guia para la evaluaciÓn y criopreservaciÓn de semen …

GUIA PARA LA EVALUACIÓN Y CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN BOVINO

LABORATORIO DE REPORDUCCIÓN ANIMAL

Florencia Caquetá 12 Julio 2021

GUÍA PARA LA EVALUACIÓN Y CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN BOVINO

CÓDIGO: GU-A-APR-01-01

VERSIÓN: 1

FECHA: 2020-10-13

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HISTORIAL DE CAMBIOS

VERSIÓN DESCRIPCIÓN DEL

CAMBIO MOTIVO DEL CAMBIO FECHA

1 Elaboración del

Documento N/A 19-17-2021



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Tabla de contenido

1. OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 4

2. ALCANCE .............................................................................................................................................. 4

3. DEFINICIONES ..................................................................................................................................... 4

4. EVALUACION DE SEMEN2,3 ................................................................................................................ 5

4.1. Equipos y Materiales ...................................................................................................................... 5

4.2. Examen macroscópico ................................................................................................................... 5

4.2.1. Volumen: ................................................................................................................................ 5

4.2.2. Aspecto, apariencia o densidad: ............................................................................................ 5

4.3. Examen microscópico .................................................................................................................... 6

4.3.1. Motilidad masal: ...................................................................................................................... 6

4.3.2. Motilidad Individual Progresiva (MIP): .................................................................................... 7

4.3.3. Vigor: ...................................................................................................................................... 7

4.3.4. Morfología: .............................................................................................................................. 7

4.3.5. Concentración3: ....................................................................................................................15

5. CONGELACION O CRIOPRESERVACION DE SEMEN ....................................................................20

5.1. Preparación de diluyente: .............................................................................................................20

5.2. Rotulado de pajuelas o pajillas .....................................................................................................25

5.3. Colecta de semen:........................................................................................................................26

5.4. Evaluación calidad seminal: .........................................................................................................26

5.5. Dilución inicial o 1+1: ....................................................................................................................26

5.6. Cálculo concentración espermática viable y cantidad de pajillas: ...............................................27

5.7. Dilución final: ................................................................................................................................28

5.8. Curva de frío o refrigeración: ........................................................................................................28

5.9. Empacado o envasado de semen10: ............................................................................................30

5.10. Sellado de pajillas10: .................................................................................................................35

5.11. Vapores de nitrógeno y congelación: .......................................................................................39

5.12. Evaluación final de calidad de semen: .....................................................................................39

5.12.1. Cálculo espermatozoides (spz) viables por pajilla: .................................................................40

6. DIAGRAMA DE FLUJO .......................................................................................................................41

7. ANEXOS ..............................................................................................................................................44

8. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ....................................................................................................45



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1. OBJETIVOS

Ofrecer las pautas para la correcta evaluación y congelación de semen bovino.

Analizar estratégicamente las características de una muestra de semen proveniente de

un eyaculado o una pajilla.

Definir la viabilidad del material seminal para la criopreservación o congelación.

Reducir la improvisación durante el proceso de evaluación y congelación.

2. ALCANCE

La guía se ha realizado con el fin de describir detalladamente todo el proceso que se lleva a cabo en el laboratorio para la identificación de características macroscópicas y microscópicas de una muestra de semen producto de un eyaculado por vaginal artificial, electro eyaculador, masaje o de material criopreservado; además, detalla los pasos y requisitos mínimos a cumplir para la congelación de semen bovino; destinada para el estudiantado, auxiliar y/o asistente del laboratorio.

3. DEFINICIONES

Colecta de semen: Proceso artificial donde se deposita en un recipiente estéril el semen proveniente de un eyaculado fresco.

Estímulo: Agente físico, químico o biológico que provoca una reacción funcional en un organismo1.

Higienizar: Realizar limpieza o aseo de algún sitio o zona con el fin de conservar la salud y prevenir enfermedades1.

Desinfección: Eliminar o quitar los gérmenes sobre algunas superficie o zonas que puedan ser causante de infección1.

Esterilización: Proceso en el que los microorganismos viables son eliminados completamente sobre alguna superficie o elemento1.

Evaluar: Desarrollar actividades que permitan determinar cuantitativamente el valor de alguna materia.

Criopreservar: Proceso por el cual se conservan íntegramente células o tejidos a temperaturas extremadamente bajas (-196°C) con el fin de disminuir sus funciones vitales y mantenerlas por tiempo indefinido siempre y cuando no se altere el medio de conservación.

Microscopio de contraste de fases: Herramienta microscópica que permite observar células vivas sin necesidad de teñirlas, facilitando la evaluación de integridad celular la cual puede ser alterada al intentar teñirlas.

Ondas espermáticas: Conjunto de millones de espermatozoides vivos en movimiento que provocan ondulaciones.

Lechoso: Sustancia que tiene apariencia de leche.



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Traslucido: Sustancia que por su baja densidad o viscosidad deja pasar la luz pero no se logra observar con nitidez a través de ella.

4. EVALUACION DE SEMEN2,3

Durante el procedimiento se debe prestar especial atención a los choques de temperatura del material seminal obtenido, este parámetro repercute negativamente en el resultado del estudio; por lo que antes de iniciar la evaluación y/o criopreservación del semen, el material a utilizar debe estar a la temperatura indicada en la siguiente guía. Tenga en cuenta diligenciar la tabla FO-A-APR-03-02“Formato de registro resultados de colecta, evaluación y congelación de semen”, que permite realizar seguimiento de la técnica.

4.1. Equipos y Materiales

Prepare todo el material especificado en la tabla 3 y 4 del documento FOA-APR-03-01 “Listado de materiales para colecta, evaluación y criopreservación de semen bovino”.

4.2. Examen macroscópico

Debe realizarse durante e inmediatamente después de haberse colectado el semen; para mayor información del proceso de colecta, consulte el documento: Manual procedimientos para colecta de semen bovino.

4.2.1. Volumen:

Parámetro que se evalúa directamente del tubo colector una vez terminado el proceso de colecta; la cantidad puede estar influenciada por el método de colecta (vagina artificial o electro eyaculador), por la edad del animal, siendo de mayor volumen cuando los toros son más maduros y la frecuencia de los servicios; en general, se menciona que el volumen puede ir de 2 ml a 12 ml.Extraiga75 µl – 1 mililitro de muestra de semen para realizar el examen microscópico, luego registre el resultado (en mililitros) en el formato FO-A-APR-03-02.

4.2.2. Aspecto, apariencia o densidad:

Permite predecir subjetivamente la cantidad de espermatozoides presentes en el eyaculado, cuanto más denso o lechoso se aprecie, mayor concentración. Esta característica se evalúa en el tubo colector y debe registrarse en el formato FO-A-APR-03-02 de acuerdo a su aspecto; siendo de buena calidad aquel semen lechoso y de media o baja calidad aquellos que presenten aspecto blanquecino lechoso o traslucido. Detalle minuciosamente la presencia de sangre o alguna otra inconsistencia (pus o mugre) en el embudo o tubo colector o en la muestra y regístrela en el formato.



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Lechoso

Blanquecino lechoso

Traslucido

Semen lechoso

contaminado

Imagen 1. Aspecto de semen Bovino

4.3. Examen microscópico

Antes de iniciar verifique que los equipos (Microscopio, placa calentadora, tubos graduados, puntas para micropiptetas, portaobjetos, cubreobjetos, beakers y cámara de neubauer) se encuentren limpios, desinfectados y/o esterilizados; de no ser así, descarte el material y realice el proceso de desinfección y esterilización de acuerdo al MB-A-APR-01 manual de limpieza, desinfección y esterilización de equipos, utensilios e instalaciones del laboratorio de reproducción animal. Además, tenga en cuenta que la placa térmica y el baño maría deben permanecer a una temperatura entre 36 – 37°C con los respectivos materiales de trabajo precalentados (portaobjetos, cubreobjetos, puntas para micropipeta, solución salina formolada al 2%).

4.3.1. Motilidad masal:

Con ayuda de una micropipeta o micro-capilar, agregue 20 µl o una gota de semen puro sobre un portaobjetos precalentado y observe en el microscopio con objetivo 10x – 20x el movimiento masivo u ondas presentes. De manera subjetiva determine la proporción y fuerza del movimiento de ondas de acuerdo a la siguiente tabla:

Gota de semen en portaobjetos

precalentado a 37°C

Valor Clasificación Descripción

1 Muy pobre Sin movimientos ni ondulaciones.

2 Pobre Intentos de ondas, se mueven algunos espermatozoides.

3 Aceptable Se alcanzan a identificar ondas o movimientos masivos.

4 Bueno Hay ondas constantes

5 Excelente Rapida formación de ondas, se aprecia formación de remolinos vigorosos.



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Tabla 1. Clasificación subjetiva de la motilidad masal.

4.3.2. Motilidad Individual Progresiva (MIP):

Inmediatamente después de determinar la motilidad masal, coloque una laminilla o cubreobjetos sobre la gota de semen y aprecie en el microscopio con objetivo 40x el avance recto de los espermatozoides; es de suma importancia detallar que la célula espermática sea progresiva y no realiza movimientos ondulados o circulares; busque relacionar en el campo, de 100 células, cuántos espermatozoides son progresivos (resultado en %), registre el dato en el formato FO-A-APR-03-02.

Laminilla sobre gota de semen con portaobjetos precalentado a 37°C

Imagen 2. Preparación de placa para evaluar MIP

4.3.3. Vigor:

Entendido como la fuerza con la que la célula espermática avanza progresivamente y por lo tanto la velocidad con la que atraviesa el campo observado. Este parámetro puede ser determinado simultáneamente con la MIP y se clasifica de 1 a 5, siendo grado 1 aquellos que apenas se mueven sin lograr avanzar y 5 aquellos espermatozoides que avanzan rápidamente y se dificulta hacerles seguimiento mientras atraviesan el campo. Registre el resultado en el formato FO-A-APR-03-02.

4.3.4. Morfología:

Durante el procedimiento de extendido y tinción, se puede provocar cambios en las características de la célula espermática en la cabeza y cola (cabezas sueltas, colas enrolladas), por lo que primero se debe provocar la muerte de la célula con solución salina formolada al 2% a 35 o 37°C.

4.3.4.1. Preparación de solución formolada

Materiales:

Solución salina al 0,9% por 500 mililitros (ml). Formaldehido comercial (concentración conocida). Agitador magnético o de vidrio. Recipiente de vidrio para almacenaje de la solución final.



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Marcador permanente para rotulado.

Procedimiento:

Para determinar la cantidad de formaldehido madre (Formol comercial) a agregar en la solución salina al 0,9% por 500 ml para preparar solución formolada al 2% u otra concentración deseada, aplique la siguiente fórmula:

𝑉 =(𝑐𝑑 ∗ 𝑣𝑑)

𝑐𝑐

Donde:

V: Volumen (ml) de formaldehido madre a agregar.

cd: Concentración deseada.

vd: Volumen deseado en ml.

cc: Concentración conocida. Ejemplo: Se necesita preparar 500 mililitros de solución salina formolada al 2% a partir de formol comercial al 37%; entonces:

𝑉 =(2% ∗ 500 𝑚𝑙)

37%=

1000 𝑚𝑙

37= 𝟐𝟕, 𝟎𝟐 𝒎𝒍

Para preparar solución formolada al 2% es necesario agregar 27 ml de formol al 37% a 500 ml de solución salina. Para realizar la mezcla, vierta todo el contenido de la solución salina en el recipiente de vidrio; luego, agregue los 27 ml de formaldehido al 37% y proceda a mezclar con el respectivo agitador por 2 – 5 minutos; por último, cierre el recipiente y rotule con el tipo de solución (Solución salina 0,9% formolada al 2%) y la fecha de preparación, almacene la solución en un lugar aislado a temperatura ambiente.

4.3.4.2. Extendido

Los extendidos con semen puro no son apropiados para la evaluación morfológica porque la alta concentración espermática reúne gran cantidad de células que permanecen unas encima de otras, observándose altas densidades de espermatozoides por campo que impiden la clasificación, por lo que se recomienda realzar una dilución 2:1 (2 de disolvente por 1 de semen puro) para dispersar las células y poder evaluar correctamente la integridad del espermatozoide (Imagen 3).



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Alta densidad espermática Dispersión apropiada

por campo. por campo.

Imagen 3. Extendidos espermáticos con semen puro y diluido. Objetivo 100x Para ello, utilice la solución salina formolada al 2% previamente calentada a 35 o 37°C. Primero agregue una gota de semen puro sobre portaobjetos precalentado e inmediatamente añada sobre la gota de semen dos gotas de la solución salina formolada al 2% precalentada; esto promoverá muerte espermática sin alterarse la morfología. Luego, utilice otro portaobjetos para apoyar con uno de los bordes cortos la gota diluida y permita que esta se distribuya completamente por el borde; enseguida haga un movimiento rápido hacia adelante del portaobjetos para formar una capa uniforme y culminar con el extendido (Imagen 4). En algunos casos la capa formada es extremadamente gruesa para lo cual se podría realizar el extendido en otro portaobjetos; por último, permita secado de la placa.

Borde corto de portaobjetos en ángulo de 30 – 45° sobre gota de semen diluida 2:1.

Distribución completa de la gota sobre el borde corto del portaobjetos.

Desplazamiento de la gota sobre portaobjetos para formar la capa.

Imagen 4. Extendido de semen diluido. Es importante recapitular que durante el extendido puede generarse cambios morfológicos de las células, principalmente cabezas sueltas por lo que, al evidenciarse altas proporciones de esta anomalía, se debe repetir el extendido para descartar los errores del procedimiento.

4.3.4.3. Tinción

Estando el frotis o extendido seco, se procede a realizar la tinción para la identificación de las características espermáticas, este procedimiento se realiza con múltiples colorantes; a



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continuación, se describe los pasos para realizar tinción de Farelly® la cual no es recomendada para semen descongelado que contenga glicerina.4

Implementos de la tinción:

Frasco A: Solución fijadora a base de formalina al 3,5%. Frasco B: Anilina – azul. Frasco C: Cristal – violeta.

Procedimiento:

a.) Prepare cuatro tubos graduados para verter en tres de ellos 35 – 40 ml de cada solución, en el tubo cuatro, agregue 35 – 40 ml de agua destilada y rotule el tubo y la tapa de cada solución con la letra correspondiente (A, B o C)

Solución A

Solución B Solución C

Imagen 5. Vertimiento de solución para tinción Farelly® en frasco graduado por 50 ml

b.) Con ayuda de pinzas de disección, sumerja el extendido realizado en la solución fijadora A por 10 segundos.

c.) Cumplido el tiempo, realice el mismo procedimiento en la solución B durante 20 segundos.

d.) A continuación, enjuague el portaobjetos en agua destilada, sumergiendo repetidas veces (mínimo 5).

e.) Inmediatamente, sumerja el portaobjetos en el colorante C por 5 segundos. f.) Repita el enjuague en el agua destilada, sumergiendo repetidas veces (mínimo 5). g.) Permita el secado completo de la tinción colocándola en un sitio aislado. h.) Examine en el microscopio con objetivo 100 x bajo aceite de inmersión.



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Extendido sumergido en solución A por 10 segundos

Extendido sumergido en solución B por 20 segundos

Extendido enjuagado en agua destilada por mínimo 5 veces

Extendido sumergido en solución C por 5 segundos

Extendido enjuagado final en agua destilada por mínimo 5 veces

Imagen 6. Procedimiento de tinción de Farelly®

4.3.4.4. Determinación de anormalidades espermáticas

Una vez seca la tinción, ubique el portaobjetos en el microscopio y enfoque con objetivo 100x sumergido en aceite de inmersión para recorrer la placa ordenadamente, procure enfocar los sitios de mejor visibilidad y menor cantidad de espermatozoides por campo para evaluar correctamente las características morfológicas:

Imagen 7. Recorrido de una tinción

Identifique las células espermáticas por campo y evalúe la integridad de cada parte de ellas (cabeza, acrosoma, pieza media y cola); realice una lista como la que se presenta a continuación y determine a qué clasificación pertenece la célula observada:

Normal (N).

Cabeza Suelta (CS).

Defecto de Cabeza (DC). Comprende: Cabeza piriforme, cabeza pequeña, cabeza gigante, cabezas dobles, acrosoma protuberante, acrosoma desprendido.

Defecto de Pieza Media (DPM).

Cola Enrollada Proximal (CEP).

Cola Enrollada Distal (CED).

Gota Citoplasmática Proximal (GCP). NOTA: De acuerdo con la Society for Theriogenology, la gota citoplasmática distal, no es considerada anormalidad espermática en toros destinados para servicio natural puesto que se



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ha comprobado que las gotas pueden desprenderse de la pieza intermedia distal por aumento de la fluidez5. Cuente 100 – 200 células espermáticas y determine el porcentaje (%) morfológico del semen evaluado. Registre el resultado en el formato FO-A-APR-03-02o FO-A-APR-06-02. Tenga en cuenta que en la tinción también pude observarse otro tipo de células (leucocitos, eritrocitos) los cuales deben ser tenidos en cuenta y relacionarlos con la anamnesis del animal y con los resultados del espermiograma (Imagen 8).

Imagen 8. Morfología espermática con diferentes tinciones (Farelly® y Eosina-nigrosina).

4.3.4.5. Porcentaje de espermatozoides vivos y muertos

Este procedimiento permite evaluar la vitalidad del semen; su aplicación toma mayor importancia en muestras donde las características de MIP y vigor son pobres, el procedimiento de tinción se realiza con eosina que colorea los espermatozoides muertos de rosa oscuro debido a la absorción de este componente al interior de la célula por daño de la membrana espermática y la nigrosina que produce un fondo oscuro siendo más fácil apreciar

espermatozoides vivos que no son teñidos6.

Preparación de eosina – nigrosina:

a.) Materiales67:

Material Cantidad



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Nigrosina al 10% (gr) 10

Eosina Y al 1% (gr) 1,67

Citrato de sodio (gr) 2,9

Agua destilada (ml) 100

Gramera de alta precisión 1

Estufa (Uds) 1

Filtro papel (Uds) 1

Agitador de vidrio (Uds) 1

Beaker por 100 ml (Uds) 1

Recipiente almacenamiento por 100 ml (Uds) 1

Marcador permanente (Uds) 1

b.) Procedimiento:

No. PASOS A

REALIZAR DESCRIPCION RESPONSABLE

1 Pesaje de los componentes

Realice pesaje de la eosina, nigrosina, citrato de sodio y agua destilada con balanza de alta precisión previamente calibrada.

Docente y auxiliar de Laboratorio.



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2 Calentado de agua y mezcla

Caliente los 100 ml de agua destilada a 60°C y proceda a agregar la nigrosina hasta disolver completamente ayudándose del agitador de vidrio; realice el mismo procedimiento para disolver la eosina. Una vez terminado el proceso, agregue a la misma temperatura (60°C) el citrato de sodio; el citrtato evita la formación de artefactos mediante el incremento de la osmolaridad de la solución de Eosina – nigrosina (hipotónicas).

Docente y auxiliar de laboratorio.

3 Enfriado y

filtrado

Permita el descenso a temperatura ambiente, realice el filtrado de la solución preparada; en caso de ser necesario, ajuste el PH a 6,8 – 7.


4 Envasado y

rotulado

Coloque la solución en un recipiente hermético, rotule de acuerdo a los reglamentos de la universidad (nombre del producto, fecha de elaboración, contenido).

Docente y auxiliar de laboratorio y estudiantes bajo supervisión del docente.

5 Almacenaje A temperatura ambiente puede ser estable hasta por 3 meses y refrigerado por años.


6 Cuidados

Evite la contaminación de la solución a la hora de extraer el contenido, siempre utilice material estéril; pues la contaminación genera formación de colonias bacterianas y/o fúngicas, visibles durante la evaluación de la tinción por microscopía.


c.) Extendido y tinción:

Antes de iniciar con el procedimiento, atempere la solución de eosina-nigrosina a 37°C para evitar malformaciones espermáticas; agregue una gota (15µl) de semen puro sobre el portaobjetos e inmediatamente deposite dos gotas (30µl) de eosina nigrosina y mezcle, luego realice el extendido tal cual el descrito en el punto 4.3.4.2.; en caso de observarse coloración excesiva, realice el extendido en otro portaobjetos o delante de la gota gruesa; promueva el secado, ensamble el portaobjetos en el microscopio y agregue aceite de inmersión para observar con objetivo 100x.



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d.) Interpretación: Los espermatozoides muertos se verán de color rojo o rosado oscuro, mientras que los vivos apenas tendrán un rosado tenue o blanco (Imagen 9). Cuente 100 o 200 células y registre el resultado en porcentaje (%), siendo aceptable un valor mínimo del 70% de células vivas3.

Imagen 9. Apariencia de espermatozoides vivos y muertos

4.3.5. Concentración3:

El cálculo se expresa en millones de células por mililitro o centímetro cúbico (x106/ml), este procedimiento puede ser realizado de último, puesto que no necesita de células vivas; a continuación, se describe el proceso para hallar concentración espermática con diferentes equipos:

Cámara de Neubauer:

Esta herramienta también conocida como hematocitómetro cuenta con cuadrículas de dimensiones conocidas (Imagen 10), visibles perfectamente en el microscopio que permite realizar el conteo de células para determinar la cantidad presente en un mililitro. En objetivo 10x se pueden apreciar 9 cuadros de gran tamaño, de los cuales el del centro cuenta con mayor cantidad de cuadriculas y será el de interés en el conteo celular, observándose 25 cuadros pequeños (5x5)divididos cada uno en 16 más pequeños (4x4).

Imagen 10. Cuadrículas de la cámara de Neubauer.



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Para realizar el conteo de células espermáticas, realice una dilución de 1:200, siendo 1 la proporción de semen y 200 una solución formolada (la descrita en el punto 4.3.4.1.); tenga en cuenta que antes y después de realizar la dilución debe agitar los componentes puesto que las células espermáticas se decantan rápidamente. Ejemplo de dilución 1:200: 0,05 ml o 50 µl de semen disueltos en 10 ml de solución formolada. 0,025 ml o 25 µl de semen disueltos en 5 ml de solución formolada.

A continuación, coloque un cubreobjetos o laminilla sobre las cuadrículas de la cámara, proceda a agitar y aspirar con micropipeta o capilar la solución preparada y viértala sobre las ranuras para que se distribuya por capilaridad, asegúrese de la distribución completa y sin burbujas sobre las dos cuadrículas; por último, espere por dos minutos para que se decanten las células espermáticas antes de iniciar con el conteo. En el microscopio enfoque con el objetivo 10x para encontrar la cuadrícula de 5x5 (central), enseguida cambie a objetivo 40x y realice el conteo de todos los espermatozoides presentes en 5 cuadros de cualquiera de las formas descritas en la imagen 11. En cada cuadro que tiene en su interior otra cuadrícula de 4x4 (16 cuadros) debe contarse la totalidad de las células incluidas las cabezas que se encuentran sobre dos de los bordes del cuadro (en L), descarte aquellas células que tienen la cabeza por fuera del cuadro y la cola dentro; sume la cantidad obtenida en cada cuadro y aplique la fórmula.

Imagen 11. Flechas gruesas: ranuras de la cámara para verter la solución 1:200 y métodos para

conteo de células espermáticas. Para el cálculo de la concentración espermática se multiplica el resultado de la suma de los cinco cuadros por el factor de conversión (10.000):

1

200𝑥

1

10𝑥

1

5=

1

10.000

Donde:

1/200 :Factor de dilución.



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1/10 :Altura o profundidad de la cámara.

1/5 : Cantidad de cuadros contados. Con el fin de facilitar el procedimiento, se puede agregar un 0 a la derecha de la sumatoria (siempre y cuando las características de la cámara, dilución y cantidad de cuadros sea la misma) y el resultado se expresa en millones por mililitro (x106/ml)

Fotómetrominitube SDM1®8: Equipo especial para determinar concentración espermática en bovinos, utilice solamente semen puro.

No. PASOS A


1 Calibración del

equipo

Consulte el documento PD-A-APR-02 Procedimientos para calibración y verificación de equipos de medición del Laboratorio de Reproducción Animal.

Docente y auxiliar de Laboratorio.

2 Encendido del

equipo

Conecte el equipo a la fuente de alimentación de 12 voltios o instale las baterías en la parte posterior del fotómetro, encienda y espere que aparezca en el display “Ready”.


3 Llenado de

cubeta

Deposite semen puro sobre la abertura de la micro-cubeta hasta observar el llenado completo de la ranura, elimine el exceso de material seminal.

También puede cargar la micro-cubeta colocándola verticalmente para sumergirla sobre el semen puro y por capilaridad sea cargada, retire el material adherido por fuera de la abertura con toalla absorbente, recuerde que antes de realizar este procedimiento debe agitar suavemente el semen.


4 Ensamble de

la cubeta en el equipo

Estando el fotómetro en modo “Ready” y con el porta-cubetas completamente abierto, inserte la micro-cubeta cargada con la muestra y gire completamente el porta-cubetas a la derecha y espere la lectura.

Docente y auxiliar de laboratorio y estudiantes bajo supervisión del docente.



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5 Resultado Registre el resultado en el formato correspondiente en millones por mililitro.


6 Retiro de la

cubeta

Saque la micro-cubeta del porta-cubetas, lave la micro-cubeta con abundante agua y jabón, deposítela en solución desinfectante.


Espermiodensímetro:

Prueba subjetiva que permite conocer en campo la concentración estimada de semen por mililitro, este resultado debe ser confirmado por alguna de las dos pruebas expuestas anteriormente (cámara de Neubauer o fotómetro SDM1). El equipo determina la densidad seminal, consta de un recipiente con una escala en la parte posterior (00 – 100. Imagen 12 A) donde a través de la luz, se determina la escala visible y por medio de una tabla preestablecida calcula subjetivamente la concentración espermática.

Imagen 12. Espermiodensímetro



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Imagen 13. Escala concentración espermática de bovino de acuerdo al factor de dilución

No. PASOS A


1 Llenado del

espermiodensímetro Mida 10 ml de agua destilada y agréguelos al recipiente (Imagen 12 B).

Docente, auxiliar de Laboratorio y estudiantes

2 Determine el

volumen a agregar

De acuerdo al volumen de semen obtenido y al aspecto o apariencia (Imagen 1), fije la cantidad de semen a agregar al espermiodensímetro. Utilice menor volumen para la prueba al obtener semen lechoso y mayor volumen cuando la muestra sea blanquecino lechoso (Imagen 1), siendo 0,1 ml el menor volumen permitido y 1 ml el mayor.


3 Adición de semen

puro

De acuerdo al volumen de semen que previamente estableció (de 0,1 ml a 1 ml), extraiga la misma cantidad de agua destilada (Imagen 12 C) y proceda a agregar el semen puro al espermiodensímetro. Ejemplo: Si se ha obtenido un volumen de 5 ml de semen y su apariencia es lechosa, se podría manejar con 0,5 o menor ml; para lo cual se extrae 0,5 ml de agua destilada y se agrega 0,5 ml de semen (Imagen 12 D).


4 Homogenización de

la muestra

Con ayuda del palmar del dedo pulgar, tape el orificio del espermiodensímetro y bata vigorosamente para promover la mezcla entre el agua destilada y el semen (Imagen 12 E, F)




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5 Lectura

Ubíquese en un sitio con alta luminosidad y agarre el espermiodensímetro desde la parte inferior para enfrentarla con la luz; observe y determine hasta qué medida de la escala puede identificar y memorícela (Imagen 12 G).

Docente, auxiliar de Laboratorio y estudiantes.

6

Cálculo de concentración

espermática en millones por ml

(x106/ml)

Diríjase a la tabla (Imagen 13) y ubíquese en el factor de dilución que realizó (Ej.: 0,5 ml); a continuación, enfrente el resultado con el valor que observó en el espermiodensímetro (Ej.: 20); dando como resultado en el ejemplo: 1270 x106/ml

Docente, auxiliar de Laboratorio y estudiantes.

5. CONGELACION O CRIOPRESERVACION DE SEMEN

Para la criopreservación de semen debe tener en cuenta la completa asepsia en el procedimiento, omita la improvisación pues esto puede repercutir en la calidad del semen congelado; cada paso por mínimo que sea debe ser atendido con especial cuidado. Tenga en cuenta que los toros a los que se congela material seminal han sido sometidos previamente a estudios físicos, clínicos, productivos, reproductivos y/o genómicos para lo cual han debido ser clasificados como satisfactorios en cada una de estas actividades, las cuales han sido registradas y evaluadas en los siguientes documentos: FO-A-APR-03-02, FO-A-APR-06-01 o FO-A-APR-06-02, FO-A-APC-01-12, MC-M-IC-01. Proceso general para congelar semen bovino:

a.) Preparación de diluyente. b.) Rotulado de pajuelas o pajillas. c.) Colecta de semen. d.) Evaluación calidad seminal. e.) Dilución inicial o 1+1. f.) Cálculo concentración espermática y

cantidad de pajillas. g.) Dilución final.

h.) Curva de frío o refrigeración. i.) Empacado o envasado de semen. j.) Sellado. k.) Vapor de nitrógeno. l.) Congelado. m.) Evaluación final de calidad de

semen.

5.1. Preparación de diluyente:

En el mercado se puede encontrar gran variedad de productos para la criopreservación de semen bovino, cada uno exige protocolos específicos para su preparación y se debe garantizar la correcta aplicación del método recomendado por el fabricante. A continuación, se describe el proceso de preparación de diluyente con Triladyl®9:

I. Materiales:



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La cantidad de materiales dependerá del volumen de diluyente que se desea preparar:

Material

Triladyl® concentrado (250 gr)

Agua estéril

Huevo de campo fresco (del día)

Probeta graduada o Beaker estéril (50 – 1000 ml)

Tubo graduado por 50 ml o más estéril

Papel filtro estéril

Jeringas estériles de más de 10 ml

Agitador de vidrio estéril

Caja de Petri

Aguja estéril 16 g 1 ½”

Con el frasco de Triladyl® concentrado de 250 gr, se puede preparar 1250 gr de diluyente el cual puede permanecer estable por 1 semana a +5°C siempre y cuando esta no haya sido precalentada, en caso tal que haya sido calentada para realizar diluciones, su tiempo de almacenamiento NO debe exceder los 2 días.

II. Distribución de los componentes: Una vez obtenido el diluyente, éste debe estar distribuido por una parte de Triladyl® concentrado, tres partes de agua estéril y una parte de yema de huevo, el cual equivale al 20% del volumen final; es decir, del total de diluyente que se puede preparar con los 250 gr de Triladyl® concentrado (1250 gr), 250 gr corresponden a yema de huevo; el restante (1000 gr) corresponden a 250 gr de Triladyl® concentrado y 750 gr de agua estéril. Debido al poco tiempo que permanece estable la dilución, ésta NO debe ser preparada en su totalidad, por lo que cada vez que se va a criopreservar semen, se debe preparar el diluyente de acuerdo a las estimaciones de pajillas o pajuelas a congelar; por lo que, al prever congelar 100pajillas de 0,5 ml, debería prepararse 50 ml de diluyente, para lo cual se realiza la conversión de los componentes por medio de regla de tres simple:

Cantidad de Triladyl® concentrado para preparar 50 ml de diluyente:

250 𝑔𝑟 𝑇𝑟𝑖𝑙𝑎𝑑𝑦𝑙® → 1250 gr diluyente

𝑥 → 50 gr diluyente

𝑋 =250 𝑔𝑟 ∗ 50 𝑔𝑟

1250 𝑔𝑟=

12500

1250= 𝟏𝟎 𝒈𝒓 𝒅𝒆 𝑻𝒓𝒊𝒍𝒂𝒅𝒚𝒍®

Cantidad de agua estéril para preparar 50 ml de diluyente:



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750 𝑔𝑟 𝐴𝑔𝑢𝑎 𝑒𝑠𝑡é𝑟𝑖𝑙 → 1250 gr diluyente


𝑋 =750 𝑔𝑟 ∗ 50 𝑔𝑟

1250 𝑔𝑟=

37500

1250= 𝟑𝟎 𝒈𝒓 𝒅𝒆 𝒂𝒈𝒖𝒂 𝒆𝒔𝒕é𝒓𝒊𝒍

Cantidad de yema de huevo para preparar 50 ml de diluyente:

250 𝑔𝑟 𝑌𝑒𝑚𝑎 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑒𝑣𝑜 → 1250 gr diluyente


𝑋 =250 𝑔𝑟 ∗ 50 𝑔𝑟

1250 𝑔𝑟=

12500

1250= 𝟏𝟎 𝒈𝒓 𝒚𝒆𝒎𝒂 𝒅𝒆 𝒉𝒖𝒆𝒗𝒐

La suma de los tres componentes debe dar la cantidad de diluyente que se desea preparar:

10 𝑔𝑟 𝑇𝑟𝑖𝑙𝑎𝑑𝑦𝑙® + 30 gr agua estéril + 10 gr yema de huevo = 𝟓𝟎 𝒈𝒓 III. Extracción de la yema de huevo:

Recuerde que, para todos los procedimientos de laboratorio, se debe usar los equipos de protección individual (EPI).

No. PASOS A REALIZAR

DESCRIPCIÓN RESPONSABLE

1 Tipo de huevo

Utilice huevos de gallina frescos (del día) provenientes de animales a pastoreo que no hayan recibido medicamentos en los últimas 15 días ni manifestado signos de enfermedad.

Docente, auxiliar de Laboratorio y estudiantes bajo supervisión

2 Manejo del huevo

Omita movimientos bruscos durante la manipulación. Lave con abundante agua (preferiblemente destilada) la totalidad del huevo y retire cualquier impureza sobre la cáscara, al final seque con gasa estéril. En la medida de lo posible, esterilice la cáscara por flameado (pasarla por una llama).




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3 Extracción de la

yema

Agarre el huevo desde el extremo más redondeado permitiendo completa visibilidad del extremo puntiagudo; con ayuda de un material rígido previamente desinfectado y/o esterilizado, rompa la cáscara de manera longitudinal.


4 Extracción de la

yema

Desprenda la cáscara del huevo evitando derramen de la clara y yema.


5 Extracción de la

yema

A continuación, vierta el contenido del huevo sobre el papel filtro y permita desplazamiento del mismo por toda la superficie con el fin que la clara se adhiera al filtro y la yema quede libre


6 Extracción de la

yema

Coloque sobre una caja de Petri, un filtro nuevo y coloque la yema.




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7 Extracción de la

yema

A continuación, utilice una aguja estéril 16 g 1 ½ para retirar la membrana que cubre la yema y enseguida, succione con jeringa estéril la yema del huevo.


8 Extracción de la

yema

Deposite el contenido necesario para la preparación del diluyente en beaker estéril (Ej:10 ml o gr), el excedente debe ser desechado.


IV. Preparación:

Solución madre: Vierta en una probeta graduada o beaker estéril la cantidad de Triladyl® concentrado necesario para la preparación del diluyente (Ej.: 10 ml o gr); a continuación, agregue la cantidad calculada de agua estéril (Ej.: 30 ml o gr) al recipiente que contiene el Triladyl® vertiendo gradualmente y sobre las paredes del recipiente.



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Imagen 14. Preparación de solución madre.

Mezcla solución madre con la yema de huevo:

Una vez obtenida la solución madre, ésta debe verterse suavemente y por completo sobre el recipiente que contiene la yema de huevo para posteriormente mezclarlas con ayuda de un agitador de vidrio. Es pertinente indicar que el fabricante enfatiza la importancia de realizar el procedimiento tal cual el descrito, pues así se promueve el desarrollo total de las cualidades del producto. Siempre debe agregar la solución madre a la yema y NO de la yema a la solución madre.

Imagen 15. Agregar la solución madre a la yema, NO al revés.

Como ya se mencionó, el diluyente puede conservarse refrigerado (+5°C) durante una semana siempre y cuando no haya sido precalentado, para lo cual vierta el diluyente sobre tubo estéril con tapa.

5.2. Rotulado de pajuelas o pajillas

La identificación de las pajuelas debe realizarse con la suficiente información para identificar la raza y el número o nombre del animal de donde proviene el semen y el fabricante; este procedimiento podría considerarse de mayor importancia, puesto que al fallar en la identificación de las pajuelas; se perdería por completo la información de proveniencia, siendo un material desconocido en los termos que conservan semen de varios individuos. El método de rotulado, podría realizarse de forma mecánica o manual, registrando como mínimo los siguientes datos:

Empresa que procesa el material: Con abreviatura (Ejemplo: Laboratorio de Reproducción Animal – Universidad de la Amazonia = LAB.R.A. - U.A σ el código (número de registro ICA si está vigente).

Raza: Con abreviatura (Ejemplo: Criollo Caqueteño = CCQ)

Nombre o número del toro (Ejemplo: 012-15)

Fecha (DD/MM/AAAA) y Lote (Ejemplo: F: 05/03/2021 L: 001)

I. Rotulado de pajillas de forma manual:



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Con ayuda de un estereoscopio, enfoque la superficie de la pajilla e inicie el rotulado a partir del tapón de algodón. Utilice marcador permanente de marca conocida (Ejemplo: Sharpie®) color negro - punta ultra fina.

Imagen 16. Rotulado manual de pajillas

5.3. Colecta de semen:

Para la colecta del material seminal, revise el documento “Manual procedimientos para colecta de semen bovino”, determine el tipo de procedimiento que va a realizar y prepare todos los materiales y utensilios del documento FOA-APR-03-01 “listado de materiales para colecta, evaluación y criopreservación de semen”; una vez obtenido el semen e iniciado la dilución, debe promoverse el descenso de temperatura gradualmente y nunca permitir que existan fluctuaciones, pues altera la calidad del producto; además, proteja el material seminal de los rayos de luz.

5.4. Evaluación calidad seminal:

Una vez obtenido el semen, extraiga como mínimo 40 µl de semen puro y deposítelos en tubo eppendorft para determinar inmediatamente motilidad masal, MIP y Vigor, luego morfología y concentración espermática (consulte el punto 4 de la presente guía). Como criterios mínimos para determinar si se congela o no el semen obtenido, compruebe:

MIP mínima (%) 70

Vigor mínimo (1 – 5) 4

Morfología: Mínimo spz Normales (%) 70

Registre en el formato FO-A-APR-03-02 “registro de resultados de colecta, evaluación y congelación de semen” los hallazgos de cada evento.

5.5. Dilución inicial o 1+1:

Mida en el tubo colector la cantidad del eyaculado presente y agregue el mismo volumen de diluyente previamente temperado a 36,5°C, vierta suavemente y escurriendo por las paredes el diluyente hacia el recipiente del semen; una vez realizada la primera dilución, verifique la vitalidad del semen; mantenga la temperatura del semen diluido y el diluyente entre +28°C hasta +32°C mientras realiza la dilución final, hecho que podría asegurarse con tan solo apagar el baño maría y mantener sumergidos los recipientes que contienen el semen y diluyente.



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Imagen 17. Temperado del semen y diluyente

5.6. Cálculo concentración espermática viable y cantidad de pajillas:

Una vez evaluada la MIP y vigor; determine la concentración espermática por mililitro con la técnica de cámara de Neubauer o Fotómetro minitube SDM1® (Punto 4.3.5.) y regístrela en el formato FO-A-APR-03-02 “registro de resultados de colecta, evaluación y congelación de semen”.

Para determinar la concentración espermática viable, entendida como la cantidad de espermatozoides vivos y funcionales en una muestra determinada, aplique la siguiente fórmula:

Spz viables = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑦𝑎𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 ∗ 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑀𝑜𝑟𝑓𝑜𝑙𝑜𝑔í𝑎 (%) ∗ 𝑀𝑜𝑡𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (%)

Para calcular el número de pajillas a empacar, divida el resultado anterior por la concentración espermática que se desea asegurar en cada pajuela, recomendando que, por cada una, haya entre 20 – 30 x106; es decir, la fórmula sería de la siguiente manera:

Cantidad de pajillas =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑦𝑎𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 ∗ 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑀𝑜𝑟𝑓𝑜𝑙𝑜𝑔í𝑎 (%) ∗ 𝑀𝑜𝑡𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (%)

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑠𝑒𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑝𝑎𝑗𝑖𝑙𝑙𝑎 (20 𝜎 30 𝑥106)

Ejemplo: Se obtienen los siguientes resultados del eyaculado de un toro:

Volumen (ml) 8

MIP (%) 75

Concentración *106/ml 600

Morfología: % Spz normales 77



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Para determinar la cantidad de pajillas que se obtienen del eyaculado asegurando una concentración de 30 millones de espermatozoides por pajilla:

Cantidad de pajillas =8 ∗ 600 ∗ 77% ∗ 75%

30 =

4800 ∗ 77% ∗ 75%

30=

3696 ∗ 75%

30=

2772

30= 𝟗𝟐

De acuerdo con las características del eyaculado, se podrían obtener 92 pajillas con una concentración de 30 millones de espermatozoides por pajilla.

5.7. Dilución final:

La dilución final debe estimarse según la cantidad de pajillas que desea empacar, según el tamaño de la pajilla o pajuela que se va a utilizar (0,25 ml o 0,5 ml) y según el volumen obtenido en la dilución inicial; para lo cual se aplica la siguiente fórmula:

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 = (𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑗𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 ∗ 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑎𝑗𝑖𝑙𝑙𝑎 (0,25 𝜎 0,5 𝑚𝑙)) − 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

Ejemplo: De acuerdo con los datos del ejemplo anterior, se podría suponer que, al momento de la dilución inicial, se agregaron 8 ml de diluyente; obteniendo un total de 16 ml de semen diluido y se desea empacar en pajillas de 0,5 ml, por lo que la fórmula sería:

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 = (92 ∗ 0,5 ) − 16 = 46 − 16 = 𝟑𝟎𝐦𝐥

Entendiendo que:

los 46 ml es el volumen necesario para empacar 92 pajillas de 0,5 ml. De los 46ml que se necesitan, se tienen 16 ml disponibles pertenecientes a 8 ml de

semen del eyaculado y 8 ml de la dilución inicial. Los 30 ml es la cantidad de diluyente que se debe agregar en la dilución final.

Agregue la cantidad de diluyente necesario para la dilución final suavemente y escurriendo por las paredes hacia el recipiente del semen, tenga en cuenta que la temperatura del diluyente puro y el semen diluido debe ser igual. Finalmente proteja el recipiente con papel aluminio o selle con la respectiva tapa. NOTA: Una vez colectado el toro, el tiempo para evaluación, cálculos y dilución final no debe exceder los 10 minutos.

5.8. Curva de frío o refrigeración:

Completada la dilución final, permita el descenso gradual de la temperatura; recuerde que se debe evitar los choques térmicos. Para asegurar el descenso pasivo, podría continuar con el semen sumergido en el agua del baño maría mediante la extracción en un recipiente que asegure la completa inmersión del tubo que contiene el semen a congelar y llevarlos a la nevera temperada a 5°C por un lapso de 4 horas; simultáneamente, ensamble las pajillas en cada una



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de las regletas o magazines de pajuelas y guárdelas en la nevera junto con la empacadora de pajillas o empajilladora con los respectivos accesorios (agujas de succión, manguera, Plomo, cono para semen, regletas). NOTA: Durante el proceso de refrigerado del semen, por ningún motivo abra la nevera ya que este evento eleva la temperatura al interior del recinto y provoca fluctuaciones térmicas que afectan la calidad seminal.

Ensamblado de las pajillas en las regletas o magazín de pajuelas10:

No. PASOS A

REALIZAR DESCRIPCIÓN RESPONSABLE

1 Accesorios para el

ensamblado

El dispositivo para carga de pajillas consta de: A: Bloque presionador y desprendedor. B: Pajuelas o pajillas C: Regleta o magazín de pajuelas. D: Porta regleta o porta magazín.


2 Distribución de las

pajillas sobre regleta

Desplace las pajillas sobre la regleta y permita que en cada una de las ranuras se deposite 1 pajilla, cada regleta debe mantener 36 pajillas.




VERSIÓN: 1

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3 Alineación de las

pajillas

Coloque el porta magazín de manera vertical para promover la alineación de las pajillas.


4 Fijación de las

pajillas a la regleta o magazín de pajuelas

Ensamble el bloque presionador sobre los surcos longitudinales de la regleta e inmediatamente realice fuerza vigorosamente hasta percibir el “click” de fijación de las pajillas a la regleta.


5.9. Empacado o envasado de semen10:

Completadas las 4 horas de refrigeración a 5°C, agite suavemente el semen refrigerado y tome una muestra de semen para observar en el microscopio la motilidad y vigor de las células, estas deben conservar su vitalidad; si la muestra presenta motilidad inferior al 30% y vigor < 3, repita el proceso de evaluación, si estas características continúan, desista en el proceso de congelación y deseche el semen. Si el semen ha soportado el proceso de refrigeración, proceda a empacar en las pajillas:

Saque la empacadora de pajillas o empajilladora de la nevera y ubíquela en un sitio previamente desinfectado y con poca luminosidad, ensamble los materiales en su sitio:



VERSIÓN: 1

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No. PASOS A


1 Identificación de las

partes de la empajilladora

A: Cono para semen. B: Prensa de manguera. C: Cabezal de llenado. D: Magazín de esferas. E: Recipiente de vidrio bomba de vacío. F: Bomba de vacío. G: Palanca de operación. H: Dispositivo fijador. I: Manguera de succión. J: Cabezal succión. K: Manguera de llenado. L: Plomo




VERSIÓN: 1

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2 Identificación de

cabezales

A: El cabezal de llenado tiene agujas largas. B: El cabezal de succión cuenta con un agujero en la parte inferior y las agujas son más cortas. En caso de ser necesario, cambie los sellos blancos que están sobre las agujas.


3 Ensamblado de los

cabezales

Identifique el agujero en el chasis de la empajilladora que se encuentra en medio de los tornillos mariposa; enseguida, confronte los agujeros con el cabeza de succión y ajústelos apretando los tornillos mariposa.

Monte el cabezal de llenado al lado contrario y ajústelo de la misma forma que el anterior.




VERSIÓN: 1

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4 Conexión bomba de vacío al cabezal de

succión

Por medio de la manguera de succión, conecte el cabezal de succión con el conector libre del recipiente de vidrio.


5 Conexión cabezal de

llenado

En un extremo de la manguera de llenado, conecte el plomo. Con el otro extremo libre, pase la manguera a través de la prensa de manguera para finalmente conectar con el cabezal de llenado.


Envasado del semen:

No. PASOS A


1 Encendido de la

bomba

Conecte la bomba de vacío a la fuente de alimentación y presione el botón de encendido.




VERSIÓN: 1

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2 Montaje de magazín de pajuelas o regleta

a la empajilladora

Encarrile la regleta en la empajilladora hasta el primer tope.


3 fijación de las

pajuelas

Coloque el dispositivo fijador sobre la regleta con el fin de mantener en posición fija cada una de las pajillas mediante presión leve.


4 Llenado de las

pajillas

Manteniendo las pajillas fijas, oprima hacia abajo la palanca de operación y observe que las agujas de los cabezales ingresan en cada extremo de la pajilla; una vez atravesado el tapón de cada pajuela, se generará un vacío provocando ingreso del semen diluido.




VERSIÓN: 1

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Preste mucha atención mientras realiza este procedimiento, pues las agujas podrían quedar por fuera de una pajilla.

5 Llenado manual

Con ayuda de jeringa por 1 σ 3 ml y aguja 21 g 1 ½” (verde), llene cada una de las pajuelas; este procedimiento también es útil en pajillas que no se han llenado completamente con la empajilladora.


5.10. Sellado de pajillas10:

El sellado de las pajuelas puede realizarse por calor, con alcohol polivinílico o mediante balines metálicos; sin importar el método que se utilice, siempre debe promoverse la formación de una burbuja o espacio de aire entre el semen y el material sellador, pues esto asegura una congelación y descongelación exitosa, evitando que se rompa la pajilla o por presión se expulse el material sellador.

Sellado manual por calor:

Se considera el método más seguro cuando la técnica está completamente mecanizada, pues su sellado es hermético y la aplicación de calor es precisa; cuando se realiza de forma manual, se puede exceder el tiempo de calor ejercido sobre la pajilla y esta puede romperse; sin embargo, podría obtenerse buenos resultados al manejar los tiempos de calor, regulando la calentadora en 5 durante 5 segundos por cada lado.

Sellado manual con alcohol polivinílico (Polvo sellador):

Este componente se considera no tóxico e inodoro y tiene propiedades adhesivas de alta resistencia y flexible por lo que es ideal para manejar en el nitrógeno, su presentación es en polvo y al entrar en contacto con el agua, se solidifica. Para utilizarlo en el sellado de pajillas, se realiza el siguiente procedimiento:

No. PASOS A


1 Preparación de

materiales

Deposite el polvo sellador (Alcohol polivinílico) en una caja de Petri, procurando llenarla.




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2 Preparación de

materiales

Deposite en otra caja de Petri, agua destilada al mismo nivel del contenido del polvo sellador.


3 Sellado

Introduzca la punta a sellar en la caja de Petri con el polvo hasta tocar el fondo e inmediatamente humedezca el polvo sellador sumergiéndolo en la otra caja de Petri.


4 Limpieza

Con papel de limpieza o secante, retire el excedente del material sellador y coloque nuevamente la pajilla en la cadena de frío (5°C).


Sellado mecánico con balines metálicos:

No. PASOS A REALIZAR

DESCRIPCIÓN RESPONSABLE

1

Alineación y centrado de las pajillas con el

magazín de esferas de la empajilladora

Una vez finalizado el proceso de llenado de las pajillas, se enfrentarán las pajillas con el magazín de esferas y se podrá iniciar con el sellado.


2 Sellado

Oprima la palanca de operación y detalle que todas las pajuelas a sellar (6) han ingresado a los agujeros del magazín, a continuación, realice la fuerza justa para el ingreso de los balines a las pajillas. Procure que el movimiento de la palanca se realice en un solo paso, de lo contrario podrían ingresar dos balines a una pajilla.




VERSIÓN: 1

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Posición de la burbuja de aire:

Como ya se mencionó, la burbuja de aire es esencial para lograr éxito en el congelado y descongelado de semen, una vez selladas las pajuelas; inspeccione si existe dispersión de las burbujas de aire.

No. PASOS A


1 Identificación de burbujas de aire

dispersas

Dispersión de burbujas de aire en pajuelas selladas con balines metálicos:




VERSIÓN: 1

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2 Fusión de las

burbujas de aire

Para unir las burbujas de aire, agarre el magazín de pajuelas o regleta de tal modo que los extremos sellados queden en dirección a su cuerpo, enseguida, sacuda por una sola vez vigorosamente la regleta hacia abajo.


3 Verificación de la

fusión de las burbujas

Inspeccione que las burbujas se han unido, si el resultado no ha sido el esperado, repita el proceso.


4 Desplazamiento de la burbuja al centro

de las pajillas

La burbuja de aire debe posicionarse en el centro de cada pajuela, pues si permanece junto al material de sellado, al momento de descongelar la pajuela, podría romperlo o expulsarlo debido a la dilatación de la burbuja; para ello, agarre el magazín de pajuelas de tal manera que el tapón de algodón quede en dirección a su cuerpo (contrario al paso 2), luego sacuda vigorosamente la regleta hacia abajo hasta obtener la burbuja en el centro de las pajuelas.




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NOTA: Estos procedimientos deben hacerse en el menor tiempo posible, siempre promoviendo el descenso de temperatura y nunca las fluctuaciones de la misma.

5.11. Vapores de nitrógeno y congelación:

Vapores de nitrógeno:

Vierta nitrógeno en el recipiente de acero inoxidable de la unidad congeladora para 90 pajuelas Minitube® hasta alcanzar la guía que se encuentra en las paredes del recipiente (a 5 cm del fondo), inmediatamente coloque la escalerilla sobre el nitrógeno para asegurar enfriamiento de la estructura al momento de utilizarla, cubra con la respectiva tapa de polietileno el recipiente y espere que el nitrógeno se estabilice (5 – 10 minutos aproximadamente). Una vez cumplido y verificado el paso anterior, retire la escalerilla del recipiente que contiene el nitrógeno y colóquela en la nevera para ensamblar las pajillas en cada una de las ranuras; terminado el proceso, coloque nuevamente la escalerilla sobre el nitrógeno líquido y tape el recipiente para evitar pérdida del nitrógeno y contabilice 20 minutos; con esto asegura descenso de temperatura a los -125°C gracias a la evaporación del nitrógeno en su estado líquido.

Imagen 18. A: Liberación de las pajillas de la regleta y posicionamiento en la escalerilla. B:

vapores de nitrógeno.

Congelación:

Rápidamente, ubique las pajillas en su respectiva canastilla o goblets para introducirlas en el termo o tanque de nitrógeno donde quedarán sumergidas y alcanzarán una temperatura de -196°C, identifique la canastilla y registre en el FO-A-APR-01-01 “Formato de registro inventario semen criopreservado” la información solicitada.

5.12. Evaluación final de calidad de semen:

Agarre una de las pajillas y descongélela en baño maría (36,5 – 37°C) durante 30 segundos, mientras se descongela, aprecie si el tapón y sello son desplazados y si existen rupturas o afectación en la integridad de la pajilla; completados los 30 segundos, séquela totalmente y sujétela desde el extremo del sello y agítela vigorosamente para desplazar la burbuja al borde



VERSIÓN: 1

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del sello; enseguida, corte los sellos y deposite la muestra en tubo eppendorft precalentado, proteja la muestra de la luz mientras realiza la evaluación seminal: MIP, vigor, morfología, concentración. Califique como semen viable, aquellos lotes que presentan como mínimo:

MIP (%) ≥ 30

Vigor (1 – 5) ≥ 3

Morfología: Spz normales (%)

≥70

Concentración *106 ≥ 10

5.12.1. Cálculo espermatozoides (spz) viables por pajilla: Una vez realizada la evaluación final de la calidad de semen, se debe estimar la cantidad de espermatozoides viables en cada pajilla, la cual debe ser ≥ 10*106. La concentración espermática se determina en millones por mililitro (*106/ml), por lo que si la pajilla contiene medio mililitro (0,5 ml), el resultado debe dividirse por 2, a continuación, multiplique el resultado por la MIP (%) y por el % de spz normales. Registre el resultado en el formato FO-A-APR-01-02 “reporte de calidad e integridad de semen criopreservado”. Ejemplo: Se recibe pajilla de 0,5 ml para evaluación de calidad e integridad de semen criopreservado, al realizar la evaluación microscópica se obtienen los siguientes resultados:

Parámetro Resultado Valor

referencia

MIP (%) 40 ≥ 30

Vigor (1 – 5) 3 ≥ 3

Morfología: Spz normales (%)

80 ≥ 70

Concentración *106/ml 90 ≥ 10

Entonces;

A. La concentración total (millones/ml) se divide por dos=90∗106/𝑚𝑙

2= 𝟒𝟓 ∗ 𝟏𝟎𝟔/𝟎, 𝟓𝒎𝒍

B. La concentración obtenida se multiplica por la MIP en %=45 ∗ 40% = 𝟏𝟖 ∗ 𝟏𝟎𝟔/𝟎, 𝟓𝒎𝒍 C. El resultado de multiplicar concentración por la MIP se multiplica por la morfología, es

decir, el % de spz normales: 18 ∗ 80% = 𝟏𝟒, 𝟒 ∗ 𝟏𝟎𝟔 𝒅𝒆 𝒔𝒑𝒛/𝟎, 𝟓𝒎𝒍 D. El total de espermatozoides viables en la pajilla evaluada es de 14,4 millones de

espermatozoides viables. Registre los resultados en el FO-A-APR-01-02 “Reporte de calidad e integridad de semen criopreservado”



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Diligenciar formato:FO-A-APR-06-02 Formato de registro completo BSE

Diligenciar formato:FO-A-APC-01-12Historia clínica de grandes animales

Diligenciar formatos: FO-A-APR-03-02 FO-A-APR-06-02 FO-A-APC-01-12

6. DIAGRAMA DE FLUJO

Inicio

¿Ejemplar viable para colecta?

*Aplazado *No Satisfactorio

No

SI

1

Aplicación del PD-S-AP-01 manual para colecta de semen bovino

Evaluación de semen

Examen macroscópico

Examen microscópico



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¿El eyaculado cumple con los requisitos mínimos para

congelar?

¿Semen con buena vitalidad?

1

Preparación del diluyente

Cálculo número de pajillas

Dilución inicial o 1+1

No

SI

Desecho

No

SI

Desecho



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Diligenciar formato:FO-A-APR-01-02Reporte de calidad e integridad de semen criopreservado

Dilución final


No

SI

Desecho

Refrigeración a 5°C por 4 horas


No

SI

Desecho

Empacado o envasado pajillas

2

2

Sellado de pajillas

Rotulado de pajillas

Vapores de nitrógeno por 20 minutos

Congelación

Evaluación final calidad semen criopreservado ¿Semen con buena

vitalidad?

No



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Diligenciar formato:FO-A-APR-01-01inventario semen criopreservado

7. ANEXOS

FO-A-APR-01-01 Formato de registro inventario semen criopreservado.

FO-A-APR-01-02: Reporte de calidad e integridad de semen criopreservado.

FOA-APR-03-01 Listado de materiales para colecta, evaluación y criopreservación de semen bovino.

FO-A-APR-03-02 Formato de registro resultados de colecta, evaluación y congelación de semen.

FO-A-APR-06-01: Evaluación de la aptitud reproductiva del toro Bull Breeding Soundness Examination (BSE). Entrega de resultados.

FO-A-APR-06-02: Evaluación de la aptitud reproductiva del toro Bull Breeding Soundness Examination (BSE). Formato de registro completo.

MB-A-APR-01 Manual de limpieza, desinfección y esterilización de equipos, utensilios e instalaciones del Laboratorio de Reproducción Animal.

PD-S-AP-01 Manual procedimientos para colecta de semen bovino.

PD-S-AC-01 Procedimientos para calibración y verificación de equipos de medición del Laboratorio de Reproducción Animal.

Fin

SI



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8. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

1. Real Academia Española. Published 2020. Accessed April 11, 2020. https://www.rae.es/

2. Castro OJA. Manual de Procedimiento Del Laboratorio de Andrología y Gineco-

Obstetricia.; 2004.

3. Guerrero GDV. Manual de procedimientos para la colecta y criopreservación de semen

bovino para la empresa Santa Clara genética estado Paraná - Brasil. Published online

2014.

4. Schlösser FM. Manual Tinción Farelly.

5. Jennifer H. Koziol, Chance L. Armstrong. Bull Breeding Manual - Society for

Theriogenology. Published 2018. Accessed November 6, 2020.

https://www.therio.org/store/ViewProduct.aspx?id=12061863

6. Agarwal A, Gupta S, Sharma R. Eosin-Nigrosin Staining Procedure. In: Andrological

Evaluation of Male Infertility. Springer International Publishing; 2016:73-77.

doi:10.1007/978-3-319-26797-5_8

7. Daghigh Kia H, Farhadi R, Ashrafi I, Mehdipour M. Anti-Oxidative Effects of Ethanol

Extract of Origanum Vulgare on Kinetics, Microscopic and Oxidative Parameters of

Cryopreserved Holstein Bull Spermatozoa. Vol 6. Islamic Azad University - Rasht Branch;

2010. Accessed November 29, 2020. www.ijas.ir

8. Minitüb GmbH. Manual Fotómetro SDM 1.; 2014.

9. Minitüb GmbH. Manual Triladyl. www.minitube.de

10. Minitübe GmbH. Manual Equipo Semi-Automático de Envasado y Sellado SFS 133-

Traducción Español.; 2014. www.minitube.de



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Elaborado por Revisado por Aprobado por

Nombre: Gilberto Tovar Claros

Nombre: Robinson López Rojas

Nombre: Wilder Meneses Gómez

Cargo: Auxiliar de laboratorio

Cargo: Coordinador Laboratorio

Cargo: Profesional Universitario OAP

Fecha: 26 marzo 2021 Fecha: 07 julio 2021 Fecha: 19 julio 2021

guia para la evaluaciÓn y criopreservaciÓn de semen …

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