se inicia cuando una célula experimenta una alteración ... · epigenética que le confiere...
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Progresa mediante la acumulación progresiva de diferentes combinaciones de
alteraciones genéticas/epigenéticas en un contexto medio-ambiental apropiado.
Se inicia cuando una célula experimenta una alteración genética o
epigenética que le confiere ventajas selectivas para crecer y multiplicarse.
Se disemina subvirtiendo mecanismos que normalmente restringen la invasión
y colonización de territorios normalmente reservados para otras células.
número de
células
división
celular
muerte
celular
diferenciación
celular
división
celularmuerte
celular
diferenciación
celular
tejido normal (homeostasis)
tumor (pérdida de la homeostasis)
metástasis
número de
células
tumor o
neoplasma
Benigno. No invasivo. Ejemplos: Adenomas, angiomas, lipomas, etc
Maligno = cáncer. Invasivo. Ejemplos: Carcinomas, Sarcomas, etc
metástasis: Refiere a la generación de tumores secundarios, que se derivan y crecen
separados espacialmente del tumor primario.
Crecimiento y diseminación
The body of an animal operates as a society or ecosystem. The individual members are cells that
reproduce by cell division and organize into collaborative assemblies called tissues. This society is
very peculiar, however, because self-limitation – as opposed to survival of the fittest- is the rule.
Ultimately, all of the somatic cell lineages in animals are committed to die: they leave no progeny and
instead dedicate their existence to support of the germ cells, which alone have a chance of continued
survival. There is no mystery in this, for the body is a clone derived from a fertilized egg, and the genome
of the somatic cells is the same as that of the germ cell lineage that gives rise to sperm or eggs. By their
self-limitation for the sake of the germ cells, the somatic cells help to propagate copies of their own genes.
Thus, unlike free-living cells such as bacteria, which compete to survive, the cells of a multicellular
organism are committed to cooperation. To coordinate their behavior, the cells send, receive, and
interpret an elaborate set of extracellular signals that serve as social controls, directing cells how to
act. As a result, each cell grow, migrate, divide, differentiate, or die as needed for the good of the
organism. Molecular disturbances that upset this harmony mean trouble for a multicellular society. In a
human body with more than 1014 cells, billions of cells experience mutations every day, potentially
disrupting the social controls. Most dangerously, a mutation may give one cell a selective advantage,
allowing it to grow and divide more vigorously than its neighbors and to become founder of a growing
mutant clone. A mutation that promotes such a selfish behavior by individual members of the cooperative
will jeopardize the future of the whole enterprise. Over time, repeated rounds of mutation, competition,
and natural selection operating within the population of somatic cells are the basic ingredients of
cancer: it is a disease in which a clone of mutant cells begins by prospering at the expense of their
neighbors, but in the end the descendants of this clone can destroy the whole cellular society and die. The
development of human cancer, as a microevolutionary process, occurs on a time scale of years or
decades, in a subpopulation of cells in the body. But the final result depends on the same principles of
mutation and natural selection that driven the evolution of all living organisms for billions of years.
Alberts et al MBC 2008
Todos los tejidos adultos en mujeres constituyen mosaicos de células con el cromosoma X paterno (Xp) o el materno (Xm)
inactivado, proceso que ocurre al azar. El análisis de genes ligados a los cromosomas X en tumores de mujeres revela que
las células de un tumor (masa central) exhiben el mismo cromosoma X inactivo indicando el origen monoclonal del cáncer.
Los tumores tienen un origen monoclonal
Alberts et al MBC 2008
Otra evidencia en favor del origen monoclonal del cáncer proviene del análisis de alteraciones
cromosómicas en las células tumorales. Por ejemplo, todos los leucocitos de pacientes con
leucemia mielógena crónica (CML) exhiben el cromosoma Filadelfia (22) .
El cáncer es producto de un proceso microevolutivo(“multi-hit model”)
Evan & Vousden, Nature 2001
El cáncer evoluciona a partir de sucesivas
rondas de mutaciones, amplificación y
selección en los tumores, acumulándose
mutaciones en oncogenes y en genes
supresores de tumores.
Consistente con un proceso microevolutivo, la incidenciadel cáncer incrementa marcadamente con la edad
Colon cáncer
colon normal
“polyposis colon”
colon con pólipos
El cáncer de colon revela una secuencia de mutaciones relativamente predecibles que se correlacionan con la histopatología
Estudios en ratones transgénicos revelan que la acción cooperativa de varias mutaciones aceleran el desarrollo de tumores
ratones que solo
sobreexpresan myc
ratones que solo
sobreexpresan ras
constitutivamente activo
ratones que
sobreexpresan
myc y ras activo
Microfotografías de células de cuello uterino obtenidas por raspado (Papanicolaou). Las células normales (A) son
grandes, planas, con abundante citoplasma y núcleos áltamente condensados. Las células pre-cancerosas (B) y de
carcinoma invasivo (C) exhiben núcleos mas prominentes, escaso citoplasma y crecimiento irregular.
Las células cancerosas exhiben rasgos morfológicosque pueden distinguirse al microscopio
Clasificación morfológica del desarrollo de cáncer de cuello de útero
Dos categorías de genes principalmente controlan el crecimiento tumoral:oncogenes y genes supresores de tumores
Proto-oncogen es un gen normal
que por mutación se convierte en un
oncogen. Los oncogenes codifican
para proteínas hiperactivas que
estimulan el crecimiento y la
proliferación celular.
Mutaciones dominantes
“gain of function”
Genes supresores de tumores.
Genes cuyas mutaciones inactivan la
función de proteínas que inhiben el
crecimiento y la proliferación celular.
Mutaciones recesivas
Circuitos afectados por mutaciones que promueven cáncer
Lodish MCB 2004
La progresión de tumores no solo involucra alteraciones genéticas sino también cambios epigenéticos
Epigenética refiere a cambios heredables en la expresión de genes que no involucran modificaciones en la
secuencia del ADN. Las células tumorales presentan mutaciones en proteínas reguladoras del empaquetamiento
de la cromatina, en el patrón de metilación del ADN y de modificación de histonas. Mecanismos epigenéticos
pueden inactivar genes supresores de tumores y genes que promueven diferenciación.
Principales capacidades adquiridas por las células tumorales
Hanahan & Weinberg Cell 2011
Genome instability
metabolism
reprogramming
Las células tumorales adquieren autosuficiencia para crecer y proliferar
Alberts et al, MBC 2015
(IR, ILGFR, etc)
Las células tumorales expresan transportadores de glucosa y enzimas
glicolíticas en mayor proporción que las células normales.
El complejo mTOR constituye un nodo esencial en la señalización que promueve el metabolismo anabólico
Dibble et al Nature Rev NCB2013
El complejo mTORC está compuesto por 3 subunidades principales,
mTOR (Ser/Thr kinasa), mLST8 (activador) y Raptor (proteína “scaffold”)
(RTK, Ras, Raf, PI3K, Akt)
(PTEN, TSC1/2, p53)
La activación oncogénica de mTOR promueve diversos procesos que estimulan la progresión tumoral,
como por ej. el crecimiento, proliferación y sobrevivencia de las células.
Alberts et al, MBC 2015
Los tumores consumen altas cantidades de glucosa. Las células tumorales exhiben un metabolismo de la glucosa alterado
Las células tumorales
incrementan la glicólisis aeróbica
(effecto Warburg), produciendo y
secretando lactato al medio
extracelular.
La glicólisis aeróbica favorece el progreso tumoral en los siguientes aspectos:
1) prioriza la acumulación de biomasa en lugar de almacenamiento de energía
en forma de ATP,
2) reduce la apoptosis inducida por radicales libres producidos por la
fosforilación oxidativa en mitocondrias,
3) produce lactato el cual estimula la angiogénesis e invasión.
(↑biomasa)
LDH
Tomografía de emisión de positrones (PET)
revela la presencia de tumores (T). Inyección
de fluodeoxiglucosa F18
Romero Garcia et al., Front Immunol 2016
El lactato acidifica el microambiente, estimula angiogénesisy suprime la respuesta inmune
estimulación
autócrina
estimulación
paracrina
célula del
microambiente
tumoralcélula
tumoral
hiperactividad
de oncogenes
estimulación
paracrina
Las células tumorales desarrollan autosuficiencia para crecer y proliferar mediante diferentes mecanismos
inactivación de
supresores
de tumores
Cdks
La capacidad de señalización sostenida para la proliferación en las células tumorales puede resultar
de una estimulación autócrina, o indirectamente a través de la estimulación de células del estroma
asociadas, a secretar factores de crecimiento y mitogénicos.
Mutaciones activantes en
un solo alelo son
suficientes para que se
manifieste el fenotipo.
EGFR/PDGFR
Ras, Raf
Src, Abl
Crk
myc
etc...
oncogenes: genes mutados que
codifican proteínas capaces de
transformar células en cultivo o
inducir cáncer en animales
proto-oncogen: contraparte
normal del oncogen
Ras: GTPasa; mutaciones puntuales activadoras, ej. bloquean la hidrólisis del GTP
Raf: Ser/Thr kinasa; mutaciones puntuales activadoras de la catálisis
Abl: tirosina-quinasa; translocación cromosómica genera la proteína
de fusión bcr-Abl constitutivamente activa
Crk: proteína adaptadora que promueve motilidad; sobreexpresada en cáncer
Myc: factor de transcripción que promueve proliferación; translocaciones cromosómicas
causan la sobre-expresión de myc.
oncogén célula normaltransfección
célula transformadaalteraciones
La expresión de oncogenes transforman células in vitro, induciendo alteraciones fenotípicas similares a las encontradas en tumores in vivo
- morfología fusiforme
- pérdida de la inhibición por contacto
- pérdida de la dependencia del anclaje al substrato
- menor dependencia a factores de crecimiento
- pérdida de adhesiones focales y fibras de estrés
Microscopía electrónica de barrido de fibroblastos normales (A) y transformados con el oncogen v-src (B)
Las células transformadas son fusiformes, con frecuente producción de microvellosidades.
El apilamiento de las células resulta de la pérdida de la inhibición por contacto.
A B
la conversión de un proto-oncogen en un oncogen
involucra mutaciones de ganancia de función.
mecanismos mutaciones puntuales/deleciones
amplificación génica
translocaciones cromosómicas
Diferentes mecanismos moleculares pueden convertir un proto-oncogén en un oncogén
ej. bcr-abl,
Trk-tropomiosina
ej. c-myc en
linfoma
de Burkitt
Prior et al Cancer Res 2012
Las mutaciones oncogénicas más frecuentes de ras ocurren en los residuos G12, G13 y Q61 de la proteína.
Las mutaciones inhiben la capacidad intrínseca para hidrolizar el GTP unido y también la interacción con
GAPs, y por lo tanto generan una forma constitutivamente activa. La incidencia promedio de variantes
oncogénicas de ras en cáncer es de ~16%, pero puede superar el 60% en ciertos tumores (ej. páncreas).
El dominio que interacciona con el efector se
muestra en verde, la localización de los residuos
G12, G13 y Q61 se muestran en amarillo.
Mutaciones puntuales activadoras de la GTPasa RAS
Sitio activo de Ras en complejo con RasGAP. La cadena
lateral de arginina (“Arginine finger”, en amarillo) estabiliza
el estado de transición de la reacción de hidrólisis.
Q61
GAP en amarillo,
Ras en verde,
GDP en naranja,
AIF3, análogo del
fosfato
Wan et al, Cell 2004; Cell Signaling 2015
(inhibited)
En ausencia de estímulo la quinasa Braf se encuentra inhibida.
Más de 30 mutaciones puntuales asociadas con cáncer ocurren
en el dominio catalítico (“N y C lobe”), y facilitan la unión del
ATP y la fosfotransferencia al substrato. Las mutaciones alteran
la estructura y favorecen la conformación activa. Una de las más
comunes, es el reemplazo de V599 por E lo cual incrementa la
actividad de raf ~ 500 veces. Raf es mutado frecuentente en
melanoma y en otros tipos de cánceres humanos.
Mutaciones puntuales activadoras de la quinasa RAF
DFG loop
D593
K482
D575
G500
K574T598
Sitio activo de las quinasas
V599
P loop
Varios oncogenes virales, ej. v-src, tienen su
contraparte celular no oncogénico (proto-oncogén), ej.
c-src. En las células no estimuladas la actividad c-Src
está normalmente reprimida por fosforilación de Tyr527.
Mutantes de v-Src codificadas por el virus RSV poseen
deleciones del terminal carboxilo que eliminan a la tirosina
Y527, o mutaciones puntuales que cambian Y527 por F.
Por lo tanto estas mutantes no pueden ser autoinhibidas
eficientemente y son constitutivamente activas.
En la configuración inactiva, la Y527 de c-Src es
constitutivamente fosforilada por otra quinasa. La
pY527 interacciona con el dominio SH2 de la misma
molécula, estabilizando la conformación inactiva del
dominio catalítico.
Dentro de las células infectadas los retrovirus utilizan su transcriptasa reversa para sintetizar ADN. El ADN viral se inserta
en el genoma huésped. Eventos de recombinación permiten la incorporación de genes del huésped en el genoma viral.
Ejemplos de virus que transducen oncogenes son: RSV v-src; Harvey sarcoma virus (HSV) H-ras, etc.
Proto-oncogenes celulares pueden mutar y convertirse en oncogenes dentro de virus
Secuencias reguladoras virales pueden convertir un proto-oncogén celular en un oncogén incrementando su expresión
Retrovirus que producen linfomas en aves usualmente se insertan en regiones adyacentes al gen c-myc
en dos posibles orientaciones. En ambos casos, secuencias promotoras o potenciadoras virales inducen
un incremento significativo en los niveles de transcripción de c-myc.
LTR: Long terminal repeats. Pueden funcionar como reguladores de la transcripción
Ciertas proteínas virales son oncoproteínasque mimetizan factores de crecimiento celulares
SFFV (Spleen Focus Forming Virus) es un retrovirus que produce eritroleucemia en ratones. El SFFV
codifica la proteína gp55, que estimula al receptor de eritropoietina en eritroblastos e induce su proliferación.
la unión del ligando
natural eritropoietina (Epo)
dimeriza el receptor y activa
la quinasa JAK asociada
la unión de gp55 mimetiza
el ligando natural y también
dimeriza y activa las quinasas JAK
Otro ejemplo es el gen v-sis del virus SSV (Simian Sarcoma Virus) codifica para una proteína
homóloga a PDGFβ. SSV induce sarcomas en fibroblastos que expresan el receptor de PDGF.
Jak2 Jak2 Jak2 Jak2
ligando natural
Deleciones y mutaciones puntuales generan variantes oncogénicas de receptores (ej. EGFR)
Ambas mutaciones promueven la activación
constitutiva del dominio tirosina-quinasa,
independiente de la presencia del ligando.
Otras mutaciones ocurren en el dominio
citosólico, p. ej. deleciones que eliminan
señales de endocitosis contribuyen a
activaciones sostenidas del receptor.
Miembros de la familia del EGFR se encuentran sobre-
expresados o están mutados en varios tipos de cáncer.
Ej. La mutación puntual de Val Gln en la región de
transmembrana favorece la dimerización y convierte el
receptor Her2 en su forma oncogénica (Neu).
Deleciones del dominio extracelular del EGFR también
producen variantes oncogénicas (hiperactivas).
Lodish, MCB 2004EGFR/HER/ErbB son denominaciones del mismo gen
Translocaciones cromosómicas generan quimeras oncogénicas (ej. TPM-Trk)
El mecanismo más común de activación oncogénica del receptor tirosina quinasa Trk es consecuencia de translocaciones
cromosómicas que generan proteínas quiméricas. Por ejemplo, una translocación cromosómica reemplaza la región
extracelular de Trk por el dominio “coiled coil” de la tropomiosina (TPM) involucrado en dimerización. La dimerización
constitutiva de la quimera TPM-Trk provoca una hiperactividad del dominio quinasa independiente de ligando.
La fosforilación y
activación de los
dímeros ocurre sin
necesidad de unir
al ligando natural.
dominio extracelular
oncoproteína quimera TPM-Trk
Translocación cromosómica en leucemia mieloide crónica (chronic myelogenous leukemia o CML). La translocación puede
detectarse por bandeo cromosómico (A) o por FISH (B). La translocación produce una oncoproteína quimera, Bcr-Abl, que exhibe
una actividad desregulada de la tirosina quinasa Abl, inducida por la dimerización que produce la región “coiled-coil” de Bcr.
c-Abl
Bcr-Abl
activación
de Abl
FISH: Fluorescence in situ hibridizationA B
BCR: Breakpoint Cluster Region
FISH: Fluorescence In Situ Hybridization
Translocaciones cromosómicas generan quimeras oncogénicas (ej. Bcr-Abl)
InTechOpen
substrate substrate
Translocación cromosómica en linfomas de Burkitt que
posiciona al gen de c-myc en la región adyacente a
activadores o “enhancers” de genes de inmunoglobulinas.
Sobreexpresión
de c-myc!!
Amplificación de c-myc (FISH)
Otras translocaciones posicionan los activadores o “enhancers”
de los genes de inmunoglobulinas adyacentes al gen que
codifica para ciclinas D o al gen anti-apoptótico Bcl-2.
Translocaciones cromosómicas alteran la expresión de factores de transcripción (ej. c-myc)
Myc regula la expresión de genes que promueven la transición G1 S
Expresión diferencial de genes blanco. Aprox
1200 de 6633 genes cambian su expresión
después de 4 h de activación de myc
niveles de expresión
respecto del control
<2 0 >2
mRNAs colectados de células beta del
páncreas y de queratinocitos, fueron
marcados con biotina e hibridizados a un
microarreglo de DNA (GeneChip, Affymetrix)
Robson et al, Genomics, 2011
Ambos alelos de los genes supresores de
tumores deben inactivarse para abolir la
función supresora del crecimiento tumoral.
CKIs
pRb
p53
TGFb
APC
PTEN
ATM/ATR
etc…
categorías de genes supresores de tumores:- proteínas de checkpoint, ej. p53, Bub, Mad
- proteínas inhibidoras de la proliferación, ej. CKIs, Rb, APC, TGFβ
- proteínas pro-apoptóticas, ej. PTEN
- proteínas reparadoras del DNA, ej. ATM/ATR, Chk1/2
TGFb inhibe el crecimiento tumoral a través de la regulación de la expresión de numerosos genes
TGFb
↑ PAI-1(plasminogen
activator
inhibitor-1)
plasminogen
activator
plasminogen
plasmin
degradación
de la ECM
TGFb
↑ p15 CKI
↑ p21 CKI
Rb
E2F
síntesis
de DNA
Cdk4/cicl D
Mutaciones inactivantes de Smads en la vía de TGF-b R son comunes en cáncer de colon y páncreas.
proliferación invasión
c-myc
efe
cto
cit
ostá
tico
efe
cto
cit
ostá
tico
APC y Axina restringen la función transcripcional de b-catenina
Mutaciones de APC, Axina y b-catenina se observan en varios tipos de cáncer incluído el colorectal. Beta
catenina se acumula y se transloca al núcleo donde forma complejos con los factores de transcripción
Tcf/Lcf y activa la transcripción de genes que promueven proliferación (ej. myc, ciclina D, E2F, etc).
PI-3k
Akt
caspasa 8/9
Bad
p53
citoc C/APAF
cascada de
activación de
caspasas
PTEN
deleciónPTEN es una fosfatasa
que defosforila PIP3 y
contraresta la función
de PI-3K.
deleción /
inactivación
en rojo se señalan alteraciones
observadas en cáncer
que confieren resistencia
a la apoptosis.
RPTKs receptores que transducen
señales anti-apoptóticas
familia de proteínas Bcl-2:
proapoptóticas (Bax, Bak),
BH-only (Bad, Noxa, Puma)
antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL)
integrinas
Bcl-2
Bax
sobre-expresión
PTEN contraresta señales de supervivencia y crecimiento
pérdida de
función
NOXA,
PUMA
mTOR
Ras
MdM2
• amplificación génica de ciclinas D
• deleciones de inhibidores de Cdk4/6, p16
• mutaciones inactivantes de Rb
Rb e inhibidores de Cdks como p16 son supresores de tumores; las ciclinas D y Cdk4 son proto-
oncogenes. Mutaciones de estos genes son comunes en cáncer. La ganancia de función de un solo proto-
oncogen de esta vía, o la inactivación bi-alélica de los supresores de tumores promueven la proliferación.
Retinoblastoma inhibe la transición G1/S
tipos de mutaciones descriptas en cáncer
p16
Rb
Virus de DNA, como el papiloma humano (HPV) y Simian Virus 40 (SV40) producen proteínas que
se unen e inactivan a las proteínas p53 y Rb. El HPV es causante del cáncer de cuello de útero.
Rb y p53 pueden inactivarse por oncoproteínas virales
E2F
Rb
E2F
HPVE7: inactiva Rb
E6: inactiva p53
E5: activa el PDGFR
Rb
E2F
verruga causada por HPV
La pérdida de heterocigosis de genes supresores de tumores puede ocurrir por diferentes mecanismos
La pérdida de función de Rb es causante de retinoblastoma y de otros tipos de cáncer.
Ratones knockout para p53 desarrollan tumores tempranamente
P53 contraresta diversas alteraciones asociadas al progreso tumoral
ANGIOGENESIS
La hiperactividad de oncogenes incrementa la expresión de p19ARFy la activación de p53
↑ ras La transcripción de p19ARF (ARF).
ARF inhibe Mdm2, lo cual estabiliza
p53 y promueve su actividad
transcripcional.
En condiciones normales
la E3 ubiquitina ligasa
Mdm2 ubiquitina a p53 y
promueve su degradación
en proteosomas.
↑ b-catenina
ARF: Alternative Reading Frame, es un producto de “splicing alternativo” del locus INK4a que codifica para P15INK4a, p16INK4a.
(No confundir con la GTPasa ARF que recluta proteinas de cubierta COPI!)
↑ proteínas pro-apoptóticas:
Bax, Puma, noxa,
receptores de Fas, etc
↑ myc
Oncogenes y supresores de tumores integran redes de señalización, su efecto depende del tipo celular y el contexto funcional
Lowe et al Nature 2004Senescencia: estado no replicativo permanente e irreversible
p19
telomer shortening
Myc activa p53 y promueve
apoptosis mientras inhibe
senescencia.
Ras activa p53 y promueve
senescencia mientras inhibe
apoptosis.
La inactivación de p19ARF
promueve la proliferación e
inhibe la senecencia y apoptosis.
Orígenes de las mutaciones y cáncer
Tomasetti et al, Science 2017
Básicamente 3 factores explican la
acumulación de mutaciones en las
células de los organismos
pluricelulares: factores hereditarios,
factores relacionados con la
replicación del ADN y factores
ambientales.
Estudios recientes sugieren una
importante correlación entre la
división celular de células madre y la
incidencia de cáncer.
inestabilidad genómica
fallas en reguladores
de "checkpoint“ mitóticos
fallas en mecanismos de
detección y reparación
del ADN
fallas en el mantenimiento
de los telómeros
Inestabilidad genómica
arresto del
ciclo celular
apoptosis
Las células normales exhiben mecanismos
que restringen la inestabilidad genómica y
eventualmente inducen arresto del ciclo
celular, senescencia o apoptosis.
senescencia
Actividad oncogénica,
estrés de la replicación
La inestabilidad genómica es una característica del cáncer. Implica un proceso de acumulación de
alteraciones en la secuencia de ADN y/o en los cromosomas que disminuyen la fidelidad en la
transmisión de copias exactas del genoma de una generación a otra. Las causas son varias.
fallas en citoquinesis,
duplicación de centrosomas
Un nivel de inestabilidad
genómica óptimo facilita
el desarrollo del cáncer
(B) Se presume que un nivel de
inestabilidad genómica óptimo en los
tumores genera la suficiente
diversidad fenotípica para evolucionar
y superar las barreras selectivas
impuestas por el organismo.
apoptosis
(A) Las células normales
restringen la inestabilidad
genómica lo cual impide la
generación de variantes que
superen las barreras selectivas
impuestas durante la vida del
organismo.
(C) Existe un umbral de
inestabilidad genómica
compatible con la vida celular,
que cuando es superado activa
la apoptosis o senescencia.
La inestabilidad genómica es un mecanismo que genera diversidad genética
Diversos sistemas reparan daños en el ADN y restringen la inestabilidad genómica
Alberts et al, MBC 2008
dímero de timinadeaminación
de 5-metil
citosina
En cada ronda de duplicación de la molécula de ADN un fragmento del extremo 3´ no puede ser copiado
telómero
Un complejo de proteínas unidas a los telómeros
normales inhiben el mecanismo sensor de daño
del DNA mediado por ATM/ATR.
loss of RNA
primer in
lagging
strand
loss of RNA
primer in
lagging
strand
La telomerasa extiende el extremo 3´
El acortamiento o mal funcionamiento de los telómeros contribuyen a la inestabilidad genómica
O´Sullivan & Karlseder,
Nature Rev MCB 2010
Las proteínas RAP1, TRF2 y POT1 son
componentes de un complejo que se une y
protege a los telómeros del ataque de
nucleasas y de la activación de sistemas de
detección de daños al ADN (MRN, ATM).
Cuando esta protección falla, se activan los
sistemas de detección de doble corte del
ADN y de reparación (ej. NHEJ).
NHEJ: Non Homologous End Joining
NHEJ
detección de
doble corte
La disfunción de los telómeros y/o la ruptura de cromosomas conducen a ciclos de ruptura y fusión que aumentan la inestabilidad genómica
inactivaciones de checkpoints,
ej. mutación de ATM/ATR
Los ciclos de ruptura y fusión de cromosomas inducen alteraciones masivas en la estructura de los
cromosomas (translocaciones, deleciones, cromosomas acéntricos y dicéntricos, etc) que se denominan
genéricamente Inestabilidad cromosómica estructural. y que en células normales inducen la apoptosis.
La re-expresión de la telomerasa limita la inestabilidad genómica y contribuye a la inmortalización de las células tumorales
a) La senescencia replicativa de una célula normal es inducida por la pérdida de los telómeros.
b) La re-expresión de la telomerasa en las células cancerosas le permiten escapar a la senescencia replicativa.
Los extremos de los cromosomas de vertebrados poseen numerosas copias de la secuencia TTAGGG (5-20 Kb),
agregadas por la enzima telomerasa. La telomerasa deja de expresarse en la mayoria de las células somáticas.
Aproximadamente el 80-90% de los cánceres muestran una reactivación de la expresión de la telomerasa.
telomerase telomerase
acortamiento de
los telómeros
telomerasa
3’5’
Odago & Gerson, 2003
telomerase
inhibitiontelomerase
re-expression
Senescencia replicativa
Los fibroblastos humanos dejan de proliferar después de ~50-60 divisiones (símbolos verdes) debido a la
erosión de los telómeros. Este estado se conoce como “senescencia replicativa”. La expresión forzada
de la enzima telomerasa extiende significativamente el potencial replicativo (símbolos rojos).
Fibroblastos transfectados con telomerasa
Fibroblastos controles no transfectados
Dos barreras distintas limitan la proliferación de la mayoría de las células normales: la senescencia
replicativa y un estado de crisis que desencadena la apoptosis. Ambas dependen de p53. Mutaciones
de p53 en las células cancerosas eliminan estos sistemas de resguardo a la proliferación ilimitada.
p53 es un sensor de la inestabilidad cromosómica estructural
BFB = "Breakage-Fusion-Breakage" (ciclos de ruptura y fusión)
La inestabilidad de los telómeros y la exposición de extremos de la doble hebra del DNA inducen la
apoptosis por medio de la activación de proteínas de checkpoint (ATM, ATR, Chk1/2 y p53). Las células
cancerosas evitan la apoptosis mediante la mutación de p53 y la re-expresión de la telomerasa.
La inactivación de p53 favorece la inestabilidad genómica
estructural y los ciclos de ruptura y fusión de cromosomas.
(p21, Bax, Puma)
p53
p53
Zivotovsky & Kroemer, Nature Rev Mol Cel Biol 2004
La poliploidía y aneuploidía es común en cáncer. Puede resultar por defectos en la mitosis, fusión celular y
endomitosis. Estas alteraciones activan apoptosis mediada por p53. En células cancerosas la apoptosis
puede ser inhibida por inactivación de p53 y/o la sobre-expresión de miembros de la familia de Bcl-2.
p53 también es un sensor de lainestabilidad cromosómica numérica
Zivotovsky & Kroemer, Nature Rev Mol Cel Biol 2004
(multiplicación
del número
haploide >2n)
(multiplicación
incompleta del
número haploide)
estabilización
y localización
nuclear
p21CIP Cdk2
degradación en
el proteosoma
proteínas pro-apoptóticas (Bax,BID,
PUMA, noxa, receptores de Fas)
G1/S
Cdc25 G2/MCdk1
Cdk4/6 Rb E2F
Resumen de funciones de p53
ATM/ATR
Chk1/2
p53
inactivación de proteínas anti-apoptóticas (Bcl2, Bcl-xl)
activación de proteínas pro-apoptóticas (BAX y BAK)
efectos
independientes
de transcripción
transcripción estrés oncogénico
ras, myc, E2Fp19
ARF
inestabilidad
genómica
Daño al DNA
El contexto y el genotipo celular influyen sobre
las vías activadas por p53
contexto celular (señalización)
- factores de crecimiento, citoquinas, etc
- integrinas
- caderinas adhesión
↑ p53
arresto temporario
apoptosis
genotipo (alteraciones en genes reguladores del ciclo celular y la apoptosis)
hiperactividad
oncogénica
inestabilidad
cromosómica
daño del DNA,
acortamiento de
telómeros
senescencia
a. Los tumores secretan VEGF, un potente factor
que induce la angiogénesis a partir de capilares
pre-existentes.
b. Un evento temprano de la angiogénesis es la
disociación de los pericitos y la dilatación de
los capilares.
c. Las células endoteliales degradan la membrana
basal e invaden el estroma.
d. Inducidas por factores del estroma, las células
endoteliales migran y proliferan.
e. Las células endoteliales se adhieren entre sí,
generan una membrana basal y reclutan pericitos
que se asocian a la pared del nuevo capilar
formado.
Berger & Benjamin, Nature Cancer Rev 2003
La capacidad de inducir angiogénesis es esencial para elcrecimiento y propagación de los tumores sólidos
pericito
Angiogénesis es el proceso de formación de vasos a partir de capilares pre-existentes.
Los tumores sólidos benignos crecen como nódulos avasculares. En la mayoría de los casos se estabilizan en un estado
de latencia ("dormancy") en el cual el tumor no crece en tamaño (a). Eventualmente, dependiendo del tipo de tumor y del
micro ambiente, la masa celular puede incrementar drásticamente si adquiere la capacidad de inducir la angiogénesis
("switch" angiogénico). Los vasos nuevos inducidos por los tumores son frágiles, irregulares y tortuosos produciendo
hemorragias e inflamación.
Berger & Benjamin, Nature Cancer Rev 2003
El "switch" angiogénico depende de un balance entre numerosos factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos
Berger & Benjamin, Nature Cancer Rev 2003
TGF-b
Thrombospondin-1 MMP9 VEGF VEGFRendothelial cell proliferation
and migration
RPTP
ECM
TGF-b
ECM
degradation
products
plasminogen
fragment
Que dispara
el "switch"
angiogénico?
hipoxia
p53
acumulación del factor
de transcripción HIF-1
(hypoxia-inducible factor-1)
↑ factores pro-angiogénicos (VEGF)
↑ genes pro-invasivos (receptor met)
↓ factores pro-angiogénicos, HIF-1
↑ factores anti-angiogénicos
normoxia
↑HIF-1
HIF-1 proteosoma
OHVHL
En condiciones de oxígeno normal el factor de transcripción HIF-1 es hidroxilado en prolinas y ubiquitinado por
la proteína supresora de tumores VHL (von Hippel-Lindau), siendo continuamente degradado en proteosomas.
En condiciones de hipoxia y/o inactivación de VHL, HIF-1 se acumula y activa transcripción de factores pro-
angiogénicos. La proteína supresora de tumores p53 reprime la expresión de VEGF y promueve la expresión
de Trombospondin-1 y HIF-1, por lo tanto mutaciones que inactivan a p53 también facilitan que se dispare la
angiogénesis.
HGF/SF
met (RTK)
↑ migración
Metástasis refiere a la capacidad de las células
tumorales de colonizar tejidos distantes al tumor
primario y generar tumores secundarios.
El proceso progresa por
diferentes fases:
1) invasión local del estroma
2) intravasación
3) circulación
4) arresto y extravasación
5) colonización
tumor
estroma
invasión, intravasación
nodos
linfáticos
Steeg, Nature Med 2006
La colonización depende de
interacciones recíprocas entre
las células tumorales y diversas
células en el microambiente de
tejido distante.
extravasación, colonización
El comportamiento invasivo (maligno) de las células involucra:
cambios en la adhesión (caderinas, integrinas)
proteólisis local (proteasas de la matriz)
migración (señalización, reguladores del citoesqueleto, etc)
Ensayos in vitro para evaluar la invasión
células de carcinoma
de colon humano
implante
ortotópico
(intestino)
implante
heterotópico
(músculo)
metástasis
Estudios in vivo
El implante heterotópico inhibe la metástasis en el órgano huésped.
En contrast, el implante ortotópico facilita el proceso de metástasis
Transiciones epitelio-mesénquima marcan el inicio de la invasión de carcinomas
El proceso de EMT de las células epiteliales
involucra la pérdida de los contactos
intercelulares, la pérdida de la polaridad y la
adquisición de un fenotipo migratorio e invasivo.
EMT ocurre normalmente durante el desarrollo, por ej. durante gastrulación, delaminación de las células de la cresta neural,
etc. También ocurre EMT fisiológicamente como resultado a injuria de epitelios (cicatrización o “wound healing”).
Rowe & Weiss ARCDB 2009
Savagner, Bioessays 2001
Experimentos in vitro muestran que diversas señalesextracelulares inducen EMT
colágeno,
TGFb
Células de carcinoma exhiben EMT cuando se las estimula con distintos factores de
crecimiento extracelulares (TGFb, EGF, HGF, etc) y con componentes de la matriz extracelular.
Las señales externas inducen EMT mediante la activación de factores de transcripción específicos
Kang & Masagué, Cell 2004
cytokines
Los factores de transcripción Twist,
Snail y SIP1 reprimen la transcripción
de la caderina-E y activan la
transcripción de proteínas pro-invasivas
como la caderina-N, fibronectina, etc.
Friedl & Wolf, Nature Rev Can 2003
migración en 3-D. Adhesión, proteólisis, contracción dependiente de actina-miosina
Las células invasivas manifiestan cambios en la expresión de moléculas de adhesión
integrinas: Las células tumorales expresan integrinas promiscuas, que
reconocen diversas moléculas de la matriz extracelular, por ej. a3b1, avb3
reconocen el motivo RGD en fibronectina, vitronectina y otras.
caderinas: Un rasgo característico de carcinomas es la supresión de la
expresión de las caderinas-E. Esto facilita la migración de las células tumorales.
La re-expresión de caderina-E inhibe la invasividad en algunos tumores.
la proteólisis pericelular controlada de la matriz exponen sitios
crípticos RGD reconocidos por las integrinas a3b1 y avb3.
a3b1 interacciona con laminina, fibronectina y colágeno.
avb3 interacciona con fibronectina, vitronectina, colágeno, trombospondina.
La invasión requiere de la degradación localizada de la matriz
Las células del microambiente tumoral secretan proteasas que degradan la matriz
y favorecen la invasividad. Las proteasas extracelulares se agrupan en dos familias:
(1) Metaloproteinasas
de la matriz (MMP)
colagenasas instersticiales degradan colágenos fibrilares
estromelisinas degradan fibronectina, proteoglicanos, col IV
gelatinasas (colagenasas tipo IV) degradan col IV, fibronectina, elastina
su actividad depende de iones zinc
o calcio
Las tres clases de metaloproteinasas poseen inhibidores endógenos (tissue inhibitors of metalloproteinasas = TIMPs)
(2) Serine
proteases Activadores del plasminógeno (PAs). Hay 2 tipos:
- laminina
- fibronectina
- colágeno IV
- vitronectina
uPA: urokinase-plasminogen activator asociada a receptores de superficie (uPAR)
tPA: tissue-type plasminogen activator secretada
las serpinas son inhibidores de las serine proteases
uPA o tPA plasminógeno plasmina activa la plasmina degrada
La invasión involucra un intercambio de señales secretadas
por las células del microambiente del tumor
Liotta & Kohn, Nature 2001
El carcinoma invasivo es considerado una
patología de poblaciones celulares diversas
que habitan el microambiente del tumor.
La transición a un carcinoma invasivo es
precedida por la activación de fibroblastos,
células endoteliales y del sistema inmune
que liberan enzimas, citoquinas y factores
de crecimiento en una zona localizada
denominada "frente de invasión".
1) Los fibroblastos secretan HGF/SF que
estimulan la motilidad de las celulas tumorales
a través de los receptores c-Met.
2) Las células tumorales secretan VEGF y
bFGF, los cuales se unen a receptores en las
células endoteliales e inducen angiogénesis.
3) Los fibroblastos y las células endoteliales
producen enzimas latentes como MMPs y uPA,
que son activadas en contacto con el
invadopodio de la célula tumoral, y degradan
la ECM y los ectodominios de las caderinas,
promoviendo la invasión.
4) La degradación de la ECM libera factores
como el TGFb y el EGF los cuales promueven
angiogénesis y la proliferación de la célula
tumoral.
5) La degradación de la ECM expone sitios
RGD reconocidos por integrinas involucradas
en la motilidad.
6) Las vias activadas en la célula tumoral
generan señales de proliferacion, motilidad y
anti-apoptóticas. Por ejemplo, la activación
de los receptores Met, EGFR e integrinas
activan FAK, PI-3K, MLCK, GTPasas rho, etc.
Interacciones moleculares en el microambiente de invasión
Liotta & Kohn, Nature 2001
3
3
2
1
4
3
5
6
Dado que el cáncer es en gran parte una enfermedad
genética debería ser posible su clasificación en base al
perfil de expresión específico del transcriptoma.
Los chips de DNA permiten analizar niveles de mRNA a
escala global (transcriptoma)
La tipificación del cáncer es importante para decidir la terapia a aplicar.
Actualmente dicha clasificación se basa en la historia clínica del paciente,
la histología del tumor y la expresión de marcadores bioquímicos.
La hibridización comparativa de mRNAs se emplea para detectarcambios en expresión de genes
El chip o microarreglo de DNA consiste en una matriz de
cDNAs u oligonucleótidos pertenecientes a una colección de
genes, cuya posición en el arreglo es conocida. Los chips se
hibridizan con una mezcla de cDNAs de muestras de
referencia y experimentales marcadas con fluorescentes
diferentes. Los datos obtenidos se emplean para construir
perfiles de expresión en relación a una determinada
condición o tratamiento.
cDNA de muestra de referencia (ej. individuo sano)
cDNA de muestra experimental (ej. individuo enfermo)
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++gen1 gen2 gen3 gen4 gen5
fijación de
oligonucleótidos
o cDNA
gen1 gen2 gen3 gen4 gen5
hibridización con
cDNA marcado
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
resultado
MBC Alberts et al 4th ed, p378
Patrones de expresión génica en distintos tipos de cáncer
En este chip se analizan los niveles de expresión
de 1800 genes (ordenados en hileras horizontales)
en 142 tumores obtenidos de pacientes diferentes
y agrupados de acuerdo al órgano que afectan
(columnas verticales).
conclusión 1: el nivel de expresión de cada
gen varía en los distintos tumores (hilera de
barras ordenadas de izquierda a derecha).
conclusión 2: cada tipo de tumor expresa
un perfil de expresión génica característico.
Cada rectángulo (ver inserto) indica el nivel de
expresión de un gen particular en un tumor
determinado, el rojo indica que la expresión es
mayor que el promedio; el verde que es
inferior al promedio y el negro indica un
valor de expresión promedio.
Esta información puede ser empleada para
tipificar células cancerosas de origen
desconocido comparando sus transcriptomas
con el de tumores conocidos.
De un chip de 6817 genes humanos
se identificó un grupo de 50 genes
que se expresan diferencialmente en
leucemia mieloide aguda (AML) y
leucemia linfoblástica aguda (ALL).
Golub TR et al, Science 286,1999
Este estudio demuestra que el perfil
genético basado en microarrays
puede ser aplicado para tipificar
distintos tumores.
genes:Perfiles transcripcionalesde dos tipos de leucemia (AML y ALL)
Alizadeh et al, Nature 2000
Los linfomas DLBCL son agresivos y clínicamente
heterogéneos. El análisis de microarreglos de DNA
revela la expresión coordinada de genes en distintas
muestras de DLBCL. Por ej. genes que se expresan
en centros germinales de células B tienen un patrón
de expresión diferencial en dos tipos de linfomas, FL y
CLL. Cada columna vertical representa una muestra
de RNAm y cada hilera horizontal representa un gen.
Niveles de expresión inferiores o superiores a la media
se representan en verde y rojo, respectivamente
Perfiles transcripcionales de linfomas difusos de células B grandes (DLBCL)96 muestras de diferentes linfomas
~19
.000 g
enes
FL: Follicular lymphoma
CCL: Chronic Lymphocytic lymphoma
De un chip de ~25.000 genes humanos se identificaron ~5000 genes que se expresan diferencialmente en 98 tumores primarios
de mama. De estos se seleccionaron 70 genes cuya expresión (rojo indica sobreexpresión, verde indica subexpresión) se
emplea como un “patrón marcador” para pronosticar metástasis en biopsias de 78 tumores de mama (hileras horizontales). Los
genes fueron ordenados de acuerdo a sus coeficientes de correlación en dos grupos: buen pronóstico o mal pronóstico.
van 't Veer et al Nature 2002
Perfiles transcripcionales asociados a metástasisCáncer de mama
genes (70)
buen pronóstico,
no metástasis
en >5 años
Mal pronóstico,
metástasis
en <5 añostu
mo
res (
78)
from Jake Youngberg
Expectativa para un futuro cercano…