replicación del adn

Blgo. Carlos A. Fernández [email protected]

Setiembre, 2007

mailto:[email protected]

Blgo. Carlos A. Fernández M.

Requisitos del material genético

• Ubicarse en el núcleo

• Control de las enzimas

• Capacidad de autorreplicación


DNA RNA Proteína

Dogma central de la biología molecular

Transcrip

ción

Traducción


Replicación del DNA

• En su artículo de 1953 Watson y Crick sugirieron que la replicación de la hélice podría tener lugar por desenrrollamiento.

• Una cadena actuaría como molde (Template) para la síntesis de la nueva cadena.


Replicación del DNA

Complementariedad


Posibilidades de replicación

Replicación conservativa

Replicación dispersiva

Replicación semiconservativa


El experimento de Meselson y Stahl


Gradiente de Cloruro de Cesio (CsCl)

Principio de la Centrifugación en Equilibrio

Centrifugación



El DNA es sintetizado por polimerasas

• Las polimerasas necesitan de un molde, La reacción de polimerización se realiza siguiendo las reglas de complementariedad establecidos por Watson y Crick.

• Es necesario un cebador (RNA, DNA o en casos especiales una proteína), que proporcione un extremo 3’ OH-


Las DNA polimerasas necesitan de un cebador (iniciador, primer) para actuar


Biosíntesis del DNA: Polimerización

• La reacción consta de un ataque nucleofílico del grupo 3’ hidroxilo del nucleótido en el extremo 3’ de la cadena en crecimiento sobre el fósforo 5’ – trifosfato del desoxinucleótido entrante, liberándose pirofosfato inorgánico.


Polimerización

(dNMP)n+ dNTP (dNMP)n+1+ PPi


Biosíntesis del DNALa síntesis del DNA transcurre en dirección 5’ 3’

El extremo 3’ OH- libre se convierte en el punto de elongación de la cadena

La cadena se sintetiza de manera discontinua mediante los Fragmentos de Okazaki.



• Precisión de la replicación

En E. coli ocurre un error cada 109 o 1010 nucleótidos incorporados, esto es 1 nucleótido cada 1 000 000 000



• Precisión de la replicación

La precisión en la incorporación de nucleótidos se basa en:

• Direccionalidad de los enlaces puentes de hidrógeno.

• Geometría del sitio activo de la Polimerasa


Apareamientos correctos


Apareamientos incorrectos



• Actividad exonucleasa

•Cuando un nucleótido incorrecto es incorporado la DNA polimerasa retrocede, corta el nucleótido (actividad 3’ 5’), incorpora el nucleótido correcto y continúa su actividad.


Errores en la incorporación


Corrección de errores

Actividad exonucleasa


Actividad exonucleasa

Corrección de errores


Actividad exonucleásica



• En E. coli existen alrededor de 5 DNA polimerasas.

• John Cairns aisló una cepa bacteriana con el gen de la DNA polimerasa I alterado, el cual producía una enzima inactiva. Increíblemente las bacterias eran viables.


La DNA Polimerasa I de E. coli

•Posee actividad polimerasa 5‘- 3’

•Exonucleasa 3’ – 5’

•Exonucleasa 5‘- 3’ (Eliminación de primers)


Exo 5-´3´

Fragmento Klenow Pol Exo 3-´5´

Pol Exo 3-´5´DNA pol I




Fragmento Klenow


La DNA Polimerasa III de E. coli


Replicación en procariotas: E. coli

Etapas

Iniciación

Terminación

Elongación



• Sistema DNA replicasa ó REPLISOMA



OriC



Alrededor de 20 moléculas de proteína

DnaA, cada una con un ATP ligado se unen a una de las 4 repeticiones de 9

pb


Luego, las tres secuencias de 13 pb se desnaturalizan de manera

secuencial




Hexámeros de proteína DnaB se unen a cada hebra con ayuda de

la proteína DnaC

La actividad helicasa de la prot. DnaB ayuda a desenrollar aún

más la hélice



Modo de actuar de la helicasa



SSB Single Stranded Binding protein

•Impide la renaturalización

•Brinda protección

•Inespecífica

•Cooperativa


Single Stranded Binding protein


La replicación es bidireccional



La Dna Primasa (DnaG) sintetiza el cebador

(primer)



Dna Helicasa (DnaB)

Dna primasa (DnaG)

Primosoma+ =


Mecanismo de acción de la DNA ligasa


Problemas topológicos de la replicación


Acción de la DNA girasa


Terminación de la replicación: E. coli

Proteínas Tus


Terminación de la replicación: E. coli


•Replicación circular (Modo θ) E. coli

•Lazo D (D-loop) Mitocondrias, cloroplastos

•Círculo rodante (Modo σ) Plásmidos, fagos

Modelos de Replicación en Procariotas:


Replicación circular (Modo θ)

Es el modelo propuesto para la replicación del cromosoma circular de E. coli


Autoradiografía

Intermediario tetha (θ)


Lazo D (D-loop)

•Es el modelo propuesto para la replicación del DNA de mitocondrias y cloroplastos.

Se debe a que en estos DNAs circulares el origen de replicación está en puntos distintos en cada cadena parental.


Lazo D (D-loop)


Círculo rodante (Modo σ)

•Es el modelo propuesto para la replicación del DNA del plásmido Hfr de E.coli durante la conjugación.

•Este método también es usado por fagos que llenan sus cubiertas proteicas con DNA lineal que se replica a a partir de un DNA circular.



Para iniciar la replicación no es necesaria la

presencia de primers



Luego una Nucleasa separa las cadenas y una Ligasa llena las mellas


Replicación del fago filamentoso M13 (ADN1C )

Genoma (DNA 1c) del fago que ha infectado la bacteria

Forma replicativa (DNA 2c)

Con las enzimas del hospedero



Genoma (ADN1C) del fago que ha infectado la bacteria

Replicación bidireccional

desde Ori



El Gen II corta la cadena

Replicación por el círculo

rodante



El Gen II completa y corta la cadena

Replicación por el círculo

rodante

Circularización de la cadena (+) completa

Empaquetamiento


ENZIMA FUNCIÓN

ADN Pol α Síntesis Hélice retardada. Síntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.

ADN Pol δ Síntesis de la Hélice conductora.

ADN Pol ε Polimerización de las Piezas de Okazaki.

ADN Pol β Unión de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente 250 pb).

ADN Pol γ Síntesis ADN mitocondrial.

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