repu

Biotecnología de proteínas

Proteínas usadas en la salud humana

Preparaciones hormonales Insulina, glucagon, hGH Productos de la sangre Factores de coagulación, hSA CitokinasInterleukinas, interferones Enzimas Urokinasa, asparaginasa, tPA Vacunas HBsA, HV Anticuerpos monoclonales Contra varios antígenos.

Proteínas de usos industriales

ENZIMA APLICACIÓN INDUSTRIAL Proteasas Detergentes Fabricación de quesos Industria de la cerveza Industria del cuero y carne Digestivos para consumo humano y animal

AMILASAS Industrias de procesamiento de almidón Celulasas/hemicelulasas Industria de la cerveza Producción de jugos Aditivos para la alimentación animal

PECTINASAS Industrias procesadoras de frutas Producción de jugos

LIPASAS Industria Láctea Industria de aceites vegetales

GLUCOSA ISOMERASA Producción de jarabes de alta fructosa

LACTASA Hidrólisis de lactosa de leche

CICLODEXTRINGLICOSILTRANSFERASA Producción de ciclodextrina

PENICILINACILASA Producción de penicilinas semisintéticas

Downstreamprecessing

Recuperación y producción del producto

El downstreamprocessing no solo involucra la recuperación y purificación del producto sino también la evaluación del control de la

calidad, estabilización del producto final y ajuste de potencia.

NUNCA SE PURIFICA MAS DE LO NECESARIO

Reducen la estabilidad biológica

Disminuyen el rendimiento

Características del producto

Costo razonable

Rendimiento máximo

Pureza adecuada

Construcción de un organismo

recombinante. INGENIERIA GENÉTICA

Obtención del producto.

FERMENTACIÓN.

Recuperación y purificación del

producto. PURIFICACIÓN.

Eliminacion de desperdicios.

TRATAMIENTO DE EFLUENTES

Propiedades físico químicas y biológicas deseadas

Las proteínas se clasifican en dos grandes grupos

Terapéuticas y diagnostico alto grado de pureza y pequeñas producciones

Enzimas para alimentación y bebidas baja pureza

Escalado del proceso de purificación

Se inicia de acuerdo con las necesidades del mercado. Protocolo escala laboratorio Estudios en planta piloto Proceso en escala

Técnicas de recuperación y producción de productos

Recuperación

Comprende la remoción de los componentes gruesos, como las células de un medio de cultivo en el caso de un producto extracelular o de las proteínas contaminantes que están en mayor proporción.

Son bastante generales y se aplican en casi todos los casos. Una vez que el producto ha sido recuperado, a veces es necesario purificarlo. Recuperación es sinónimo de aislamiento o enriquecimiento.

Purificación

Los métodos utilizados son muy dependientes del producto en particular y de su uso: Van ser distintos si se quiere purificar una pequeña molécula orgánica soluble ensolventes orgánicos que una enzima soluble

en agua. Además, también serán diferentessegún que el producto sea para uso industrial o farmacológico inyectable. Las técnicas de purificación son más sofisticadas por naturaleza, más lentas, y procesanmenores volúmenes de material. Algunas técnicas de recuperación pueden ser usadas en operaciones de purificación.

Técnica de separación Recuperación Purificación

Centrifugación X

Filtración X

Ultrafiltración X X

Precipitación X X

Partición X X

cromatografía X

Parámetros de evaluación de la purificación

Rendimiento o

Pureza y

Factor de purificación

Costo

Separación sólido-liquido (Sedimentación y centrifugación)

En los biorreactoes los microorganismos están suspendidos como células simples, fóculos o micelios. Un proceso de separación sólido-

líquido consta:

Pretratamiento

Para facilitar la operación, reducir la viscosidad y romper las estructuras gelatinosas. Ayudan a incrementar el tamaño de la

partícula a través de diferentes efectos como puede ser la neutralización de cargas o la generación de redes 3D a través de iones Ca.

Al, Fe o polímeros naturales o sintéticos. También se usa el cambio de pH

Físicos: Térmico

o Floculación o Esterilización

Químicos: Floculantes

o Iones inorgánicos / pH o polielectrolitos

Ayuda filtros o Tierra diatomeas o Perlas de vidrio

Sistemas mecánicos de separación solido-liquido

Sedimentacion

Se basa en el movimiento de una partícula sólida en un líquido por la gravedad. Si las partículas tienen entre 5 a 50 µm pueden

usarse decantadores, si son mas pequeñas se necesitarán separadores centrífugos u otros. Hay que tener en cuenta la diferencia de

densidad ente el sólido y el líquido.

Centrifugación

Separa sustancias de diferente peso específico. Aplicaciones:

Separación de biomasa

Eliminación de desechos celulares

Separación de proteínas

Separación de matrices cromatograficas en batch

Recuperación de cuerpos de inclusión

Pretratamiento Concentración SeparaciónPost-

tratamiento

Filtración centrífuga

Separa por filtración donde la fuerza impulsora en lugar de ser una diferencia de presión es la centrífuga.

Centrífuga canasta

Puede manejar un caldo con 1 – 5 % de sóldios

Trabaja en el rango de 5000 – 9000 g

Sedimentación centrífuga

Centrífuga tubular

Centrífuga de cámara múltiple

Centrífuga de tazón sólido

Centrífuga de tornillo o decantadora

Centrífuga de discos

Centrífuga tubular

Mas eficiente y sencilla

Contenido de sólidos < 0,5%

Aceleración 12000 – 62000 g / alimentación 100 1/hr – 3500 1/hr

Centrífuga de cámara multiple

Aumenta la superficie del rotor por el agregado de rotores concéntricos. La velocidad de rotación es menor pero se compensa en

parte con el aumento del radio.

2 a 6 cámaras

Contenido de sólidos 1 – 5%

5000 – 9000 g

Centrpifuga de razón sólido

Los sólidos son eliminados continuamente a través de un tubo ubicado sobre la superficie interna de la cámara. Sin embargo para

que los sólidos puedan ser removidos continuamente deben tener una proporción de líquido.

Permite trabajar de forma continua

Contenido de solidos entre 1 – 5 %

Centrífuga decantadora

Ideal para suspensiones con alto contenido de sólidos

Descarga de sólidos entre 30 kg/hr – 60000 kg/hr

Contenido de sólidos entre 2 – 60%

Aplicación principal: tratamiento de aguas residuales

Centrífuga de discos

Se aumenta de manera muy importante la superficie de sedimentación. Es la ms usada en bioseparaciónes

Flujo entre 0,5 – 1500 1/hr

Contenido de sólidos:

o 1% centrífuga de retención

o <10% centrífuga de descarga intermitente y continua

5000 – 15000 g

Resumen

Tipo de centrífuga

Tamaño partícula

Contenido de sólidos (%)

Prueba de sedimentación

Prueba de consistencia de sólidos

Flujo de alimentación (L/min)

Fuerza g. max

Tubular 0,1 – 200 ≤ 0,5 2 – 20 Torta firme 8 – 120 12000 – 16000

Cámara simple 0,5 – 5000 1 – 5 2- 20 Torta firme 1,5 – 335 5000 – 9000

Discos y boquillas

0,5 – 200 2 – 20 1 – 10 Lodo 30 – 3780 5000 – 8500

Discos de tazón abierto

0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 1500 5000 – 7000

Discos y boquillas

0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 570 1400 – 1500

Discos intermitente

0,25 – 200 ≤ 1 1 – 10 Torta firme 0,4 – 1500 500 – 800

Tazón solido 2 – 5000 1 – 5 0 – 3 Torta firme 1,5 – 250 500 – 800

decantadora 2 – 5000 2 – 60 0 – 3 Lodo – torta 3,8 – 1900 2000 – 3200

Fundamentos de la sedimentación y centrifugación

El número de Reynolds relaciona las fuerzas inerciales y de fricción. Los sitemas que vamos a analizar están entre la condición de

Re<1 por lo tanto corresponden a la zona conocida como de resistencia viscosa y la fuerza de fricción se puede calcular a través de la

ley de Strokes (solo para partículas esféricas) y teniendo en cuenta que_

Las partículas están en una suspensión muy diluida

La sedimentación no es influenciada por otras partículas

Re<1

Encontramos que la velocidad de sedimentación es:

Y la velocidad de centrifugación es:

Donde = velocidad angular de la centrífuga

R= radio del rotor de la centrífuga

Dp= diámetro de partícula

µ= viscosidad

ρ= peso específico de la partícula

La viscosidad para la mayoría de los caldos bacterianos esta entre 1 y 2 cP dependiendo de la composición del medio. Cuando hay

ácidos nucleicos aumenta. La diferencia de peso específico en general es muy pequeña ya que las bacterias están constituidas por un

70-80% de agua. µ≤1. El diámetro de partícula es el principal factor que controla la eficiencia de la centrifugación. Al centrifugar

cosas de menor tamaño, hay que aumentar para mejorar la centrifugación.

El tiempo de sedimentación se puede calcular usando la siguiente ecuación:

Si se conoce el radios inicialR0 y el radio final R1de la centrífuga.

Factor G

El factor G permite relacionar la velocidad de sedimentación con respecto a la gravedad:

Se usa para calcular el tiempo equivalente de centrifugación para producir una sedimentación aceptable.

Como determinar el flujo óptimo de alimentación de una centrífuga tubular

El tiempo que permanece la suspensión dentro de la centrífuga (tiempo de residencia) debe ser mayor o igual al tiempo de

sedimentación de la/s particula/s que deseamos sedimentar. Tiempo de Residencia > sedimentación

El cauldal depende del caldo de cultivo y de los parámetros de la centrífuga

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN: depende del caldo de cultivo

PARÁMETROS DE LA CENTRÍFUGA: depende de la centrífuga (Σ) que depende de la geometría de la centrífuga.

Σ= área equivalente de sedimentación

Todos los parámetros excepto g dependen de las características geométricas de la centrífuga

Hay que sedimentar una partícula hasta el 50% del volumen de una partícula determinada

Escalado

La velocidad de sedimentación es constante e independiente de la escala de trabajo. Y como no hay correspondencia entre las

centrífugas, la velocidad de sedimentación es:

Operación de centrífugas continuas

Hay que tener 3 factores en cuenta, la generación de calor, de aerosoles y de ruido.

Filtración Separa un sólido de un fluido por acción de un medio filtrante y una diferencia de presión

Métodos tradicionales

Filtración en lecho profundo

Los sólidos se depositan en el interior del filtro

Filtración convencional

Los sólidos se depositan en la superficie del filtro formando una torta. Se puede clasificar según:

La fuerza impulsora

Gravedad

Vacío

Fuerza centrífuga

El mecanismo

Formación de una torta

De profundidad

El producto

Retentato (torta)

Filtrado (clarificado)

El modo de operación

En batch

En continuo

Tipos de equipos

Filtro prensa

Simplicidad de operación

Bajo costo

Opera bajo presión positiva donde los sólidos se acumulan en el filtro mientras el permeato fluye a través de las placas filtrantes y

sale a una cañería colectora de los canales de flujo. Los sólidos son posteriormente recuperados separando las placas y lavando

manual o semiautomáticamente cada placa. Las placas deben ser limpiadas en ciclos.

Filtro de cámara

Posee una mayor superficie de filtración y se los utiliza en el caso de que los filtro prensa tengan un bajo flujo de operación.

Filtro de tambor rotatorio

La fuerza impulsora es el vacío (presión negativa de filtración) que se produce en el interior de un tambor hueco. El tambor rota y

parte de éste está sumergido en un contenedor donde se encuentra la suspensión a filtrar. Es un equipo de filtración continua y más

complejo de operar.

Métodos modernos

La retención ocurre solo en la superficie.

Sistemas de filtración de membrana

Las membranas filtrantes son de 3 materiales distintos:

Celulosa modificada (acetatos, nitratos, etc)

Polímeros sintéticos (polisulfona, polipropileno,

polietileno, etc)

Minerales (óxidos de Al y/o Zr)

Microfiltración (MF)

Rango de partículas 0,1 – 10 µm

No retiene macromoléculas disueltas

Se utiliza para esterilizar líquidos o gases

Presión de operación: <2 bar

Ultrafiltración (UF)

Discriminan macromoléculas disueltas en solución

que se clasifican de acuerdo al PM minimo de una

molécula globular que puede retener (MWCO)

Rango de poros 5 – 300 kDa

Son usados para concentrar, diafiltrary fraccionar

proteínas

Reemplaza a la diálisis en el escalado

Presión de operación: 1-10 bar

Nanofiltración

Las membranas retienen iones divalentes y pequeñas

moléculas orgánicas

Se usa para la purificación de agua para uso

farmacéutico y biotecnológico


Osmosis reversa

Las membranas son capaces de retener iones y

pequeñas moléculas orgánicas.

Se usan para purificar el agua para uso farmacéutico

y biotecnológico

Se usan presiones más altas porque hay que vences

la fuerza osmótica


Electrodiálisis

Se emplean membrana intercambiadoras de iones

pero impermeables al agua. La separación es forzada

por un campo eléctrico a diferencia de la filtración

que es conducida por la presión.

Se usa para eliminar NH3 y lactato

MWCO

Se refiere al menor PM que es retenido por la membrana

¿Cómo se mejora el flujo de filtración? En UF

Aumentar la PTM o aumentar el área del filtro

Parámetros importantes en filtración con membranas

La PRESIÓN OSMÓTICA depende del MW y de la concentración del componente.

TEST DEL PUNTO BURBUJA: se usa para caracterizar una membrana y monitorear la consistencia y calidad, se basa en la determinación

de la presión mínima en el cual el líquido es eliminado por presión formando una burbuja.

TAPONAMIENTO: deposición de sustancias sólidas sobre la superfice de la membrana lo que produce la disminución del filtrado y su

calidad.

THROUGHPUT: evalúa la capacidad de filtración durante la vida de un filtro.

El flujo es proporcional a la presión transmembránica e inversamente proporcional a las resistencias al pasaje del líquido

RM = resistencia de la membrana

RPB = resistencia de la bloqueo del poro (importante en MF)

RAds = resistencia por adsorción (importante en UF)

RKP = resistencia de un gradiente de concentración (importante en MF)

Rgel = resistencia de la formación de gel (importante en UF)

Nuevos sistemas reducir el taponamiento

Sistema de fibras huecas helicoidales

Membranasvibrantes

Nuevas técnicas para mejorar la separación

HPTFF (High Performance Tangencial FlowFiltration)Agrega la interacción electrostática al efecto estérico:

Modificando el pH y la fuerza iónica de la solución se modifica el tamaño real de las proteínas.

Membranas de UF con carga electrostática

Diferencias con la centrifugación

Evita la formación de aerosoles por ser sistema cerrado

La mayor limitación es el taponamiento que puede ocurrir por ciertas proteínas que se absorben en la membrana o desechos

celulares que forman una capa fina sobre la membrana o compuestos químicos usados como antiespumantes que bloquean

los poros

Tamaño de partícula a separar

A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el costo de separación por centrifugación cae, mientras que

para la filtración no se ven afectados.

La UF no tiene competencia con la centrifugación ya que esta última no permite separar componentes solubles.

Ruptura celular

Objetivos de esta etapa:

Maximizar la liberación del producto

Evitar la desnaturalización y/o inactivación, la degradación térmica, alteraciones secundarias como oxidación,

proteólisis

Maximizar la velocidad de liberación

Métodos Físicos

Mecánicos

Agitación con abrasivos

Homogenización a alta presión

Extrusión por presión

No mecánicos

Shock osmótico

Congelamiento- descongelamiento

Sonicado

Secado

Métodos químicos

Tratamiento con álcali

Tratamiento con solventes

Tratamiento con detergentes

Tratamiento con ácidos

Tratamiento con sustancias caotrópicas

Métodos biológicos

Lisis enzimática

Inhibición de la síntesis de pared celular

Fagos

Virus

Factores a tener en cuenta al seleccionar una técnica de disrupción celular

Mic

roo

rgan

ism

o

Medio de cultivo en el que creció

El medio complejo muestra una mayor resistencia a la

disrupción

Tipo de microoganismoLas Gram + son mas

resistentes a la disrupcion que las gram -

Estado fisiológicolas células en fase

estacionaria tienden a ser mas dificiles de desintegrar

Tamañolas células mas grandes son

más fáciles de romper

Forma los microorganismos

esféricos son más resistentes a la ruptura

Métodos Físicos

Molino de bolillas

Una suspensión celular es agitada a alta velocidad dentro de una cámara en presencia de una alta proporción de bolillas. La

eficiencia de ruptura se ve afectada por la concentración de células.se usan especialmente para microorganismos filamentosos.

BOLILLAS PARA LEVADURAS: >0,5 MM

BOLILLAS PARA BACTERIAS: < 0,5 MM

Rm: ruptura máxima

R: ruptura

Pro

du

cto sensibilidad al calor

El calor causa degradación térmica o desnaturalización de proteínas

Sensibilidad al shear

Localización dentro de la célula

las proteínas periplasmáticas pueden ser liberadas por un tratamiento moderado

mientras que las citoplasmáticas requeiren un tratamiento mas vigoroso

Fact

ore

s

velocidad a la que ha crecidolas altas velocidades específicas

de crecimiento permiten una más facil ruptura de las células.

Si Rm es 100% (quiero romper todo)

El tiempo de residencia es: a mayor k, menor tr para logar el mismo % de liberación. (línea verde abajo)

K representa la eficiencia de la ruptura y es función de:

Velocidad de agitación

Concentración de células (30-60% de sólidos)

Concentración de bolillas de vidrio (70-90 % respecto al volumen de la cámara)

Diámetro de las bolillas (>0,5 levaduras, <0,5 bacterias)

temperatura

diseño del molino de bolillas

Homogeneizador a alta presión

El efecto de la presión de operación sobre la liberación de proteína es exponencial y se ha demostrado que el exponente de presión a

para levaduras es 3 y para bacterias entre 1,5 y 3

No recomendada para organismos filamentosos

Mas usada a gran escala

El calor es por descompresión adiabática

Presión de trabajo: 300 – 600 atm

Rm: cantidad máxima de proteína soluble que puede

ser liberada

R: cantidad de proteínas liberada

K: constante de velocidad temperatura dependiente

N: numero de pasajes de la suspensión celular por el

homogeneizador

P: presión de operación del homogenizador

A: exponente de presión que depende del

microoganismo y del estado metabólico

Si Rm es 100%

Número de pasajes:

Microfluidizadores

Funcionan por el choque de un chorro de líquido (caldo) de alta velocidad de una suspensión (jet) sobre una placa.

De choque: un chorro de 80 µm de diámetro contra una placa metálica enfriada

Microfluidizador: dos corrientes de líquido de 2x100µm se encuentran en una cruz

De choque contra corritente: dos chorros de líquido de 180µm se chocan entre sí de frente.

Ventajas

Dejan residuos de mayor tamaño (facilitan la separación solido-líquido)

Son eficientes a bajo contenido de biomasa

Major enfriamiento

Permiten trabajar a bajos flujos

Se pueden usar volúmentes pequeños

Son compactos

Ultrasonido

Mecanismo de ruptura: cavitación: generación de microburbujas que al colapsar generan una onda expansiva que se propaga por el

medio variando la presión. No se usa a escala industrial porque la energía se transforma en calor.

Métodos Químicos

Tratamiento con álcali

Ventajas

Económico

Fácil escalado

No quedan microorganismo viables

Inactivación de proteasas

Reduce contaminación con piretógenos

Desventajas

Posible desnaturalización

Posible degradación

Tratamiento con solventes

Ventajas

Económico

Fácil escalado

No quedan microorganismo viables

Estabiliza proteínas

Inhibe el crecimiento de microorganismos

contaminantes

Desventajas

Desnturalizacion

Solventes inflamables

Liberación de proteasas

Mecanismo

Extracción del componente liídico de las membranas

autólisis

Autólisis y extracción química

Ventajas

Económico

Fácil escalado

Desventajas (autolisis)

Tiempos largos de reacción

Bajos rendimientos

Las condiciones óptimas deben ser determinadas empíricamente

Temperatura

pH

tiempo de incubación

molaridad del buffer

estado metabólico de las células

Permeabilización con detergentes

Desorganizan la membrana plasmática solubilizando las proteínas haciendo la membrana permeable al pasaje de ciertas proteínas

mediante el uso de agentes caotrópicos.

Ventajas

Evita la extensiva fragmentación de la pared celular

hay pocos residuos de pared celular

Evita la liberación de DNA

Fácil escalado

Desventajas

No es económico

Es un contaminante en la posterior purificación

Inactivan proteínas con estructura cuaternaria

La regulación de la temperatura y el pH son críticas

Mecanismo

Solubilización de membranas

Permeabilización celular

Métodos biológicos

Métodos enzimáticos

Los sustratos para la disrupción enzimática son las paredes celulares:

Gram +

Peptidoglicano

Membrana citoplasmática

Gram –

Pared externa

Peptidoglicano


Levaduras

Mananos parcialmente entrecruzadas por puentes

fosfodiester

Glucanos y proteínas


Hongos filamentosos

Α y β glucanos

Capa de glicoproteínas

Microfibras de quitina

Tipos de enzimas bacteriolíticas

GLICOSIDASAS: cortan cadenas de polisacáridos

ACETILMURANIL-L-ALANINAAMIDASAS:clivan la unión

entre proteínas y polisacáridos

ENDOPEPTIDASES:clivan cadenas polipeptidicas

Lisis de levaduras

Β(1-3) GLUCANASA: degrada la capa interna de glucano

PROTEASA: especifica para la pared celular, degrada la capa externa de proteína-manano

Β(1-6) glucanasa

Mananasa

Kitinasa

Ellas actúan sinérgicamente en la lisis de la pared celular pero solo 2 son esenciales para la ruptura de la célula

Método para la liberación de proteínas por lisis selectiva

PASO 1: Eliminación de la pared celular, enzimas líticas en medio osmótico (1,2M sorbitol) y un estabilizador de membrana

(15mM sulfato de zinc)

PASO 2: ruptura del protplasto con DEAD-Dextram y glucosa

PASO 3: ruptura de organelas con Triston X-100 a 0°C

Precipitación La precipitación es una operación que convierte a un producto solubilizado en un producto solido por acción de algún precipitante.

Los agentes precipitantes no deberían producir desnaturalización del producto y deben proveer una mayor estabilidad del

precipitado.

Operación fácilmente escalable

Requiere poco equipamiento

Los precipitantes son económicos

Desnaturalización selectiva

Se desean producir cambios en la conformación de las proteínas contaminantes (desnaturalizacion) y mantener la proteína de interés

soluble.

Precipitación por afinidad

Se forman complejos proteína-ligando donde uno o ambos componentes deben tener mas de un sitio de interaccion para poder

formar una red macromolecular que se insolubilice. (inmunoprecipitacion)

Saltingout

Adicion de sales a la solución que contiene la proteína de interés, estas afectan el balance entre las fuerzas electroestáticas (que

mantienen la proteína en solución) y las fuerzas hidrofóbicas (que precipitan la proteína en un medio acuoso). La cada de hidratación

recubre la superficie de la proteína y previene las interacciones proteína-porteína, las altas concentraciones de iones salinos eliminan

esta agua porque la usan para hidratarse y permiten las interacciones proteína-proteína llevando a la precipitación.

S= solubilidad de la proteína

S0= solubilidad extrapolada de la proteína a concetracion cero de sal. Depende de la temperatura y el pH.

K= disminución de la solubilidad de la proteína por unidad de sal agregada. Depende de la proteína y la sal usada

C= concentración de sal.

Curva típica del saltingout:

Las sales con mayor carácter precipitante son las que mas estructuran el agua (poco carácter caótropo) y las de menor poder

precipitante son las que interfieren con la estructura del agua (interfieren en los puente de H como el SCN) la concentración salina

también puede expresarse como fuerza ionica.

El sulfato de amonio

Es usado a baja escala por su alta solubilidad a bajas temperaturas. Aunque es barato, su uso a gran escala esta restringido por

problemas de eliminación de residuos. La mayor parte de la sal queda en el sobrenadante pero una cantidad residual siempre

contamina el precipitado, pudiendo ser eliminada resolviendo el precipitado y realizando una UF o cromatografía de exclusión

molecular.

Ventajas:

Alta solubilidad 4M entre 0 y 30°C

Barato

Conserva la integridad de proteínas termolábiles

Previene proteólisis y contaminaciones bacterianas

Densidad de solución saturada: 1,235 g/l

Desventajas

Contamina el precipitado

Corroe el metal y el cemento

Problemas de eliminación

No se puede usar por encima de pH 8

El sulfato de sodio

Debe ser usado a 35 – 40 °C para asegurar la solubilidad adecuada. La sal puede recuperarse del sobrenadante de la precipitación

disminuyendo la temperatura

Ventajas

Recuperable

Desventajas

Caro

Equipamiento termostatizado

Problemas de degradación enzimática

Precipitación con solventes orgánicos

El solvente orgánico debe ser totalmente miscible con agua y de carácter hidrofilico para evitar desnaturalización de la proteína de

interés. La adicion de un solvente orgánico reduce la constante dieléctrica de la solución lo que aumenta las interacciones proteína-

proteína con lo que se llega a la agregación y ulterior precipitación

S: solubilidad de la proteína en la mezcla solvente orgánico- agua

D: constante dieléctrica de la mezcla

K: constante que depende del solvente usando, de la proteína, del pH y la temperatura

S0: solubilidad de la proteína en la solución acuosa original

Un problema es la tendencia general de los solventes orgánicos a desnaturalizar irreversiblemente las proteínas. Cuando se reduce la

constante dieléctrica del solvente, la proteína puede responder plegándose a una forma inactiva en la que lso residuos hidrofóbicos

estén expuestos en el exterior. Por eso se debe realizar a bajar temperaturas (<10°C) para tener una buena recuperación.

Solventes orgánicos:

Metanol

Etanol posee el mejor efectro entre la solubilidad de las proteínas y el carácter hidrofilico adecuado que minimiza la

desnaturalización. Dificultades: sustancia controlada

Isopropanol es mashidrofóbico y puede llegar a desnaturalizar las proteínas en mayor grado.

Acetona

DESVENTAJAS: hay que diseñar todo el proceso a prueba de incendios debido a la inflamabilidad de los solventes usados. Requiere un

control estricto ya que hay que mantenerlo a bajas temperaturas y hay que contrarrestar el calor generado cuando se mezclan

solventes orgánicos con agua.

VENTAJAS: su efecto bactericida y su fácil rescuperacion (destilación)

Precipitación isoeléctrica

Las proteínas exhiben menor solubilidad en su punto isoeléctrico pI es el valor de pH en que la molécula tiene carga neta cero. En este

punto, el grado de hidratación de la molécula es mínimo. Esto aumenta las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y causa la

precipitación. Además disminuyen los fenómenos de repulsión. La primera dificultad es su rango limitado de pH en que las proteínas

son estables. Se requiere un control estricto y un buen mezclado para no sobrepasar el pH crítico y no causar con esto serias pérdidas

del producto.

Precipitación con polímeros no ionicos (PEG)

Las operaciones se efectúan a temperatura ambiente ya que el PEG no interactúa significativamente con la proteína como lo hacían

los solventes orgánicos y tiene bajo calor de disolución. PEG es un polímero tóxico con viscosidad moderada. A gran escala aparecen

dificultades para reciclar el polímero que es caro. PEG es difícil de eliminar de la fracción protéica: si junto con las proteínas

precipitadas se arrastra una cantidad significativa de PEG pueden producirse serios problemas en etapas posteriores de purificación

del producto. El pH mas cercano al pI requerirá menor concentración de PEG.

Precipitación por polielectrolitos

Con carga negativa

Acidopolacrílico

Polisacáridos acídicos

polifosfatos

Con carga positiva

Polietilenimina

Quitosano

El mecanismo de precipitación está relacionado a la cancelación de cargas ya que en general un determinado polielectrolitopreciíta

proteínas de cargas contrarias. Se requieren bajas concentraciones de polielectrolitos para producir la precipitación de proteínas,

normalmente 0,05 a 0,1 %. Los precipitados se forman bien y sedimentan rápido. Las operaciones a gran escala son económicas ya

que la recupración del polielectrolito puede llegar a 90%. La mayor desventaja es el costo inicial del polielectrolito y al igual que el

PEG se deberá evaluar posibles dificultades posteriores por contaminación de la muestra.

Crioprecipitacion

Las proteínas precipitan solo por el hecho de disminuir la temperatura. Ej. Factor VIII de coagulación del plasma humano.

Precipitación por desnaturalización selectiva

Aumento de la temperatura

La combinación con otros agentes precipitantes hace que estos tratamientos se realicen a menor temperatura mejorando la calidad

de las proteínas precipitadas. Con el agregado de citrato se puede disminuir de manera importante la tempratura para logra un 70%

de precipitación y además lograr una precipitación diferencial con BSA. El aumento del poder precipitante en este caso esta asociado

al poder quelante del calcio del citrato que extrae dicho metal desestabilizando la proteína.

Cinética de precipitación

El tamaño de las partículas es uno de los determinantes de la eficiencia de las separaciones solido-liquido.

Nucleación

Para concentraciones de proteína por encima de 2mg/ml toda la proteína desaparece de la fase soluble en un segudo formándose

partículas submicrónicas que se mueven muy rápido y colisionan entre sí.

Crecimiento limitado por difusión

Estas partículas se van uniendo formando otras mas grandes. La eficiencia de la colisón para formar agregados disminuye con el

tamaño de las partículas. El crecimiento puede verse entonces como la adición de pequeñas unidades a los agregados en crecimiento.

La falla en las colisiones entre los agregados mas grandes para formar aglomerados finales, reduce el proceso de crecimiento donde

sólo las partículas primarias y lo pequeños agregados pueden servir como unidades de crecimiento, actuando éstos últimos como

colectores.

Crecimiento influenciado por el flujo

El mezclado favorece el crecimiento del agregado formándose particuals del rango 1 – 100 µm

Floculación

Los agregados se juntan formando los grandes flóculos.

Escalado

El escalado puede realizarse en:

Batch intermitente

Tubular continuo

Tanque agitado continuo CTRS

Puede suponerse que las proteínas precipitan rápidamente, entonces la velocidad de agitación afectará el tamaño inicial de las

partículas y las características del crecimiento posterior.

Problemas:

Problemas de escalado en Batch

Tiempos largos de mezclado

Coprecipitación (precipitan proteínas con contaminantes)

Desnaturalización térmica del producto.

Partición en dos fases acuosas

Sistemas de dos fases acuosas

Tipo polímero-polímero

PEG-Dextran

PEG- hidroxipropil almidón (El dextran es caro y a nivel industrial se usa este polímero)

Tipo polímero-sal

PEG-fosfato

PEG-sulfato

PEG-citrato

Composición global del sistema

Todos sistemas de dos fases acuosas cuya composición de cada fase sean iguales pertenecen a la misma tie-line. Entonces para dos

sistemas de “FA de diferente composición global pertenecientes a la misma tie-line es necesario que la relación de volúmenes

de los dos sistemas sea la misma. El punto crítico (teórico) es donde la composición de las fases es igual y el volumen también. Para

dos sistemas en 2FA pertenecientes a la misma tie-line, el volumen de las fases respecto del volumen total del sistema esta dado por

la longitud relativa de la tie-line. Entonces se puede calcular el volumen relativo de cada fase de un sistema X con la siguiente

ecuación:

Y la composición de cada una de las fases será la misma para todos los sistemas pertenecientes a la tie-line definida por A B.

Comportamiento de una proteína en un sistema de 2FA

Cuando se introducen proteínas en este sistema, éstas se repartirán en forma diferente en ambas fases según sus características

moleculares. Entonces el coeficiente de partición para una proteína P:

Las características moleculares que hacen que las proteínas se repartan distinto en las dos fases son:

Peso molecular

Cargas electroestáticas superficiales

Hidrofobicidad superficial

De esta manera puede extraerse selectivamente algunas proteínas buscando condiciones que hagan que se dirijan hacia la fase

superior K>1 mientras que las otras proteínas y restos celulares van a la fase inferior K<1. Que los contaminantes queden en la fase

inferior es una ventaja para la economía del proceso.

La ruptura de los microorganismos genera problemas:

Los restos celulares poseen un tamaño pequeño del orden de los 0,5µm

Junto con las proteínas se liberan ácidos nucleicos que aumentan la viscosidad del medio.

Para la purificación de una proteína de interés por métodos convencionales, es necesaria una clarificación previa por lo que hay que

recurrir a la centrifugación o ultrafiltración. En la centrifugación como los restos celulares son del orden de 0,5 µm habría que aplicar

mucha energía y tiempo y en cuanto a la UF, como con la lisis se aumenta la viscosidad del medio, este método se hace menos

efectivo. En el sistema de 2FA no se necesita clarificación previa.

¿Cómo cambiar la KP?

Tipos de polímeros

Concentración de polímeros

Peso molecular de los polímeros (+PM la proteína sale de esta fase)

pH es efectivo slo en sistemas polímero/polímero

Temperatura. Es efectivo solamente con algunos polímeros termosensibles especiales donde la separación ocurre a

determinada temperatura.

Tipo de sales en cuya presencia se realiza la extracción (modifican K)

Fuerza ionica

Unión de ligandos de afinidad a los polímeros

¿Cómo comparar dos sistemas de2FA para la purificación de una proteína?

Una manera es determinando la K de la proteínas de interés y compararla con la K de las contaminantes. En un sistema ideal KP<KC.

Las comparaciones deben hacerse para sistemas con tie-lines equivalentes. La manera más fácil de tener estas es trabajar con

sistemas de 2FA con composición global muy cercanas a la curva binodial.

Ventajas

Económico, solo si los polímeros se pueden reciclar

Condiciones de extracción muy suaves, por lo que puede usarse para proteínas poco estables como las enzimas

El scale-up es simple

Rendimientos altos

Capacidad concentradora, solo cuando K es muy grande o muy chico de manera que la reducción del volumen de fase en

donde se encuentra es posible sin afectar la recuperación

La mayoría de los polímeros usados poseen propiedades estabilizantes de las proteínas

Calcular el porcentaje de proteína extraído:

Si la proteína de interés tiene propiedades que se acercan al promedio de las proteínas contaminantes, su constante de partición no

será muy distinta al del resto de las proteínas de la mezcla y no se logrará una purificación muy importante. En estos cados quedan

dos cosas por hacer: usar la partición en 2FA como primer paso de un proceso de purificación (como extracción) y luego aplicar otros

métodos de alta resolución o usar la partición en 2FA por afinidad para tratar de mejorar la K usando polímeros con ligandos de

afinidad.

Eliminación de los polímeros

El agregado de sal al PEG genera otro sistema de dos fases que extraiga la enzima. Las sales luego se sacan por diálisis o UF. Si el PEG

es de bajo PM y la proteína de alto PM se puede diafiltrar (previamente diluir la muestra para disminuir la viscosidad). También se

puede precipitar la muestra con solventes o sales pero los precipitados siempre van a tener polímero contaminante. Otra alternativa

es hacer una extracción con intercambiadores iónicos previo ajuste del pH y fuerza iónica.

Precipitación vs sistema 2FA

El PEG además de ser usado para formar sistemas de 2FA también se usa para precipitar proteínas. Entonces ¿CÓMO SABER QUE

FENÓMENO ESTÁ OCURRIENDO?

Para diferenciarlos aplicamos concentraciones distintas de extracto a una solución de PEG. Si la concentración de la proteína se

interés se encuentra en el sobrenadante, se mantiene la constante entonces hay equilibrio entre la precipitación y la solubilidad. Si la

actividad enzimática responde linealmente con la concentración del extracto entonces se está formando un sistema de 2FA

¿Cómo mido ruptura?

DO(turbidez)

Recuento en microscopio

Actividad Bradford

Abs 280

Métodos cuantitativos para determinar proteínas

Folinphenol

Bradford

Lowry

Métodos para estimar proteínas

Absorbancia a 280 pero puede detectar otras cosas q abs a esta longitud de onda.

repu

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