criobiologia del semen

Criobiología del semen

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© CRIOBIOLOGIA DEL SEMEN (EN ANIMALES DOMESTICOS Y AVANCES EN ALPACAS)

Autores:

Ing. Brian J. Ordoñez Mulato

[email protected]

Obra compilada, editada y publicada en la Universidad Nacional de Huancavelica –

E.A.P. de Zootecnia.

1ra Edición, Julio 2009

Impreso en Perú – Hvca


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PREÁMBULO

La presente publicación nace con toda la intención de

hacer una difusión e incentivar tanto a estudiantes, docentes

universitarios u otros investigadores, interesados en

sumergirse al campo de la criopreservación de gametos de

alpaca.

La mayor parte del contenido del presente posee

fundamentos teóricos compilados sobre criobiología,

explicaciones y efectos en las células reproductivas

masculinas. En la segunda parte se mencionan los materiales,

métodos y procedimientos que se tomaron en cuenta para

realizar un estudio en alpacas, así también se muestran

resultados, que dan luces para poder concretar esta

biotecnología, desde luego sabemos que su importancia radica

para emplearse en las comunidades alpaqueras, mediante la

inseminación artificial u otra biotecnología similar; Así para

muchos que desconocíamos, podemos entender que la razón

por la cual no se efectúa la inseminación artificial en esta

especie es no poseer semen criopreservado, de ahí nace la

investigación y la presente publicación.


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AGRADECIMIENTOS

Es necesario agradecer a personas que por sus

diversos aportes muy importantes fue posible concluir

este estudio: Álvaro López, Teodosio Huanca M. y

Mario L. Gonzáles C, INCAGRO – Wilfredo Huanca.


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CONTENIDO

ÍNDICE

PREAMBULO

INTRODUCCIÓN

1.1 ASPECTOS GENERALES. 12

1.2 Criobiología del semen. 12

1.3 Factores que afectan la viabilidad espermática durante el proceso de

criopreservación. 13

1.3.1 Cambios de volumen. 13

1.3.2 Shock de frío. 13

1.3.3 El crioprotector y el estrés celular. 14

1.3.4 Estrés osmótico. 14

1.4 Alteraciones a los espermatozoides durante el proceso de

Criopreservación. 15

1.5 Efecto de la criopreservación sobre el espermatozoide. 16

1.5.1 Crio daño sobre la bicapa lipídica. 16

1.5.2 Crio daño sobre la integridad mitocondrial. 17

1.6 Procesamiento para el congelado del semen. 18

1.6.1 Los diluyentes o dilutores. 18

1.6.2 Refrigeración. 19

1.6.3 Adición del crioprotector. 19

1.6.4 Envasado o empacado del semen. 20

1.6.5 Congelamiento de semen. 20

1.6.6 Descongelamiento de semen y evaluación post

congelación. 21

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Del lugar. 23

2.2 Materiales y equipos. 23

2.2.1 Materiales. 23

2.2.2 Reactivos o material químico. 24

2.2.3 Equipos. 24

2.4 Metodología. 25

2.4.1 Preparación seminal pre congelamiento 25

2.4.1.1 Obtención de la muestra de semen. 25

2.4.1.2 Evaluación macroscópica y microscópica del semen. 26

2.4.1.3 Preparación del dilutor. 26

2.4.2 Preparación y proceso del congelamiento seminal. 27

2.4.2.1 Proceso de refrigeración y agregado del

crioprotector. 27

2.4.2.2 Proceso de congelamiento. 28

2.4.3 Evaluación post congelamiento. 30

2.4.4 Análisis estadístico. 30

RESULTADOS Y DISCUSIONES


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3.1 Evaluación seminal post congelamiento. 31

3.1.1 Resultado de motilidad del espermatozoide post congelamiento. 31

3.1.2 Resultado de mortalidad del espermatozoide post congelamiento. 31

3.1.3 Prueba de contrastes ortogonales para motilidad y mortalidad

espermática post congelamiento. 33

CONCLUSIONES 37

RECOMENDACIONES 37

COMENTARIO 37

REFERENCIAS 39


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INTRODUCCIÓN

Para mejorar la calidad de fibra de las alpacas (Vicugna pacos), en este momento se

cuenta con un moderno medio de mejoramiento genético que actualmente nos brinda el uso

de la biotecnología reproductiva como es la inseminación artificial con semen fresco

diluido (INIA, 2004), el cual tiene la ventaja de efectuar con un solo eyaculado la

posibilidad de inseminar un gran número de hembras pero, sin embargo se tiene el limitante

de que el donador de semen tiene que estar en el lugar de obtención; De lograr un protocolo

de congelamiento seminal ideal en alpacas mediante un conservador o crioprotector viable,

el semen congelado de esta especie podría ser considerado al presente una alternativa seria

para fines de mejoramiento genético, pues brindaría una mayor rapidez al progreso genético

a nivel de los rebaños de nuestro país, así mismo ayudaría a obtener ejemplares de alto

valor genético; Pero las investigaciones realizadas concernientes a este tema son muy pocas

por lo que hasta ahora no se cuenta con protocolo definido.

En el Perú la producción de alpacas es la fuente de vida de miles de familias que

directa e indirectamente se benefician económicamente, así mismo contribuye al país

aportando el 2% del PBI, su demanda es importante debido a que actualmente se aprecia en

el extranjero como una fibra exótica y sus características textiles de calidad hacen que tenga

un precio mayor frente a la lana de ovino en el mercado mundial.

Dado el valor económico actual y su demanda en el mercado exterior de la fibra

hace que su producción sea preponderantemente valiosa, es por ello que recién en los

últimos años se esta dando el interés respectivo acerca de la finura de la fibra, pues según

estudios realizados en nuestro país se cuenta con una alta producción de fibra gruesa.

En nuestros días se cuenta con el 87% de la población a nivel mundial, ventaja que

debe ser aprovechada por ahora, no solo el Perú es el único interesado en el desarrollo de

alguna biotecnología reproductiva como la inseminación artificial, congelación de semen,

transferencia de embriones, entre otros, que funcionan muy bien en otras especies, uno de

los más grandes interesados es Australia, que ya para el 2005 contaba con 60,814 alpacas

según (Reyna, 2005) y últimamente está invirtiendo mayores recursos económicos en

investigación de este tipo, además, están EEUU, Gran Bretaña, Nueva Zelanda y Alemania,

y los países hermanos de Sudamérica el caso de Chile principalmente.

En ese sentido la presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto

crioprotector que brindan el glicerol y el etilen glicol sobre la motilidad y mortalidad del

espermatozoide de alpaca al post congelamiento.

Los autores


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.


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1. ASPECTOS GENERALES.

El uso de la inseminación artificial es considerado como un medio para

acelerar el mejoramiento genético de los rebaños, haciendo factible que unos

cuantos machos seleccionados de buena calidad puedan donar semen para inseminar

artificialmente a cientos de hembras dentro de su vida reproductiva y así lograr

mejores generaciones.

La inseminación artificial es la técnica individual más importante creada

para el mejoramiento genético de animales y actualmente se práctica en vacunos,

porcinos, ovinos y otras especies (Hafez, 1993).

En las alpacas la mejora genética es lenta en comparación a otro ganado,

debido a su fisiología reproductiva que limita la aplicación de alguna biotecnología

reproductiva la misma que funciona muy bien en otras especies, una de estas

limitantes es el largo periodo de gestación, otra restricción es que los animales

machos inician la pubertad al primer año de edad y tienen problemas en la

liberación completa del pene que les impide realizar una copula normal y recién a

los 3 años el 100% de animales se encuentran libres de la adherencia pene-

prepucial, por tal razón sugieren trabajar con animales mayores (Reyna, 2005).

También hay otro problema importante pero ya casi superado acerca de la

obtención de semen de buena calidad, pues se ha intentando diversos métodos por

muchos años, el empleo del maniquí y una vagina artificial modificada que en la

actualidad viene a ser el mejor método utilizado, con este procedimiento la copula

es similar a la monta natural durando en promedio 20 minutos según Tibary et al,

(1999), como se sabe la monta natural es prolongada sosteniendo aproximadamente

25 minutos (Bustinza 2001).

Acerca de las características seminales se indica que los eyaculados

colectados de 3 o 4 días tienen un mejor volumen y concentración. El volumen de

semen varía de acuerdo a la técnica de obtención utilizada, a la individualidad y

entre una colección a otra, tal es así que oscila de 0.8 ml a 1.0 ml y

excepcionalmente se ha reportado 12 ml (Bustinza, 2001). Con respecto a la

concentración hay una variación extensa desde 22.5 a 875 millones/ml (Vaughan et

al, 2003). Así también según Sumar y Leyva, (1981) indica que en el semen de

alpaca no hay motilidad masal por la baja concentración relativa de espermatozoides

y porque se ha observado una motilidad progresiva individual, esta última

observación obedece a que el plasma seminal es altamente viscoso por lo que el

movimiento de los espermatozoides es lento en cuanto a su desplazamiento

comparado con el ovino y bovino. A ello se agrega que la cuantificación promedio

de la motilidad individual en semen fresco es de 85% con rangos de 69% a 91%

(Bustinza, 2001).

CRIOBIOLOGÍA DEL SEMEN.

La criopreservación y su empleo para la inseminación artificial han causado

un gran impacto sobre la reproducción animal. Innumerables crías de diferentes

especies han nacido a partir del uso del semen congelado. Sin embargo

constantemente se modifican los protocolos de congelación a fin de obtener mejores

resultados en relación a la supervivencia y fertilidad del semen congelado. Múltiples


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factores afectan la sobrevivencia de los espermatozoides al descongelamiento como

la concentración espermática en el diluyente, el envasado, la composición del

diluyente empleado, el shock de frío entre otros (Stornelli et al, 2005).

Durante el proceso de congelación y descongelación se pierde

aproximadamente el 50% de la población inicial de espermatozoides debido a los

efectos de criopreservación sobre las membranas celulares, el citoesqueleto, aparato

locomotor y núcleo del espermatozoide. Se considera que el principal sitio de daño

asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermáticas,

considerándose a esta causa como la más asociada a la reducción de la fertilidad del

semen congelado durante los procesos de refrigeración, congelación y

descongelación. (Watson, 1995).

La optimización del protocolo de congelación debe contemplar no solo la

obtención de un alto número de espermatozoides sobrevivientes sino también la

habilidad funcional de esta población (Stornelli et al, 2005). La eficiencia para la

congelación del semen varía entre las especies y entre machos individuales de una

misma especie. Estas variaciones se relacionan con las características biofísicas y

bioquímicas de las membranas espermáticas (Hafez, 2002).

FACTORES QUE AFECTAN AL ESPERMATOZOIDE DURANTE EL

PROCESO DE CRIOPRESERVACIÓN.

Para obtener buenos resultados de supervivencia espermática y fertilidad de

los espermatozoides es necesario comprender a que tipo de estrés se ven sometidos

los espermatozoides durante los procesos de congelación y descongelación así como

la manera en que las células responden a las agresiones físico-químicas y

medioambientales (Stornelli et al, 2005).

CAMBIOS DE VOLUMEN.

Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados se ven

sometidos a varios ciclos de deshidratación e hidratación lo que resulta en

cambios significativos de volumen. El primer cambio de volumen ocurre

cuando la célula es colocada dentro de un diluyente, el cual contiene

sustancias crioprotectoras como glicerol, y posteriormente cuando la

solución es congelada. Mas tarde ocurren cambios de volumen cuando la

solución es descongelada. Estos cambios de volumen están asociados a

cambios de la concentración de iones y electrolitos en las soluciones intra y

extra celulares. La forma en que ocurren estas modificaciones determinan la

mayor o menor capacidad de la célula para soportar el daño a la que se ve

sometida. El cambio de volumen es solo uno de los factores de estrés a los

que la célula se ve sometida durante el proceso de criopreservación (Leivo y

Dradey, 1999).

SHOCK DE FRÍO.

Es bien conocido que el enfriamiento rápido del semen entre 30 ºC y

0 °C induce un estrés letal en algunas células, el cual es proporcional a la

tasa de enfriamiento. Es así que el enfriamiento en este rango de temperatura

debe ser realizado cuidadosamente (Watson, 1981). Este fenómeno es


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conocido como shock de frío y puede apreciarse durante el enfriamiento de

espermatozoides de cualquier especie. En el porcino este fenómeno se

manifiesta inmediatamente después de la eyaculación haciéndose la célula

cada vez más sensible al mismo en las horas siguientes (Pursel et al, 1978).

El estrés de la membrana puede continuar por debajo de 0 °C sin que

el cambio de fase sea completo, sin embargo es bien conocidoque los

cambios de fase ocurren, en su mayoría, entre los 5 °C y 15°C (Dobrins et al,

1993).

En un estudio sobre la función de permeabilidad de la membrana del

espermatozoide al criopreservar semen de verraco, se ha demostrado la

importancia de la composición lipídica del medio ambiente donde se

encuentra la membrana plasmática durante el enfriamiento, esto relaciona al

componente lipídico en la participación del paso de moléculas en la

membrana e interviene en el mecanismo del daño celular (Pettit y Bhur,

1998).

El agregado de preparaciones lipídicas purificadas a los

espermatozoides reduce significativamente el shock de frío y el daño

producido por la congelación – descongelación (Graham, 1987), por lo que

usualmente se incluye yema de huevo en la preparación de los diluyentes

debido a que los fosfolípidos y las lipoproteínas de baja densidad poseen un

efecto protector contra el shock del frío (Quinn et al, 1980).

EL CRIOPROTECTOR Y EL ESTRÉS CELULAR.

El crioprotector permite mantener una mayor proporción de agua

líquida intracelular a bajas temperaturas y en consecuencia una menor

concentración de electrolitos posibilitando la supervivencia celular durante

el proceso de criopreservación. Sin embargo, estos compuestos y los

diluyentes producen un estrés transitorio pero importante sobre la membrana

plasmática de los espermatozoides (Stornelli et al, 2005).

La magnitud de este hecho esta íntimamente relacionado con la

capacidad penetrante de los crioprotectores (Gao et al, 1993). El

crioprotector de elección es comúnmente el glicerol, el cual produce una

alteración osmótica. A la vez se ha observado que la hiperosmolaridad

producida por este compuesto posee un efecto estimulador para la reacción

del acrosoma (Aitken et al, 1983).

Además del glicerol existen otros compuestos que poseen

propiedades crioprotectoras como por ejemplo el etilen glicol,

propilenglicol, dimetil sulfóxido o metanol (Navarro et al, 2004).

ESTRÉS OSMÓTICO.

El estrés, inducido por la formación de cristales de hielo está

asociado a los cambios en la presión osmótica de la fracción no congelada

(Watson, 1988). Cuando una solución es enfriada por debajo del punto de

congelación los cristales de hielo se integran y el agua pura se cristaliza

formando hielo. Los solutos permanecen disueltos en la fracción de agua

líquida y por lo tanto la presión osmótica de la solución aumenta. La


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proporción de agua cristalizada como hielo y la presión osmótica de la

solución restante depende de la temperatura, velocidad de descenso de la

misma y el volumen de la fracción no congelada (Stornelli et al, 2005).

Por tal sentido la duración de la exposición a estos eventos debería

minimizarse para lograr una óptima sobrevivencia, implicando entonces que

el enfriamiento celular debería ser rápido. Sin embargo la tasa de

enfriamiento debe ser suficientemente lenta como para permitir la salida de

agua, y prevenir la formación de cristales de hielo intracelular, lo cual es

letal para la célula (Holt y North, 1991). Así también refieren que el

porcentaje de células que sobrevive a un proceso de congelación esta

determinado por la sensibilidad al estrés osmótico durante la adición y

remoción de crioprotectores durante el enfriamiento y el recalentamiento

(Stornelli et al, 2005). Las células espermáticas poseen mayor permeabilidad

al agua que otros tipos celulares (Noiles et al, 1993). Si bien puede haber

diferencias entre especies en la sensibilidad del espermatozoide a la

criopreservación, el eyaculado es heterogéneo habiendo una resistencia

variable al estrés osmótico entre las células espermáticas (Katkov et al,

1998).

Los signos de estrés manifestado por los espermatozoides luego de la

descongelación no se relacionan solo con el estrés osmótico sufrido en el

descongelado sino también con el estrés sufrido durante el congelado (Holt y

North, 1991). Es por eso que cada tipo celular posee una velocidad óptima de

congelación que garantiza su supervivencia luego de la criopreservación. Si

la velocidad de congelación es demasiado rápida o demasiado lenta el estrés

producido por el proceso de criopreservación aumenta. Mazur, (1984) hizo

un calculo empírico acerca del congelamiento de las células espermáticas

estimando un rango de 15 a 60 °C/minuto como la velocidad optima de

congelación que permite mayor probabilidad de obtener una mejor tasa de

sobrevivencia celular.

ALTERACIONES A LOS ESPERMATOZOIDES DURANTE EL PROCESO DE

CRIOPRESERVACIÓN.

Uno de los efectos comprobados producidos durante el proceso de

criopreservación es la disminución de la motilidad del espermatozoide (Hafez,

2002; Stornelli et al, 2005).

En tanto que una pequeña parte de la población celular exhibe un

movimiento progresivo vigoroso, la mayoría de las células muestran variables

grados de alteración de la motilidad post congelado en comparación con la

motilidad del semen fresco. Este hecho puede estar íntimamente relacionado con la

pobre capacidad fecundante del semen congelado. En un estudio con semen

criopreservado realizado en humanos se encontró que tanto la motilidad progresiva

como el vigor del movimiento celular eran factores relacionados estrechamente con

la fertilidad (Kelly et al, 1997).


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Si bien, estudios de fertilización in vitro han demostrado que los

espermatozoides criopreservados son capaces de fertilizar, solo algunos acceden al

proceso pero muchos otros estan estructuralmente afectados y son incapaces de

fertilizar (Ellinton et al, 1999).

EFECTO DE LA CRIOPRESERVACIÓN SOBRE EL ESPERMATOZOIDE.

Una vez que los crioprotectores ingresan al citoplasma a favor del gradiente

de concentración, el fluido intracelular puede ser enfriado a temperaturas entre -5 y -

15, sin que ocurra la formación de cristales hielo, debido a que estas sustancias

disminuyen el punto de congelación por medio de la interacción entre las moléculas

de agua, a estos rangos de temperatura los cristales de hielo comienzan a formarse

en el medio externo. Cuando las temperaturas descienden por debajo de estos

rangos, se inicia la formación de cristales de hielo intracelular (Vincent et al, 1998).

La temperatura a la cual deben ser incorporados los crioprotectores a la

solución de semen y el tiempo de exposición celular, dependen del grado perjudicial

del crioprotector principalmente en volúmenes excesivos y de su velocidad de

difusión a través de la membrana plasmática. Esta difusión puede verse afectada por

el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso la membrana celular

aumenta la proporción de colesterol con el propósito de lograr mayor estabilidad

mecánica; sin embargo, este aumento del colesterol también disminuye la

permeabilidad de la membrana a pequeñas moléculas, pudiendo afectar la

penetración del crioprotector en la célula de una manera efectiva (Spinel, 2002).

Los mecanismos de acción especifica de los agentes crioprotectores a nivel

celular no están bien explicados, al parecer la interacción ocurre en el ámbito de la

bicapa lipídica específicamente en la interacción con los fosfolipidos, a lo indicado,

no solo es importante establecer como interactúa el crioprotector, sino que es

necesario y mas imprescindible determinar el efecto perjudicial de estos para poder

tomar el control celular (Medina et al, 2005).

1.5.1 CRIO DAÑO SOBRE LA BICAPA LIPÍDICA

Las propiedades de la membrana están dadas por la proporción

lipídica de un 70% de fosfolipidos, 25% de lípidos neutros (principalmente

colesterol), y 5% glicolípidos (Muller et al, 1994). Los fosfolipidos al formar

la mayor parte de la membrana, pueden conferir gran fluidez, pero también

mayor inestabilidad, que es contrarrestada por las cantidades variables de

colesterol (Holt, 2000).

Se ha sugerido que el estrés térmico sobre la membrana plasmática

durante el enfriamiento resulta en la transición de la fase líquida a una fase

de gel en los fosfolipidos de la membrana, como resultado de esta transición,

las proteínas integrales de la membrana pueden ser excluidas de los

dominios de los lípidos de la fase de gel y son agrupadas, algunas veces de

forma irreversible. La actividad de muchas enzimas asociada a las

membranas se reduce, así como la tasa de difusión de proteínas por

lateralización dentro del plano de la bicapa, reduciendo de este modo la

eficiencia de los procesos relacionados con la difusión (Labbé et al, 1997).


17

Durante la exposición al frío se ha observado la reducción en la

proporción de ácidos grasos saturados e incremento en la proporción de

ácidos grasos insaturados. Cuando aumenta la temperatura, la relación de los

fosfolipidos y los contenidos de colesterol se correlacionan positivamente;

estos cambios originan una reorganización de la membrana, lo que ayuda a

la célula a sobrevivir a las nuevas temperaturas (Labbé et al, 1997).

Se ha demostrado que un largo periodo de aclimatación térmica

induce a algunas modificaciones en los patrones de ácidos grasos de los

fosfolipidos de la membrana plasmática de los espermatozoides. Sin

embargo, esto podría ser el resultado del cambio fisiológico que sufren los

animales para mantener la fluidez de la membrana, donde la composición de

los ácidos grasos y la proporción de moléculas de colesterol se modifica en

función de la temperatura del ambiente. Se observó una mejor resistencia a

la criopreservación, los espermatozoides que se mantuvieron bajos en

contenidos de colesterol en la membrana plasmática, esta baja cantidad de

colesterol se correlacionó con una mejor capacidad de fertilización de los

espermatozoides después de la criopreservación (Spinel, 2002).

1.5.2 CRIO DAÑO SOBRE LA INTEGRIDAD MITOCONDRIAL

La integridad mitocondrial juega un papel importante. Los

procedimientos de congelación y descongelación inducen una disminución

en la producción de ATP, la cual varía con el crioprotector utilizado. Esta

disminución puede resultar del estrés osmótico durante la adición del

crioprotector o el congelamiento del agua externa. Las diferencias entonces,

en la capacidad entre el glicerol y el metanol para prevenir la disminución en

la síntesis de ATP, pueden ser parcialmente explicadas por el hecho de que

el medio de congelación con glicerol permite los más altos valores de

osmolaridad y con el metanol los más bajos (Ogier et al, 1997).

Los cambios morfológicos determinados por microscopia electrónica,

revelan daños en la pieza media del espermatozoide en la fase de post

descongelación, conllevando a la formación de protuberancias o

ensanchamientos de la membrana en esta zona como resultado de la perdida

de la envoltura densa de las mitocondrias. La formación de protuberancias

también ha sido determinada en el flagelo y la cabeza del espermatozoide,

con pérdida de cromatina nuclear, dándose una pérdida de la funcionalidad

mitocondrial y una disminución de las reservas de energía necesarias para el

movimiento flagelar del espermatozoide, comprometiendo la

osmoregulación celular (Yao et al, 2000).

Aparentemente la toxicidad de los crioprotectores está dirigida sobre

el estado bioenergético del espermatozoide, interfiriendo con el balance

entre síntesis y utilización de ATP, ya que frente a una deficiencia de ATP,

durante la congelación, el control metabólico sobre los procesos celulares

dependientes de iones podría verse afectado, ocasionando una inapropiada


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activación de fosfolipasas y proteasas afectando un daño celular irreversible

(Holt, 2000).

1.6 PROCESAMIENTO PARA EL CONGELADO DEL SEMEN.

1.6.1 LOS DILUYENTES O DILUTORES.

Este medio debe realizar la función de aporte de nutrimentos como

una fuente de energía, proteger contra el efecto nocivo del enfriamiento

rápido, ser amortiguador de tal manera que impidan los cambios

perjudiciales de pH, mantener la presión osmótica apropiada y el balance

electrolítico, inhibir la proliferación electrolítica, incrementar el volumen del

semen y proteger a las células durante el congelamiento (Hafez, 2002),

generalmente a este primer medio de solución se denomina diluyente A.

Prácticamente, todos los diluyentes para semen líquido o congelado

tienen yema de huevo o leche descremada o una combinación de estas dos,

como componentes básicos. Es posible que el suero sanguíneo al igual que la

yema de huevo ofrezca una protección a la membrana del espermatozoide al

congelamiento, que consistiría en una interacción de la superficie celular

más con los lípidos que con las proteínas, señalando que el suero posee una

inclusión proteínica de 7 gr/ml (Palacios y Zarco, 1995).

A continuación se mencionan varios ejemplos del empleo de

dilutores en diferentes especies. En semen de carnero Angulo et al, (1999)

utilizaron un dilutor conformado por tris 36.05 gr, ácido cítrico 20.2 gr,

fructuosa 14.88 gr, agua bidestilada 100 ml y 20% de yema de huevo. En el

caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) empleó un dilutor compuesto de

74 partes de citrato de sodio, 25 partes de yema de huevo, 1 parte de glucosa,

1000 UI/cc de penicilina y 500 mg/cc de estreptomicina. Por otro lado Cueto

et al, (2003) en una dilución de semen de caprino emplearon 10% de leche

descremada en polvo (50 ml de agua bidestilada y 5 gr de leche), glucosa 1%

(0.5 gr de glucosa), 1 gr de penicilina y estreptomicina (1000 UI) por

mililitro de diluyente, en caso del caprino antes de unir al dilutor, se debe

proceder a lavar el semen, es decir separar del plasma seminal mediante

centrifugación a 2000 rpm/10 minutos. En otro estudio con fines de

congelación se utilizaron dilutores para semen de cerdo compuesto a base

yema de huevo y lactosa, previo a esta se mantuvieron a 15 °C/24 horas y se

centrífugo (250gr) a 1500 rpm/10 minutos (Gosálvez et al, 2003).

Antes de la dilución debe mantenerse a 30°C para evitar el shock

térmico, se extrae una porción de semen para su evaluación y el resto puede

mezclarse con tres o más partes de diluyente a 30°C, en toros el semen no

congelado puede diluirse en una proporción de 200 a 300 veces (Hafez,

2002).

Bravo, (1998) indica que en camélidos, se viene aún investigando

dilutores adecuados para trabajos de congelamiento. Los dilutores que

mantuvieron mayor número de espermatozoides vivos, en orden de

importancia según Vaughan et al, (2003), son: tris tamponado 70%; tryladil

65%; yema de huevo, glucosa y citrato 8%.


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Así también Aller et al, (2003) utilizaron citrato sódico, yema de huevo,

glucosa, penicilina, sulfato de estreptomicina para emplearlo en semen de

llama.

1.6.2 REFRIGERACIÓN.

Luego de la mezcla realizada se enfría gradualmente hasta 5°C en

todas las especies excepto en el verraco que suele mantenerse a 15°C. El

enfriamiento debe ser lento, tomando por lo menos 1 hora, este proceso suele

realizarse protegiéndose con un recipiente en una camisa de agua para

amortiguar el shock térmico (Hafez, 2002).

El enfriamiento se realiza a razón de 2°C cada 3 minutos y

permanece a 5°C durante 45 a 60 minutos antes de proceder al agregado del

diluyente B que contiene el crioprotector (Cueto et al, 2003).

Similarmente Angulo et al, (1999), sometieron el semen de carnero

en un recipiente de 22°C e introdujeron a refrigeración a 0°C durante 2

horas, tiempo suficiente que paulatinamente alcanza 5°C, afirma que no

sufre choque térmico con este procedimiento. Del mismo modo Medrano et

al (2004), refrigeraron pajillas con semen de caprino hasta 5 ºC por dos

horas. El procedimiento no tiene diferencia entre pajuelas, pellets u otro, en

cuanto a refrigeración.

1.6.3 ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR.

Por lo general se añade el crioprotector al semen después de enfriarlo

y esta incorporación debe ser por etapas lo que permite una mayor

proporción de espermatozoides sobrevivientes (Gao et al, 1993). La cantidad

final del crioprotector en las diferentes especies puede variar desde 5% en

medios de yema de huevo o azúcar a 10% en leche. En caso del verraco se

utiliza 2% de glicerol (Hafez, 2002).

Para el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) emplearon 14% de

glicerol en la fracción B a base de yema y citrato, es decir quedando una

concentración final de 7% de glicerol, este proceso es general en la

criopreservación de semen, y para el periodo de estabilización un tiempo

entre 3 a 6 horas.

Angulo et al, (1999) mencionan, que para poder congelar semen de

carnero debe utilizarse 5% de glicerol más un dilutor a base de tris, yema de

huevo y ácido cítrico.

Otro estudio en semen de cerdo fue realizado por Gosálvez et al,

(2003) quienes utilizaron 4% de glicerol mas yema de huevo y lactosa,

dejando una proporción final de 2% del crioprotector, que por lo general la

concentración de glicerol es baja en esta especie.

Cueto et al, (2003) trabajando con semen de caprino usó 6% de

glicerol, agregado que fue en tres partes cada 10 minutos, teniendo en cuenta

un pH entre 6.8 y 7.2.

Hafez, (2002) afirma que la mezcla del semen y el diluyente en

cualquier especie se debe dejar reposar durante varias horas antes de


20

congelarla, para permitir que las células espermáticas se equilibren con el

diluyente, 4 a 6 horas como óptimo dependiendo del medio utilizado.

Mientras Medrano et al, (2004) emplearon solo 2 horas antes de

someter a congelamiento.

1.6.4 ENVASADO O EMPACADO DEL SEMEN

Se pueden realizar de 3 formas; a) En pajillas de 0.25 a 0.5 ml de

semen diluido. b) En ampolletas de vidrio de 0.5 a 1 ml que son recipientes

estériles que se pueden rotular, llenar y sellar de manera automática y c) Por

píldoras o pellets de 0.1 a 0.2 ml, que requieren poco espacio cuando se

almacena masivamente y es una forma económica, su principal desventaja es

la dificultad para identificar cada píldora (Hafez, 2002).

Por otro lado, en un estudio con semen de carneros se demostró que

en pajillas de 0.25 ml puede envasarse el semen con 300 x 106

espermatozoides motiles (Angulo et al, 1999).

1.6.5 CONGELAMIENTO DEL SEMEN.

Olivares y Urdaneta, (1985) precisaron, que posterior al periodo de

equilibrio con el crioprotector debe procederse a precongelar las pajuelas de

semen, en vapores de nitrógeno a –120 °C por 10 minutos y luego introducir

a –196 °C.

Para realizar el congelamiento de semen de carnero Angulo et al,

(1999) sometieron a 4.5 cm sobre el nivel superior del nitrógeno durante 10

minutos.

Hafez, (2002) menciona que en caso de las pajillas suelen congelarse

en vapores de nitrógeno y almacenados a –196°C, a menudo las ampolletas

se congelan a razón de 3°C/minuto hasta –15 y este desciende hasta llegar a

–150 °C, es ahí entonces donde se depositan a –196°C. Para el método de

píldoras se colocan gotas en un volumen aproximado de 0.1 ml, en huecos de

forma hemisférica hechos en bloques de hielo seco (-78 º C), este

procedimiento muestra buena supervivencia al descongelado.

En otra investigación con semen de caprino se demostró que es

posible el congelamiento en vapores de nitrógeno en pajillas o en pastillas

(pellets) en hielo seco en volúmenes de 0.2 ml por un tiempo de 1 a 2

minutos, por cualquiera de estos métodos se conservan en termo de

nitrógeno líquido (Cueto et al, 2003).


21

Fig. Nº 01 : Espermatozoides en criopreservación.

1.6.6 DESCONGELAMIENTO DEL SEMEN Y EVALUACIÓN POST

CONGELACIÓN.

Después de congelarse, los espermatozoides no resisten un segundo

congelamiento, pues no sobreviven como los que han sido congelados en

una primera oportunidad por ello es necesario asegurarse la utilización del

semen congelado (Stornelli et al, 2005).

La motilidad espermática es la primera característica de evaluación y

una de las principales que se realiza, pues es un importante indicador de vida

del espermatozoide que se realiza antes y después de la criopreservación

(Hafez, 2002).

Se estima que entre el 40% y 50% de la población de

espermatozoides sobreviven al proceso de congelación–descongelación.

Así bien, parte de la población de espermatozoides que sobreviven

han sufrido daños que les convierte en incapaces de fecundar (Watson,

2000).

Cuando el semen criopreservado se descongela, se transfiere del

tanque de nitrógeno a 37°C durante 3 a 5 minutos o a una unidad de

descongelamiento automático (Hafez, 2002).

Cueto et al, (2003) por otro lado afirma que la evaluación de un 10%

de las dosis congeladas en semen de caprino es importante, lo cual debe ser

sometida a varias observaciones y poseer una motilidad masal al

descongelamiento superior al 30% y un vigor del movimiento igual o

superior a 2.5 según escala (1 - 5) enunciada por Hafez, (2002).

Se han descongelado pajillas de semen de vacuno a 37°C con buenos

resultados, mientras que las píldoras se descongelan mejor en un medio

líquido a 40°C, en condiciones prácticas de campo (Hafez, 2002).

Se obtuvieron buenos resultados al descongelar semen de cerdo a 42

°C/20 seg, obteniendo una motilidad de 28.8% y manteniendo 36.2% de

células con acrosomas normales (Gosálvez et al, 2003).


22

Otro resultado al descongelar semen de carnero a 38 °C por 8

segundos se obtuvo una motilidad progresiva de 51.2%, para ello se

consideró que el semen fresco debía tener mayor a 60% de motilidad

(Angulo et al, 1999).

Para congelar el semen en camélidos sudamericanos (caso de la

llama) se utilizó yema de huevo, glicerol y tris a lo cual se hallo una

motilidad de 10% al descongelamiento (McEvoy et al, 1992).

Se ha indicado que el dilutor PBS más 40% de suero sanguíneo, 5%

de yema de huevo y 5% de glicerina logra conservar al post congelamiento

una motilidad de 34% a partir de un promedio inicial de 69% en semen de

alpacas (Bustinza, 2001).

Al congelar semen de llama y utilizando el dilutor a base de citrato

sódico, yema de huevo, glucosa mas los crioprotectores el DMSO (dimetil

sulfóxido) a 6% y glicerol a 8% se alcanzó una motilidad individual de 20.4

% y una viabilidad de 32,4 % al descongelado (Aller et al, 2003).

Para la congelación de semen de alpaca se sirvieron del dilutor

comercial Biladyl A y B mostrando buenos resultados frente a otros dilutores

comerciales empleados en otras especies, encontrando un rango de motilidad

entre 10 y 40% con un promedio de 21.3%, los cuales fueron congelaron en

pajillas de 0.5 ml, los resultados en pellets (pastillas) mostraron 10% menor

actividad motil (Vaughan J. et al. 2003).

Para someter a congelamiento el semen de alpaca y llama

procedentes del conducto deferente, se utilizaron como componentes del

dilutor: TRIS buffer, ácido cítrico monohidratado, fructuosa y yema de

huevo, como crioprotector el glicerol a 7.5 %, se obtuvo un promedio

general de 41.0 % de motilidad individual progresiva y 43.0% de motilidad a

5% de glicerol en llamas, el procedimiento de descongelamiento fue a 37 °C

por 30 seg (Pérez et al, 2004).


23

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 DEL LUGAR

Se realizó en el Banco de Germoplasma de Camélidos Sudamericanos

Domésticos del C. I. P. Quimsachata, en el INIA-Puno que se encuentra a 15° 04’

00” de Latitud Sur y a 70° 18’ 00” Longitud Oeste a una altitud 4200 m.s.n.m.

cuenta con una área 6,282.50 has. El acceso es por trocha carrozable a 12 km del

Distrito Santa Lucia, Provincia de Lampa y Región de Puno.

2.2 MATERIALES Y EQUIPOS.

2.2.1 MATERIALES.

Se utilizaron los siguientes materiales:

Maniquí de madera

cubierto por piel de alpaca

hembra.

Vagina artificial de PVC

de 2 pulgadas de diámetro.

Funda recta de látex de uso

en vacunos.

Funda cónica de

polietileno.

Tubo colector falcón

graduado de 15 ml.

Termos de capacidad de 2

litros.

Jeringas descartables de 1,

5 y 10 ml.

Cubre objetos de 0.8 x 0.8

cm.

Porta objetos de 3.5 x 1.0

cm.

Pipetas de 1 ml y 10 ml.

Gradilla.

Algodón.

Cinta adhesiva masking

type.

Rotulador.

Vasos de precipitación de

500 ml.

Guantes quirúrgicos

descartables.

Tubos de ensayo.

Viales de 2 ml.

Mechero.

Pinza.

Detergente.

Caja térmica de tecnopor.

Superficie plana de acrílico

(8 x 15 cm).

Inflador.

Esponjas pequeñas.

Ligas de sujeción.

Toallas.

Baldes.

Lavador.

Cocina a gas.


24

2.2.2 MATERIAL QUÍMICO.

Dilutor:

TRIS (hidroximethyl) aminomethan AR 99.5%, laboratorio

GMBH.

Penicilina - Streptomicina 1000 UI, laboratorio Gibco.

Glucosa, laboratorio Merck.

Ácido cítrico, laboratorio Mallenckodt.

Yema de huevo fresco (no mayor a tres (03) días).

Crioprotectores:

Glicerol 99.5% pureza. Laboratorio SIGMA - ALDRICH

Etilen glicol 99.5% pureza. Laboratorio Malunckrodt.

Otros:

Alcohol.

Desinfectante.

Nitrógeno líquido.

Combustible (gasolina de 84 oct.)

2.2.3 EQUIPOS.

Microscopio de contraste de fases con 4 objetivos, marca Micros.

Termómetro digital marca Checktemp 1, con una escala de –50 a 150 °C.

Balanza de precisión, capacidad 0.01 gr a 200 gr, marca Ohaus.

Frazadilla eléctrica de 110V, fabricado en México.

Tanque de nitrógeno de 18 litros, GM.

Selladora, marca Impulse Sealer.

Cámara fotográfica marca Olympus de 3.5 megapixeles.

Generador de luz de 220 voltios, marca Honda 650.

Refrigeradora marca National de 14 pies, a gas propano.

2.3 ANIMALES DONADORES DE SEMEN.

Se utilizaron los siguientes animales:

Cuadro N° 01: Alpacas donadoras de semen.

Nº ARETE RAZA COLOR EDAD

01 103298 Huacaya Café Adulto

02 13145 Suri Blanco Adulto

03 EEI-021 Suri Gris Adulto

04 EEI-022 Huacaya Café Adulto

05 EEI-005 Huacaya Blanco Adulto

06 289298 Huacaya Lf Adulto

07 2170294 Huacaya Api Adulto


25

08 1299M Huacaya Lf Adulto

09 040299 Huacaya Lf Adulto

10 14803 Huacaya Blanco Adulto

Fuente: Elaboración propia.

2.4 METODOLOGÍA.

2.4.1 PREPARACIÓN SEMINAL PRE CONGELAMIENTO.

2.4.1.1 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SEMEN.

En este proceso se utilizaron 10 alpacas machos adultos

preparados como donadores de semen, además se contó un maniquí

que estuvo incorporado en su interior con una vagina artificial

acondicionado con una frazadilla eléctrica con la finalidad de

mantener la temperatura constante a 38 °C durante el tiempo de

cópula, este procedimiento se repitió a intervalos de 3 días por cada

animal para poder obtener muestras de calidad, una vez que se cuenta

con una buena muestra de semen se sometió a baño maría a una

temperatura promedio de 36°C según INIA, (2004) enseguida se

realizó el análisis macroscópico y microscópico, es en esta

evaluación donde se determina si las muestras procederán con la

investigación.

Fig. Nº 02: Animales empleados.


26

Fig. Nº 03: Muestra de semen una vez obtenida.

2.4.1.2 EVALUACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DEL

SEMEN.

Para la evaluación macroscópica se tomó en cuenta un

volumen mínimo de 0.5 ml.

Para la evaluación microscópica se evaluaron la motilidad y

mortalidad. Para la evaluación de la motilidad y mortalidad se

realizaron observaciones objetivas empleando para ello un

microscopio de contraste de fases, analizando las muestras en un

mínimo de 10 observaciones por muestra en distintos campos para

una mayor precisión, las muestras fueron observadas a aumentos de

40X para semen fresco y 100X para análisis de viabilidad, los

resultados se expresaron en porcentajes.

2.4.1.3 PREPARACIÓN DEL DILUTOR.

Para la preparación del dilutor A se mezclaron los siguientes

agentes químicos TRIS (0.36 gr), ácido cítrico (0.19 gr), que

similarmente usaron en ovinos y vacunos Angulo et al, (1999),

Olivares y Urdaneta, (1985); Adicionalmente se empleó glucosa

(0.05 gr), agua bidestilada estéril (8.5 ml), antibiótico (0.1 gr de

penicilina -streptomicina 1000 UI), utilizado también en ovinos por

Cueto et al, (2003), y como último componente se utilizó yema de

huevo (1.4 ml) que representa el 14%.

Para la preparación del dilutor B, primero se incorpora el

dilutor A más la adición de los crioprotectores en 8 %, 10 % de

glicerol y etilen glicol respectivamente.


27

Fig. Nº 04: Dilutor congelado, nótese la coloración

amarilla brindada por la yema de huevo.

2.4.2 PREPARACIÓN Y PROCESO DEL CONGELAMIENTO SEMINAL.

2.4.2.1 PROCESO DE REFRIGERACIÓN Y AGREGADO DEL

CRIOPROTECTOR. En primer lugar se realizó la dilución del semen en el dilutor

A en una proporción 1:1 (mezcla A) a 36 ºC, para mantener dicha

temperatura se sometió a baño maría, enseguida la mencionada

mezcla A es sometida a refrigeración por espacio de 2 horas y 30

minutos aproximadamente hasta llegar a una temperatura de 5 ºC,

tiempo adecuado para poder estabilizar la muestra a dicha

temperatura (Angulo et al, 1999; Hafez, 2002; Cueto et al, 2003;

Medrano et al, 2004).

Fig. Nº 05: Muestras de semen y dilutor sometidas a baño maría.


28

Una vez alcanzada los 5 ºC se procedió a agregar el dilutor B

a la mezcla A, lo cual se añadió en 3 partes cada 15 minutos, todo

ello en igual proporción 1:1 formando la mezcla B (dilutor B y

mezcla A) enseguida se deja en un periodo de tiempo de 2 horas para

permitir el equilibrio con el crioprotector.

2.4.2.2 PROCESO DE CONGELAMIENTO.

Concluida el tiempo de equilibrio, se procede a preparar una

caja térmica con las siguientes dimensiones (24 x 13 x 15 cm), en

dicha caja se deposito el nitrógeno líquido (NL) hasta una altura de 3

cm, enseguida se sumergió una superficie plana de acrílico con las

medidas (20 x 10 x 0.3 cm), por un lapso de 10 segundos hasta que el

NL cese de ebullir, e inmediatamente después se eleva la mencionada

superficie en posición horizontal quedando ubicado a 2 cm sobre el

nivel del NL y expuestos sobre los vapores del mismo; quedando

listo para depositar la muestras que estuvieron a 5 ºC, para ello con la

ayuda de una jeringa de 1 ml se ubican sobre la superficie en un

volumen que varía desde 0.10 ml a 0.15 ml por un espacio de 2

minutos (precongelación), luego las muestras en precongelación

junto a la superficie de acrílico se sumergen al nitrógeno líquido (-

196°C) para alcanzar la congelación, es en este medio que se separan

por si solos los pellets de la superficie acrílica para luego proceder a

depositar y envasar en viales de 2 ml debidamente identificados, para

su posterior análisis post congelamiento.

Fig. Nº 06: Obtención de las muestras para su congelación.


29

Fig. Nº 07: Precongelación en vapores de nitrógeno.

Tapa externa

Pellets o pastillas en pre congelacion

Nitrógeno líquido (-196 C)

Superficie solida5 cm4 cm3 cm2 cm

1 cm

Fig. Nº 08: Vista lateral del procedimiento realizado.

Tapa externa

Superficie solida

5 cm4 cm3 cm2 cm

1 cm

Fig. Nº 09: Nótese los pellets sumergidos a NL .


30

2.4.3 EVALUACIÓN POST CONGELAMIENTO.

Las muestras se obtienen del tanque de nitrógeno y se procede a

someter al baño preparado a 38 ºC por un espacio de 90 segundos, enseguida

se deposita una alícuota entre una lámina porta y cubre objeto que

previamente fue temperada a 37º para su observación, los resultados de

motilidad fueron expresados en porcentajes, para ello se efectuó varias

observaciones por muestra analizada. La evaluación de la motilidad se

ejecutó con la misma metodología mencionada en el item de evaluación

macroscópica y microscópica del semen.

2.4.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Para la presente investigación se evaluaron cuatro tratamientos:

T1 = 8% glicerol, T2 = 10% glicerol, T3 = 8% etilen glicol y T4 = 10%

etilen glicol, con 10 repeticiones cada una, haciendo un total de 40 muestras.

Para el análisis estadístico se empleó un diseño completamente al azar

(DCA), para la comparación de grupos se utilizó la prueba de media de

contrastes ortogonales.

El modelo aditivo lineal que se utilizó fue:

Y ij = µ + Ci + Eij

Donde:

Yij = Es el efecto del crioprotector en la

criopreservación del espermatozoide de alpaca después del congelamiento.

µ = Efecto de la media general

Ci = Efecto del i-ésimo crioprotector:

i1 = Glicerol 8%

i2 = Glicerol 10%

i3 = Etilen glicol 8%

i4 = Etilen glicol 10%

jr = 1,2,3…r (r = 10 repeticiones)

Eij = Error experimental.


31

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES EVALUACIÓN SEMINAL POST CONGELAMIENTO.

RESULTADO DE MOTILIDAD DEL ESPERMATOZOIDE

POST CONGELAMIENTO.

Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 02, evidencian

principalmente que la mejor motilidad que se halló al descongelado

fue con el tratamiento a 8% de glicerol, obteniendo 31.93% en

promedio de motilidad individual, y el siguiente mejor resultado fue

24.04% a 10% de glicerol, los dos siguientes tratamientos a 8 y 10%

de etilen glicol mostraron valores inferiores por lo que se puede

formular que no ejercen igual capacidad crioprotectora a los

espermatozoides.

Al ejecutar el análisis de varianza a los datos mencionados

post congelamiento, se pudo determinar que existen diferencias

altamente significativas entre los tratamientos evaluados en su

motilidad por lo que se demuestra estadísticamente al menos uno de

los tratamiento en cada caso es diferente frente a los otros.

RESULTADO DE MORTALIDAD DEL ESPERMATOZOIDE

POST CONGELAMIENTO.


32

Los resultados que se muestra en el cuadro Nº 03, demuestran

principalmente una elevada mortalidad con el empleo de 8% y 10%

de etilen glicol, en el siguiente caso de las muestras de glicerol

mostraron menor mortalidad con respecto al etilen glicol.

Al ejecutar la desviación estándar en el cuadro de mortalidad

post congelamiento, se pudo determinar que las muestras de glicerol

tienen menor grado de dispersión frente a las de etilen glicol. Para

determinar en forma específica que tratamiento es diferente se

efectuó la prueba de contrastes ortogonales que se muestra en el

siguiente cuadro Nº 04.

Fig. Nº 10: Espermatozoide observados.


33

PRUEBA DE CONTRASTES ORTOGONALES PARA

MOTILIDAD Y MORTALIDAD ESPERMÁTICA POST

CONGELAMIENTO.

En el cuadro Nº 04 al realizar las comparaciones de glicerol y

etilen glicol se determina que hay diferencias altamente significativas

(P<0.01) aseverando que el glicerol es superior en capacidad

crioprotectora frente al etilen glicol a iguales concentraciones.

Así mismo se halló diferencias significativas (P<0.01) entre

las concentraciones de glicerol al 8% y 10% donde resulto mejor la

proporción de 8% demostrando un mejor perfil crioprotector.

Y al efectuar el análisis entre los dos diferentes porcentajes de

etilen glicol (8% y 10%) no existe ninguna diferencia significativa

(P>0.01), afirmando que son similares y que estas concentraciones no

ejercen un buen efecto crioprotector.


34

El presente cuadro destaca cuando se observa el resultado de

contraste entre 8% y 10% de glicerol donde resulta no significativo

(n.s.) debido a su similitud o semejanza entre los promedios y el

grado de dispersión que muestran las unidades muéstrales. De igual

manera los resultados restantes se mantienen igual al cuadro Nº 04 en

su grado de significación.

El mejor resultado en la presente investigación fue empleando

glicerol a 8% logrando una motilidad promedio de 31.93%,

alcanzando niveles máximos de 46%, trascendiendo mejor que varios

estudios realizados en camélidos domésticos hasta la fecha.

Investigaciones anteriores que mostraron resultados inferiores

a la presente investigación podemos mencionar los siguientes: como

el caso de McEvoy et al, (1992) quienes intentaron criopreservar

semen de llama encontrando motilidades desde 5 a 10%, así también

Huanta et al, (1999) en otra oportunidad obtuvo una motilidad de

20% y 25% con glicerol y etilen glicol respectivamente; en otra

ocasión Huanca y Sapana, (2000) congelaron semen de alpaca y

obtuvieron 5.22% de motilidad, mientras Aller et al, (2003)

obtuvieron en llamas resultados semejantes al presente estudio,

encontrando 20.4% de motilidad utilizando los crioprotectores

DMSO (dimetil sulfóxido) y glicerol.


35

Sin embargo equivalentes resultados a la presente

investigación encontraron Vaughan et al, (2003) pero con un rango

mas amplio desde 10 a 40% y un promedio general de 21.3% de

actividad motil; concluyendo estas referencias varios investigadores

atribuyeron estos resultados poco alentadores a las características

seminales de la alpaca.

En ese sentido se plantearon otras alternativas de obtención de

semen y que también alcanzaron resultados similares y ligeramente

superiores, uno de estos intentos fue efectuado por Pérez et al, (2004)

que obtuvo semen procedentes del conducto deferente y usando como

medio de dilución yema de huevo, tris, ácido cítrico y glicerol

encontró un rango de motilidad a la descongelación de 24.4% a

43.0% en distintas proporciones de yema de huevo y glicerol. Similar

resultado encontró Canorio et al, (2006) al congelar semen

epididimario hallando resultados de 34% de motilidad progresiva

usando dimetil acetamina como crioprotector.

En la presente investigación se obtuvo semen casi en las

mismas condiciones naturales y características propias de una copula

normal, en los casos anteriores las muestras de semen fueron

obtenidas de lugares no comunes del aparato reproductor del macho.

Con estos resultados se confirmó lo mencionado por Watson, (1995)

que durante el proceso de congelación – descongelación se pierde

aproximadamente el 50% de la población inicial. Al respecto Katkov

et al, (1998) indicaron que a pesar de que optimicemos el proceso de

criopreservación y minimicemos el riesgo de muerte celular, una

parte de la población celular no es capaz de sobrevivir; y aun así

algunas células sobrevivientes se convierten en incapaces de fecundar

afirmaron Stornelli et al, (2001); por lo que es necesario concentrarse

en la funcionalidad de la población sobreviviente sugieren Katkov et

al, (1998).

Sin duda los mejores resultados en cuanto a criopreservación

de semen de la alpaca están alrededor de 7.5 y 8.0% de glicerol

después del presente estudio podemos concluir que no debe estar

lejos la concentración mas adecuada para su criopreservación y su

empleo en la inseminación artificial.

Los ultimo estudios han reportado el empleo del glicerol a

concentraciones que oscilan desde 2% a 10% en las diferentes

especies domesticas como ovinos, vacunos, porcinos y otros según

Medrano et al, (2004); Cabrera, (2007) y Batista et al, (2007).

El grado de concentración de los crioprotectores es variable

debido a las características seminales que varia entre especies, por

ello no es posible generalizar y adecuar a cualquier especie un

protocolo de congelación que funciona en otra, y por lo que es

necesario realizar algunos cambios y experimentar otros agentes

crioprotectores o nuevas metodologías.


36

Para hacer algunas comparaciones de motilidad con otras

especies a los resultados obtenidos hay una serie de investigaciones

en otras especies como lo efectuado en semen de toros donde

obtuvieron resultados mayor al 50% de motilidad al descongelado

(Cabrera, 2007).

En carneros ya se ha encontrado motilidades de 58.3% y

56.7% en razas de costa y sierra respectivamente Flores y Mellisho,

(2004).

En otro estudio por Flores et al, (2004) en ovinos hallo 48.2%

desde 80.9% de motilidad inicial en semen fresco.

En caprinos Ceiro et al, (2006) al evaluar la respuesta a la

criopreservación de semen pudo hallar una motilidad de 24.61%. En

cerdos la mayoría de los casos, la motilidad es menor a 50%

menciona Watson, (1996), no obstante se ha registrado una motilidad

espermática de 40 a 50% en pellets y de 20 al 40% en pajillas según

publicaron Pursel y Jonhson, (1975). Otro estudio en cerdos halló una

motilidad de 28.8% de motilidad post congelamiento investigación

que fue efectuado por Gosálvez et al, (2003) sin embargo mejor

resultado a lo enunciado por Gosálvez encontró Córdova et al, (2004)

con 47.14% de motilidad post congelamiento a partir de una

motilidad inicial de 80%.

Sánchez et al, (1999) al investigar semen de canino encontró

resultados al descongelado de 47.4%, a partir de una motilidad inicial

de 83.8% de motilidad progresiva.

Por todo lo mencionado antes, por los diversos investigadores

en cuanto a los resultados de congelamiento de semen podemos

afirmar que varios protocolos son sensibles a cambios, pues los

resultados post congelamiento en mejor de los casos están alrededor

de 40% a 50% empleándose así en la inseminación artificial,

fertilización in vitro y otros, desde luego dependiendo de la especie.

Por estos resultados con que actualmente se cuenta se viene

investigando el nivel de eficiencia con el uso de semen congelado en

la inseminación artificial en diferentes especies, a pesar de estas

características de motilidad.


37

CONCLUSIONES

El crioprotector que brindó mejor motilidad individual fue el tratamiento de 8% de

glicerol.

En cuanto al etilen glicol la concentración que mostró mejor motilidad individual

fue al 10%, pero muy inferior al glicerol.

El 8% de glicerol produjo menor mortalidad, confirmando la mejor concentración

de crioprotector en la presente investigación.

La mayor mortalidad hallada al descongelado fue empleando con 8% de etilen

glicol.

RECOMENDACIONES

Para seguir avanzando con este trabajo y tomando como base lo efectuado se sugiere los

siguientes.

Experimentar proporciones mas finas de glicerol de preferencia entre el rango 7.5,

7.6, 7.7 … hasta aproximadamente 8.4, 8.5% de concentración final, para poder

determinar lo mas óptimo.

Investigar otras distancias (alturas) menor o mayor a 2 cm sobre el nivel superior

del nitrógeno líquido, al cual se estudio en el presente.

Realizar pruebas de criopreservación en pajillas de 0.25 ml.

Como investigación secuencial a la presente, se debe ejecutar pruebas espermáticas

para determinar la condición de la membrana celular como la integridad del

acrosoma, pruebas hipoosmóticas entre otros y finalmente la fertilidad de estas

células.

COMENTARIO

Este estudio como se menciona antes se efectuó en pellets, al parecer los resultados

positivos pudo haber sido influido por la forma de la pastilla, pues en el proceso de

congelación a nivel de la lamina sólida fue posible notar que tiene unas 03 etapas antes de

la solidificación total, que se recreara mas adelante en un grafico, pero esto es simplemente

una hipótesis que necesita ser tomada o desechada, en este sentido podemos concluir que

talvez hay una proporción útil de la pastilla optima y otra 02 posiblemente con menor

calidad de células vivas. De todas maneras en todo lo mencionado antes nos podemos dar

cuenta que hay diversas partes en la metodología que requieren ser afinados.


38


39

REFERENCIAS 1. Aitken R. J., Wang Y. F., Liu J., Best F. and Richardson D. W. 1983. The influence of madium comsition

osmolarity and albumin on acrosome reaction and fertilizing capacity of human spermatozoa development of an

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3. Ángulo Mejorado R. S., Ortiz Hernández A. y Berruecos Villalobos J. M. 1999. Motilidad y fertilidad del

semen de carnero descongelado a dos diferentes ritmos de temperatura. Departamento de reproducción, Facultad

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