practica recoleccion de semen
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REPRODUCCION ANIMAL
PRESENTADO POR:
JHON JAIRO CHAMORRO GOMEZ
COD: 13042030
PRESENTADO A:
ALVARO FERNAN CASTELLANOS
PRACTICA RECOLECCION DE SEMEN BOVINO
BOGOTA D.C
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
2005
MARCO TEORICO
Colección de Semen
La inseminación artificial ha tenido una gran importancia en el mejoramiento
genético de los animales, especialmente en el ganado bovino donde su
práctica es un requisito indispensable para acceder a animales de altas
producciones en un corto período de tiempo y así poder ser competitivo en un
mercado tan estrecho.
Mejor aprovechamiento del macho: por ejemplo un toro en monta natural
deposita en la hembra todo el semen producido en una eyaculación, en cambio
con inseminación artificial ese semen puede ser diluido y alcanzar para 1.400
vacas y también congelarse y preservarse en el tiempo.
- Mejoramiento genético más rápido.
- En general es más económico que tener un macho de monta libre.
- Evita la transmisión de enfermedades venéreas.
- Aumenta la fertilidad del rebaño por ser más controlada que la monta natural.
- Permite usar machos con excelentes características pero con algún problema
físico no hereditario (quiebre o daños en extremidades, ciegos, etc.).
- Uso de machos a grandes distancias mediante semen congelado.
Para realizar una inseminación artificial lo primero que hay que hacer es
recolectar el semen del macho.
La colección del semen se puede realizar mediante:
a) Electroeyaculación: aplicable a toros y carneros.
b) Manual: utilizado en cerdos, aves y peces.
Vagina artificial: es el más práctico y el que da mejores resultados. Consiste en
un tubo rígido con una manga de goma que se llena con agua tibia (40º) a fin
de simular la temperatura corporal
El semen colectado es sometido a un completo examen de viabilidad.
La inseminación se puede realizar con semen fresco, utilizado inmediatamente
después de la extracción (pavos, gansos y cerdos) o congelado (vacas), lo cual
permite usarlo mucho tiempo después de obtenido y ser transportado largas
distancias.
Tambor con semen congelado y almacenado
En nitrógeno líquido a -196ºC
En vacas, para utilizar el semen congelado, éste debe ser descongelado en
agua a 35ºC por 20 a 30 segundos, para llevarlo a temperatura corporal. Este
proceso debe realizarse rápidamente a fin de evitar la reorganización de
cristales de agua en el interior de los espermios, lo que provocaría la ruptura de
membranas y muerte de éstos. Una vez descongelado el semen, la pajuela que
lo contiene debe introducirse en la vagina de la hembra en un tiempo máximo
de 2 minutos:
Diagrama de la inseminación artificial de una vaca
Descripción de la vagina artificial: Cuerpo de la vagina: consiste en un tubo
cilíndrico, provisto de una válvula y una tapa, generalmente de caucho
resistente, tienen 40 a 50 centímetros de largo y 7 a 10 centímetros de
diámetro.
Funda interna: goma elástica o de látex que se ubica en el interior del tubo
cilíndrico y representa las paredes de la vagina, sus extremos se doblan sobre
la parte externa del tubo y se fija con bandas de caucho.
Cono de látex: se fija en uno de los extremos de la vagina cerca de la válvula
para el agua.
Tuvo colector de semen: se coloca en el otro extremo del cono; este tubo
está protegido por una cubierta protectora, que generalmente es una jeringa
plástica, cuya finalidad es proteger el semen de la luz y de los cambios de
temperatura.
Foto 1. Partes de la vagina
artificial
Foto 2. Proceso de llenado de
la vagina artificial
Recolección de Semen
Por una válvula ubicada en la vagina artificial se introduce agua a una
temperatura de 50 a 60 grados centígrados, hasta llenar los dos tercios de su
capacidad total
En el momento de recoger el semen, la temperatura óptima en el interior de la
vagina debe ser de 38 a 39°C. Sin embargo, existen toros que exigen una
mayor temperatura para eyacular.
Luego se procede a la toma del eyaculado, sujetando una hembra en celo u
otro macho o un maniquí. El técnico encargado de la recolección se coloca a la
derecha del toro y mantiene la vagina artificial en la mano derecha, con la
abertura dirigida hacia el pene, mientras que con la mano izquierda colocada
sobre el prepucio lo dirige hacia la abertura de la vagina.
Debe evitarse tocar directamente el pene, ya que la erección puede ser inhibida y el toro
negarse a montar. Es recomendable practicar la falsa monta, con la finalidad de que el
toro alcance el máximo grado de erección y de esta manera obtener un semen de buena
calidad. Luego de practicar la falsa monta, se procede a efectuar la recolección,
mediante la introducción del pene en la vagina artificial hasta lograr la eyaculación;
después el operador retira la vagina artificial y el eyaculado o semen se deposita en el
tubo colector.
Foto 3. Recolección
del semen
Evaluación del Semen
Una vez realizada la recolección del eyaculado, debe conservarse en un
recipiente con agua a 37°C para evitar los cambios de temperatura que afectan
su calidad.
La evaluación del semen se divide en dos partes:
1) Examen macroscópico y 2) examen microscópico.
1) Examen macroscópico
Volumen: varía desde uno hasta ocho centímetros cúbicos. La mayoría de los
toros proporcionan de 3 a 6 cc.
Color: depende de la cantidad de espermatozoides; cuando el semen es de
buena calidad, presenta una coloración blanco lechosa o cremosa y cuando es
de baja calidad su color es similar a leche aguada.
Olor: el semen en buenas condiciones presenta un olor similar a la leche
fresca. El olor a orina nos indica que el semen está contaminado con ésta.
Cuando el olor es muy desagradable, se sospecha alguna enfermedad en los
testículos o en otra parte del aparato reproductivo.
Aspecto: depende de la concentración de espermatozoides y se mide por el
mayor o menor grado de opacidad que presenta la muestra de semen.
PH: se determina mediante el empleo de una cinta colorimétrica, su valor varía
entre 6,4 a 6,9; valores por encima de 6,9 son indicativos de semen de baja
calidad.
2) Examen microscópico
Mortalidad masal: se determina colocando una gota de semen en un
portaobjetos y luego se observa al microscopio con pequeño aumento. En toda
la gota de semen se observa la presencia de ondas y remolinos y éste se
puede clasificar atendiendo a las características de las ondas en:
Semen muy bueno: presenta ondas oscuras marcadas en rápido
movimiento.
Semen bueno: se observan ondas menos oscuras que el anterior,
marcadas con movimiento moderado.
Semen regular: presenta ondas claras con movimiento muy ligero.
Semen malo: no hay ondas, se observan los espermatozoides inmóviles.
Motilidad individual: debe evaluarse colocando sobre el portaobjetos una gota
de semen diluido con suero fisiológico o citrato de sodio. Luego se coloca un
cubreobjetos y se observa al microscopio con mayor aumento. De acuerdo al
movimiento individual, el semen se clasifica de la siguiente manera:
Semen muy bueno: igual o mayor de 70% de motilidad individual.
Semen bueno: 50-69% de motilidad individual.
Semen regular: 30-49% de motilidad individual.
Semen malo: menor de 29% de motilidad individual.
Morfología: se determina mediante la observación al microscopio de un frotis de
semen coloreado con tinciones especiales; generalmente, se utiliza la tinta china. Las
anormalidades observadas se clasifican en primarias y secundarias. Para las primeras se
aceptan un valor entre 2 a 5% y para las segundas un valor de 10 a 14% (Foto 4).
Foto 4. Examen
microscópico del
semen
Concentración: el número de espermatozoides por mm3 se determina diluyendo 0,1
cc de semen en 7.9 cc de citrato de sodio. Luego con la ayuda de un aparato
denominado Spectronic, se obtiene una lectura que se compara con una tabla para
obtener la concentración de espermatozoides. Generalmente, la concentración varía de
1000000 a 1200000 espermatozoides/mm3 (Foto 5).
Foto 5. Determinación de
la concentración del semen
Procesamiento del Semen
Los propósitos del procesamiento del semen son los siguientes: aumentar el
volumen del eyaculado para inseminar mayor número posible de hembras.
Proteger los espermatozoides para mantenerlos fértiles el mayor tiempo
posible. El procesamiento del semen comprende las siguientes fases: Dilución:
para diluir el semen se utilizan diferentes dilutores, entre los más conocidos
tenemos citrato-yema, fosfato-yema y dilutores a base de leche. A estos
dilutores se les agrega antibióticos, con el propósito de frenar el desarrollo de
gérmenes que pudieran estar presentes en el eyaculado.
En la Estación Experimental Carrasquero, para el procesamiento del semen se
utiliza el dilutor a base de citrato-yema, en la siguiente proporción:
Citrato de sodio 74 partes Yema de huevo 25 partes
Glucosa 1 parte Penicilina 1000 UI/cc Estreptomicina 500 mg/cc
El grado de dilución del semen depende de la concentración espermática y de
la técnica de conservación.
Conservación a 5°C: cuando el semen se va a mantener a temperatura de
5oC, el grado de dilución que se realiza es menor, en comparación con la
técnica de la congelación. Bajo estas condiciones el semen conserva su poder
fecundante por un periodo de cuatro a cinco días.
Conservación mediante congelación: el grado de dilución que se realiza es
mayor que el anterior y una vez congelado en nitrógeno líquido, el semen se conserva
por un tiempo indefinido. Proceso de congelación en nitrógeno líquido Una vez
determinada la concentración espermática se procede a determinar la cantidad de dilutar
que se puede agregar al semen, en base a la siguiente fórmula:
N° de
pajuelas =
V x Ml x C(ml)
N° de
espermetazoide/pajuelas
Donde:
V = volumen del semen en mL
MI = motilidad individual en porcentaje
C = concentración espermática expresada en ml
Después de determinar el número de pajuelas se procede a calcular el volumen del
dilutor de la siguiente manera:
Volumen dilutor = NP x 0,5 -
V
Donde:
NP = número de pajuelas
0,5 = corresponde al volumen de las pajuelas medianas
V = volumen del semen en ml
El dilutor a base de citrato-yema, se divide en dos fracciones: la fracción A que
no contiene glicerol y la fracción B a la cual se le agrega glicerol en la
proporción del 14%.
Seguido de la recolección del semen y después de calcular el volumen del dilutor, se
agrega la fracción A para conservarlo. El semen diluido en la fracción A, se lleva hasta
una temperatura de 5oC. Una vez que alcanza esta temperatura se le agrega la fracción
B.
Foto 6. proceso
de llenado de
Pajuela
Luego de agregar la fracción B es necesario esperar un período de tiempo de tres a seis
horas, que se llama período de estabilización, antes de empezar a congelar. Con el
propósito de ganar tiempo, antes del período de estabilización, se procede al llenado y
sellado de las pajuelas. El llenado se efectúa corrientemente utilizando una bomba de
vacío y el sellado de la pajuela se realiza con el polvo sellador a base de polietileno.
Foto 7. Proceso de
sellado de las pajuelas
Después del llenado y sellado de las pajuelas y una vez que se ha alcanzado el
período de estabilización se procede a la congelación en nitrógeno líquido.
Primeramente se colocan las pajuelas en un termo con vapores de nitrógeno
hasta alcanzar la temperatura de 120°C en 10 minutos. Este proceso se llama
precongelación (Foto 8).
Inmediatamente las pajuelas se introducen directamente en el nitrógeno líquido
para alcanzar una temperatura de 196°c, este proceso recibe el nombre de
congelación (Foto 9).
EVALUACIÓN DE SEMEN BOVINO CONGELADO
Foto 9. Proceso de CongelaciónFoto 8. Proceso de congelación
Para evaluar semen resulta esencial contar con un microscopio de calidad,
preferentemente con adaptación para contraste de fase, una platina térmica y
un baño María. Según Barth, en la evaluación del semen congelado se deben
tener en cuenta al menos 3 parámetros básicos. Ellos son:
- Viabilidad post-descongelación.
- Morfología.
- Número de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis inseminante.
Algunos investigadores consideran conveniente realizar controles
bacteriológicos y/o virológicos a espacios de tiempo variables según el caso.
Barth recomienda determinar la presencia de microorganismos patógenos
únicamente cuando hembras fértiles fracasan en ser preñadas con semen de
buena viabilidad y morfología, en dosis adecuada o cuando una historia de
infertilidad implica una posible causa infecciosa. En nuestro laboratorio
efectuamos de rutina un control bacteriológico a partir del momento que
registramos un caso donde un semen que había superado la evaluación de los
parámetros básicos, pero que tenía un elevado grado de contaminación con
gérmenes inespecíficos, afectó seriamente la fertilidad de un lote de
vaquillonas inseminadas.
Viabilidad post-descongelación
Se determina mediante el porcentaje de espermatozoides con motilidad
progresiva y el vigor espermático. Es recomendable efectuar además, un
examen directo del acrosoma.
El daño a la membrana puede no ser completamente expresado
inmediatamente después de la descongelación. Por ello, el semen debe ser
incubado a 37º C durante 2 horas. Esta evaluación es conocida como prueba
de termorresistencia o de incubación.
Esta prueba puede ser realizada de distintas formas. En nuestro laboratorio
normalmente descongelamos 2 pajuelas de la misma partida simultáneamente.
A la hora 0, vaciamos el contenido de una de ellas en un tubo de vidrio que
contiene un volumen de solución fisiológica equivalente al de la pajuela,
procediendo de inmediato a evaluar la motilidad progresiva y el vigor
espermático. La otra pajuela permanece en el baño María y es diluida en el
momento de efectuar las determinaciones correspondientes a la hora 2.
Las pastillas se diluyen en 1 ml de solución fisiológica y el semen se mantiene
tapado dentro del baño en un tubo de vidrio neutro.
a) Examen de motilidad: el porcentaje de motilidad progresiva y el vigor son
determinados inmediatamente después de descongelado el semen y luego de
2 horas de incubación.
Diversos métodos pueden ser utilizados para determinar motilidad. Cuando se
cuenta con experiencia, generalmente se realizan estimaciones visuales
rápidas, sin efectivamente contar células.
Una gota de semen delgada y uniforme es colocada entre porta y cubreobjeto
tibios procediendo a evaluar a 100 aumentos el porcentaje de espermatozoides
con motilidad progresiva y luego, la tasa de progresión (vigor). Esta, puede ser
cuantificada utilizando la siguiente escala:
0= sin movimiento.
1= ligera ondulación o vibración de cola, sin progresión.
2= progresión lenta, incluyendo detención y comienzo de movimiento.
3= movimiento progresivo continuo y moderada velocidad.
4= movimiento progresivo, rápido.
5= movimiento progresivo muy rápido, en el cual las células son difíciles de
seguir visualmente.
El semen de buena calidad, que ha sido recientemente descongelado,
normalmente tiene 40-50% de espermatozoides con motilidad progresiva y un
vigor de 3-4. Después de 2 horas de incubación, estos valores generalmente
disminuyen un 10- 15% y 1 punto, respectivamente.
Las normas mínimas para motilidad exigidas en nuestro laboratorio son las
definidas por el Departamento de Medicina del Rodeo y Teriogenología de la
Universidad de Saskatchewan, Canadá y que se corresponden con las de las
normas ISO 9002. Ellas son:
0 hs= 25% de espermatozoides con motilidad progresiva. Vigor 3.
2 hs= 15% de espermatozoides con motilidad progresiva. Vigor 2.
En los últimos años han sido introducidos análisis por sistemas de
computación, los cuales proporcionan un método objetivo de determinación de
la motilidad espermática. Una cámara de circuito cerrado de televisión,
montada sobre un microscopio alimenta información a un sistema de
computación, el cual entrega inmediatamente el porcentaje de motilidad
progresiva, el vigor, la concentración espermática y el número de
espermatozoides móviles por mililitro.
El costo del equipamiento para este sistema es muy alto y no ofrece ventajas
para predecir la fertilidad en forma más acabada que los métodos tradicionales
b) Porcentaje de acrosomas intactos: la determinación del porcentaje de
acrosomas intactos es un método morfológico de medición de la viabilidad
post-descongelación, el cual tiene correlación con la fertilidad. Es un valioso
complemento de la motilidad, para determinar la viabilidad y fertilidad potencial
del semen congelado.
Para examinar el acrosoma, el movimiento de los espermatozoides debe ser
detenido. Esto se logra mezclando el semen con glutaraldehido bufferado al
0,2%, que fija las membranas y previene su deterioro posterior. La preparación
puede ser hecha sobre el portaobjeto, colocando una pequeña dosis de semen
próxima a una gotita de glutaraldehido mezclándolas bien y colocándoles un
cubreobjeto. Doscientas células deben ser examinadas a 1000 aumentos,
inmediatamente después de descongelado el semen y luego de 2 horas de
incubación. Los valores mínimos para una clasificación satisfactoria son:
0 hs= 50% de acrosomas intactos.
2 hs= 35% de acrosomas intactos.
Otra prueba que se utiliza para determinar integridad de membrana es el Test
de resistencia osmótica. El semen es incubado, 2 hs a 37º C, en una solución
hipoosmótica de fructosa y citrato de sodio. Se realizan observaciones
seriadas (horas 0, 1 y 2) entre porta y cubreobjeto, determinándose el
porcentaje de espermatozoides vivos. Estos reaccionan al shock osmótico
enrollando la cola. Debe haber como mínimo un 40% de espermatozoides
reaccionantes.
La viabilidad post-descongelación es el parámetro más importante y
generalmente aparece comprometida en aquellos casos donde se ha producido
algún inconveniente en la conservación del semen. En el Servicio de
Evaluación de Semen que funciona en nuestra Facultad, periódicamente se
registran casos en que se solicita dicha evaluación al comprobarse que, por
descuido o accidente, el termo ha quedado sin nitrógeno líquido por algún
período más o menos prolongado. También hemos comprobado que la
viabilidad post-descongelación suele verse afectada en aquellos casos en que
el análisis revela un elevado grado de contaminación con microorganismos
inespecíficos que si bien son incapaces de provocar una enfermedad
reproductiva, pueden afectar la viabilidad de los espermatozoides al competir
con ellos por el oxígeno y los nutrientes
Morfología espermática
La coloración de eosina-nigrosina es ideal para evaluar la morfología
espermática dado que al carecer de pasos de lavado, todo lo que está en el
semen se descubrirá en el frotis.
El concepto de defectos primarios y secundarios sirve bien para evaluar la
aptitud reproductiva de un toro pero no para predecir la fertilidad de cierta
partida de semen congelado. Cabe recordar que por definición, un defecto
primario es aquel que se origina durante la espermatogénesis dentro del
testículo y un defecto secundario, el que se origina dentro del epidídimo o en el
laboratorio.
Blom, citado por Barth, introdujo un sistema de clasificación en defectos
mayores y menores. Un defecto mayor es aquél que, presente en gran
número, ha sido asociado con infertilidad. Los defectos menores son
desviaciones que hasta ahora no han sido asociadas con infertilidad. Este
sistema de clasificación es abierto y deberá ser modificado a medida que
avance el conocimiento.
Una nueva clasificación en defectos compensables y no compensables fue
propuesta por Saacke y col. Los espermatozoides con defectos compensables
son aquellos incapaces de alcanzar el oviducto o de participar del proceso de
fertilización. Tales espermatozoides tendrían poco efecto sobre la fertilidad, si
se insemina con un número suficiente de espermatozoides aptos. En cambio,
los espermatozoides con defectos no compensables (cráteres y vacuolas
nucleares -defecto diadema-) acceden al óvulo como los espermatozoides
normales, son capaces de penetrar la zona pelúcida desencadenar la reacción
cortical impidiendo la entrada de otros espermatozoides. La presencia de este
tipo de defectos suele ser la causa de baja fertilidad dado que, luego de la
fertilización, se desarrollan embriones de mala calidad que mueren durante los
primeros días de gestación.
Si bien cada nueva clasificación parece más apropiada que la anterior, cuando
se evalúa la morfología espermática siempre surgen interrogantes tales como:
¿Qué tipo de modificación en la estructura de los espermatozoides es
realmente una anormalidad y si constituye una causa significativa de
infertilidad?
¿Qué nivel de anormalidad es tolerable?
Un conteo de 100 células es satisfactorio cuando no existen problemas
mayores. Cuando un gran número de defectos espermáticos está presente,
hasta 500 células deben ser contadas para obtener un espermograma preciso.
Se exige un 70% de células normales.
Con las colocaciones más comunes que se utilizan habitualmente en los
laboratorios es difícil detectar alteraciones en la morfología espermática que no
se vean reflejadas en parámetros más sensibles como lo es por ejemplo, la
viabilidad post-descongelación
Número de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis
Surge de multiplicar el número de espermatozoides totales por el porcentaje de
espermatozoides con motilidad progresiva a la hora 0 pos descongelación.
Existen al menos 4 formas distintas de determinar el número de
espermatozoides. En nuestro laboratorio, se utiliza el método hemocitométrico
Un criterio vigente durante años, basado en la definición de pubertad, indicaba
que la dosis inseminante no debía ser inferior a 10 millones de
espermatozoides con motilidad progresiva. Cuando el semen congelado en
pastillas dominaba el mercado de la IA en nuestro país, esta cifra era superada
con creces dado que las pastillas generalmente tenían 40 millones de
espermatozoides, oscilando el porcentaje de motilidad progresiva generalmente
entre un 30 y 40 %.
La descongelación de pajuelas, por tratarse de un proceso automatizado con
tasas de enfriamiento estrictamente controladas, significó un gran avance. Al
resultar menos traumáticos los procesos de congelación y descongelación fue
posible disminuir de manera significativa el número de espermatozoides
contenidos en cada dosis de semen.
La situación actual, caracterizada por una alta competencia, hace que cada
Centro de Inseminación Artificial quiera obtener el máximo provecho de sus
reproductores, sacando mayor cantidad de dosis de cada eyaculado. Esto es
común de observar en el semen de toros de alto valor genético de razas
lecheras, donde el número de espermatozoides por dosis se ajusta de acuerdo
a los datos de no retorno que los Centros reciben periódicamente
Las normas ISO 9002 establecen que la dosis inseminante debe tener un
mínimo de 8 millones de espermatozoides con motilidad progresiva. Este
número puede reducirse a 6 millones si el semen posee más de 30% de
espermatozoides con motilidad progresiva y si la tasa de anormalidades es
inferior al 25% o si, el porcentaje de no retomo 60/90 de 300
primoinseminaciones resulta equivalente al obtenido con 8 millones.
A los efectos de una correcta interpretación de los análisis de laboratorio, se
debe tener presente que la evaluación del porcentaje de espermatozoides con
motilidad progresiva es subjetiva y que los toros difieren en el porcentaje en el
que expresan su máxima fertilidad. Al mismo tiempo, hay que recordar que por
más que se establezcan valores mínimos de referencia, no es conveniente
ceñir eventos biológicos a la más pura matemática.
METODOS
1. se realiza un lavado abdominal2. se realiza un lavado interno dentro del prepucio3. con un masaje prepucial se deja que el toro arroje los residuos de
solución salina y orina.4. se lleva el toro donde esta la vaca para que realice la monta5. cuando valla a realizar la eyaculacion se le introduce la vagina artificial6. después de recolectar el semen es recolectado en el termo a 33 grados
centígrados.
Movilidad basal e individual
Procedimiento:
Se calienta la laminilla y con una pipeta póster se saca un poco de semen para observarlo en el microscopio este procedimiento se debe realizar rápido para que no se mueran los espermatozoides.
Motilidad individual
Se coloca semen una gota para diluirlo y se hace un extendido la vida útil de los espermatozoides es de 24 horas
Cámara de new bauver
- dilución semen 1 a 200 hasta la segunda raya-se coloca en la cámara de new bauver-se realiza el conteo en x
Vivos y muertos
Se le adiciona una gota de semen a una laminilla con nigrosina y se mezcla se deja secar y se coloca en el microscopio y mirar si presenta acromosomas, cola doblada. Nos dio como resultado
-80% vivos -20muertos
Características microscópicasColor = cremosoVolumen=8mlTextura= denso
Resultado del ejercicio
50% espermatozoides viables
1400*8=11.200.000.000*0.5 =56.000.000.000
=280.52 pajillas
BOGRAFIA
1. http://www.ceniap.gov.ve/publica/divulga/fd17/texto/coleccion.htm
2. http://www.puc.cl/sw_educ/prodanim/caracter/fi8.htm
3. http://www.produccionbovina.com/informacion_tecnica/ inseminacion_artificial/05-evaluacion_de_semen_bovino_congelado.htm