24 de noviembre de 2014

Ingeniería de fermentaciones e Ingeniería de biorreactores | 6FV1

INSTITUTO

POLITÉCNICO

NACIONAL

ELABORACIÓN DE CERVEZA TIPO “ALE” MEDIANTE

FERMENTACIÓN BAJA A PARTIR DEL AISLAMIENTO DE S.

CEREVISIAE.

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería campus Guanajuato.

Proyecto final para el tercer departamental.

Integrantes del equipo (fermentaciones):

Daniel Aranda Cano

Yvan Arroyo Gánem

Francisco Frausto Parada

Nora Liliana Negrete Bosques

Maritza Fernanda Reyes Zúñiga

Integrantes del equipo (biorreactores):

Deyandira Barroso Salas

Sandra Karina Caudillo Rivera

Valentina Lira Crisanto

Eduardo Ramos Monjaraz

Maritza Fernanda Reyes Zúñiga

Isabel Reynoso

Antecedentes e Introducción

Primer Departamental Varias especies del género Saccharomyces (S. Cerevisiae, S. uvarum, S. Carlsbergensis, S. bayanus,

S. Ellipsoideus, S. Chevalieri, entre otras) se relacionan con la producción de bebidas alcohólicas,

basándose en la forma de asimilar o fermentar diferentes sustratos. Las diferencias entre las cepas

de Saccharomyces, radican en pequeñas mutaciones del material genético, sin embargo, aunque

estas diferencias pueden parecer poco significativas, tienen una gran importancia de manera

industrial en la elaboración de bebidas alcohólicas, ya que fermentan y asimilan la glucosa.

La morfología celular de S.Cerevisiae puede ser: esférica, elipsoidal, cilíndrica o alargada, puede

encontrarse sin agrupar, en pares, cadenas cortas o racimos. Las colonias de esta levadura

presentan una coloración crema o ligeramente café, pueden ser lisas o rugosas y brillantes u

opacas.

La capacidad de producir alcohol depende de varios factores:

Características de la cepa.

Condiciones de aeración.

Concentración del inóculo.

Composición del medio

Condiciones de fermentación.

Alterando también, el rendimiento.(García et al, 2004)

Además de su uso para la elaboración de bebidas alcohólicas, el alcohol producido por S.

cerevisiae, puede ser utilizado como combustible. (Tortora et al, 2007)

Los términos de Fermentación alta y/o Fermentación baja, se refieren a la propiedad de

las levaduras de flocular y formar una nata en la superficie al final de la fermentación

(alta) o bien, de flocular y sedimentar en el fondo del contenedor una vez terminada la

fermentación (baja). De manera general, las cervezas tipo ale se elaboran mediante

fermentación alta, la cual, emplea S. Cerevisiae, mientras que la cerveza tipo lager, se elabora

con otro género de Saccharomyces.

El proceso de fermentación, se inicia con la inoculación del mosto lupulado con un cultivo puro de

levaduras. La mayoría de los procesos de elaboración de cerveza en el mundo, utilizan inóculos

previamente aislados, aunque hay procesos en los que no se seleccionan los inóculos.

Una vez que las levaduras se han propagado en pequeños volúmenes, se colocan en

fermentadores, los que utilizan el mosto estéril y se cultiva aeróbicamente, con una temperatura

inicial de 15-16°C para fermentación tipo ale y de 7-11°C para fermentación tipo lager. (García et

al, 2004)

Segundo Departamental El uso de cultivo continuo en fermentaciones para la producción de cerveza, ha sido

implementado a nivel industrial sin mucho éxito. En Nueva Zelanda, se ha implementado el

sistema de cascada, el cual consiste en dos fermentadores agitados en serie, donde el mosto

circula a 15°C por 24-30 horas, mientras que en Gran Bretaña, se implementó el sistema de Torre,

que está compuesto de un tanque cilíndrico vertical, donde el mosto se bombea desde abajo,

utilizando una levadura floculante para que sedimente en la parte alta del fermentador para

posteriormente resuspender en la base al contacto con el mosto fresco, por aproximadamente 4-8

horas. El poco éxito de estos sistemas, se debe principalmente a:

Alto costo de inversión y operación.

Problemas de contaminación que obligan a parar el proceso, que provocan:

o Aromas y sabores desagradables.

o Disminuyen el rendimiento, ya que compiten con la levadura por el sustrato.

o Viscosidad, películas en la superficie y turbidez.

o Acidez excesiva.

Inflexibles en términos de volumen de producción y elaboración de cervezas de diferentes

características.

Los problemas de contaminación de la cerveza, con microorganismos indeseables, se han logrado

minimizar gracias a que los procesos cuentan con medidas higiénicas muy amplias, por lo que se

ha reducido el uso de agentes antimicrobianos en la cerveza, aun cuando la cerveza no se

pasteurice, ya que el pH, el contenido de alcohol y algunos componentes del lúpulo que tienen

carácter antimicrobiano, provocan que los microorganismos que puedan contaminar el producto,

sean pocos. (García et al, 2004)

La primera etapa del proceso de elaboración de la cerveza (fase de producción del mosto),

termina con una ebullición prolongada, lo que conlleva muchas consecuencias físico-

químicas y microbiológicas, que favorecen las cualidades higiénicas. En la siguiente etapa,

la fermentación produce la aparición de alcohol. Las fases de filtración y pasteurización de la

cerveza, contribuyen también a la estabilidad del producto. (De Loma-Ossorio y Rodríguez, 1999)

En la figura 1, se muestra la metodología para producir cerveza, a nivel industrial.

Figura 1.Diagrama de flujo de elaboración de la cerveza. (De Loma-Ossorio y Rodríguez, 1999)

Tercer Departamental Para que un microorganismo o levadura se pueda desarrollar de manera adecuada en un ambiente

uniforme y con las condiciones necesarias para su crecimiento, en este caso para la levadura S.

Cerevisiae, es necesario el uso de biorreactores que pueden mantener dichas condiciones para el

microorganismo. Los Biorreactores son recipientes en los cuales se llevan a cabo reacciones

bioquímicas y/o bioprocesos, ya sea con enzimas, microorganismos o con células vegetales y

animales, viables y no viables. Todas estas especies se conocen como biocatalizadores. (Ertola et

al, 2006)

El biorreactor utilizado para la producción de cerveza ALE, fue uno de tanque agitado, el cual

puede desempeñar las siguientes tareas:

Mantener de forma uniforme las células distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de

prevenir la sedimentación o la flotación.

Mantener la temperatura constante y homogénea.

Suministrar oxigeno a una velocidad que satisfaga el consumo.

Minimizar los gradientes de concentración.

Su diseño permite mantener el cultivo puro, después de que todo el sistema ha sido

esterilizado.

(G. Vázquez, 2010)

Un biorreactor de tanque agitado, como su nombre lo dice, realiza la agitación mecánicamente

mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor. El aire es inyectado por la parte

inferior del tanque y distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados

regularmente. El chorro de aire que sale de cada uno de los orificio es golpeado por las paletas de

la turbina inferior generándose pequeñas burbujas de aire, las cuales difunden el oxigeno hacia el

seno del líquido. El sistema de agitación es completado con cuatro o seis deflectores, que tienen

por finalidad cortar el movimiento circular que imprimen las turbinas al líquido, generando mayor

turbulencia y mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua o un

intercambiador de calor, lo que permite controlar la temperatura y debe de tomarse en cuenta

que entre mayor sea el volumen del cultivo, mayor será la cantidad de calor generado, por esta

razón entre mayor sea el volumen mayor será el área de refrigeración. El aire que ingresa al

biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de

poro es de 0.45 µm, que impide el paso de microorganismos que puedan contaminar el medio de

cultivo. Un biorreactor de este tipo consiste en un cuerpo cilíndrico con tapas elipsoidales,

semiesféricas o toriesféricas, que generalmente tienen una relación de altura/diámetro menor a

tres y más comúnmente menor a dos Figura 2. (G. Vázquez, 2010)

Figura 2. Biorreactor tanque agitado. (Vázquez, 2010)

Justificación

Ya que en la actualidad, la cerveza es uno de los productos con mayor demanda dentro del

mercado internacional, con este proyecto se trata de elaborar una cerveza de tipo ale, con un

sabor único y característico, seleccionando entre tres lúpulos: Chinook, Cascade y Nugget, los

cuales agregarán un sabor amargo pero agradable, además del olor característico de una cerveza

pero dándole un toque a hierbas, y empleando cepas de Saccharomyces cerevisiae, previamente

aislada e identificada. Además de tener conocimiento del funcionamiento de un biorreactor tipo

lambda y uno tipo tanque agitado, sus componentes y la forma en cómo estos ayudan al

desarrollo de la levadura para la producción de cerveza, así como las condiciones a las cuales se

tienen que dejar los biorreactores para el desarrollo de la cepas: temperatura, rpm, O2, etc.

Objetivos

Objetivo General

Elaborar cerveza mediante fermentación baja (cerveza tipo ALE), a partir del aislamiento de cepas

de Saccharomyces Cerevisiae.

Objetivos específicos

Primer Departamental

Aislar la levadura Saccharomyces Cerevisiae en agar papa dextrosa (PDA).

Identificar y comprobar la obtención de la cepa de S. Cerevisiae mediante pruebas

bioquímicas.

Segundo Departamental

Conocer el funcionamiento del biorreactor Lambda, así como el manejo y las técnicas de

montado y limpieza.

Producir cerveza tipo “ALE” de sabor, olor y apariencia agradable, utilizando malta y tres

lúpulos: Chinook, Cascade y Nugget, inoculando la levadura aislada previamente (primer

departamental).

Tercer Departamental

Conocer el funcionamiento del biorreactor de tanque agitado, así como el manejo y las

técnicas de montado y limpieza.

Producir y mejorar la cerveza tipo “ALE” oscura hecha en el segundo departamental, en su

sabor, olor y apariencia, utilizando malta tostada y dos lúpulos: Chinook y Cascade,

inoculando la levadura aislada previamente (Se inoculó y se aisló una nueva cepa de la

levadura, ya que la del primer parcial ya estaba seca).

Material

Primer Departamental Materiales Reactivos

Matraces Erlenmeyer de 250 mL Agar papa-dextrosa (PDA)

Tubos Falcon de 15 mL Almidón soluble

Vasos de precipitados de 250 mL Agar

Campanas Durham Caldo nutritivo

Cajas Petri estériles Agar TSI

Asas y agujas bacteriológicas Peptona proteosa*

Espátula Dextrosa*

Mecheros de bunsen Extracto de carne*

Parrilla de calentamiento con agitación Cloruro de sodio (NaCl)*

Agitador magnético Rojo de fenol*

Micropipeta (100-1000µL) Agua destilada

Puntas para micropipeta

Incubadora a 37°C

Microscopio

Autoclave

Balanza analítica

Cinta testigo

Algodón y gasas estériles

(*): Componentes para el medio Rojo de fenol.

Segundo Departamental Materiales Reactivos

Matraces Erlenmeyer de 250 mL

Agua destilada Tubos Falcon de 15 mL

Vasos de precipitados de 500mL

Vasos de precipitados de 1 L Etanol 70°

Biorreactor Lambda

Tubos Eppendorf de 2 mL Caldo nutritivo con Saccharomyces

cerevisiae

Jeringa

Lúpulo Chinook* Cámara de Neubauer

Parrilla de calentamiento con agitación

Agitador de vidrio

Lúpulo Cascade* Micropipeta de 100-1000µL y 20-200µL

Puntas para micropipeta de 100-1000µL y 20-200µL

Refractómetro

Lúpulo Nugget*

Microscopio

Autoclave

Balanza analítica

Cinta testigo

Matraz Erlenmeyer de 5 L

Centrífuga

Cebada malteada* Aluminio

Pinzas

Campana de flujo Laminar

(*): Proporcionados por el laboratorio de fermentaciones.

Tercer Departamental Materiales Reactivos

Matraces Erlenmeyer de 250 mL

Agua destilada Tubos Falcon de 15 mL

Vasos de precipitados de 500mL

Vasos de precipitados de 1 L Etanol 70°

Biorreactor tanque agitado

Tubos Eppendorf de 2 mL Caldo nutritivo con Saccharomyces

cerevisiae

Jeringa

Lúpulo Chinook* Cámara de Neubauer

Parrilla de calentamiento con agitación

Agitador de vidrio

Lúpulo Cascade* Micropipeta de 100-1000µL y 20-200µL

Puntas para micropipeta de 100-1000µL y 20-200µL

Refractómetro

Cebada malteada*

Microscopio

Autoclave

Balanza analítica

Cinta testigo

Matraz Erlenmeyer de 5 L

Centrífuga

Aluminio

Pinzas

Campana de flujo Laminar

Torundas de algodón

(*): Proporcionados por el laboratorio de fermentaciones.

Metodología

Primer Departamental Metodología para aislar Saccharomyces cerevisiae.

1) Hacer los cálculos para preparar 100 mL de Agar Papa Dextrosa (PDA)

2) Disolver la cantidad necesaria de PDA en 100 mL de agua destilada.

3) Calentar hasta ebullición, con agitación constante.

4) Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos y 15 libras de presión.

5) Vaciar el agar en cajas Petri estériles (aproximadamente 6) y dejar enfriar.

6) Inocular la levadura (obtenida de una muestra de cerveza, proporcionada por el

laboratorio de fermentaciones), agregando aproximadamente 100µL de la muestra a la

caja Petri y extender con ayuda de un triángulo de vidrio estéril.

7) Incubar a 37°C de 24 a 48 horas.

8) Observar la morfología colonial de la levadura en la caja.

9) Tomar muestra de una colonia y colocarla en un portaobjetos con una gota de agua

destilada, colocada previamente, y extender la muestra con ayuda del asa bacteriológica.

10) Pasar el portaobjetos por la flama del mechero pasa fijar la muestra.

11) Observar al microscopio y describir la morfología celular.

Metodología para Rojo de fenol.

1) Se suspenden todos los ingredientes de la formulación en 40 ml de agua destilada.

2) Agitar hasta disolver completamente.

3) Distribuir en tubos de ensayo que contengan campana de Durham.

4) Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos y 15 libras de presión.

5) Dejar enfriar a temperatura ambiente.

6) Con ayuda de un asa estéril, inocular con la cepa deseada el medio.

7) Dejar en incubación a 37°C por 24 horas. (García et al, 1994)

Metodología para prueba de almidón.

1) Suspender 1.25 g en 50 mL de agua destilada o desmineralizada.

2) Calentar a ebullición para disolver completamente.

3) Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión (121 °C).

4) Distribuir en la forma deseada.

(Extraído: http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/ap_a.pdf)

Metodología para TSI.

1) Suspender 2.196 g en 40 mL de agua destilada o desmineralizada.

2) Calentar a ebullición para disolver completamente.

3) Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión (121 °C).

4) Distribuir en tubos Falcon de 15 mL.

5) Dejar enfriar de forma inclinada.

6) Inocular muestra con ayuda de un asa estéril.

Segundo Departamental Molienda del grano

1. Moler la malta (a menos que ya se haya comprado molida). Este es un proceso

importante para obtener una buena producción. Mientras mejor este molido el

grano mayor será la producción.

Mashing o maceración de la malta

1. Calentar 20 litros del agua declorada. Mientras tanto ir limpiando la nevera

(Hielera).

2. Cuando el agua llegue a unos 80ºC (usar termómetro), entonces sacar del fuego y

traspasar sólo 12 de los 20 litros a la nevera (como regla se deben traspasar 2 o 4

litros por cada kilo de malta, en nuestro caso para 5 kilos son 12 litros).

3. Después de traspasar el agua a la nevera esta se debería enfriar un poco, luego se

meterá el grano y (como el grano está frio) el agua debería bajar más aún de

temperatura, al final la temperatura debería ser de 67ºC aproximadamente.

4. Se debe mezclar bien el grano en el agua con una cuchara de plástico (no se

recomienda usar de madera).

5. Tapar la nevera y empezar a contar el tiempo. Hay que esperar aproximadamente

90 minutos, que es el tiempo en que se demora en convertir los almidones en

azúcares.

6. Cada media hora medir la temperatura, si ha bajado mucho, agregar un poco más

de agua caliente de manera cuidadosa y suavemente.

Lavado del grano

1. Una vez transcurridos los 90 minutos, ahora lo que se hará es lo que llaman

Lauthering o lavado del grano. Aquí lo primero es ver si la nevera tiene desagüe o

no, si la nevera tiene desagüe entonces no habrá mayor dificultad y simplemente

abrir el desagüe cuando se empiece a sacar el líquido, pero si no tiene, entonces

se necesitara hacer sifón para poder sacar el líquido desde adentro de la nevera,

para eso utilizaremos una manguera limpia que se pondrá en el fondo de la nevera

y que va a ser utilizada para sacar el caldo haciendo sifón. Simplemente se mete

uno de los extremos de la manguera hasta el final de la nevera, y aspira por el otro

lado extremo de la manguera (lo único importante para que funcione es que el

extremo que está en la nevera, debe estar a más altura que el extremo por donde

aspiraste).

2. Se empieza a sacar el líquido de la nevera, y se va depositando en una de las jarras

limpias. Bueno en este paso vas a necesitar la ayuda de algún compañero, porque

cuando se termine de llenar la primera de las jarras, el compañero tiene que

reemplazarla con la segunda jarra mientras la primera jarra se devuelve a la

nevera y así sucesivamente unas 10 ó 15 veces (esto se llama re-circular el caldo).

Recuerda que cada vez que eches líquido a la nevera debes hacerlo suavemente

usando la espumadera o una especia de regadera, y procurando de echarlo

disperso y por todos lados de la nevera.

3. Una vez que se haya terminado de re-circular el líquido, entonces se va empezar a

juntar el líquido en la olla, mientras se hace eso, se tomara una probeta con una

muestra del líquido o jarabe, y utilizar el densímetro para medir la densidad. Como

nuestro jarabe es más espeso que el agua, debería tener una densidad mayor,

cercana a 1080 ó 1090, lo cual quiere decir que tenemos que agregar bastante más

agua (diluirlo) para llegar a los 1040 ó 1030 que va a ser la densidad que

necesitamos para nuestro siguiente paso.

4. Para diluir nuestro jarabe, agarramos el resto del agua caliente que teníamos y

empezamos a echarlo suavemente sobre el grano que quedó en la heladera, para

después sacarlo por el desagüe y mezclarlo con el resto del jarabe, cada dos o tres

litros que se añadan se va midiendo la densidad nuevamente y cuando llegue a los

1040 ó 1030 dejar de echar agua.

Hervido del caldo o wort

1. Una vez que ya se tiene bien lavado el grano, se procede a ponerse en una olla con

jarabe de malta, en este paso es donde se le agrega el lúpulo.

2. El lúpulo encargado de añadirle el amargor a la cerveza se agrega al inicio de la

cocción debido a que a mayor cocción el grado de amargor será mayor, mientras

que los lúpulos encargados de incorporar el aroma se le añade en los últimos 5

minutos de cocción, para evitar perder la menor cantidad de esencia. La cantidad

de lúpulo a utilizar depende directamente de la cantidad de cerveza a fabricar y de

los gustos personales por el sabor y aroma de la misma.

3. Una vez que se tenga establecido el sabor y aroma que se le desea agregar a la

cerveza se pone a calentar en una olla hasta hervir, en este punto se le agrega el

lúpulo correspondiente al amargor, se deja hervir por una hora más.

4. Al pasar entre 50 y 55 minutos de hervor se le añaden los lúpulos del aroma y sólo

se dejan hervir durante 5 minutos.

Enfriado del caldo

Antes que nada se debe de activar la levadura a utilizar, para ello se procede a lo

siguiente:

1. Si la levadura esta deshidratada, se rehidrata.

2. Se hierve un poco de agua, aproximadamente una taza y se deja enfriar, cuando el

agua ya se encuentre en una temperatura alrededor de los 30 ° o temperatura

ambiente entonces se le añade la levadura seca dejándola reposar durante 15

minutos con el fin de obtener la rehidratación.

3. Cuando se esté enfriando el caldo se debe de sacar una muestra y medirle la

densidad, está debe oscilar entre los 1040 y 1050 Kg/m3.

4. El sistema de enfriado a utilizar será muy básico y práctico.

5. Primeramente se debe homogeneizar el contenido de la olla para evitar que se

sedimente todo el contenido, después se debe de traspasar el caldo caliente a un

bidón (en nuestro caso es un garrafón), pero para ellos se debe de ir filtrando

cuando se vaya traspasando, terminando de filtrar se debe cerrar el bidón y

colocarse en un recipiente de mayor tamaño el cual debe de estar lleno de agua

muy fría, de preferencia abastecido lo suficientemente de hielo para lograr que

enfríe rápidamente.

6. Transcurridos aproximadamente 8 minutos abrir el sifón y medir la temperatura, si

se encuentra entre los 25 °C ya está lista y se procede al siguiente paso, sin

embargo si se encuentra caliente entonces se cierra el bidón y se deja más tiempo

en el agua.

Fermentación

1. Una vez obtenido el enfriamiento se cierra el bidón y se agita fuertemente para

que este bien mezclado.

2. Si bien en esta parte de la producción de cerveza es donde se hace presente el CO2

es importante no dejar abierto nuestro bidón ya que podría sufrir de una

contaminación, pero tampoco se puede mantener cerrado herméticamente pues

podría explotar, por ellos se recurre a usar un airlock, sin embargo al no contar

con este aparato se recurrió a usar un globo al cual se le hacen unos pequeños

orificios con una aguja, lo cual dificulta la entrada de las bacterias.

3. Cuando se está teniendo una buena fermentación en los primeros 4 días entonces

se habla de una primera fermentación, donde hay mucha espuma y mucho gas,

una vez transcurrida esta etapa se presentan retos de lúpulo en el fondo de la

garrafa, el espesor varía entre 3 y 4 cm.

4. Una vez transcurridos los 10 días de fermentación se debe volver a medir la

densidad para poder determinar el porcentaje de alcohol de la cerveza.

Embotellado

1. Colocar la cerveza en envases color ámbar, previamente esterilizados y secos, sin

tapa rosca. (Extraído de

http://www.cervezacasera.com.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=17&It

emid=42)

Tercer Departamental Molienda del grano

1. Se lava el grano y se procede a tostarlo, se realizó esta modificación para poder liberar la

mayor cantidad de almidón contenido al momento de molerlo.

2. Moler la malta (a menos que ya se haya comprado molida). Este es un proceso importante

para obtener una buena producción. Mientras mejor este molido el grano mayor será la

producción.

Mashing o maceración de la malta

1. Calentar 20 litros del agua declorada. Mientras tanto ir limpiando la nevera (Hielera).

2. Cuando el agua llegue a unos 80ºC (usar termómetro), entonces sacar del fuego y

traspasar sólo 12 de los 20 litros a la nevera (como regla se deben traspasar 2 o 4 litros por

cada kilo de malta, en nuestro caso para 5 kilos son 12 litros).

3. Después de traspasar el agua a la nevera esta se deberá enfriar un poco, luego se meterá

el grano y (como el grano está frio) el agua deberá bajar más aún de temperatura, al final

la temperatura estará en 67ºC aproximadamente.

4. Se debe mezclar bien el grano en el agua con una cuchara de plástico (no se recomienda

usar de madera).

5. Tapar la nevera y empezar a contar el tiempo. Hay que esperar aproximadamente 90

minutos, que es el tiempo en que se demora en convertir los almidones en azúcares.

6. Cada media hora medir la temperatura, si ha bajado mucho, agregar un poco más de agua

caliente de manera cuidadosa y suavemente.

Lavado del grano

1. Una vez transcurridos los 90 minutos, ahora lo que se hará es lo que llaman Lauthering o

lavado del grano. Entonces se necesitara hacer sifón para poder sacar el líquido desde

adentro de la nevera, para eso utilizaremos una manguera limpia que se pondrá en el

fondo de la nevera y que va a ser utilizada para sacar el caldo haciendo sifón. Simplemente

se mete uno de los extremos de la manguera hasta el final de la nevera, y aspira por el

otro lado extremo de la manguera (lo único importante para que funcione es que el

extremo que está en la nevera, debe estar a más altura que el extremo por donde

aspiraste).

2. Se empieza a sacar el líquido de la nevera, y se va depositando en una de las jarras limpias.

Bueno en este paso vas a necesitar la ayuda de algún compañero, porque cuando se

termine de llenar la primera de las jarras, el compañero tiene que reemplazarla con la

segunda jarra mientras la primera jarra se devuelve a la nevera y así sucesivamente unas

10 o 15 veces (esto se llama re-circular el caldo).

3. Una vez que se haya terminado de re-circular el líquido, entonces se va empezar a juntar

el líquido en la olla, mientras se hace eso, se tomará una probeta con una muestra del

líquido o jarabe, y utilizar el densímetro para medir la densidad. Como nuestro jarabe es

más espeso que el agua, debería tener una densidad mayor, cercana a 1080 o 1090, lo cual

quiere decir que tenemos que agregar bastante más agua (diluirlo) para llegar a los 1040 o

1030 que va a ser la densidad que necesitamos para nuestro siguiente paso.

4. Para diluir nuestro jarabe, agarramos el resto del agua caliente que teníamos y

empezamos a echarlo suavemente sobre el grano que quedó en la heladera, para después

sacarlo por el desagüe y mezclarlo con el resto del jarabe, cada dos o tres litros que se

añadan se va midiendo la densidad nuevamente y cuando llegue a los 1040 o 1030 dejar

de echar agua.

Hervido del caldo o wort

1. Una vez que ya se tiene bien lavado el grano, se procede a ponerse en una olla con jarabe

de malta, en este paso es donde se le agrega el lúpulo.

2. El lúpulo encargado de añadirle el amargor a la cerveza se agrega al inicio de la cocción

debido a que a mayor cocción el grado de amargor será mayor, mientras que los lúpulos

encargados de incorporar el aroma se le añade en los últimos 5 minutos de cocción, para

evitar perder la menor cantidad de esencia. La cantidad de lúpulo a utilizar depende

directamente de la cantidad de cerveza a fabricar y de los gustos personales por el sabor y

aroma de la misma.

3. Una vez que se tenga establecido el sabor y aroma que se le desea agregar a la cerveza se

pone a calentar en una olla hasta hervir, en este punto se le agrega el lúpulo

correspondiente al amargor (Chinook), se deja hervir por una hora más.

4. Al pasar entre 50 y 55 minutos de hervor se le añaden el lúpulo del aroma (Cascade) y sólo

se deja hervir durante 5 minutos.

Enfriado del caldo

Antes que nada se debe de activar la levadura a utilizar, para ello se procede a lo siguiente:

1. Si la levadura esta deshidratada, se rehidrata.

2. Se hierve un poco de agua, aproximadamente una taza y se deja enfriar, cuando el agua ya

se encuentre en una temperatura alrededor de los 30 ° o temperatura ambiente entonces

se le añade la levadura seca dejándola reposar durante 15 minutos con el fin de obtener la

rehidratación.

3. Cuando se esté enfriando el caldo se debe de sacar una muestra y medirle la densidad,

está debe oscilar entre los 1040 y 1050 Kg/m3.

4. El sistema de enfriado a utilizar será muy básico y práctico.

5. Primeramente se debe homogeneizar el contenido de la olla para evitar que se sedimente

todo el contenido, después se debe de traspasar el caldo caliente a un bidón (o en su

defecto garrafón), pero para ellos se debe de ir filtrando cuando se vaya traspasando,

terminando de filtrar se debe cerrar el bidón y colocarse en un recipiente de mayor

tamaño el cual debe de estar lleno de agua muy fría, de preferencia abastecido lo

suficientemente de hielo para lograr que enfríe rápidamente.

6. Transcurridos aproximadamente 8 minutos abrir el sifón y medir la temperatura, si se

encuentra entre los 25 °C ya está lista y se procede al siguiente paso, sin embargo si se

encuentra caliente entonces se cierra el bidón y se deja más tiempo en el agua.

Sin embargo nosotros no tuvimos que rehidratar levadura debido a que al haberla aislado desde

tiempo atrás, se tenían incubada en petri en Agar Papa Dextrosa. Que después se utilizaría como

inoculo junto con una cantidad de mosto.

La cantidad de mosto utilizado para la usarlo como inóculo fue de 800 ml, cantidad suficiente para

tener la fermentación de los 4.2 L restantes de mosto.

Fermentación

1. Una vez obtenido el enfriamiento se cierra el bidón y se agita fuertemente para que este

bien mezclado.

2. Se procede a utilizar el biorreactor tanque agitado, cuidando que al momento de pasar el

mosto al reactor este se realice de manera estéril, utilizando dos torundas de algodón

bañadas en alcohol 96°, y se procede a tomar una muestra para obtener, una

concentración inicial de levadura presente, calcular los grados brix y determinar la

cantidad de alcohol presente.

3. Cuando se está teniendo una buena fermentación en los primeros 4 días entonces se

habla de una primera fermentación, donde hay mucha espuma y mucho gas, tomando

muestras 2 o 3 veces por día y así apreciar la variación de crecimiento en levadura y

aumento en la graduación de alcohol, una vez transcurrida esta etapa se presentan retos

de lúpulo en el fondo de la garrafa, el espesor varía entre 3 y 4 cm.

Aclaramiento

Para poder obtener una cerveza con la menor cantidad de residuos de levadura asó como

de la malta utilizada para la producción de la cerveza, se procede a centrifugar en una

centrifugadora de discos.

Se debe de realizar con la mayor esterilidad posible, para garantizar que nuestro producto

cuente con la mejor asepsia posible.

Para ello se debe de esterilizar la centrifugadora, así como una bomba peristáltica y una

manguera de plástico.

Una vez que ya se ha esterilizado, se procede a colocar la manguera en la bomba a una

velocidad de rpm.

En nuestro caso sólo le realizamos una centrifugada, sin embargo consideramos adecuado

para un perfecto color entre 2 o 3, la razón por la cual se considera esta cantidad de

centrifugaciones necesarias es porque en el molido del grano se dejó muy fino, lo cual

ocasionó una gran cantidad de sedimento, el cual es más difícil de retirar de la cerveza.

Embotellado

1. Colocar la cerveza en envases color ámbar, previamente esterilizados y secos, con tapón

de corcho (Extraído de

http://www.cervezacasera.com.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=17&It

emid=42)

Resultados y discusión

Primer Departamental Morfología colonial

Se observaron las colonias en las cajas Petri a simple vista y se determinó la morfología, la

cual, presentó las siguientes características:

Forma: Circular.

Elevación: convexa.

Borde: Entero.

Color: blanco-cremoso.

Morfología celular

Después de realizar el frotis, se colocó al microscopio (Fig. 2) y se observaron las

siguientes características:

Forma y borde: circular y entero.

Color: blanquecino-transparente.

Figura 2. Frotis de Saccharomycescerevisiae visto al microscopio óptico con objetivo de 40x.

Con base a lo que dice M. Atlas (2004), el agar PDA es un medio de cultivo selectivo para todos los

organismos fungí, contiene infusión de papa, almidón, agar y glucosa, es por ello que nuestro

cultivo presentó crecimiento favorable (Fig. 3).

Figura 3. Crecimiento de levadura observado en caja Petri.

Según Konerman (2008), las especies Saccharomyces aparecen en el transcurso de 36 a 48

horas, son de un color blanco-grisáceas y pastosas con pliegues irregulares. El aspecto es

inespecífico y puede ser necesario realizar estudios de asimilación de hidratos de carbono

para confirmar la identificación (Prueba TSI y rojo fenol). La morfología microscópica

tampoco es específica. Se observan racimos de levadura grandes, ovales, con brotes en las

preparaciones de agar.

De acuerdo a las características observadas y a las reportadas en la bibliografía, nuestra

levadura si pertenece a la especie Saccharomyces, ya que nuestras colonias si son blancas

y pastosas, y en su morfología colonial, se pueden observar levaduras grandes de forma

circular u ovalada aunque no en racimo, ya que se deformó un poco la muestra al

momento de hacer el frotis.

Rojo de Fenol

Existen diversas pruebas para la detección de un organismo, que se basan en la actividad

metabólica o bioquímica de las bacterias y levaduras. (Tortora et al, 2007)

De acuerdo a lo establecido por Mariano García et al, en su libro de biotecnología

alimentaria, Saccharomycescerevisiae es una levadura capaz de fermentar y asimilar la

glucosa, sacarosa, maltosa y galactosa.

En la detección de S. Cerevisiaese optó por hacer la prueba de rojo fenol, la cual consiste

en la capacidad que posee un organismo para fermentar un carbohidrato, en el caso de

nuestro medio de cultivo, el carbohidrato agregado es la dextrosa, siendo esta una forma

de glucosa. Esta prueba se detecta observando los cambios de color del indicador rojo

fenol de pH. (García et al, 1994)

Las bacterias a través de la fermentación de un hidrato de carbono lo degradan y

descomponen en dos moléculas de carbono, también conocidas como triosas, estas son

degradadas nuevamente, el número de compuestos que resultan varían en la cantidad de

carbonos que contienen, estos cambios son de acuerdo a la especie que la está llevando a

cabo, así como de las condiciones del medio, entre otras. (García et al, 2004)

Como se puede observar en la figura 4, la prueba con rojo de fenol resultó ser positivo

después de 24 horas de haber sido inoculada en el medio, esto porque el medio cambió

de color de rojo a naranja-amarillo, es decir, el medio se acidificó, lo cual indica que hay

fermentación de azúcares. Así mismo, es importante mencionar que dos de los tubos

inoculados presentaron una burbuja en la campana de Durham, esto indica que hubo

producción de gases.

Figura 4. Prueba de rojo de fenol. A) Tubo de control. B) Resultados de los tubos inoculados después de 24 horas de incubación.

Prueba de Hidrólisis de Almidón

Esta prueba se realizó para determinar la capacidad de la

levaduraSaccharomycescerevisiae, de hidrolizar el almidón mediante la producción de la

enzima amilasa, y para probar la desaparición del almidón, se usó un reactivo con yodo

(lugol). Como se puede observar en la figura 5, en el medio almidón no hubo crecimiento

de la levadura, por lo que ni siquiera fue necesario llevar a cabo la prueba con el lugol. La

levadura Saccharomycescerevisiae no es capaz de producir la enzima amilasa y entonces,

cuando se agregó el lugol al medio de cultivo, no se presentó el halo claro, porque había

presencia de almidón, el cual que no fue hidrolizado por las, más de 30, unidades

presentes de glucosa. El almidón es un compuesto que se encuentra muy

abundantemente en la naturaleza y sirve como fuente de carbono para el crecimiento de

una gran variedad de microorganismos, pero sin embargo, Saccharomycescerevisiae no

posee el suficiente poder enzimático necesario para su hidrólisis y, posteriormente, la

producción de etanol, por lo que es necesario llevar a cabo un tratamiento previo para

obtener azúcares fermentables que puedan ser utilizados por esta levadura. (Haq et al.,

2005; Mac Faddin, 2000)

A B

Figura 5. Resultados de la prueba de hidrolisis de almidón en agar almidón después de 48 horas de

incubación.

El almidón es un polímero de reserva, compuesto por muchas unidades de glucosa unidas

por enlaces glucosídicos α 1-4 y α 1-6, formando la fracción lineal de amilosa y la

ramificada de amilopectina. Para que el almidón pueda ser utilizado en la producción de

etanol, requiere de un pre-tratamiento de licuefacción y sacarificación, de tal manera que

se liberen moléculas más sencillas y asimilables, como la glucosa. El proceso de

sacarificación por vía enzimática se puede realizar con bacterias del género Bacillus como:

B. licheniformes, B. amyloliqueniformis, B. megaterium, B. polymixa y B. subtillis. La

mayoría de estas bacterias producen una o varias de las glucosilhidrolasas implicadas en el

proceso de hidrólisis de almidón hasta obtener gran cantidad de azúcares fermentables

como la glucosa y la maltosa. (Kaur et al., 2007)

Agar TSI

El agar TSI se y utiliza para saber si un organismo puede usar la glucosa y la lactosa o la sacarosa de

forma fermentativa, produciendo sulfuro de hidrógeno (H2S) o gases como CO2 o H2. El medio se

vuelve de un color amarrillo cuando el pH es ácido, y cuando el medio esta de color rojo significa

que tiene un medio alcalino (Forbes, 2009)

En los tubos Falcon, se espera observar lo siguiente:

La parte inclinada del medio es alcalino y conserva un color rojo en el fondo (K/NC)=los

organismos no utilizaron los azúcares presentes (glucosa, lactosa y sacarosa). También se

puede expresar esto como (K/K)= el pH de la parte inclinada y en el fondo es alcalino.

En la parte inclinada el medio es alcalino y el fondo tiene color amarillo (fondo con pH

ácido), (K/A)=el organismo solo fermenta glucosa.

En la parte inclinada y en el fondo del medio tienen un pH ácido, (A/A)= el organismo es

fermentador de la glucosa, sacarosa o la lactosa.

Otro resultados que arroja esta prueba bioquímica son:

1. Se tiene en el fondo un precipitado negro, esto significa que los organismos

produce sulfuro ferroso y H2S gaseoso.

2. Presencia de burbujas o grietas en el fondo del tubo que contiene el medio indica

que el organismo produce CO2 o H2 (Forbes, 2009).

Se realizó la inoculación en 4 tubos con medio agar TSI.

Figura 6. Tubos con medio agar TSI inoculados con una cepa que presentó morfología de similar a Saccharomycescerevisiae.

El tubo A, tubo B y tubo D presentaron una coloración amarilla en la totalidad del medio,

indicando que tiene un pH ácido por la presencia de ácidos orgánicos producidos por la

fermentación de las azúcares presentes en el medio TSI. (Forbes, 2009)

Los tubos B y D, respectivamente, presentaron ruptura en el medio, en la parte del fondo. Este

rompimiento indica que los organismos están produciendo gases, los cuales pueden ser: CO2 y H2.

(Forbes, 2009)

En el tubo C hubo una diferencia en cuanto a la coloración del medio, ya que en el fondo

prevaleció un color rojizo, por los indicadores de acidificación (rojo fenol y sulfato ferroso), lo que

indica que el medio conservó un pH alcalino, esta variación podría ser resultado de una baja

densidad microbiana en esta zona, resultado de una mala tinción o un organismo distinto

inoculado en este tubo, probablemente generado por contaminación, ya que en los demás tubos

obtuvieron una coloración amarilla uniforme. (Forbes, 2009)

La Saccharomycescerivisiaees un organismo anaerobio facultativo, no requiere oxígeno para

crecer, aunque se favorece su crecimiento en la presencia de oxígeno, pero en general tiene buen

crecimiento microbiano en presencia o no de oxígeno. Esta propiedad es similar con la observada

en los medios TSI, ya que se observó crecimiento microbiano, color blanco en el medio, tanto en la

superficie de la parte inclinada del tubo como en el fondo por donde paso la aguja bacteriológica.

(Prescott, et al., 2002)

La Saccharomycescerivisiaees capaz de fermentar la glucosa produciendo etanol (Prescott).

Cuando un organismo fermenta glucosa todo el medio se acidifica, esto significa que nuestro

organismo inoculado en los tubos con medio TSI son fermentadores de glucosa, propiedad que

coincide con la capacidad de producción de etanol a partir de glucosa de la

A B C D

Saccharomycescerivisiae, esta propiedad es muy empleada en la industria para la producción de

etanol. (Forbes, 2009)

El organismo que creció en nuestros medios de cultivo (agar TSI), también mostró propiedades de

fermentar la lactosa, dado la homogeneidad del color amarillo del medio. La característica

mencionada anteriormente concuerda con la que cuenta la Saccharomycescerivisiae, ya que es

una cepa que es capaz de fermentar la lactosa y aparte cuenta con alta tolerancia al alcohol.

(García, 1993)

Las Saccharomycescerivisiae en la fermentación alcohólica produce dióxido de carbono, en los

medios de cultivo se aprecia fácilmente la producción de gases (CO2 y H2), ya que pudo provocar

una ruptura en el medio en el fondo del tubo, esto se observa en los tubos B y D. (Tortora, et al,

2007)

Segundo Departamental Una vez obtenido el mosto, de acuerdo a los pasos de la metodología mencionada anteriormente,

se procedió a filtrar con una “manta de cielo” para retirar los restos de malta y lúpulo,

posteriormente esterilizar el caldo y meter al biorreactor Lambda.

Ya que el volumen del biorreactor utilizado, es pequeño (aproximadamente 1.5 L), se colocó una

parte del líquido filtrado en el biorreactor y el restante, se colocó en un matraz de 4L, para realizar

la fermentación sin ayuda del biorreactor.

Después de haber esterilizado, se colocó el 80% del volumen de operación del biorreactor,

mientras que al 20% restante del volumen, se inoculó con la levadura aislada el primer

departamental (Saccharomyces cerevisiae). Este inóculo se guardó en incubación a 27°C y con

agitación constante durante 4 días. Transcurrido ese tiempo y con técnicas estériles, se introdujo

el inóculo al biorreactor, al cual ya se le había definido una velocidad de agitación.

Se tomaron 8 muestras en total para hacer cuantificaciones de biomasa (levadura), sustrato

(azúcares) y producto (alcohol), con el fin de determinar el comportamiento de éstos, tomando un

volumen menor a 2 mL por medio del dispositivo para toma de muestra (figura 7), siempre en

presencia de una torunda de algodón encendida, para evitar contaminaciones a nuestro cultivo.

Las mediciones de pH no se pudieron realizar, debido a una falla con el electrodo.

Figura 7. Biorreactor Lambda. 1) Toma de muestra. 2) Parte donde va el motor. 3) Discos o platos para agitación. 4) Motor.

Se dejó fermentar en el reactor por 3 días. Una vez que se sacó el caldo del biorreactor, se colocó

en un matraz Erlenmeyer, decantándolo previamente para que los restos de mosto se quedarán

en el fondo del reactor. El mosto sedimentado, se agregó al matraz que contenía el caldo que no

se metió al reactor, para llevar a cabo una fermentación artesanal. A ambos matraces, se les

colocó en la boquilla, tapones de gasas y algodón, para evitar contaminaciones y además, se

envolvieron en aluminio para evitar posibles alteraciones debidas a la luz. Se dejaron reposar por 5

días.

Como paso final, se clarificaron las cervezas producidas con ayuda de una centrífuga, colocando el

producto clarificado en botellas de vidrio, previamente lavadas y esterilizadas. Se llenaron las

botellas con, aproximadamente, el mismo volumen, cerrándolas con un tapón de corcho y

parafilm. Debido a que no se pudo gasificar la cerveza, se metieron las botellas a la incubadora a

27°C con agitación constante, para que las levaduras presentes, al seguir fermentando los

azúcares, produjeran dióxido de carbono (CO2).

Como resultado de las dos fermentaciones realizadas, se obtuvieron dos cervezas (figura 8) con

las características mencionadas en la tabla 1, resultantes de pruebas organolépticas.

Tabla 1. Resultados de las pruebas organolépticas realizadas a las cervezas.

Prueba realizada Cerveza producida en

biorreactor Cerveza producida de forma

artesanal

Olor Olor herbal (lúpulos) Olor herbal (lúpulos)

Color Café amarillento oscuro Amarillo

Sabor Amargo agradable Amargo diluído

1

)

2

)

3

)

4

)

La cuantificación de biomasa, se realizó mediante conteos en cámara de Neubauer,

tomando un volumen de 20 µL de cada una de las muestras para cada conteo. Para

determinar la concentración de biomasa, se utilizó la siguiente fórmula:

#𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝟏𝟎𝟎𝟎𝟎𝟏

𝒎𝑳

#𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏= [

𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝒎𝑳]

Se utilizó un factor de conversión, para que el resultado tuviera unidades de 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿, como

se muestra a continuación:

#𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ 100001

𝑚𝐿

#𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 ∗ 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛= [

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝐿] ∗ (

1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = [

𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳]

Para determinar la concentración de azúcares (sustrato), se utilizó un refractómetro

(figura 9). Para hacer una lectura lo más correcta posible, la muestra tomada se centrifugó

por 5 minutos a 3000 rpm, con el fin de sedimentar la biomasa, posteriormente se tomó 1

gota del sobrenadante de la muestra centrifugada y se leyó en el refractómetro, la cual, se

registraba en grados Brix.

A B

Figura 8. Cervezas elaboradas. A) Cerveza producida en biorreactor. B) Cerveza producida de

forma artesanal.

Figura 9. Refractómetro.

Tomando como referencia los grados Brix leídos en el refractómetro, se determinó la cantidad de

alcohol presente en las muestras conforme aumentaba el tiempo de fermentación. (Tablas

obtenidas de documento en línea en http://www.ictsl.net/downloads/refractometros.pdf)

Tabla 2. Resultados de concentración de producto, biomasa y sustrato.

No. De muestra

Tiempo (h) Biomasa

(𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳)

Sustrato (°Brix

leídos)

Sustrato (°Brix

reales)*

Sustrato real

consumido (°Brix, Sc)

Producto (%)

1 0 6420000000 5.1 5.37 0 0.11

2 2 8920000000 3.7 3.9674 1.4026 0.795

3 3 11060000000 3.7 3.9674 1.4026 0.795

4 10 72000000000 3.6 3.8672 1.5028 0.861

5 11 80000000000 3.5 3.767 1.603 0.928

6 13 90000000000 3.3 3.5666 1.8034 1.061

7 25 114000000000 3.3 3.5666 1.8034 1.061

8 26 114600000000 3.2 3.4664 1.9036 1.107

*Ajustes realizados de acuerdo a la temperatura a la que se analizó la muestra.

(Ver anexos de segundo departamental)

Como se observa en la tabla 2, la concentración de biomasa y la producción de alcohol

aumentan, mientras que la del sustrato disminuye a medida que pasa el tiempo. Con los

datos mostrados en la tabla 2, se realizaron los cálculos para conocer los rendimientos

(Ypx, Yxs, Yps), la constante de crecimiento celular (µ) y la tasa de generación de producto

(qp).

Para la constante de crecimiento celular, se realizó una regresión utilizando los datos de la

tabla 3, donde X es la concentración de biomasa que cambia con respecto al tiempo y X0,

la concentración de biomasa en el tiempo 0, es decir, la concentración inicial.

Tabla 3. Datos para conocer la constante de crecimiento celular.

Tiempo (h)

𝑿

𝑿𝟎 Ln

𝑿

𝑿𝟎

0 1 0

2 1.3894081 2

3 1.722741433 3

10 11.21495327 10

11 12.46105919 11

13 14.01869159 13

25 17.75700935 25

26 17.85046729 26

Empleando una ecuación de la forma y=mx +b, donde la pendiente (m), está representada por µ:

𝑳𝒏𝑿

𝑿𝟎= 𝝁𝒕

Se calculó el rendimiento del producto respecto a la biomasa (Ypx), del producto respecto al sustrato (Yps) y de la biomasa respecto al sustrato (Yxs) en cada tiempo de la cinética, utilizando las siguientes fórmulas:

𝑌𝑝𝑥 =𝑃𝑓−𝑃0

𝑋𝑓−𝑋0 ; 𝑌𝑝𝑠 =

𝑃𝑓−𝑃0

𝑆𝑐𝑓−𝑆𝑐0; 𝑌𝑥𝑠 =

𝑋𝑓−𝑋0

𝑆𝑐𝑓−𝑆𝑐0

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7

Ln (

X/X

0)

Tiempo, h

Constante de crecimiento celular (µ)

µ=0.109𝟏

𝐡

Figura 10. Tiempo vs logaritmo natural de concentraciones de biomasa

Tabla 4. Rendimientos en cada tiempo.

Tiempo (h)

𝒀𝒑𝒙 𝒀𝒑𝒔 𝒀𝒙𝒔

0 0 0 0

2 2.74x10-10 0.488 1782.4

3 1.47x10-10 0.488 3308.1

10 1.14x10-11 0.535 43638.5

11 1.11x10-11 0.583 45878.5

13 1.13x10-11 0.678 46345.7

25 8.83x10-12 0.678 59653.9

26 9.21x10-12 0.7108 56829.1

Para determinar la tasa de generación de producto, se utilizaron los datos del rendimiento del producto respecto a la biomasa (Ypx) y el tiempo, haciendo una regresión utilizando una ecuación de la forma y=mx +b, donde la pendiente (m), está representada por qP:

𝒀𝑷𝑿 = 𝒒𝑷𝒕

𝑞𝑃 = −5.04 ∗ 10−12 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ ℎ

El signo negativo de la velocidad de crecimiento, indica la declinación de la generación de producto. Finalmente, en la figura 11 se muestra el comportamiento de la biomasa, producto y sustrato, con el paso del tiempo, respectivamente.

En la elaboración de la cerveza, el grano a utilizar debe ser rico en almidón y dextrinas, con lo cual

se produce el alcohol.

La cerveza se prepara a partir de un extracto seco a partir del malta que contiene una elevada cifra

de almidón, poca concentración de proteína y una buena y uniforme capacidad de germinación,

la malta generalmente va acompañada de otros cereales que no se maltean, como el trigo, arroz

y maíz, los cuales proporcionan hidratos de carbono, que a su vez se convertirán en azúcares

gracias a las levaduras que los someten a una hidrólisis. (Hernández, M. y Sastre, A., 1999)

Para llegar a la malta, la cebada debe de sufrir una maceración, esto con el fin de que la semilla

absorba agua generalmente hasta un 45%, este proceso tiene un tiempo de duración de entre 3 y

4 días a una temperatura de 10-15 °C. El agua debe de estarse cambiando, para separar las

sustancias amargas, algunas proteínas y evitar la formación de sabores extraños.

Una vez hidratada la semilla, se expone a una aireación para así favorecer la respiración.

Controlada la temperatura y con una humedad ambiental, se provoca la germinación del grano, lo

cual induce a la síntesis de enzimas, que van a ser producidas en el proceso de obtención de

azúcares, una vez alcanzado cierto desarrollo se detiene la germinación mediante los procesos de

secado y tostado. (Hernández, M. y Sastre, A., 1999)

El grano de cebada será más rico en almidón cuanto más finas sean sus cubiertas y sea menor su

contenido en proteína.

Figura 11. Comportamiento de biomasa, producto y sustrato, respecto al tiempo.

Una vez obtenida la malta, se procede a la producción del mosto, lo cual implica agregarle agua a

la malta y a los otros cereales que se molieron, esto con el fin de aumentar el pH; si nuestra

solución es rica en bicarbonatos conlleva con él la disminución de la actividad de las enzimas, esto

también implica que la cerveza se vuelva dulce al contener más dextrinas.

Ahora bien, si se cuenta con un alto porcentaje de sulfato cálcico entonces el pH tiende a

disminuir, se aumenta la actividad de las enzimas, lo cual provoca que las cervezas sean más

amargas y con un mayor grado de alcohol.

El amargor y aroma característico de la cerveza se obtiene a partir de una planta aromática que es

el lúpulo (Humus lupulus) la cual se le agrega en esta etapa de producción de cerveza, es decir al

mosto. (Hernández, M. y Sastre, A., 1999)

El lúpulo es una planta de la familia de las cannabáceas, contiene cantidades de taninos

(metabolitos que tienen olor característico, sabor amargo y astringente), destacables que

enriquecen a la cerveza para su conservación.

El lúpulo es el ingrediente que aporta el amargor, esto es debido a la lupulina que se encuentra

en la resina amarilla en los conos del lúpulo, asimismo el lúpulo modifica y enriquece el aroma de

la cerveza.

En esta parte del proceso es donde se inactivan las enzimas, se esteriliza el mosto, se extraen las

propiedades del lúpulo, se provoca la precipitación de las proteínas y hay una caramelización de

azúcares.

En la elaboración de esta cerveza se utilizaron los siguientes lúpulos: Chinook, Cascade y Nugget,

los cuales proporcionan el sabor amargo, picoso o cítrico, además de un aroma herbal,

respectivamente, motivos por los cuales se eligieron para la producción de la cerveza. Asimismo al

ser una planta de la familia de cannabis tiene efectos relajantes por lo tanto se recomienda para

dormir. (Castillo, F., 2012)

Una vez que se tiene el mosto que previamente se filtró, se inocula con el cultivo de S. Cerevisiae,

para que se lleve a cabo la fermentación, que depende del tipo de cerveza a producir, las cuales

pueden ser Lager, Ale, Porter, Bock, Stout, Weiss.

El tipo de fermentación utilizada en este tipo de cerveza es el “Ale”, la cual se caracteriza por

poseer un color pálido, obtenido a través de una fermentación alta; tiene un alto contenido en

alcohol y es fuerte en cuanto al sabor. Así el tiempo que dure dependerá directamente del tipo de

fermentaciones por lo que puede variar entre 7 y 10 días. (Hernández, M. y Sastre, A., 1999)

Cabe mencionar que el color pálido obtenido en la cerveza es debido también a que la malta no se

tostó, el tostado le brinda a la cerveza una coloración oscura y a ausencia de este procedimiento le

da el color pálido.

La clarificación y maduración de la cerveza incluye que se enfríe hasta alcanzar una temperatura

de 0°C y filtrarse, esto con el fin de precipitar proteínas, restos de levadura y otros compuestos,

además de ir liberando ésteres y otras sustancias aromáticas, es común que se le añada dióxido de

carbono para poder suplementar lo que ya se produjo con la fermentación. (Hernández, M. y

Sastre, A., 1999)

Tercer Departamental Se realizaron, aproximadamente, 5 litros de cerveza. De dicho volumen, se tomaron 800 mL para

realizar el inóculo, el cual se metió a incubar a 27°C durante 3 días con agitación constante y 1 día

a temperatura ambiente y en reposo, debido a que se apagó la incubadora con agitación (shaker).

En consecuencia al reposo que se tuvo, la levadura aislada desde el primer departamental

(Saccharomyces cerevisiae), comenzó a crecer en la superficie del medio, pero sin ninguna

contaminación. La inoculación realizada al caldo, se realizó en presencia de 3 mecheros de Bunsen

para mantener el área estéril, tomando una muestra de una colonia aislada en agar PDA con ayuda

de un asa bacteriológica y cerrando el matraz donde se encontraba el caldo, con un tapón de gasas

y algodón. Mientras que los 4.2 L restantes, se metieron al reactor de tanque agitado

(previamente lavado) y posteriormente, se metió a esterilizar por 15 minutos a 15 lb de presión,

en un autoclave.

Una vez estériles, se enfrió el caldo, con ayuda del intercambiador de calor integrado en el

sistema, hasta llegar a una temperatura de 27°C aproximadamente, esto para no dañar al inóculo

que se añadiría momentos después. En presencia de dos torundas de algodón encendidas y

utilizando un embudo de vidrio estéril, se añadió el inóculo al caldo presente en el reactor,

verificando que todas las posibles entradas y salidas, además de la toma de muestra, estuvieran

correctamente cerradas, o bien, cubiertas con algodón y/o aluminio. Se dejaron los 5 litros de

caldo fermentando en el biorreactor por alrededor de 5-6 días, a 220 rpm.

Posteriormente, se sacó el caldo del tanque, utilizando una bomba peristáltica estéril (figura 12) y

se introdujo la cerveza en un matraz Erlenmeyer de 5L, cerrándolo con un tapón de plástico con un

filtro, para dejar escapar el gas producido y evitar una presurización en el recipiente y evitando la

entrada de contaminantes.

Se tomaron 6 muestras, cuantificando la concentración de biomasa, grados Brix y el grado de

alcohol presente en la cerveza (tabla 5).

Para conocer la concentración de biomasa, se utilizó la siguiente fórmula:

#𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 ∗ 100001

𝑚𝐿

#𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 ∗ 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛= [

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝐿] ∗ (

1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = [

𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳]

Tabla 5. Resultados de concentración de producto, biomasa y sustrato.

No. De muestra

Tiempo (h) Biomasa

(𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳)

Sustrato (°Brix

leídos)

Sustrato (°Brix

reales)*

Sustrato real

consumido (°Brix, Sc)

Producto (%)

1 0 60000000 6.3 6.5026 0 0

2 26 400000000 6.0 6.202 0.3006 0.154

3 29 1000000000 5.9 6.1018 0.4008 0.199

4 33 800000000 5.8 6.0016 0.501 0.253

5 51 1400000000 5.7 5.9014 0.6012 0.3307

6 54 1600000000 5.8 6.0016 0.501 0.253

*Ajustes realizados de acuerdo a la temperatura a la que se analizó la muestra.

(Ver anexos de tercer departamental)

En la figura 13, se observa el comportamiento de biomasa, producto y sustrato, respecto al

tiempo.

Figura 12. Traspaso de caldo del biorreactor a matraz Erlenmeyer usando bomba peristáltica.

Tomando como referencia las observaciones hechas al producto elaborado en el departamental

anterior, y como se muestra en la metodología, se realizaron cambios para la mejora de nuestra

cerveza. Nuevamente, se realizaron pruebas organolépticas para examinar la cerveza (tabla 6).

Tabla 6. Resultados de las pruebas organolépticas realizadas a la cerveza.

Prueba realizada Cerveza producida en

biorreactor

Olor Olor característico a cerveza

Color Café oscuro

Sabor Malta tostada, amargo

agradable

Figura 13. Comportamiento de biomasa, producto y sustrato, respecto al tiempo.

Debido a que solo se centrifugó una sola vez para clarificar por falta de tiempo, el producto final

presentó una coloración oscura y un poco turbia (figura 14). Una vez colocado el mismo volumen

de cerveza clarificada, en cada una de las botellas limpias y estériles, se cerraron con un tapón de

corcho y parafilm, para mantener un cierre hermético. Se introdujeron las botellas a una gaveta

oscura, para que se produjera dióxido de carbono (CO2) y la luz no alterara la composición de la

cerveza. En la tabla 7, se muestra una comparación entre las cervezas producidas el

departamental pasado y la producida recientemente.

Tabla 7. Comparación entre las cervezas elaboradas.

Segundo departamental Tercer departamental

Cerveza producida en biorreactor

Cerveza producida de forma artesanal

Cerveza producida en biorreactor

Olor herbal (lúpulos) Olor herbal (lúpulos) Olor característico a cerveza

Color café amarillento oscuro Color amarillo Color café oscuro

Sabor amargo agradable Sabor amargo, un poco diluido Sabor a malta tostada,

amargo, agradable

Figura 14. Cerveza clarificada y envasada.

Los factores a considerar en la producción de cerveza son el agua, la malta y el lúpulo (Pilla et al,

2013) En este caso para nuestra cerveza se tomó a consideración el tipo de lúpulo a utilizar, ya que

en el parcial pasado, se utilizaron 3 lúpulos, lo que sobresaturo el sabor a lúpulo, ahora se utilizó

solamente el lúpulo de mayor concentración y el de menor concentración, dando como resultado

un sabor agradable.

La cerveza dark ale tiene una espuma muy cremosa y fina, es de color café castaño, la

concentración de alcohol generado no sobrepasa el 5%, tiene un sabor agridulce y persistente

(Pilla et al, 2013). Después del envasado de la cerveza se produjo una capa muy fina de espuma y

un color café oscuro, al realizar el cálculo para la concentración de alcohol se determinó que el

porcentaje resultante fue de 3 - 4 % y al momento de la exposición, muchos de los voluntarios

notificaban que si sabía a “cerveza” y que era muy fuerte.

En la cerveza obtenida no era apreciable desprendimiento del gas disuelto en la misma, no se

observaba la liberación de gas que provocase burbujeo en la cerveza. Esta característica algunos

sitios de referencia la asocian a las cervezas pale ale y no a dark ale.

En el caso de la persistencia de la espuma en el vaso, era muy poca, al momento de su vaciado en

otro envase no se apreciaba una formación de espuma considerable, siendo esta de color

blanquecina pálida, tornándose a color café, como se mencionó anteriormente. En algunas

metodologías de cata de cervezas mencionan que una menor persistencia de la espuma indica que

se tiene una mayor concentración de alcohol.

Figura 15. Cervezas elaboradas. (Lado izquierdo: cerveza producida en biorreactor Lambda durante el segundo

departamental. Lado derecho: cerveza producida en biorreactor de tanque agitado durante el tercer

departamental.

Se aprecia un aroma caramelizado de la cerveza, esto se debe a la malta, que al ser tostada, como

es en el caso de nuestra cerveza, adopta matices de aroma más dulces. (Fermur et al, 2013)

En cuanto a cuerpo de la cerveza era alto, ya que al ser ingerida se percibía una viscosidad que

perduraba en la boca después de ser ingerida, sensación muy diferente al de la de beber agua,

dicha sensación provocada por una cerveza habla de que tiene poco cuerpo. La viscosidad

mencionada anteriormente se debe a la presencia de los componentes residuales en la cerveza,

los cuales pueden ser proteínas y azúcares. (Fermur et al, 2013)

Conclusión

Primer Departamental Se logró obtener e identificar la levadura deseada (Saccharomyces cerevisiae) en el medio de

cultivo propuesto (PDA), mediante la observación de morfología colonial y celular, además de

analizar su capacidad de fermentar azúcares e hidrolizar almidón mediante la realización de

pruebas bioquímicas.

Segundo Departamental El sabor obtenido en las dos cervezas producidas, se vio afectado por el tiempo de reposo, ya que

se recomienda dejarlo, por lo menos 7 días para tener una producción de alcohol idónea y un

sabor agradable, además de que, las condiciones en las que se lleve a cabo el procedimiento,

deben ser lo más estériles posibles.

Tercer Departamental Con la modificación del proceso, se obtuvo un mejor sabor para la cerveza, dado que al tostar la

malta se libera una porción mayor de almidón que es lo que toma como fuente de energía. La

levadura y el proceso se realizó bajo circunstancias estériles lo cual mostró mejores resultados

que la vez anterior, posiblemente la producción se perfeccionaría si se dejara más tiempo

fermentando, pero debido al poco tiempo con el que se disponía del biorreactor sólo se pudo

dejar por un corto periodo de tiempo en este dispositivo, y pasando un periodo de tiempo extra

en reposo en un matraz Erlenmeyer, el mosto inoculado no se encontraba homogéneo

provocando que se redujera la fermentación de los azúcares presentes en alcohol. Otra cuestión a

considerar es la gasificación, la cual no se pudo llevar a cabo por medio de suministrarle CO2, si no

que se optó por dejar las cerveza ya embotellada a temperatura ambiente, con la biomasa

resultante siguió habiendo proceso de fermentación el cual produjo gases, presurizado las botellas

siendo apreciable al momento de destapar las botellas.

Anexos

Primer Departamental Cálculos realizados para los distintos medios de cultivo utilizados en este departamental.

Agar Papa Dextrosa (PDA)

Agar necesario para preparar 1 litro:

Agar Papa Dextrosa……………..39g

Cálculos correspondientes:

PDA

39 g [0.1𝐿

1 𝐿]=0.39g para 100mL de

agar PDA.

Medio de cultivo rojo de fenol

Ingredientes para 1 litro

Caldo base Rojo de Fenol:

Peptona proteosa …………………10g

Extracto de carne…………………..1g

Cloruro de sodio……………………5g

Rojo de fenol………………………..0.018g

Carbohidrato deseado………...5g

*el carbohidrato añadido fue dextrosa

Cálculos correspondientes:

Peptona proteosa

Adecuación para 40 mL

Caldo base Rojo de Fenol:

Peptona proteosa …………………0.4g

Extracto de carne…………………..0.04g

Cloruro de sodio……………………0.2 g

Rojo de fenol………………………..0.0072g

Carbohidrato deseado………...0.2 g

10 g [.04 𝑙

1 𝑙]=0.4 g

Cloruro de sodio

5 g [.04 𝑙

1 𝑙]=0.2 g

Rojo de fenol

.018 g [.04 𝑙

1 𝑙]=0.072 g

Carbohidrato

5 g [.04 𝑙

1 𝑙]=0.2 g

Medio de cultivo agar almidón

Ingredientes para 1 litro

Caldo base Rojo de Fenol:

Extracto de carne…………………..3 g

Almidón soluble……………………10 g

Agar…...............……………………..12 g

Cálculos correspondientes

Extracto de carne

3 g [.05 𝐿

1 𝐿]=0.15 g

Almidón soluble

10 g [.05 𝐿

1 𝐿]=0.5 g

Agar

12 g [.05𝐿

1 𝐿]=0.6 g

Adecuación para 50 mL

Agar almidón:

Extracto de carne…………………0.15 g

Almidón soluble………...…………..0.5 g

Agar…………........................………0.6 g

Agar TSI

Agar necesario para 1 litro:

Agar TSI……… 54.9g

Cálculos correspondientes:

TSI

54.9 g [0.04𝐿

1 𝐿]=2.196g para 40mL de agar TSI

Segundo Departamental Cálculo de concentración de biomasa para cada muestra, usando la fórmula:

#𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 ∗ 100001

𝑚𝐿

#𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 ∗ 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛= [

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝐿] ∗ (

1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = [

𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳]

Muestra 1.

321 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

10

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 6420000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 2.

446 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

10

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 8920000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 3.

553 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

10

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 11060000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 4.

360 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 72000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 5.

400 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 80000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 6.

450 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 90000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 7.

570 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 1140000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 8.

573 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 1146000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Tercer Departamental Cálculo de concentración de biomasa para cada muestra, usando la fórmula:

#𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 ∗ 100001

𝑚𝐿

#𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠 ∗ 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛= [

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝐿] ∗ (

1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = [

𝒄é𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔

𝑳]

Muestra 1.

3 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

10

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 60000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 2.

20 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

10

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 400000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 3.

5 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 1000000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 4.

4 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 800000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 5.

7 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 1400000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Muestra 6.

8 ∗ 100001

𝑚𝐿

5 ∗1

100

∗ (1000 𝑚𝐿

1 𝐿) = 1600000000

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝐿

Referencias

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Edición. Editorial CRC. Forbes, Betty A. (2009). Diagnóstico Microbiológico. Editorial Médica Panamericana.

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Extraído de la página en línea http://www.cervezacasera.com.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=17&Itemid=42, escrito el día viernes 20 de febrero de 2009 y revisado por última vez el día 28 de septiembre de 2014.

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Tablas obtenidas de documento en línea en

http://www.ictsl.net/downloads/refractometros.pdf, revisado por última vez el día 17 de

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Sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores. Capitulo 7.

Escrito por S. Pilla,G. Vinci 2013 “Cervezas de Todo el Mundo” Barcelona, España.

Fermun D., Castells E., Español N., García M. 2013. Guía para descubrir las mejores

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G. Vásquez Morgan. 2010. Diseño del sistema de control para un biorreactor de tanque

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Tablas obtenidas de documento en línea en

http://www.ictsl.net/downloads/refractometros.pdf, revisado por última vez el día 22 de

noviembre de 2014.