congelación.
◊ El principio de ósmosis nos dice que cuando se tiene una célula
semipermeable sumergida en otra disolución salina, entonces el agua empieza a fluir en
un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las disoluciones. O sea, si se
sumerge la célula en una disolución de sales más concentrada que el interior celular,
entonces el agua (y sólo el agua) sale de la célula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce
de volumen. Si, por el contrario, se sumerge la célula en una disolución más diluida que
el interior celular, entonces empezará a entrar agua dentro de la célula intentando diluir
también la disolución salina de su interior; el resultado es que la célula se hincha.
◊ El principio de descenso del punto de congelación dice que si se tiene agua
pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0º C, sino por debajo
de esta temperatura; a una temperatura tanto más baja cuanta más cantidad de sal se
haya disuelto en ella.
Cuando se tiene un conjunto de células que se quiere conservar en frío,
inicialmente las células se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene una
solución salina isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular.
Cuando se empieza a enfriar este preparado, el frío alcanza antes la solución exterior
que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el
medio extracelular cuando aún no se ha formado hielo dentro de la célula. A medida que
se forma el hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo. Al disminuir la
cantidad de agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a
salir agua de la célula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones
intra y extracelulares.
Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a
estar más concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua salga. Y es aquí cuando
interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de congelación. Y es
que al estar más concentrada la disolución salina intracelular, la temperatura a la que se
formará hielo desciende: será más difícil que el agua de dentro de la célula se congele y
dañe sus estructuras. Así, mientras se enfríe poco a poco, el proceso continuará
indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la célula para compensar
las concentraciones salinas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro de la célula y
descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello,
con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo
la formación del dañino hielo intracelular.
Pero la no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de
supervivencia celular. Y es que aunque no se forme hielo aparecen dos nuevos factores
que perjudican gravemente a la célula. Por una parte está el hecho de que en cierto
instante la concentración de sales dentro de la célula llega a ser tan alta que resulta muy
tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen disminuye
peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales irreversibles. Estos dos
factores son tantos o más perjudiciales que la formación de hielo intracelular. Por ello,
en los protocolos de preservación de células aisladas hay que enfriar a una velocidad
que sea lo suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formación de hielo
intracelular, pero a su vez, lo suficientemente rápida como para no producir una
deshidratación excesiva que conlleve una destrucción irreversible de la estructura
celular.
Esto da lugar a que el perfil que aparece cuando representamos el porcentaje de
células que sobreviven a un proceso de preservación en frío frente a la velocidad de
enfriamiento sea típicamente el de una U invertida.
1.3. La necesidad termodinámica de vitrificar.
La vitrificación es el resultado del hecho de que un líquido no puede tener más
orden que su correspondiente cristal. Mientras la temperatura de una sustancia líquida
baja, su entropía se reduce más rápidamente que la entropía de la correspondiente forma
cristalina de la sustancia. Kauzmann reconoció que para mantener la consistencia
termodinámica, algunos hechos deben prevenir la continua reducción de entropía del
líquido ya que crea un líquido cuya entropía es menor que la entropía del cristal,
(Kauzmann, 1948). Este hecho es la transición cristalina y debe ocurrir a una
temperatura por encima de la temperatura de Kauzmann, Tk, a la cual las leyes de la
termodinámica serían violadas por el logro de un estado líquido con la misma entropía
que el estado cristalino del mismo material.
La transición vítrea elimina los traslacionales y rotacionales grados de libertad
que caracterizan el estado líquido y que son responsables de la gran dependencia de la
entropía de un líquido con la temperatura en comparación con la del cristal, en el cual
predomina los vibracionales grados de libertad. Otra forma de ver la transición vítrea es
que la movilidad molecular de un líquido tiene una energía de activación, y mientras la
temperatura de transición cristalina se aproxima, la energía de activación llega a no estar
disponible, (Angell, 1976).
1.4. El papel de los agentes crioprotectores en la vitrificación.
Un criopreservante es un compuesto químico que permite la mantención de un
tejido o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los
criopreservantes se catalogan de acuerdo a la velocidad para penetrar los tejidos, el
grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que
pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente
vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad,
menor el agua disponible para la cristalización dañina. Además, estos productos se
utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas
congelantes.
Las concentraciones criopreservantes son lamentablemente tóxicas para el tejido
a temperatura ambiente, por lo cual, en el procedimiento de congelado, se deben
respetar ciertos tiempos de exposición del material a 4° C, para que el producto
protector penetre el tejido sin alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio del
proceso de congelamiento propiamente tal. En el mismo sentido, cuando se procede a la
técnica de descongelado, previo al uso del material, se lo debe someter a un lavado
minucioso con medios nutritivos a concentraciones decrecientes del criopreservante, para
su total eliminación evitando de esa forma los efectos tóxicos.
Un crioprotector adecuado para usarlo en la vitrificación de embriones debe
vitrificar a una concentración que no sea tóxica para éstos durante el proceso de
enfriamiento y a la temperatura del procedimiento. La temperatura tiene un gran efecto
en la toxicidad. Además se ha observado que la cristalización del agua para formar hielo
puede ocurrir durante el enfriamiento como también durante el calentamiento de los
embriones, (Mazur, 1980).
Por tanto es obvio que un crioprotector a usar en vitrificación de embriones debe
cumplir las siguientes características:
Debe conducir a la vitrificación cuando se enfríe al introducirlo en nitrógeno
líquido.
No debe devitrificar para formar hielo o fracturarse durante el calentamiento o el
enfriamiento.
Debe no ser tóxico para los embriones. La toxicidad es dependiente de la
temperatura, así la selección de un crioprotector debe ser estudiado a las
temperatura a las que los embriones y los medios van a estar alojados durante la
primera fase de criopreservación.
1.4.1. Definición.
Los criopreservantes son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que
disminuyen el punto eutéctico de una solución dada (punto en el cual una composición
dada de A y B solidifica como un elemento puro). El descenso del punto eutéctico
implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de
forma que la célula estará más deshidratada y el gradiente osmótico al que estará
sometido será menor, (García, 1984).
1.4.2. Clasificación.
Bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores, los
alcoholes, azúcares y el dimetilsulfóxido. Además de esta clasificación también pueden
diferenciarse por ser agentes penetrantes o no penetrantes de acuerdo a la permeabilidad
celular:
- Crioprotectores penetrantes: Son de bajos pesos moleculares y permeables a
través de la membrana celular. Se utilizan el glicerol, el dimetilsulfóxido, el etilenglicol
y el propanodiol.
▪ El glicerol es el crioprotector de elección empleado en la congelación de
semen de mamíferos. Se denomina químicamente propanotriol por ser un alcohol con
tres grupos hidroxilos.
▪ El dimetilsulfóxido es un solvente bipolar aprótico, hidrosoluble y de bajo
peso molecular. Su acción crioprotectora se atribuye principalmente a su habilidad de
prevenir acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de
congelamiento, y evitar también la formación de cristales de hielo que rompen la
estructura de la membrana.
▪ El 1,2-propanodiol ha sido utilizado principalmente para congelación de
blastocitos y embriones en estado de preimplantación de humanos y otras especies. Es
un crioprotector descubierto más recientemente que ofrece condiciones excelentes para
la vitrificación y además menor toxicidad que otros, como el etilenglicol.
▪ El etilenglicol o 1,2-dioxietano es un compuesto químico que pertenece al
grupo de los glicoles. Es un líquido transparente algo viscoso y poco volátil. Es muy
tóxico y se mezcla con agua en cualquier proporción.
- Crioprotectores no penetrantes: Son sustancias de alto peso molecular,
efectivas a velocidades altas de congelación, caracterizadas por ejercer su acción
protectora promoviendo la rápida deshidratación celular, por lo que suelen usarse
asociados a los agentes penetrantes. Los más utilizados son la sacarosa, glucosa,
dextrosa y dextrano.
Los crioprotectores que penetran la célula reemplazan el agua, es decir, entra el
crioprotector y sale agua. El no penetrante, en cambio, evita el arrugamiento excesivo
de la membrana plasmática, que ocurre cuando entra crioprotector y sale agua, ya que
las velocidades son distintas (sale más rápido el agua). Por lo tanto, en criopreservación,
se utiliza una mezcla se crioprotectores penetrantes y no penetrantes.
La adición de criopreservante genera estrés osmótico sobre las células porque
aumenta la osmolaridad del medio. Las células inicialmente se deshidratan para
compensar la fuerza osmótica inducida por la presencia de los agentes crioprotectores y
después se hidratan.