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Equation Chapter 1 Section 1

Trabajo Fin de Grado

Ingeniería de Telecomunicación

Construcción de Sistema Electromecánico para

Criopreservación de Tejidos de Interés Biomédico

mediante Vitrificación

Autor: Alejandro Romero Barbero

Tutor: Ramón de Jesús Risco Delgado

Dep. Física Aplicada III

Escuela Técnica Superior de Ingeniería

Universidad de Sevilla

Sevilla, 2018

iii

Trabajo Fin de Grado

Ingeniería de Telecomunicación

Construcción de Sistema Electromecánico para

Criopreservación de Tejidos de Interés Biomédico


Autor:

Alejandro Romero Barbero

Tutor:

Ramón de Jesús Risco Delgado

Profesor titular

Dep. Física Aplicada III

Escuela Técnica Superior de Ingeniería

Universidad de Sevilla

Sevilla, 2018

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Trabajo Fin de Grado: Construcción de Sistema Electromecánico para Criopreservación de Tejidos de Interés

Biomédico mediante Vitrificación

Autor: Alejandro Romero Barbero

Tutor: Ramón de Jesús Risco Delgado

El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros:

Presidente:

Vocales:

Secretario:

Acuerdan otorgarle la calificación de:

Sevilla, 2018

El Secretario del Tribunal

vii

A mi familia

A mis maestros

ix

Agradecimientos

A mi tutor Ramón Risco, por haberme seleccionado para la realización de este proyecto, y cuyas ideas han

sido fundamentales en el devenir del trabajo.

A Alejandro Lucas, investigador del laboratorio, sin cuya ayuda me habría resultado imposible avanzar con el

proyecto, aportándome innumerables soluciones a los problemas.

A María Caño y Samuel Rodrigo, compañeros que han estado conmigo en el día a día y cuyos ánimos y

apoyos han sido muy importantes para mí.

A mi familia y amigos, cuyas muestras de cariño me han alentado a seguir.

xi

Resumen

El tema de la criopreservación está siendo cada vez más importante en el mundo de la investigación, ya que

logra conservar en el tiempo cualquier tipo de organismo con una gran fiabilidad. Numerosas empresas

nacionales e internacionales destinan parte de su presupuesto a indagar en este campo. Se ha demostrado

científicamente que los organismos sometidos a condiciones de frío extremo logran mantener intactas sus

propiedades corporales. De ahí la importancia de crear sistemas y mecanismos que permitan favorecer el uso

de la criopreservación.

El presente trabajo se centra en la construcción de un sistema eléctrico y mecánico que permita realizar

experimentos con tejidos biomédicos para su posterior estudio en los laboratorios clínicos. Dicho sistema hace

uso de un dispositivo externo de enfriamiento, que ayudará a alcanzar las temperaturas criogénicas requeridas

en los ensayos. Se profundizará en aspectos básicos de electrónica de sistemas y de programación, así como en

el diseño de piezas.

xiii

Índice

Agradecimientos ix

Resumen xi

Índice xiii

Índice de Tablas xv

Índice de Figuras xvii

1 Introducción a la CRIOPRESERVACIÓN 1

1.1. Teoría biológica y física 1 1.2. Métodos usados 2

1.2.1. Congelación lenta o Slow freezing 2 1.2.2. Congelación ultrarrápida 3 1.2.3. Vitrificación 3 1.2.4. Vitrificación lenta 4

1.3. Dispositivos para el enfriamiento 5 1.3.1. VIA FREEZE RESEARCH 5 1.3.2. BIOCOOL 6

1.4. Otros conceptos relacionados 8

2 Sistema ELECTROMECÁNICO 11 2.1. Funcionamiento 11 2.2. Elementos necesarios 13 2.2.1. Servomotor 14 2.2.2. Motor paso a paso 15 2.2.3. Final de carrera 16 2.3. Electrónica del sistema 16 2.3.1. ARDUINO MEGA 2560 17 2.3.2. RAMPS 1.4 18 2.4. Diseño de piezas 19 2.4.1. Soportes del mecanismo 20 2.5. Modificaciones futuras 22

3 Programación en ARDUINO 23 3.1. Código 24

Anexo A. BIOCOOL 27

Anexo B. PLANOS 29

Anexo C. PIN MAPPING 2560 33

Anexo D. PINOUT RAMPS 37

Anexo E. PROVEEDOR COSELA 39

Referencias 41

xv

Índice de Tablas

Tabla 1-1. Ejemplo de perfil biofísico de la célula CD34+ 2

Tabla 1-2. Datos experimentales de vitrificación lenta en tejido ovárico de vaca 5

Tabla 2-1. Características técnicas del servo 14

Tabla 2-2. Características técnicas del motor paso a paso 15

Tabla 2-3. Especificaciones técnicas del 2560 17

xvii

Índice de Figuras

Figura 1-1. En la parte superior, comparación visual; en la parte inferior, comparación estadística 4

Figura 1-2. VIA FREEZE RESEARCH 6

Figura 1-3. Tipos disponibles 6

Figura 1-4. En la parte superior, BIOCOOL; en la parte inferior, panel de control 7

Figura 1-5. Fenómeno que ocurre durante una rampa de enfriamiento en el BIOCOOL 8

Figura 1-6. Recipiente del BIOCOOL 8

Figura 1-7. Válvula criogénica 9

Figura 2-1. Sistema electromecánico real 11

Figura 2-2. Sistema en funcionamiento 12

Figura 2-3. De izquierda a derecha; posición 1, posición 2 y posición 3 del servo 13

Figura 2-4. Logotipo 14

Figura 2-5. Modulación PWM usada por el servo 14

Figura 2-6. Controlador A4988 16

Figura 2-7. Final de carrera 16

Figura 2-8. Entorno gráfico de ARDUINO 17

Figura 2-9. ARDUINO MEGA 2560 18

Figura 2-10. RAMPS 1.4 19

Figura 2-11. Unión de la RAMPS con el ARDUINO MEGA 19

Figura 2-12. Impresora 3D con PLA amarillo 20

Figura 2-13. Soportes 21

Figura 2-14. Porta-servo 22

1 INTRODUCCIÓN A LA CRIOPRESERVACIÓN

a criopreservación consiste en congelar células o tejidos a temperaturas muy bajas (normalmente entre -

80 ºC y -196 ºC). El objetivo de alcanzar temperaturas extremas es disminuir o incluso detener las

funciones vitales de estos organismos, quedando en un estado de “vida suspendida”. De esta forma, se

consigue reducir la degradación de las células y tejidos en un largo periodo de tiempo [1].

Actualmente, numerosas empresas nacionales e internacionales dedican su trabajo a la investigación y puesta

en marcha de esta técnica. La necesidad de almacenar, conservar y proteger organismos es de vital

importancia en numerosos campos científicos y tecnológicos, tales como reproducción asistida. Parejas con

problemas de fertilidad utilizan este método para congelar sus ovarios o espermatozoides, y así poder fecundar

los óvulos en el momento que se estime oportuno.

Para criopreservar muestras de forma exitosa es necesario seguir protocolos estandarizados y reproducibles

que permitan lograr la máxima viabilidad después del descongelamiento. Los métodos más usados hoy en día

en el campo de la criopreservación serán detallados en este capítulo. Estas técnicas deben permitir recuperar

las muestras evitando daños durante todo el proceso.

El rango de temperaturas en criopreservación puede ir desde los 0 ºC (temperaturas “hipotérmicas”) hasta los -

196 ºC (temperaturas “criogénicas”), temperatura de ebullición del nitrógeno a nivel del mar. El nitrógeno

líquido es nitrógeno puro en estado líquido a una temperatura igual o inferior a su temperatura de ebullición,

además de ser inodoro e incoloro. Este líquido es de vital importancia en criopreservación, especialmente en el

ámbito de la criogenización, aspecto que se detallará en este capítulo.

1.1. Teoría biológica y física

Conservar a bajas temperaturas no supone un problema en la actualidad, ya que no existen fenómenos de

difusión o térmicos que conlleven efectos perjudiciales para los organismos. Sin embargo, los procesos de

congelación y descongelación sí suponen un riesgo para las células, especialmente para su membrana. Sus

estructuras están representadas por una doble capa lipídica que sufre una transición de líquido a sólido al

disminuir la temperatura, haciéndola muy frágil. También contribuyen a la inestabilidad de las células los

lisosomas, los cuales pueden verse afectados por las temperaturas tan extremas.

Las bajas temperaturas en criopreservación favorecen la aparición de hielo intracelular y extracelular,

causando graves daños a las células y tejidos. Al haber diferencias de salinidad y de niveles de pH, las células

sufren un incremento de toxicidad. Generalmente, todos los métodos de criopreservación han de evitar la

generación de hielo intracelular y, en la medida de lo posible, controlar la aparición de hielo extracelular.

Los principales daños que se producen a nivel celular son: lesión por isquemia (disminución de riego

sanguíneo y oxígeno en la célula), daño osmótico o choque por frío (cambio en las concentraciones de solutos

intracelulares debido al congelamiento), crioprotectores (tóxicos en determinadas circunstancias) y lesión por

reperfusión (estrés oxidativo, inflamación y sobrecarga de calcio intracelular) [1].

En cuanto a los aspectos físicos, el proceso de convección de la energía térmica es descrito por la ley de

enfriamiento de Newton:

L

Introducción a la CRIOPRESERVACIÓN

2

donde h es una variable dependiente de la velocidad del movimiento del fluido y conductividad térmica del

medio; A es la superficie del sólido; Ti es la temperatura inicial; y Tf es la temperatura final.

Las velocidades de las reacciones químicas son proporcionales a la temperatura. Esta relación es descrita por la

ecuación de Arrhenius:

donde k(T) es la constante cinética dependiente de la temperatura; A es el factor de frecuencia, indicador del

número de colisiones moleculares; Ea es la energía de activación; R es la constante universal de los gases; y T

es la temperatura absoluta expresada en kelvins (K) [1].

1.2. Métodos usados

En el campo de la criopreservación existen técnicas tanto para la congelación como para la descongelación de

células. Esta sección se centra en los métodos que varían según la velocidad de congelación.

1.2.1. Congelación lenta o Slow freezing

Es el método utilizado con mayor frecuencia en todo el mundo. Se añaden agentes crioprotectores que hacen la

función de anticongelantes impidiendo la formación de cristales en las células. La velocidad de congelación en

este protocolo es muy lenta, lo cual permite a las células almacenarse durante largos periodos de tiempo

debido a la inactivación de procesos biológicos. El enfriamiento es gradual y puede alcanzar hasta los -196 ºC.

Los anticongelantes añadidos (glicerol o DMSO) evitan que se produzcan daños osmóticos en la célula,

aunque tienen un efecto tóxico a pesar de su baja concentración. La ósmosis consiste en la transferencia de

disolvente (en este caso agua) entre dos volúmenes de disolución con diferencia de concentraciones con el fin

de tender al equilibrio. Al disminuir la temperatura se produce una diferencia osmótica entre la célula y su

medio, provocando la deshidratación de ésta por ósmosis. De ahí la importancia de usar agentes

crioprotectores.

Gracias a los anticongelantes se evita en primera instancia la aparición de hielo intracelular, aunque también

tienen otras consecuencias no tan beneficiosas para las células. Una de ellas es la toxicidad que pueden

provocar si no se controla su concentración en el soluto. Otro aspecto a tener en cuenta es el punto eutéctico

del crioprotector, debiendo ser el menor posible, permitiendo que la célula o embrión alcance temperaturas

muy bajas sin que los cristales de hielo extracelulares crezcan en demasía y así el soluto nunca llegue a

precipitar. Al aumentar la concentración de crioprotector, aumenta el porcentaje de solución que permanece en

estado líquido. Por estos motivos es fundamental controlar y estudiar qué concentración de anticongelante es la

adecuada para cada experimento [2].

Aunque la congelación lenta es relativamente fácil a nivel técnico y puede ser utilizada de forma simultánea en

varias células, es importante destacar algunos inconvenientes de esta técnica. El primero de ellos es que tiene

un riesgo de pérdida del 30%, es decir, una de cada tres células no podrá terminar el proceso de fecundación

tras la descongelación. Por esta razón, el slow freezing es útil fundamentalmente con óvulos fecundados, ya

que son considerablemente menos sensibles que los no fecundados. Otro inconveniente es la localización de

las células en suspensión en las dendritas del hielo extracelular [3].

Tabla 1-1 Ejemplo de perfil biofísico de la célula CD34+

3

Construcción de Sistema Electromecánico para Criopreservación de Tejidos de Interés Biomédico


1.2.2. Congelación ultrarrápida

La congelación ultrarrápida fue originalmente descrita en 1986 para la congelación de embriones. Tras la

congelación lenta, fue la segunda técnica propuesta en el ámbito de la criopreservación. Este método se basa

en la rápida deshidratación de las células, usando para ello altas concentraciones de crioprotectores. A

continuación, las células se sumergen en nitrógeno líquido, y no en otros fluidos refrigerantes como el etanol

(congelación lenta).

Durante este protocolo de enfriamiento, las células o tejidos son expuestos a dos tipos de deshidrataciones: la

primera consiste en una deshidratación parcial mediante crioprotectores permeables (DMSO o glicerol);

mientras que en la segunda se realiza una nueva deshidratación con crioprotectores no permeables (sacarosa o

lactosa) que deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente [4].

Dado la gran cantidad de anticongelante que se necesita, la congelación ultrarrápida ha pasado a ser un método

criopreservante poco utilizado en la actualidad, en pos de otras técnicas más prometedoras que se detallan a

continuación.

1.2.3. Vitrificación

La vitrificación surge como un innovador método de criopreservación para evitar la formación de hielo

extracelular que tiene lugar en los procesos de congelación vistos anteriormente. Esta técnica consiste en el

enfriamiento muy rápido de las células con el fin de transformarlas en sólidos amorfos similares al vidrio,

carentes de cualquier estructura cristalina. Es decir, debido a la gran velocidad de enfriamiento, las células

alcanzan un estado vítreo sin llegar a aparecer hielo extracelular. Internamente, las partículas tienen tan poca

energía que dejan de fluir como un líquido y pasan a mantenerse estáticas en el último sitio donde se

encontrasen. Teniendo en cuenta que el hielo necesita un periodo de tiempo para poder formarse, el proceso de

vitrificación debe ser lo más rápido o instantáneo posible, eliminando así la posibilidad de que empiecen a

aparecer dendritas de hielo.

En este caso, los anticongelantes utilizados pasan a denominarse agentes vitrificantes, aunque por lo general

suelen ser los mismos que los usados en congelación lenta. Deben usarse anticongelantes viscosos para

favorecer la aparición del estado vítreo y así aumentar la viscosidad total de la solución. De esta forma, se

reduce en gran medida la velocidad de crecimiento de los cristales durante la congelación. Destacar que la

temperatura de vitrificación se alcanza con un gradiente de descenso térmico mayor que la velocidad de

crecimiento del hielo, de ahí que se utilicen anticongelantes viscosos [2].

Para conseguir el estado de sólido no cristalino, se requiere un control riguroso y exhaustivo de la

concentración de crioprotector y de la temperatura de la muestra en cuestión. Así como la temperatura es un

parámetro fácil de monitorizar en los procesos de criopreservación, la concentración de crioprotector es más

difícil de controlar, especialmente en tejidos y órganos voluminosos. De ahí que se hayan propuesto

numerosos métodos de medida de concentraciones de crioprotectores, particularmente de dimetil sulfóxido o

DMSO, gracias al átomo de azufre que constituye la molécula. Los resultados han mostrado que el DMSO es

detectable tanto a temperatura ambiente como a temperaturas criogénicas. También existen técnicas para la

detección de cristales de hielo en muestras biológicas, bien sea en muestras ya vitrificadas o durante el proceso

de criopreservación y recuperación. Todo esto permite evaluar los daños producidos y ajustar los parámetros

necesarios en los procesos de criopreservación de muestras, evitando en todo momento la formación de hielo.

En este prometedor método, la tasa de supervivencia de las muestras es mayor del 90%. Los embriones suelen

sobrevivir intactos, pero no es útil en espermatozoides. En la siguiente figura se realiza una comparativa

cualitativa y cuantitativa entre la congelación y la vitrificación de células.


4

Figura 1-1 En la parte superior, comparación visual; en la parte inferior, comparación estadística

1.2.4. Vitrificación lenta

Los métodos vistos anteriormente focalizan su atención en células aisladas o embriones. Sin embargo, es de

vital importancia desarrollar una técnica alternativa que permita realizar experimentos con elementos más

grandes como pueden ser órganos o tejidos. La rapidez del proceso de vitrificación hace inviable que el órgano

en cuestión pueda absorber el agente vitrificante de forma uniforme. Es decir, al realizar la inmersión, habrá

células que se enfríen antes que otras debido a la conducción térmica dentro del elemento. Lo más probable es

que las células exteriores del órgano empiecen a enfriarse mucho antes que las interiores, causando daños en

los tejidos. Para cualquier ensayo en criopreservación es fundamental la uniformidad en el enfriamiento del

tejido, de ahí que la Universidad de Sevilla haya desarrollado un nuevo protocolo denominado “vitrificación

lenta”.

Esta técnica surge debido a la gran necesidad de conservar órganos y tejidos para su posterior análisis. Se basa

en un principio de equilibrio entre la temperatura y la concentración de agente vitrificante: para cada

temperatura existe una mínima concentración de anticongelante antes de que éste empiece a resultar tóxico o

empiece a aparecer hielo extracelular. Conforme se vayan alcanzando temperaturas criogénicas, menos

toxicidad expulsará el anticongelante. Esto hace posible el aumento de concentración de agente vitrificante

conforme disminuya la temperatura del proceso, siempre y cuando no empiece a ser demasiado tóxico para el

tejido. Aquí radica la importancia en la precisión entre temperatura y concentración de la solución.

En vitrificación lenta, el protocolo de enfriamiento es el siguiente: dado el primer criovial con una temperatura

inicial y una concentración de anticongelante determinada, la muestra de tejido desciende y asciende

lentamente una y otra vez, con el fin de absorber la mayor cantidad de agente vitrificante. El movimiento

gradual de la muestra es necesario para expulsar de ésta el agua y poder absorber el anticongelante. Todo esto

se produce durante una primera rampa de enfriamiento, de forma que al alcanzar la temperatura final, la

muestra debe pasar al segundo criovial y volver a repetir el proceso. Obviamente, en este segundo caso, la

temperatura es considerablemente más baja que al principio y, por consiguiente, se necesita una concentración

de agente vitrificante mayor, a la vez que ligeramente inferior a la concentración tóxica para esa temperatura.

La muestra va pasando de un criovial a otro hasta alcanzar el estado vítreo.

Gracias a los investigadores de la universidad, estos experimentos han sido probados y validados para

comprobar qué concentraciones son las adecuadas para cada temperatura y durante cuánto tiempo deben ser

5



vitrificadas las muestras. A continuación se presenta un protocolo preliminar para la vitrificación lenta de

tejido ovárico de vaca.

RAMPAS DE

ENFRIAMIENTO

TEMPERATURAS

(ºC)

CONCENTRACIÓN

(% DMSO)

TIEMPO

(MIN)

PRIMERA 0 -4 10 15

SEGUNDA -4 -8 20 15

TERCERA -8 -25 40 15

CUARTA -25 -40 50 60

Tabla 1-2 Datos experimentales de vitrificación lenta en tejido ovárico de vaca

Como se muestra en la tabla 1-2, conforme se alcanzan temperaturas más bajas, la concentración de

anticongelante aumenta. También es importante destacar la pendiente de las rampas de enfriamiento, siendo

las dos primeras más suaves que las dos últimas. Estos datos experimentales han sido elegidos con el objetivo

de optimizar al máximo el enfriamiento de los tejidos y evitar que sufran los menos daños posibles.

Como conclusión a esta sección, subrayar que el presente proyecto se basa en la construcción de un sistema

que permita criopreservar muestras de tejido utilizando la vitrificación lenta. Dicho sistema deberá reproducir

exactamente el protocolo de enfriamiento haciendo uso de los datos aportados anteriormente.

1.3. Dispositivos para el enfriamiento

Todos los experimentos han sido realizados utilizando únicamente tejido ovárico de vaca, en un entorno de

trabajo acondicionado para ello. Los dispositivos adecuados para criopreservar son básicamente dos: VIA

FREEZE y BIOCOOL. Ambos pueden ser encontrados fácilmente en cualquier laboratorio dedicado a este

campo de investigación, motivo por el cual se explicará el funcionamiento de cada uno de ellos en esta

sección. No obstante, el sistema electromecánico construido está adaptado a su uso sólo en el BIOCOOL, ya

que en el laboratorio de la universidad sólo se dispone de este dispositivo para realizar los experimentos.

1.3.1. VIA FREEZE RESEARCH

Este dispositivo es proporcionado por la empresa Asymptote, empresa líder mundial en congelación celular y

pionera en medicamentos avanzados. Su cartera de productos innovadores preserva la viabilidad y el

funcionamiento de las células durante el proceso criogénico de las terapias celulares, desde la congelación

hasta la descongelación, con el fin de mejorar la atención médica mundial. Tiene aplicaciones en medicina

regenerativa, microfísica atmosférica, conservación, reproducción asistida y procesamiento de alimentos [5].

El VIA FREEZE funciona con un motor Stirling inverso, el cual enfría una placa de acero sobre la que se

coloca una placa porta-viales, fijada mediante imanes. Hay disponibles numerosos formatos de esta placa

porta-viales, con una capacidad de criovial estándar de 48 x 2.0 ml. En la parte frontal se encuentra un panel

táctil que permite controlar y programar las rampas de enfriamiento de una forma muy sencilla. También

puede ser controlada a distancia desde otro terminal informático. El sistema integrado ofrece protocolos de

enfriamiento programables, control de acceso de usuarios, registro de datos, validación de procesos y

generación de informes. Otra característica que tiene la máquina es que proporciona por sí misma una lectura

de la temperatura del fluido vitrificante en todo momento.

Estos dispositivos están diseñados para ser compatibles con salas limpias, teniendo poca suciedad, un área de

muestra sin costuras y soportes de muestras montados magnéticamente [5]. La principal ventaja de usar este


6

dispositivo es que se evita el nitrógeno líquido a la hora de realizar los experimentos, de forma que no existen

problemas de contaminación de ningún tipo. Además, no existe riesgo de agotamiento de oxígeno, lo que

supone un ahorro considerable en los costos de instalación. Sin embargo, tiene un gran inconveniente, y es su

reducido espacio de trabajo en la cavidad de enfriamiento. En relación a este proyecto no influye en nada, ya

que nuestro sistema no trabaja sobre este dispositivo, pero si en un futuro se hiciera una adaptación al VIA

FREEZE, sí sería una limitación importante a la hora de diseñar el mecanismo.

Por último, destacar que existen dos tipos más de VIA FREEZE aparte del RESEARCH: el DUO y el QUAD.

El primero, como su nombre bien indica, está formado por dos placas de acero; mientras que el segundo está

formado por dos motores Stirling y cuatro placas de acero.

Figura 1-2 VIA FREEZE RESEARCH

Figura 1-3 Tipos disponibles

1.3.2. BIOCOOL

Es el dispositivo sobre el que trabaja el sistema electromecánico diseñado. Está formado por un recipiente

cilíndrico que contiene el fluido refrigerante para enfriar las muestras. Dicho fluido estará formado por etanol

7



en un 70% y por agua en un 30%, aproximadamente. Es necesario hacer uso del etanol, ya que impide que el

agua se congele al ir disminuyendo la temperatura. El recipiente cilíndrico contiene también una varilla que

hace de lector de temperatura, valor que se muestra continuamente en el display de la máquina. Como se

muestra en la figura 1-4, existe un panel de control donde se encuentran los botones para programar la rampa

de enfriamiento. A diferencia del VIA FREEZE, este dispositivo sólo es capaz de programar una rampa; es

decir, hasta que no se termine de procesar la rampa programada no será posible volver a programar otra.

Figura 1-4 En la parte superior, BIOCOOL; en la parte inferior, panel de control

Una rampa de enfriamiento está formada por la temperatura de inicio (start temperature) en ºC, la pendiente

de la rampa (cooling rate) en ºC/min, la temperatura final (last temperature) en ºC y el tiempo de espera (hold

time) una vez alcanzada la temperatura final, en minutos. Debido a que el BIOCOOL está gobernado por un

controlador PID (Proporcional - Integral - Derivativo), las temperaturas finales no logran alcanzarse

rápidamente; es decir, se producen pequeñas oscilaciones que hacen que el sistema no pueda estabilizarse de

una forma rápida. No obstante, los errores producidos son pequeños (del orden de ± 5ºC), produciendo unos

retardos de pocos minutos. Esto hace que la máquina tenga que estar durante esta fase en constante bucle

enfriamiento/calentamiento (cool/heat). En la siguiente figura se observa claramente este fenómeno.


8

Figura 1-5 Fenómeno que ocurre durante una rampa de enfriamiento en el BIOCOOL

Las muestras de tejido son colocadas en una pieza rectangular fabricada en impresión 3D, la cual contiene

cuatro orificios cilíndricos para introducir los crioviales. Dicha pieza es sumergida en el interior del recipiente

del BIOCOOL y sostenida mediante dos cestas a cada lado, como se muestra en la siguiente figura:

Figura 1-6 Recipiente del BIOCOOL

La muestra de tejido va pasando por cada uno de los crioviales de izquierda a derecha, absorbiendo las

distintas concentraciones de DMSO en solución salina con fosfato. El BIOCOOL enfría el etanol, que a su vez

enfría el DMSO y éste al mismo tiempo enfría las muestras de tejido. Las temperaturas que se utilizan en

criopreservación pueden llegar a ser muy bajas, aunque en este caso, el frigorífico de rampa controlada sólo es

capaz de alcanzar -40 ºC como temperatura mínima. El uso del fluido refrigerante en este dispositivo implica

un pequeño riesgo por contaminación en el laboratorio, de forma que han de adoptarse las medidas de

seguridad oportunas para su uso.

1.4. Otros conceptos relacionados: Criobiología, Criogenia y Criónica

Frecuentemente, la gente suele confundir la palabra criopreservación con otras como criobiología, criogenia o

9



criónica. En esta sección se explica la diferencia entre cada una de ellas, ya que es un aspecto que puede crear

confusión en el ámbito de la criopreservación.

La criobiología es la rama de la biología que estudia los efectos de bajas temperaturas en los seres vivos, es

decir, cómo afecta al material biológico el hecho de estar a temperaturas más bajas que las normales. Estos

materiales estudiados pueden ser células, tejidos, órganos, proteínas, bacterias, plantas, hongos o animales. En

el caso de las plantas, muchas de ellas experimentan un proceso llamado endurecimiento que les permite vivir

a temperaturas muy bajas durante semanas o meses. En los animales, invertebrados como las cucarachas,

escarabajos y osos de agua son tolerantes a la congelación; mientras que vertebrados como las ranas, algunas

de ellas son capaces de congelar parte de su cuerpo durante el invierno, donde la respiración, el flujo de sangre

y los latidos del corazón cesan. Las áreas de estudio en criobiología se basan en la adaptación al frío de

microorganismos, plantas y animales (hibernación), así como en la criopreservación de gametos y embriones

con fines médicos y en la preservación de órganos bajo condiciones de hipotermia [1].

La criogenia es el conjunto de técnicas utilizadas para enfriar un material a temperaturas extremadamente

bajas. Es ampliamente utilizada en tecnologías que dependen de la superconductividad, ya que todos los

superconductores conocidos lo son sólo a bajas temperaturas. Por ejemplo, los aparatos de resonancia

magnética nuclear usados en medicina dependen de técnicas criogénicas para mantener la temperatura de los

imanes superconductores [1].

Figura 1-7 Válvula criogénica

La criónica es la preservación a bajas temperaturas de seres humanos que la medicina contemporánea ya no

puede mantener con vida, con el fin de tratarlos médicamente y reanimarlos en el futuro. El fundamento básico

es que la memoria y la personalidad se encuentran almacenadas en la estructura y la química cerebral. Se ha

comprobado que la actividad cerebral puede detenerse y después reactivarse bajo determinadas circunstancias,

aunque aún existe controversia en este asunto. Estudios revelan que la neuropreservación es posible, ya que la

adición de crioprotectores puede prevenir la mayoría de las lesiones producidas por la congelación,

preservando las delicadas estructuras celulares. En relación a los dos conceptos anteriores, se podría decir que

la criobiología es la base biológica de la criónica, mientras que la criogenia es la base física. Actualmente,

existe tanto la preservación del cuerpo entero, donde el paciente es vitrificado de forma completa, como la

neuropreservación, que sólo conserva el cerebro. Este último caso es el más demandado, ya que el precio es

menor y más fácil de transportar; sin embargo, la conservación completa es más adecuada para los fines de la

criónica. Además se indica que la información contenida en el cerebro podría ser insuficiente para la

regeneración de un nuevo cuerpo. La principal ventaja del cuerpo completo es que en caso de pérdida de la

memoria por parte del paciente, el cuerpo podría funcionar como un respaldo que permitiera recuperar

recuerdos. No obstante, esto sigue siendo un tema ficticio para algunas partes de la comunidad científica [1].


10

2 SISTEMA ELECTROMECÁNICO

n este capítulo nos centramos en la construcción del sistema electromecánico diseñado para la

vitrificación lenta de tejidos. Se muestran fotografías reales de la máquina en funcionamiento para una

mejor visualización por parte del lector. Además se detallan todos los elementos usados en la

construcción, tanto eléctricos como mecánicos.

2.1. Funcionamiento

En la siguiente figura se muestran vistas del sistema completo:

Figura 2-1 Sistema electromecánico real

E

Sistema ELECTROMECÁNICO

12

Figura 2-2 Sistema en funcionamiento

El protocolo de funcionamiento es el siguiente:

1. La pieza encargada de desplazar el servomotor a través de la varilla roscada está situada a la mitad del

recorrido.

2. El motor paso a paso hace girar la varilla roscada de forma que el servomotor comienza a desplazarse

hacia la izquierda, con una velocidad de 60 rpm.

3. La pieza encargada de desplazar el servomotor hace pulsar el sensor izquierdo de final de carrera.

4. El motor paso a paso se detiene por un instante y comienza a hacer girar de nuevo la varilla roscada,

pero esto vez cambiando el sentido del giro, que hace desplazarse al servomotor hacia la derecha, con

la misma velocidad.

5. Gracias a un ajuste de calibración entre la distancia total del recorrido y la distancia entre crioviales, el

motor paso a paso se detiene justo en el primer criovial, haciendo que la aguja quirúrgica encargada

de contener la muestra de tejido coincida exactamente con el centro del primer criovial.

6. Hasta ahora, el aspa del servomotor se encontraba en una posición inicial de 45º, para que no influyera

en el movimiento. Ahora, el aspa pasa de 45º a 130º de forma muy gradual, con el objetivo de que la

muestra de tejido esté completamente introducida en el líquido del primer criovial.

7. En este momento, comienza la agitación vertical del tejido dentro del criovial, pasando de un ángulo

de 130º a otro de 160º, con una velocidad de 10º por segundo. Esto se hace indefinidamente durante la

primera rampa de enfriamiento, que dura unos 15 minutos. Es decir, el movimiento vertical tiene un

periodo de 60º, durante 6 segundos y con una frecuencia de 0,17 Hz.

8. Una vez que el BIOCOOL marque la temperatura final de la primera rampa, se procede a accionar un

pequeño pulsador situado en la caja que contiene toda la electrónica. Cuando el sistema detecte que el

pulsador está accionado y el aspa del servomotor se encuentre en la posición de 130º, dicho motor

pondrá el aspa de nuevo en 35º de forma gradual y pasará al siguiente criovial.

9. Se vuelve al paso número 5, pero con el segundo criovial y la segunda rampa de enfriamiento.

10. Una vez terminado con los cuatro crioviales, la pieza encargada de desplazar el servomotor hará

pulsar el sensor derecho de final de carrera, desplazándose hacia la izquierda y volviendo al paso

número 1.

13



En la figura 2-3 se muestran las distintas posiciones del servomotor durante el proceso. Como se observa en

las posiciones 2 y 3, la muestra de tejido no sale en ningún momento del criovial, ya que es fundamental en

vitrificación que el tejido esté en contacto continuo con el DMSO. Además, es necesario que la muestra de

tejido esté en continuo movimiento dentro del criovial durante la rampa de enfriamiento, ya que así podrá

expulsar el agua contenida y absorber el agente vitrificante con mayor facilidad.

Para optimizar los recursos, en cada experimento se colocarán tres muestras de tejido ovárico, con una

separación de 1 cm aproximadamente entre ellas. De esta forma, conseguimos que las muestras no se

deterioren con el paso de los días. La persona biomédica encargada de realizar los experimentos será también

la responsable de recoger las muestras de las empresas biomédicas, así como de su traslado y posterior entrega

en el laboratorio de trabajo. Es esencial que este ciclo se realice de forma adecuada para garantizar el mayor

éxito posible en los resultados de los experimentos.

Figura 2-3 De izquierda a derecha; posición 1, posición 2 y posición 3 del servo

Como punto final a esta sección destacar que el método de agarre de la muestra elegido ha sido una pequeña

aguja quirúrgica, en lugar de otros métodos alternativos como una posible cesta de alambre de acero

inoxidable o unas pequeñas pinzas. Se ha elegido dicho sistema principalmente porque resulta fácil de reparar

o reemplazar en caso de daños, además de que favorece el movimiento de la muestra al entrar en contacto con

las paredes del criovial.

2.2. Elementos necesarios

Para la realización del proyecto ha sido esencial la búsqueda de un proveedor externo que nos proporcionase

todos los dispositivos mecánicos. Gracias a COSELA, Comercial Sevillana de Laboratorios, hemos podido

adquirir todos los elementos necesarios. A través de los enlaces webs, esta empresa hacía los pedidos y nos los

entregaban en el laboratorio. El único inconveniente es que el tiempo de entrega estimado para cada elemento

era de unos 20 días, por lo que nuestro trabajo se retrasaba bastante. En esta sección se detalla cada uno de los

elementos y sus funciones dentro del proyecto.


14

Figura 2-4 Logotipo

2.2.1. Servomotor

Este dispositivo es el encargado de hacer mover la muestra verticalmente dentro del criovial. Tiene la

capacidad de ubicarse en cualquier posición dentro de su rango de operación, y mantenerse estable en dicha

posición. Puede ser controlado tanto en velocidad como en posición. Son motores con gran fuerza, baja inercia

y poco consumo. Están formados por un sistema de control, un potenciómetro y un conjunto de engranajes.

Hacen uso de la modulación por ancho de pulsos para controlar la dirección o posición [1].

Figura 2-5 Modulación PWM usada por el servo

VALOR

Longitud del cable 150 mm

Dimensiones 22 x 11 x 27 mm

Velocidad 0.12 segundos / 60º

Temperatura -30 a +60 ºC

Voltaje 3.0 – 7.2 V

Peso 14 g

Tabla 2-1 Características técnicas del servo

15



2.2.2. Motor paso a paso

Este motor es el encargado de hacer que la pieza que sostiene al servo se desplace horizontalmente, gracias a

una varilla roscada que está acoplada al eje del motor paso a paso. Es decir, convierte una serie de impulsos

eléctricos en desplazamientos angulares discretos, lo que significa que es capaz de girar una cantidad de grados

o pasos dependiendo de sus entradas de control. Puede ser gobernado por impulsos procedentes de sistemas

digitales. Tiene grandes ventajas, como la precisión en su posición.

Existen varios tipos de motores paso a paso: de reluctancia variable, de rotor de imán permanente e híbrido. En

nuestro caso vamos a usar el motor híbrido, ya que se caracteriza por tener varios dientes en el rotor, una alta

precisión, un alto par motor y se puede configurar para suministrar un paso angular de 1.8º. También existen

los motores paso a paso unipolares o bipolares. Los primeros suelen tener 5 ó 6 cables de salida dependiendo

de su conexión interna, son más simples de controlar y utilizan un cable común a la fuente de alimentación.

Los segundos tienen 4 cables de salida y requieren del cambio de dirección de flujo de corriente a través de las

bobinas en la secuencia apropiada para realizar un movimiento [1].

Sin embargo, estos motores no están preparados para trabajar con los controladores de ARDUINO, por lo que

necesitan un dispositivo externo para comunicarse: un driver. En este caso se ha elegido el controlador A4988,

ya que presenta un tamaño reducido.

VALOR

Tipo Híbrido y Bipolar

Ángulo de paso 1.8º

Pasos / revolución 200

Dimensiones 0.79 x 0.79 x 1.1

Peso 60 g

Voltaje 4.8 V

Corriente 0.2 A

Resistencia 24 ohm

Longitud 28 mm

Tabla 2-2 Características técnicas del motor paso a paso


16

Figura 2-6 Controlador A4988

2.2.3. Interruptor final de carrera

Estos interruptores son los encargados de detectar cuándo se llega al final del recorrido. Para ello tienen un

sensor que se activa al entrar en contacto con la pieza que se desplaza horizontalmente. Están a cada lado de la

máquina y, según sea el izquierdo o el derecho, hará al motor paso a paso cambiar de un sentido de giro a otro.

Son de tipo eléctrico, activos a nivel bajo, fáciles de instalar y robustos.

Figura 2-7 Final de carrera

2.3. Electrónica del sistema

El software elegido en este sistema es ARDUINO, ya que es libre, los microcontroladores físicos son muy

fáciles de adquirir en el mercado y a precio muy económico. Esta compañía diseña y produce placas de

desarrollo para construir dispositivos digitales e interactivos que puedan controlar objetos del mundo real.

Acerca y facilita el uso de la electrónica y la programación de sistemas en proyectos de todo tipo [1].

Las placas ARDUINO usan distintos microcontroladores y microprocesadores, conectados sobre una placa de

circuito impreso a la que se le pueden conectar placas de expansión a través de la disposición de los puertos de

entrada y salida presentes en la placa. Los drivers agregan circuitería, sensores y módulos de comunicación

externos a la placa original. La mayoría de las placas son programadas a través de un puerto serie o puerto

USB, mientras que también pueden ser conectadas a la corriente a través de un puerto Jack. El software de

17



ARDUINO está formado por un entorno de desarrollo y un lenguaje de programación. Este entorno compila el

código original a la versión de la placa seleccionada.

Figura 2-8 Entorno gráfico de ARDUINO

Existen muchos tipos de placas ARDUINO: Galileo, Uno, Leonardo, Due, Zero, Micro, Ethernet, Mega, Mini,

Nano, Robot, Gemma… En nuestro caso se ha optado por la placa MEGA 2560.

2.3.1. ARDUINO MEGA 2560

Esta placa es la más adecuada para nuestro proyecto, ya que contiene numerosas entradas y salidas, es fácil de

manejar y muy completa. A continuación se muestran las especificaciones técnicas:

Tabla 2-3 Especificaciones técnicas del 2560


18

El mega 2560 puede ser alimentado a través de la conexión serie o con una fuente de alimentación externa. La

fuente de alimentación es seleccionada automáticamente, y puede venir de un adaptador o de una batería. Si la

tarjeta se alimenta con menos de 7 voltios, el pin de 5V puede suministrar menos de 5 voltios y la placa se

puede volver inestable. Si se utiliza más de 12 voltios, el regulador de voltaje se puede sobrecalentar y dañar la

placa. Los pines de alimentación son: Vin (tensión de entrada a la placa cuando se utiliza la fuente de

alimentación externa), 5V (salida de 5 voltios regulada), 3V3 (suministro de 3.3 voltios) e IOREF (referencia

de tensión) [6].

En cuanto a los pines digitales, algunos de ellos tienen funciones muy específicas: Serie (recibe y transmite

datos serie), Interrupciones externas (activas a nivel bajo, en un flanco ascendente o descendente, o en un

cambio de nivel), PWM (salida de 8 bits), SPI (comunicación SPI), LED, Reset…

Figura 2-9 ARDUINO MEGA 2560

2.3.2. RAMPS 1.4

RAMPS son las siglas en inglés para RepRap Arduino Mega Pololu Shield. Sólo puede ser usada con el

MEGA 2560, y es necesaria siempre que se utilicen motores paso a paso, como es nuestro caso. Están

diseñadas con el fin de ser usadas con los drivers de corriente A4988. Tienen una gran estabilidad de

operación y gran compatibilidad. Expande al MEGA con todas sus características. Es fácil de usar, de bajo

coste y con espacio para conectar ampliaciones.

CARACTERÍSTICAS:

Conexión de hasta 5 drivers de motores paso a paso.

Conectores de potencia de 15 amperios.

3 salidas de potencia con MOSFETs.

Salidas de potencia protegidas por diodos.

Protegida por un fusible de 5 amperios.

Circuito independiente de 11 amperios protegido por otro fusible.

Pines para 3 termistores y 6 finales de carrera.

Salida SPI.

Conexión de pantalla LCD.

Salidas para servos.

LEDs.

19



Condensadores y resistencias.

Reset.

Figura 2-10 RAMPS 1.4

Figura 2-11 Unión de la RAMPS con el ARDUINO MEGA

2.4. Diseño de piezas

Las piezas que dan soporte al mecanismo han sido diseñadas usando SolidWorks, un software de diseño

asistido por ordenador para modelado mecánico en 3D. Este programa permite modelar piezas y conjuntos y

extraer de ellos planos técnicos para la producción. Una vez realizado el diseño de la pieza, el programa

exporta el fichero con extensión .asm, el cual habrá que convertir en otro tipo de fichero ejecutable por la

impresora 3D. Estas impresoras sólo ejecutan órdenes de ficheros con extensión .gcode, de forma que se

necesita un programa adicional que haga esta conversión: la aplicación Cura. Este programa incluye la


20

mayoría de parámetros para una impresión óptima, pero hay otros parámetros que habrá que verificar, como el

tipo de impresora que se va a utilizar, las dimensiones de la pieza, la velocidad de ejecución o la temperatura.

Las impresoras 3D realizan réplicas exactas de diseños en 3D. Existen varios tipos de impresoras según el tipo

de material que utilicen y la forma en que realicen la impresión de la pieza. En el laboratorio de trabajo se

dispone de la Prusa i3, una impresora de inyección de polímeros en la que el material empleado se añade por

capas. Este material es un filamento de PLA (plástico termoplástico) que se funde en el extrusor de la

impresora, formando capas muy finas superpuestas unas con otras, creándose la pieza diseñada. Estas piezas

son muy resistentes y admiten un pulido posterior a la impresión. El tiempo de fabricación depende del tamaño

de la pieza.

Figura 2-12 Impresora 3D con PLA amarillo

2.4.1. Soportes del mecanismo

Sobre la parte superior del BIOCOOL se sitúan las piezas que sostienen los ejes que recorre el servomotor

durante el trayecto. A continuación se muestran estas piezas fabricadas mediante impresión 3D.

21



Figura 2-13 Soportes [2]


22

Figura 2-14 Porta-servo

Como se muestra en la figura anterior, además de la varilla roscada y su tuerca, existe otra varilla lisa para una

mejor sujeción de la pieza que contiene al servo. Esto permite el traslado de forma segura y precisa del

servomotor en la dirección horizontal. La tuerca es la que permite a la pieza poder desplazarse con el giro de la

varilla roscada.

2.5. Modificaciones futuras

La primera modificación podría ser introducir un termopar tipo K o tipo T que detecte la temperatura de

cambio de criovial y dé la orden a la placa electrónica para que avance al siguiente criovial. De esta forma, no

sería necesario tener que accionar un pulsador cada vez que queramos saltar al siguiente criovial. Esta mejora

supondría añadir un poco más de dificultad a la programación y la electrónica, ya que habría que realizar un

ajuste de calibración del termopar en cuestión y, además, encontrar un módulo tipo MAX que haga la

conversión oportuna para que los valores del termopar puedan ser leídos por el ARDUINO.

La segunda modificación consistiría en cambiar el software del BIOCOOL, permitiendo que se pudiesen

programar varias rampas de enfriamiento consecutivas. De esta forma, con esta mejora y la anterior, ya no

haría falta ninguna persona durante la ejecución del protocolo completo, ya que se programaría todo al

principio y la máquina iría haciendo su trabajo sola.

Otro aspecto a tener en cuenta sería el tema del agitador. En estos momentos, al realizar los ensayos, se viene

colocando un agitador externo encima del BIOCOOL, justo al lado de nuestra máquina. Esta circunstancia

limita bastante el área de trabajo de nuestro sistema, debido fundamentalmente al considerable tamaño del

agitador. Una posible solución sería encontrar en el mercado un agitador más pequeño que se adaptase a las

paredes del BIOCOOL y no entorpeciera los experimentos.

Por último, también sería conveniente diseñar una pieza que hiciera de aislante entre el BIOCOOL y nuestra

máquina, ya que actualmente se encuentran en contacto directo.

3 PROGRAMACIÓN EN ARDUINO

n este capítulo se hace hincapié en el código informático que es enviado a la placa ARDUINO. El

lenguaje de programación elegido ha sido C, aunque podría haberse elegido cualquier otro compatible

con ARDUINO, como Java, C++ o Python. Una vez procesado este código, el microcontrolador dará las

órdenes necesarias a los dispositivos y comenzarán a hacer lo que se les pide.

La sintaxis de un programa en ARDUINO está formada por dos partes, como se muestra en la siguiente figura.

La primera parte es la encargada de recoger la configuración, conteniendo la declaración de las variables. Es la

primera función que se ejecuta en el programa y se usa para inicializar pinMode (modo de trabajo de las

entradas y salidas). Se invoca una sola vez cuando el programa empieza. Ha de ser incluida en el programa

aunque no haya declaración que ejecutar. También se utiliza para establecer el estado inicial de las salidas de la

placa [7].

La segunda parte es la que contiene el programa que se ejecutará cíclicamente (bucle). Esta función es el

núcleo del programa, y siempre estará ejecutándose. Contiene la lectura de entradas, activación de salidas...

E

Programación en ARDUINO

24

Ambas funciones son necesarias para que el programa trabaje. Cuando el programador termina de diseñar el

código, el compilador de ARDUINO primero verifica que todo está correcto y a continuación se dispone a

cargar el programa en la placa electrónica.

3.1. Código

25



Programación en ARDUINO

26

Para no hacer el código muy pesado visualmente, se han omitido en esta memoria las funciones

correspondientes al segundo, tercer y cuarto vial, ya que son muy parecidas a la del primer vial.

27



ANEXO A. PUESTA EN MARCHA DEL

BIOCOOL

1. Enchufar el BIOCOOL a la corriente.

2. Presionar el botón POWER.

3. Dejar que el display muestre la temperatura ambiente.

4. Presionar el botón SET hasta que se encienda el LED START TEMP.

5. Con la ayuda de los botones UP y DN, ajustar la temperatura inicial de la

rampa.

6. Presionar el botón SET y se encenderá el LED RAMP.

7. Con la ayuda de los botones UP y DN, ajustar la pendiente de la rampa.

8. Presionar el botón SET y se encenderá el LED END TEMP.

9. Con la ayuda de los botones UP y DN, ajustar la temperatura final de la rampa.

10. Presionar el botón SET y se encenderá el LED HOLD TIME.

11. Con la ayuda de los botones UP y DN, ajustar el tiempo de espera.

12. Presionar el botón SET y se encenderá el LED ALARM.

13. Con la ayuda de los botones UP y DN, ajustar la alarma (‘0’ apagada, ‘1’

encendida).

14. Presionar el botón SET.

15. Presionar el botón RUN y se encenderá el LED START TEMP.

16. El sistema empezará a alcanzar dicha temperatura inicial y, cuando la alcance,

sonará la alarma en caso de que esté activada.

17. Presionar el botón RUN.

18. El sistema realizará la rampa completa y, cuando termine, sonará la alarma de

nuevo.

Anexo A. Puesta en Marcha del BIOCOOL

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29



ANEXO B. PLANOS DE LAS PIEZAS

Anexo B. Planos de las Piezas

30

31



Anexo B. Planos de las Piezas

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33



ANEXO C. PIN MAPPING ARDUINO MEGA

2560

Anexo C. PIN MAPPING ARDUINO MEGA 2560

34

35



Anexo C. PIN MAPPING ARDUINO MEGA 2560

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37



ANEXO D. PINOUT RAMPS 1.4

Anexo D. PINOUT RAMPS 1.4

38

39



ANEXO E. PROVEEDOR COSELA

Kit ARDUINO

http://www.ebay.es/itm/like/253108403726?chn=ps

Cargador 9V

http://www.gear4music.com/Guitar-and-Bass/Zoom-AD16-Power-Supply/UME?origin=product-

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+Zoom&utm_medium=vertical_search&network=google&adgroup=1+-+Product+Level+-

+Zoom&merchant_id=1279443&product_id=39686d1&product_country=GB&product_partition_id=120

653332639&gclid=CI7DjK6chdICFc-c7QodR34Nhw

Servo



http://www.gear4music.com/Guitar-and-Bass/Zoom-AD16-Power-Supply/UME?origin=product-ads&utm_campaign=PLA+Shop+-+Zoom&utm_medium=vertical_search&network=google&adgroup=1+-+Product+Level+-+Zoom&merchant_id=1279443&product_id=39686d1&product_country=GB&product_partition_id=120653332639&gclid=CI7DjK6chdICFc-c7QodR34Nhw






Anexo E. Proveedor COSELA

40

Motor

http://uk.stepperonline.com/nema-820x28mm-18deg-02a-smallest-stepper-motor-8hs110204s-p-81.html

Varilla roscada: Ø 3 mm.

Varilla lisa: Ø 3 mm.

http://uk.stepperonline.com/nema-820x28mm-18deg-02a-smallest-stepper-motor-8hs110204s-p-81.html

REFERENCIAS

[1] Wikipedia, https://es.wikipedia.org

[2] Pablo Martínez Cano, "Diseño e implementación de sistema de carga de crioprotector para vitrificación

lenta de tejidos", Trabajo Fin de Grado, Universidad de Sevilla, 2016.

[3] Fertilitat, http://www.fertilitaet.de/es/kinderwunsch-sterilitat/therapie/kryo/slow-freezing

[4] Jairo Serrano, http://jairoserrano.com/2016/06/congelacion-de-embriones

[5] Asymptote, http://asymptote.co.uk/VIAFreezeP.php

[6] Manuel Delgado, http://manueldelgadocrespo.blogspot.com.es/p/arduino-mega-2560.html

[7] Arduino, https://playground.arduino.cc/ArduinoNotebookTraduccion/Structure

construcción de sistema electromecánico para criopreservación de tejidos de...

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