analisis microscopico del semen
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3
1999
97-99-2000
Manual de Análisis Básico2002 NAFA - ESHRE
2010
Génesis del nuevo Manual
4´ EDICION OMS 5 ´EDICION OMS
PARAMETRO VALOR DE REFERENCIA VALOR DE REFERENCIA
Volumen 2.0 mL o más 1.5 mL o más
pH 7.2 o más 7.2 o más
Concentración Espermática
20 millones/mL. o más 15 millones/mL. o más
Número Total de Espermatozoides
40 millones/Eyaculado o más 39 millones/Eyaculado o más
Movilidad 50% o más con movilidad A y B
25% o más con movilidad A
MP= 32%
MT (MP+MNP)= 40%
Morfología Consenso en Proceso (>14%) >4%
Viabilidad 50% de vivos o más 58% vivos o más
Leucocitos Menos de 1 millón/mL. Menos de 1 millón/mL.
Licuefacción 15 min-60 min. 15 min-60 min.
Viscosidad >2cm >2cm
Aglutinación (grados
esperma)
>10% 1:<10, 2:10-50, 3:>50, 4:aglu totales
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EXAMENMACROSCOPICO
VISCOSIDAD ASPECTO VOLUMEN pH
VITALIDAD
EXAMENMICROSCOPICO
CONCENTRACION
MOTILIDADAGLUTINACION YAGREGACION
OTRAS CELULAS
MORFOLOGIA
ESPERMATICA
ANTICUERPOSANTI-ESPERMATOZOIDES
ANALISIS DEL SEMEN
LICUEFACCION
El semen es viscoso
Área 1 elevada concentración de espermatozoidesespermatozoides rápidosbuena morfología
Área 2 baja concentración de espermatozoides
espermatozoides lentos -mala morfología
• Mezclar bien la muestra• Coger dos alicuotas• Contar 2×200 espermatozoides (cuando sea posible)• Comparar por duplicado
Distribución de Poisson (número de espermatozoides/leucocitos)Distribución Binomial (% motilidad, % morfología, % vitalidad)
A: Movilidad Progresiva RápidaB: Movilidad Progresiva LentaC: Movilidad No progresivaD. Inmóviles.
Movilidad Progresiva (MP)
Movilidad No Progresiva (NP)
Inmóviles (IM)
“La movilidad progresiva esta relacionada con las tasas de embarazo
(Jounnet et al., 1988., Zinaman et al., 2000; Larsen)
“licuada la muestra <30
minutos”.
Difícil separar movilidad A y B con exactitud (Cooper and yeung, 2006)
MP= 32% MT (MP+MNP)= 40%
EJEMPLOConteo total de espermatozoides= 200 por duplicadoCONTEO 1 CONTEO 2PR= 37% PR= 28%NP= 3% NP= 6%IM= 60% IM= 66% = promedio 63% ; diferencia 6%
Los resultados son aceptados y se reportan los promedios:PR= 33%, NP= 4%, IM= 63%
PORCENTAJE DIFERENCIA
ACEPTABLE
PORCENTAJE DIFERENCIA
ACEPTABLE
0 1 66-76 9
1 2 77-83 8
2 3 84-88 7
3-4 4 89-92 6
5-7 5 93-95 5
8-11 6 96-97 4
12-16 7 98 3
17-23 8 99 2
24-34 9 100 1
35-65 10
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Agregaciones: adherencia de espermatozoides (inmóviles o móviles) a células no espermáticas o detritos
Aglutinaciones: espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles
Vitalidad utilizando Eosina-Nigrosina.
Permite almacenar las placas para re-
evaluación y propósitos de control de
calidad. Björndahl et al., 2003)
Test hipo osmótico (Jeyendran et al., 1984)
Espermatozoides con membranas intactas se hinchan y sus forma
flagelar cambia dentro de los 30 minutos.
Hossain et al., 1998.
Fundamental en muestras con < 40 % de espermatozoides móviles.Se realiza inmediatamente licuada la muestra (de preferencia a los 30 minutos).
-Espermatozoides vitales pero inmóviles puede deberse a un defecto estructural del flagelo. (Chemes and Rawe, 2003).
-Evaluar en duplicado 200 espermatozoides.
•NOTA: El Porcentaje de Viabilidad debe ser mayor o igual al porcentaje de movilidad total, cuando sucede lo contrario se deben verificar ambas mediciones.
>58% vivos
Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar
solo una muestra del paciente.
Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos confiables y
una media. Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006.
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OMS´5: Cámara de recuento de espermatozoides
No recomendado:Cámaras de pequeño volumen: demasiados pocos espermatozoides Cámaras llenadas por capilaridad: llenado desigual
Numero de
espermatozoides
contados por
campo con el
objetivo de 40X
Numero de
espermatozoides
contados por
campo con el
objetivo de 20X
Dilución
(Semen +
Diluyente)
Seme
n
(µL)
Diluyente
(µL)
Cámar
a
***Numer
o de
cuadro
que debe
ser
contado
>101 >404 1:20(1+19) 50 950 Neubau
er
5,4,6
16-100 64-400 1:5 (1+4) 50 200 Neubau
er
5,4,6
2-15 8-60 1:2 (1+1) 50 50 Neubau
er
5,4,6
<2 <8 1:2 (1+1) 50 50 Neubau
er
(toda la
camara)
los 9
cuadros
completos
Conteo espermático
o Media de 3 camposoPreparación x duplicado de la dilución (tabla 1)oPreparación del HemocitometrooContar mínimo 200 células/ por duplicadooComparar las diferencias de los conteosoCalcular C=(N/n) x (1/profundidad de la camra)X factor dilucón(espermas/nL)oReportar Mill/mL
1515
20 nl
dilución 1+1 (1:2),C=(N/n)x (1/100)x2 espermatozoides/nlC= (N/n)x (1/50) espermatozoides/nl.
dilución 1+1 (1:2),C=(N/2)x (1/900)x2 espermatozoides/nlC= (N/1800) espermatozoides/nl.C=(N/1.8uL)2 esperma/nl
<2 <8
Sensibilidad56,000/ ml
0.25 esperma/nl=250/uL=250000/ml
Concentración espermática: cámara Neubauer Improved
Cámara de 100 µl de profundidad
9 rejillas de 100nl
Rejilla central 25 cuadrados grandes de 4nl
Cada cuadrado grande 16 cuadrados pequeños de 250pl
dilucion 1+4 (1:5), C=(N/n)x(1/20)x5 espermatozoides por nlC= (N/n)x(1/4) espermatozoide/nl ( o 106x ml de semen).
dilucion 1+19 (1:20),C=(N/n)x(1/20)x20 espermatozoides por nlC= (N/n)x espermatozoide/nl ( o 106x ml de semen).
dilucion 1+50 (1:49),C=(N/n)x(1/20)x50 espermatozoides por nlC= (N/n)x2.5 espermatozoide/nl ( o 106x mL de semen).
Si se observan < 25 espermatozoides, state:
“< 56,000 /ml” o “< 2,000 /ml”
20 nl
Suma Diferencia
Aceptable *
Suma Diferencia Aceptable *
144-156 24 329-346 36
157-169 25 347-366 37
170-182 26 367-385 38
183-196 27 386-406 39
197-211 28 407-426 40
212-226 29 427-448 41
227-242 30 449-470 42
243-258 31 471-492 43
259-274 32 493-515 44
275-292 33 516-538 45
293-309 34 539-562 46
310-328 35 563-587 47
EJEMPLOCon una dilución 1+19 (1:20).Conteo 1: 98 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)Conteo 2: 114 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)(98+114)= 212 en 30 filas : diferencia (114-98) =16
De acuerdo a la tabla 2.C=(N/n)x(1/20)x20C=(N/n)x espermatozoide nl ( o 106x ml de semen).(212/30)x1.00=7.07 espermatozoides/nl(212/30)x1.00=7.07 106 espermatozoides/mL.
>15 mill/mL>39 mill eyaculado
Limite de referencia inferior: >4 %
Similares a los reportados para fertilización in vitro (Coetzee et al., 1998), inseminación intrauterina (Van Waart et al., 2001)y fertilidad in vivo (Van der Merwe et al., 2005)
Valor en la población general: Entre 0 y 30 % (Menkveld et al., 2001).
Que es un espermatozoide normal?????
CABEZA CUELLO Y PIEZA
MEDIA
COLA
•4-5 μm Longitud.
•2.5-3.5 µm. Ancho.
•40-70%, Acrosoma.
•Oval y Uniforme.
•5 µm Longitud.
•1 µm Ancho.
•<1/2 Cabeza, Gota
Citoplasmica.
•45 µm
largo.
•Derecha y
Uniforme.
MORFOLOGÍA NORMAL DE LOS ESPERMATOZOIDES
O.M.S Criterio Estricto > 14% (Kruger)
Se asocia a alteraciones de la concentración y movilidad.
Teratozoospermia Causas:
Varicocele, la sepsis seminal, el estrés y la exposición a agentes externos nocivos.
2121www.analisisdesemen.com.mx
Genital exposure
to heat stressTemperature peaks:
Sauna, hot baths,heated car seat,
electric blanket, fever
Profession:Boilerman, welder,
foundry worker, baker...
Constitutional:Varicocele,
undescended testicle,retractile testis
Clothing:Tight trousers/underpants,
pyjamas,down-filled duvet
Physical inactivity:Car, desk, computer,
TV; paraplegia
El grosor de la extensión de semen dependerá de:
• volumen de la alicuota (5-10 µl) pequeño espermatozoides separados
• ángulo de arrastre del portaobjetos (45º) mayor extensión más fina
• velocidad de la extensión (~1s) más alta extensión más gruesa
• Estirar la gota de semen sobre un portaobjetos• No estirar hacia delante• No dejar que la gota se seque
Se pueden hacer dos extendidos por cada muestra fresca previniendo roturas o mala tinción. La evaluación se hará en replicados preferentemente en cada replicado
Es preferible dejar secar, fijar y teñir las muestras.
Sin embargo sabemos que esto se asocia a cambios en las dimensiones del
esp. ya que teñidos, resultan más pequeños que los que están frescos.
Expansión de cabezas inmaduras.
Pérdida de gota citoplasmática sensible a cambio osmótico.
Muestras de baja concentración (< 2 x 10 6/ml)
Centrifugar a 600 g x 10 min
Muestras de mucha viscosidad resulta un extendido muy grueso:
Diluir con solución salina
Ccf 10 min a 600 g
Descartar el sobrenadante
Resuspender el pellet en 20-40 ul
Chequear de que los espermatozoides esten bien distribuidos y no amontonados
Dejar secar
Centrifugar la muestra puede afectar la morfología y se debe dejar por escrito en el informe
Espermatozoides anómalos se asocian a bajo potencial fértil y daño al DNA,
cromatina inmadura, aneuploidias, etc.
Esto se asocia con una espermatogénesis anormal
Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma > 1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media defectuosa.
Exceso de citoplasma residual (ERC)
Una frecuencia alta de colas enrolladas puede indicar que el espermatozoide ha estado sometido a un stress hipoosmótico o envejecimiento
Si hay más de un 20 % hay que informarlo
Esto se asocia con una espermatogénesis anormal
Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma > 1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media
defectuosa.
1000x bajo aceite
Analizar todos los espermatozoides en cada campo que tengan cabeza y cola
Evaluar normales y anormales
Evaluar 200 esp x duplicado
Calcular el valor medio y la diferencia de los duplicados
Si la diferencia es aceptable (ver Tabla) informar valor medio. Sino volver a evaluar.
Informar valores enteros.
LRL: 4 % (IC 95 %: 3-4)
De acuerdo con Ward (1994), la descondensación del núcleo delespematozoide involucra una serie de eventos:
rearreglos topológicos de la cromatinatransición de las proteínas que envuelven a la cromatinamodificación en el patrón de la transcripciónpérdida de la estructura del nucleosomaadquisición de un arreglo condensado de la cromatina
% normales y % anormales
% Anomalías de cabeza
% Anomalías Pieza media
% Anomalías de cola
% Anomalías de exceso de citoplasma residual
Expresión de resultados
Ejemplos
N= 200, 18 %
N= 200, 9 %
Difer: 9, valor medio; 14 %
Aceptable hasta: 7
Descartar lecturas y repetir
N=200, 10 %
N= 200, 14 %
Difer. 4, valor medio 12%
Aceptable hasta 7:
Valor 12 % formas normales
Ejemplo
N=200
Normales: 36 esp. (18 %)
Anormales: 164
An.cabeza: 122
An. SI: 108
An.cola: 22
ECR: 36
N=200
Normales: 42 esp. (21 %)
Anormales: 158 esp.
An.cabeza: 140
An. SI: 102
An.cola: 30
ECR: 44
Ejemplo
Solo se compara el % de formas normales :21 % y 18 %= valor medio: 19, 5 % redondeado a 20 % y una diferencia de 3.
Voy a la Tabla y la diferencia aceptada es hasta 8.
Informe:Normales: 20 %Anormales: 80%An.cabeza: 140+122/400: 66 %An. SI: 102+108/400: 53 %An.cola: 30+22/400: 13 %ECR: 44 + 36/400: 20%
TZI > 1,6 se asocia a daño a DNA y mal
pronóstico de fecundar
Procedimientos opcionales: Indice de teratozoospermia, evaluación de anomalías múltiples
1 4
• Normal > 14% formas normales con buena tasa de fertilización• Buen pronóstico 4 a 14% formas normales con una tasa de fertilizaciónregular. • Mal pronóstico <4% formas normales con una tasa de fertilización muydisminuida.
OTROS TIPOS CELULARES PRESENTES EN EL SEMEN
Presencia de células no espermáticas Epiteliales y Redondas
Células Germinales Inmaduras (daño testicular) Leucocitos (inflamación de las glándula accesorias)
100X, Tinción Diff-Quick.
ESPERMATOCITOESPERMATOGONIA ESPERMATIDE
CELULAS GERMINALES INMADURAS
C= N X S
200
C= Concentración celular
N= Cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos que 200 espermatozoides.
S= Concentración espermática.
Ejemplo: 10 X 120 millones/mL = 6millones/mL
200
EVALUACION DE LAS CELULAS REDONDAS
Necrozoospermia o AstenozoospermiaFalsa (los datos no
concuerdan)
Patología o intervenciones
Recogida inadecuada
(coitus interruptus)
Posible
Contaminación
Abstinencia Prolongada
Transporte Inadecuado
Retraso en la Entrega de la
Muestra
Eyaculación
Fraccionada
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ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS
Si el análisis de semen se encuadra en estudios de esterilidad:
•Si se aplica en RA (REM)
•Oligozoospermia (<5 mill/mL) y Azoospermia (cariotipo y microdeleccionesdel cromosoma Y)
•Hipospermia y/o pH<7, Leucocistospermia >10 mill/mL, aglutinaciones eneyaculado, Oligoastenoteratozoospermia, marcadores prostaticos (cultivo desemen)
•Azoospermia u Oligozoospermia: Agenesia bilateral de conductos deferente(estudios del gen de la fibrosis quísticas)
Si la estimación de la concentración de células Redonda Excede de 1 millon/ml
Deberá evaluar por la prueba de peroxidas (leucocitos marcados)
Las células de peroxidas positivas se tiñen de pardo y la peroxidasa negativas no secolorean.
Cuente por duplicado por lo menos 200 leucocitos peroxidas-positivos en elHemocitómetro y saque el porcentaje de peroxidasa positivas y negativas.
Cummings JM & Jequier AM (1994)
Treating male infertility needs more clinical andrology, not less.
Hum Reprod 9: 1214-1219
1995
2000
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CONCLUSION
Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para elexamen de semen humano están enfocados a:
• aumentar la exactitud de los datos analíticos
• suministrar más detalles experimentales de métodos
comunes
Estos deberían ayudar a mejorar
• la estandarización entre laboratorios
• el valor diagnóstico de los resultados de los análisis de
semen
• y llevar a cabo tratamientos terapéuticos