Replicación del ADN en Procariotas 3.2.1

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA.FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS.BIOLOGIA MOLECULAR.

JOSE ALFREDO SOTO ALONSO 212679

INDICEMecanismos generalPropiedadesReplicacion en procariotasMecanismoMaquinaria enzimaticaInicio, enlongacion, replisoma y

terminacionMecanismos de reparacionReplicacion de ADN in vitro

Es el proceso en la cuál una molécula de ADN de doble hélice da lugar a otras dos moléculas de ADN con la misma secuencia de bases

La división celular requiere de la duplicación del material genético

mitosis

mitosis

meiosis

Mecanismo general

La misma estructura del ADN sugirió un mecanismo de replicación de la información◦Cada hebra sirve como

molde para replicar la complementaria

PropiedadesLa Replicación ocurre sólo una vez en cada ciclo celular y resulta esencial en la

duplicación de las cromátidas de los cromosomas.

Semiconservativa: cada nueva molécula esta formada por una hebra parental y una recién sintetizada◦ Experimentos de Meselson y Stahl

Se utilizaron bacterias de Escherichia coli cultivadas en medio con isótopos de N (N15 y N14).

Se purificó ADN utilizando una gradiente de densidad (CsCl)

Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio denominado origen de replicación

A cada lado de la burbuja de replicación se forma una horquilla de replicación

Dirección de la síntesis: 5’ 3’

Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser sintetizada de continuo◦ Consecuencia de la direccionalidad

Replicación en procariotas

Mecanismo Inicio

◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.◦ Separación de hebras. ◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

Elongación ◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua,

coordinada.

Terminación ◦ Reconocimiento de señales de terminación.◦ Desensamble de replisomas.

ADN polimerasas:◦ Pol I◦ Pol II◦ Pol III (replicasa)◦ Pol IV y V

Necesitan 3’ OH libre

DNA POLIMERASA II

Con actividad exonucleasa 3’5’ está involucrada en procesos de reparación de DNA frente a un daño térmico o por radiación.

DNA POLIMERASA III

Esta es la enzima que realiza el proceso replicativo, su función es la síntesis de DNA. También cuenta con actividad revisora, 3’5’ exonucleasa.

Maquinaria enzimáticaADN polimerasas: Síntesis de

ADNPrimasas: Generación 3’OH libresLigasas: Unión los fragmentos de

OkazakiHelicasas: Separación de hebrasTopoisomerasas: Mantenimiento

del grado de superenrollamientoSSBs: Mantenimiento de simples

hebras

InicioReconocimiento del

origen y apertura de las hebras

Elongación

Primasa: ◦ Sintetiza fragmentos

de ARN (cebadores) que provean los 3’ OH libres

◦ Puede comenzar sin necesidad de cebador

Replisoma

Terminación

Mecanismos de reparaciónLas propias replicasas son capaces

de reparar sus errores durante la elongación:◦actividad correctora de prueba

(proofreading)◦Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’

Mecanismos de reparación

Replicación de ADN in-vitro: PCR Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés Algunas aplicaciones:

◦ Clonado acelular de moléculas de ADN◦ Detección de secuencias sin purificación previa◦ Análisis de expresión génica◦ Secuenciación de ácidos nucleicos◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular◦ Aplicaciones en medicina:

Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas) Tipado de tejidos para transplantes Detección de células tumorales Estudios de asociación genotipo-fenotipo

◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos) Identificación individual Tests de paternidad

◦ Filogenia◦ Análisis de genética poblacional

Reacción de replicación in-vitro:

MoldeADN polimerasa: Taq polimerasa

(termoestable)Cebadores:

◦ 3’ OH libre◦ Definen la región a amplificar

dNTPs (A, C, G, T)Condiciones para el funcionamiento de la

enzima:◦ Buffer◦ Mg++ (cofactor de la enzima)

ProcedimientoDesnaturalización

del ADN (94ºC)Agregado e

hibridación de los cebadores (50ºC-65ºC dependiendo de los cebadores)

Elongación (72ºC)

Repetición de estas etapas (25-35 ciclos)

Luego de terminados los ciclos se obtienen millones de moléculas de la región blanco

La hace una técnica extremadamente sensible◦Ventaja: se puede amplificar ADN

partiendo de muy poco material◦Desventaja: Contaminaciones

Variantes del métodort- PCR:

◦Se usa una transcriptasa reversa para pasar una muestra de ARN a ADN obteniendose ADN copia (ADNc)

◦Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de interés

◦Estudios de expresión génica◦Clonado de genes eucariotas

(eliminación de intrones)

PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):◦Se diferencia en que en cada ciclo de

amplificación se cuantifica la cantidad de ADN obtenida

◦Permite inferir la cantidad de moléculas de molde que existía originalmente en la muestra: Cuantificación de la expresión génica Cuantificación de microorganismos

Secuenciación de ADNMétodo de Sanger (nobel en 1980)Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs)

para terminar una reacción de síntesis de ADN in-vitro

Realizando 4 reacciones independientes (una para cada base) se puede inferir la secuencia original

Secuenciación automáticaSigue el mismo principioA diferencia del método anterior cada

ddNTP se marca con una molecula fluorescente diferente

Esto permite realizar una unica reaccion en la cual estan presentes los 4 ddNTPs marcados

Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis capilar

La detección se realiza en un punto fijo al final de la corrida

Secuenciación de genomas

Cada reacción de secuencia es capaz de leer unas 500 pb

Como se obtuvo la secuencia continua del conjunto de los cromosomas humanos?

Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb (genoma completo 109)

Construcción de biblioteca de ADN genómico fragmentado al azar

Lectura de secuencias individualesLas secuencias individuales son solapadas

y ensambladas (contigs)Para asegurarse de que todas las

secuencias estén representadas se leen unas 10 veces la cantidad de bases del genoma

La velocidad de producción de las secuencias ha ido en.

Recaumentoientemente se dio un salto en este sentido con el desarrollo de los secuenciadores de “próxima generación”

No usan terminación de cadenaSe coloca una base cada vez y se detecta

cual fue incorporada a cada molécula que se esta secuenciando

Producen en una única reacción de secuencia millones de lecturas de fragmentos diferentes (paralelización)

108 1010 bases por corrida (menos de 1 día)

De esta forma se secuencio el genoma entero de Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo

CONCLUSION• La capacidad de las células de mantener un elevado

grado de orden dentro de un universo caótico, depende de la información genética que se expresa, se mantiene y a veces mejora, mediante los procesos genéticos básicos la síntesis de proteínas y del RNA, la reparaci6n de l DNA, la replicaci6n del DNA y la recombinaci6n genética.• En estos procesos, que producen y mantienen las proteínas y los ácidos nucleicos de una célula la información de una secuencia lineal de nucleótidos se utiliza para especificar otra cadena lineal de nucleótidos (una molécula de DNA o de RNA) o una cadena lineal de aminoácidos (una molécula proteica).

BIBLIOGRAFIA Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. Fundamentos de

Bioquímica. 2º edición. Buenos Aires: Médica Panamericana.

Thomas M. Devlin, Ph. D. Bioquímica. 4º edición. Editorial Reverté, S.A.

M. Zafri Humayun. Department of Microbiology and Molecular Genetics, UMDNF_ New Jersey Medical School, 185 South Orange Avenue, Newark, NJ 07103-2714, USA. Molecular Microbiology (1998)30(5), 905-910.

http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0714105-180036//mjr3de9.pdf

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm

http://www2.uah.es/biomolq/BM/Esquemas/Tema4.htm

http://www.pakosimarro.com/paraimprimir/diversidad/ampliacionbio2bto/unidad17