registro de proyectos protocolo de investigaciÓn 2013 (cr

Arcos de Belén Núm. 79, PH, Col. Centro, Del. Cuauhtémoc, C.P. 06010, México, D.F.,

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Subsecretaría de Educación Superior Dirección General de Educación Superior Tecnológica

Coordinación Sectorial Académica Dirección de Estudios de Posgrado e Investigación

Registro de Proyectos

2013 PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN (CR-02-2013)

Institución

Instituto Tecnológico Superior de Irapuato

Título del proyecto

Ectomicorrizas asociadas a encinos en el Área Natural Protegida “Cerro del Cubilete”

DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO

1.1 Resumen

Describa de manera general la problemática que abordará en su proyecto de investigación, cómo la pretende

resolver y sus posibles resultados, (máximo una cuartilla).

Este proyecto es una propuesta que busca contribuir al uso y Manejo de la diversidad biológica, enfocado

principalmente al conocimiento de la diversidad microbiana asociada a bosque de encino-pino y al entendimiento de su

interacción con el hábitat. Otro enfoque de interés es la bioprospección de sustancias bioactivas de interés Biológico con

especial referencia en el área agroindustrial. No obstante, la importancia tan amplia que representan los

microorganismos para los diferentes procesos biológicos en la naturaleza, se encontró que la información relacionada

con la caracterización o identificación de microorganismos en los suelos del Estado de Guanajuato es escasa.

Con estos antecedentes se plantea un proyecto enfocado al estudio de la diversidad microbiana integrando técnicas

de estudio de la microbiología más tradicional, junto con metodologías moleculares basadas en la amplificación de la

región Interespaciadora (ITS) del DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores

específicos para cada grupo, a fin de obtener una perspectiva más realista de la diversidad microbiana que sin duda

contribuirá a un mejor conocimiento del funcionamiento de las comunidades del bosque de encino-pino en el Área

Natural Protegida del Cerro del Cubilete.

Introducción (Máximo tres cuartillas)

En un sistema forestal estable donde el suelo es protegido de la erosión por la vegetación la erosión es

relativamente baja, siendo de unos 0.004-0.05 t/ha/año (Lal., 1994). Grandes extensiones de bosques deben ser

preservadas y nunca sustituidas por pastizales o tierras de cultivos por esta razón. Y porque su incidencia en el

régimen de lluvias es determinante también para la conservación del medio ambiente, debido a que el agua es el

factor limitante primordial que define la productividad de los ecosistemas. Un ecosistema forestal con una

temperatura y humedad apropiada así cómo abundante materia orgánica sustenta miles de especies vivas por metro

cuadrado incluyendo artrópodos, nematodos y protistas. La microflora del suelo, bacterias y hongos, pueden llegar

a existir en una cantidad 4 veces mayor. La importancia de la microflora radica en que ella mejora las

características del suelo, tanto en calidad como en materia de productividad. La biosprospección es una tarea

estratégica que permite conocer y caracterizar la biodiversidad de los diferentes ecosistemas y encontrar nuevas

fuentes de recursos naturales para el desarrollo de productos y procesos que contribuyan a la optimización de

actividades de interés social y económico. El estudio de la microflora es una herramienta fundamental para

encontrar nuevos aislados capaces de poseer actividades biológicas de interés ya sean de carácter enzimático o a

través de la síntesis de ciertos metabolitos. También nos permite hacer una valoración del estado de los suelos y

como son afectados a medida que el impacto erosivo aumente o cómo se va recuperando el mismo a medida que

medidas de se tomen acciones e implementes medidas que ayuden a restaurar un ecosistema.

Antecedentes

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2013 Refiera los antecedentes y avances científicos y/o tecnológicos que soportan la investigación a desarrollar (máximo

tres cuartillas)

Ubicación del tema propuesto

México es ampliamente conocido en el mundo como país Mega-diverso, aunque su alta diversidad biológica suele

asociarse de manera importante con las selvas tropicales, los ecosistemas de regiones templadas también

contribuyen significativamente en la conformación de la diversidad biológica del país. Dentro de esta diversidad

biológica, un papel fundamental se encuentra en nuestros suelos; en ellos habitan organismos microscópicos como

bacterias y hongos de importancia vital en el sostenimiento de los ecosistemas, contribuyen a la formación del suelo

y participan en la degradación de la materia orgánica y en los ciclos de elementos como el carbono, nitrógeno,

oxígeno, azufre, entre otros (Sly, 1995). A pesar del papel esencial que juegan los microorganismos en el

mantenimiento de la biosfera, es el grupo menos conocido, se estima que Los microorganismos constituyen las dos

terceras partes de la diversidad biológica de la Tierra.

Problemática

El suelo es un sistema complejo en equilibrio dinámico, en el que los seres vivos que habitan en él tienen un papel

esencial en el sostenimiento de la fertilidad. Este ecosistema edáfico es el hábitat de un gran número de especies

microbianas, tanto eucariotas (hongos, algas, protozoos, ácaros e insectos entre otros) como procariotas (bacterias y

arqueas) que establecen relaciones intra e interespecíficas que contribuyen a las características propias del suelo

(Nogales, B. 2005).

Debido a las prácticas agrícolas inapropiadas, las tierras agrícolas alrededor del mundo han estado sujetas a

procesos degradadores, tales como la erosión del suelo por viento y agua, el agotamiento de nutrientes, y la pérdida

de materia orgánica; todo esto ha contribuido en un serio deterioro de la productividad del suelo y es sabido que

cuando un suelo se altera físicamente, el potencial microbiano se reduce (Parr et al: 2006).

Por otro lado, la posibilidad de encontrar nuevos compuestos a partir de microrganismos es baja, debido a que una

gran parte de lo microrganismos del suelo no son cultivables en condiciones de laboratorio (Rolf. D, 2004).

Área Natural Protegida del Cerro del Cubilete

El Área Natural Protegida Cerro del Cubilete es la segunda elevación montañosa de la región, con una altura de

2,580 msnm, cuenta con una extensión de 3,611.79 hectáreas y se localiza en la región Centro-Oeste del estado, al

noreste de la ciudad de Silao. Sin embargo, esta área presenta problemas de alto grado de erosión, como

consecuencia de la agricultura extensiva y sobrepastoreo que se han realizado en zonas de vocación forestal y vida

silvestre; existe un déficit aproximado de 64.3 millones de m3/año en el acuífero Silao-Romita, y el balance entre

evapotranspiración y precipitación es negativa; el bosque de encino, la flora y la fauna se han visto amenazados en

cuanto a su distribución y abundancia; también, como consecuencia del uso inapropiado del suelo y el alto turismo

religioso, hay más zonas deforestadas y contaminadas, (IEE, 2006).

Marco teórico

Fundamento teórico que respalda el trabajo de investigación (máximo 5 cuartillas).

Función ecológica de los bosques

Los bosques son el hábitat de un gran número de seres vivos, además éstos cumplen importantes funciones

ecológicas, entre las que están (Echarri, 1998):

• Regulación del agua.- Las masas forestales retienen el agua de lluvia. Así facilitan que se infiltre al subsuelo y

se recarguen los acuíferos. Asimismo, los bosques disminuyen la erosión al reducir la velocidad del agua y sujetar

la tierra, rebajan el riesgo de inundaciones, tanto por la retención de agua que hacen como al impedir el arrastre de

sedimentos que aumentan el volumen de las avenidas de agua y las hacen más peligrosas.

• Influencia en el clima.- En las zonas continentales más del 50% de la humedad del aire está ocasionada por el

agua bombeada por las raíces y transpirada por las hojas de la vegetación. Cuando se talan los bosques o selvas de

áreas extensas el clima se hace más seco.

• Absorben dióxido de carbono (CO2) de la atmósfera.- En el proceso de fotosíntesis, los árboles

como todas las plantas, toman CO2 de la atmósfera y devuelven O2. En el momento actual esta función





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2013 tiene especial interés porque colabora a frenar los efectos negativos del exceso de emisiones de CO2 de origen

humano que están provocando el efecto invernadero. Se suele decir que los bosques son sumideros de dióxido de

carbono o, también, los "pulmones" de la Tierra, por el papel que cumplen en el ciclo del carbono.

• Reservas de gran número de especies.- Los bosques naturales ofrecen multitud de distintos hábitats, por lo que

en ellos se puede encontrar una gran variedad de especies de todo tipo de seres vivos. Por eso se dice que los

bosques son las principales reservas de biodiversidad y como veremos, tiene mucho interés, desde muy diversos

puntos de vista, conservar la máxima biodiversidad en nuestro planeta.

• Acción depuradora.- Distintos contaminantes de la atmósfera y el agua del planeta son retenidos y filtrados por

los seres vivos del bosque.

• Áreas de recreación y esparcimiento.- Considerando también como contaminación el ruido y la agitación que

generamos en nuestra vida diaria, los bosques son también fuente de paz para el espíritu humano y lugar de reposo

para muchas personas

El Área Natural Protegida “Cerro del Cubilete”

El Área Natural Protegida “Cerro del cubilete” se localiza en la región Centro-Oeste del Estado, comprende una

superficie de 3611-79-76 ha y un rango de altitud que varía entre los 1900 y 2580 m.s.n.m.

El área contiene diversas elevaciones montañosas así como cañadas y barrancas, sobresaliendo el paisaje

fisiográfico de la región. Los suelos dominantes son de tipo pheozem lúvico, de textura fina y topografía

montañosa con pendientes de más de 20o. El clima es tamplado subhúmedo, conlluvias en verano y estación seca

en invierno, con temperatura media anuel entre 16 y 18oC.

El ANP “Cerro del Cubilete” es muy importante hidrológicamente ya que es el acuífero más importante de la zona

Silao-Romita, además forma parte de la Cuenca Río Lerma-Salamanca y subcuenca del Río Guanajuato.

Aspectos biológicos.

La vegetación predominante del lugar es principalmente matorral subtropical, pequeños remanentes de bosque

templado latifoliado, con diversos grados de alteración debido al cambio de uso de suelo para actividades agrícolas,

sobrepastoreo y extracción de leña entre otras.

Las especies arbóreas presentes en el ANP Cerro del Cubilete son en su mayoría encino Quercus rugosa, Quercus

mexicana y Quercus laurina. Otras especies son la Acacia pennatula y el varaduz Erysenhardtia polystachya, así

como 17 especies arbustivas y más de 25 especies herbáceas.

La fauna está compuesta por más de 12 especies de mamíferos entre los que destacan la zorra , el tejón y el venado

cola blanca, así como alunas serpientes como el alicante catalogado como especie amenazada de acuerdo con la

NOM-059-SEMARNAT-2001.

Aspecto ambiental

El uso excesivo de los recursos del área con actividades como agricultura extensiva, sobrepastoreo y extracción de

leña, además de la contaminación por residuos diversos ha reducido dramáticamente el área de bosque templado,

dejando a su paso matorrales y pastizales y zonas desprovistas de vegetación. Estos aspectos influyen

negativamente en la captación de agua, por lo que existe un déficit aproximado de 64.3 millones de m3/año en el

acuífero Silao-Romita, agravándose la pérdida de agua por efecto de evapotranspiración, disminución de lluvias y

erosión.





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2013 El bosque de encino, la flora y la fauna, se han visto amenazadas en cuanto a su distribución y abundancia, como

consecuencia de uso inadecuado del suelo y excesiva desforestación. El manejo inadecuado de los residuos que se

generan contribuye también al deterioro ambiental, ya que se disponen de manera desordenada en el lugar.

En el plan de gobierno 2000-2006 se plantearon ocho subprogramas, cada uno con acciones específicas a realizarse

en en corto, mediano y largo plazo para garantizar el respeto y uso racional de los recursos naturales en los

procesos de desarrollo económico y social del Estado, reafirmándose así el compromiso de aprovechar, conservar y

regenerar los recursos naturales del Estado de Guanajuato.

Así los subprogramas creados fueron:

1. Protección y aprovechamiento de los recursos naturales, la flora y fauna.

2. Restauración ecológica.

3. Educación ambiental.

4. Recreación y ecoturismo.

5. Investigación y monitoreo ambiental.

6. Desarrollo integral de las comunidades rurales.

7. Diversificación productiva.

8. Inspección y vigilancia.

A pesar de que las acciones fueron parte del esquema de gobierno, la intención por diversos aspectos no se traduce

necesariamente en acciones reales, por lo que es necesario que otros actores participen y generen estrategias que

posteriormente se puedan incorporar en los planes de manejo, y que se conviertan en acciones reales.

Revisión de literatura

En el ANP del Cerro del Cubilete se sabe que han desarrollado algunos trabajos de investigación, pero en una

búsqueda realizada no se encontró ningún trabajo de investigación que haya generado una publicación en alguna

revista de corte científico, menos aun que se halla derivado producto de investigaciones algún producto, bien o

servicio benéfico y ecológico. En este sentido, la información de que se dispone proviene casi exclusivamente del

Programa de Manejo del Área Natural Protegida “Cerro del Cubilete” por lo que es prioritario que apegado a los

subprogramas se atiendan las acciones correspondientes que de cada una emanen para conocimiento de lo que

actualmente hay y del estado en que se encuentra. En el libro sobre la Biosiversidad del Estado de Guanauato,

también se menciona el ANP Cerro del Cubilete como parte de la geografía y biodiversidad del Estado, pero sin

que se aborde información precisa de la biodiversidad local.

En algún medio escrito de comunicación estatal como el periódico El Heraldo, Vecinos y ejidatarios de la zona

natural protegida hicieron un llamado a las autoridades para que apoyen y trabajen en la preservación del sitio.

Según una publicación del 12 de julio de 2012, si bien comentan que el decreto publicado en 2003 fue un paso

importante, hace falta más atención para lograr los objetivos planteados. En el periodo de 2004 a 2009 se invirtió

un poco de recurso que permitió la realización de obras y acciones para captación de agua y reforestación de 60 mil

árboles. Sin embargo, no solo se debe reforestar por reforestar, hay que tomar cuenta la estructura del bosque, su

composición, la relación o asociación de las especies de árboles con organismos de los cuales dependen, por lo que

el estudio de los microorganismos nativos que potencialmente se puedan usar como biofertilizantes puede ser parte

de la estrategia para mejorar sustancialmente la sobrevivencia de los árboles, ya que allí radica uno de los

problemas asociados con la reforestación, la sobrevivencia.

Estado del uso de Tecnologías





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2013 Las estrategias de mejoramiento van desde aplicación de las tecnologías de compostaje y co-compostaje utilizadas

para transformar residuos orgánicos en productos que pueden ser usados de modo seguro y benéfico como

biofertilizantes del suelo; prácticas más apuntan hacia el uso potencial de inoculantes microbianos para controlar la

microflora del suelo y lograr un ambiente más favorable para una producción y protección óptimas de cultivos.

(Parr et al, 2006).

Para estudiar la diversidad microbiológica del suelo se han utilizado principalmente dos tipos de técnicas: las

técnicas bioquímicas y las técnicas basadas en Biología molecular. Dentro de las técnicas moleculares se incluye la

clonación de ADN, secuenciación y otros métodos basados en PCR (Kirk et al; 2004).

Se reconoce que hasta el 99% no son cultivables por técnicas estándar de laboratorio, lo que hace indispensable la

implementación de métodos independientes de cultivo, como la metagenómica, para acceder a la diversidad

genética y la estructura de la población con el fin de aprovechar este conocimiento en procesos de bioprospección

(Tyson et al; 2004).

1.5 Objetivos

Precise los propósitos que se cumplirán con el desarrollo del proyecto de forma cualitativa (objetivos generales y

particulares descritos con verbo en infinitivo), (máximo una cuartilla).

Determinar la mejor especie de hongo ectomicorrícico en encinos del Área Natural Protegida “Cerro

del Cubilete” y su potencial biotecnológico para sobrevivencia en reforesaciones.

Objetivos particulares

1. Establecimiento de la relación existente entre las características edafológicas del suelo y los

hongos ectomicorrícicos asociada a los árboles de encinos.

2. Colección de aislados que potencien del bosque de encinos.

3. Selección de las especies con capacidad de potenciar el crecimiento y desarrollo de las

plantas.

1.6 Metas

Especifique los resultados a obtener en forma cuantitativa, (máximo una cuartilla).

Indicador Número Etapa (s) en que se lograra

Base de datos 1 Final

Lista de microorganismos con

bioprospección

1 Final

Proyectos en proceso de titulación o Tesis

de licenciatura

1 Final

Manuscrito de artículo para publicación 1 Final

1.7 Impacto o beneficio en la solución a un problema relacionado con el sector productivo o la

generación del conocimiento científico o tecnológico.





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2013 Sustente la realización de su proyecto respecto a la magnitud del problema, la trascendencia de su estudio, su

factibilidad, vulnerabilidad e impacto social, congruencia con la línea de investigación e impacto en el programa

educativo, acreditación, permanencia o ingreso al PNPC, SNI, etc., (máximo dos cuartillas).

El presente proyecto tiene como principal finalidad la determinación de los hongos de tipo simbiontes denominados

ectomicorrizas que en algunos casos son llamados biofertilizantes, dado que tienen la habilidad de proveer

nutrientes a los árboles, además de agua. En este sentido, uno de los problemas derivasdos de la reforestación es la

sobrevivencia de los pepueños árboles recien plantados, por lo que si se determinan a aquellos microorganismos

nativos con los que de manera natural se asocian en simbiosis y les proveen ventajas como las descritas

anteriormente, los árboles sufren un periodo de adaptación menor y se adaptan mejor a las nuevas condiciones. Sin

embargo es necesario no solo saber cuales microorganismos son benéficos, sino tambien generar una estratagia para

cultivarlos, aumentarlos para que puedan ser suministrados desde una etapa temprana de vivero. Además es

necesario tambien determinar la mejor época para suministrarlos como fuente de inóculo y la mejor época para el

transplante. Sin ambargo, no es una tarea sencilla, requiere de fases de estudio y establecimiento de cada etapa,

como la determinación inicial de las especies de hongos ectomicorrícicos directamente en simbiosis, aspecto que no

es posible sin las herramientas moleculares, la determinación de las condiciones edáficas para sobrevivencia, el

cultivo en el laboratorio y la manipulación de las especies de ectomicorrizas de interés para lograr reproducirlas

adecuadamente en sustratos y que éstos se puedan estabilizar y mantener por periodos relativamente largos de

tiempo sin cambios significativos en su viabilidad y por último generar un sistema de manejo integrado que permita

estandarizar las prácticas durante el proceso completo.

Actualmente la CONAFOR produce solamente algunas especies forestales y muy por debajo de la demanda para

satisfacer la reforestación de las superficies de aprovechamiento forestal. Una cantidad importante de planta la

compra a viveros particulares y alguna otra a viveros de ejidos y comunidades que en alguna vez apoyó con

programas para generación de viveros. Plantas de mala calidad, sustrato inadecuado, tamaño muy pequeño, época

de transplante incorrecta, poca disponibilidad de agua, desconocimiento de microorganismos benéficos nativos por

especie y región, entre otros son los problemás más comunes que hacen que de los millones y millones de árboles

plantados en los programas de reforestación apenas sobrevivan unos cuantos y en malas condiciones. Por lo tanto,

este proyecto y su continuidad, pretenden incidir de una manera clara y objetiva, de tal forma que se puedan

integrar programas de reforestación más acordes y eficaces.

1.8 Metodología

Explique el o los procedimientos científico- metodológicos a seguir para cumplir los objetivos y metas del

proyecto, indicando las pruebas estadísticas, diseño experimental y técnicas a utilizar (máximo tres cuartillas).

Muestreo general

1. Muestreo de suelos

Las muestras de suelo se guardarán en bolsa de nylon con cierres y se guardará en el laboratorio ITESI a 4°C. Las

muestras de suelo se tomaran siguiendo las metodologías establecidas en zonas altamente impactada, en fase de

recuperación y en zonas no perturbadas. Se utilizó un arreglo factorial (3×2×4) que contempla 3 niveles de

vegetación (masas puras de pi¬nos, masas puras de encinos y masas mezcladas con ambos géneros), 2 de

exposición (oriente y poniente) y 4 de altitud (que abarcan desde los 1 600 m s. n. m. a 2 200 m s. n. m.), con un

total de 24 combinacio¬nes (zonas de muestreo) que se ubicaron por medio de cartas de uso de suelo, de fisiografía

y vegetación del Instituto Nacional de Estadística, Geografía e In¬formática (INEGI) a escala 1:50 000. En cada

una de zona de muestreo se ubicaron aleatoriamente tres parcelas (repeticiones) de 1 000 m2, sumando un total de

72 parcelas. En cada una de las parcelas se hizo la planimetría de los árboles existentes a evaluar con el método del

acimut.. Se realizarán muestreos en los sitios seleccionados colectando hojas sanas de cada una de las

especies de encino. Se colectará una muestra de cada especie en cada sitio de estudio cuidando una





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2013 distancia entre los ejemplares muestreados de al menos 100 m para disminuir la relación parental entre los

individuos. Posteriormente las hojas serán liofilizadas y guardadas a -20°C.

Muestreo para raíces ectomicorrizadas

Se efectuarán 2 visitas al área de estudio en de manera que coincidan con la época de lluvias y secas, llevando a

cabo recorridos al azar a lo largo del bosque de Quercus, (muestreo oportunista, O’ Dell et al., 2004), contrastando

entre una zona con alto impacto antropogénico y otra zona con relativo grado de conservación. Para el aislamiento

de microorganismos se tomarán al menos 5 muestras representativas de cada condición a diferentes profundidades,

dependiendo del perfil del suelo. Para los análisis físico-químicos de suelo se tomarán 15 submuestras para preparar

una muestra representativa de cada condición. Para las raíces con ectomicorrizas se utilizará el horizonte A

utilizando muestreador tubular de 5 cm de diámetro, las cuales serán mantenidas en fresco en hielera durante su

transporte y almacenadas en refrigerador a 4 – 8 °C por no más de una semana.

Caracterización físico-química del suelo

La caracterización físico-química está centrada en la determinación del perfil, tipo de suelo, pH, Conductividad

Eléctrica, Nitrógeno, Fósforo Potasio, sodio, Calcio, Magnesio, Materia Orgánica, densidad aparente y textura del

suelo. Las determinaciones anteriores se realizarán para cada tipo de condición (impactada y conservada),

realizando una comparativa de los valores obtenidos y su relación con el impacto observado.

Aislamiento y caracterización de ectomicorrizas

Limpieza y clasificación de las raíces con ectomicorrízas

Las muestras de suelo de manera individual serán remojadas en agua durante toda la noche y posteriormente se

enjuagarán y se filtrarán usando una combinación de dos tamices con tamaño de malla 1.0 y 0.5 mm. Las raíces

lavadas serán removidas con ayuda de unas pinzas y colocadas en agua destilada. La separación final de las raíces

se realizará bajo un estereoscopio. Todas las raíces cortas laterales que presenten la estructura del manto serán

consideradas con ectomicorríza (Stendell y col., 1999; Karén y col., 1997). Las raíces con ectomicorríza (REM)

serán clasificadas de acuerdo a su morfotipo. Los criterios para clasificar las REM dentro de diferentes morfotipos

se basarán en el color, textura, patrones de ramificación y características del manto tales como cistidas. Los

morfotipos obtenidos serán posteriormente comparados con otras descripciones publicadas de ectomicorrízas

(Agerer 1987-1998; Massicotte y col., 1999; Baxter y col., 1999; Peter M y col., 2001; Wurzburger y col., 2001).

Las REM de un mismo morfotipo de cada punto de muestreo serán colocados en tubos de plástico de centrífuga de

1.5 mL y se guardarán a -70ºC hasta su utilización.

Aislamiento de ADN de morfotipos ectomicorrícicos

Para las muestras de tejido fúngico proveniente de morfotipos ectomicorrícicos se utilizará el método desarrollado

por Vázquez-Marrufo (2003). Se utilizarán ápices de cada morfotipo debidamente caracterizados o micelio

proveniente de cultivo aislado en medio sólido a los cuales se les agregará N2 en un tubo de microcentrífuga de 1.5

mL y se molerán con la ayuda de un micropistilo hasta obtener un polvo fino. Todos los pasos y centifugaciones se

regulador de lisis (tris-HCl 100 mM pH 8.5, EDTA 50 mM, NaCl 50 mM, SDS 10% (w/v)), agitándose

vigorosamente durante

vigorosamente durante 1 min, colocándose las muestras en hielo durante 15 min. Posteriormente, las muestras se

centrifugarán a 8500xg durante 15 min, se recuperarán las fases acuosas y se mezclarán con el mismo volumen de

isopropanol frío incubándose las muestras a - durante 15 min. Se

descartará el sobrenadante y la pastilla se lavará dos veces con etanol al 70%, resuspendiéndola

finalmente en el mínimo volumen de agua desionizada esterilizada (20-





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2013 Amplificación del ADN.

Para el ADN obtenido de cada morfotipo la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se

resultados de amplificación reproducibles. La amplificación de la región Interespaciadora (ITS) del DNA se

realizará utilizando los iniciadores específicos para basidiomicetes ITS1-F (5´-

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3´) e ITS4-B (5´-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3´) de acuerdo a

Gardes y Bruns (1993.

El volumen final de reacción será -HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 0.2 mM de

de enzima Taq polimerasa. La visualización de los productos de amplificación se realizará por técnicas

convencionales en geles de agarosa al 2% (Sambrock y col. 1989). El registro de la imagen se efectuará en un

sistema de captura de imágenes digitales y si solamente una banda de DNA se encuentra presente por muestra

(confirmando que el DNA proviene de una sola fuente) el producto de amplificación será purificado en columnas y

posteriormente enviado a secuenciación. La no presencia de banda amplificada por PCR para un aislado específico

se tomará como indicador de que el hongo no pertenece a los basidiomicetes, En este caso, será realizada la

extracción del ADN con iniciador ITS-4 universal. El tamaño de la banda esperada varía entre 600-950 pares de

bases (Horton y Bruns, 2001).

1.9 Programa de actividades (cronograma de trabajo)

Conforme a las etapas que integran el desarrollo de su proyecto, enliste las actividades a realizar y calendarice indicando periodos.

N

o

Actividad Responsable de

la actividad

Periodo de realización

(fecha inicio y término)

Justificación

1. Caracterización suelo y

ectomicorrizas

Francisco Alejo

Iturvide

Noviembre – Febrero de 2014 Resultados del análisis físico

químico de suelos.

Base de datos de cepas

ectomicorrícicas para uso potencial

en viveros forestales.

2. Caracterización y

bioprospección de bacterias

promotoras de crecimiento

Gustavo A. de la

Riva de la Riva

Diciembre - abril de 2014 Base de datos con cepas

bacterianas y características

distintivas.

Clasificación y manejo del cepario

microbiano.

3. Caracterización y selección

de levaduras para el

mejoramiento de suelos

Claudia Isela

González López

Enero – Agosto de 2015 Lista de aislados fúngicos

levaduriformes y sus actividades

fisiológicas para incorporación en

el mejoramiento de suelos

forestales.

4. Caracterización molecular de

microorganismos.

Juan Gualberto

Colli Mull

Marzo – Noviembre de

2015

Base de datos de caracterización e

identificación molecular de

microorganismos aislados.

5.

1.10 Productos entregables

Especifique los productos y beneficios a obtener, máximo una cuartilla.

Entregables del anteproyecto.





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2013 1. Base de datos con la información sobre diversidad de la microflora asociada a encinos de la zona de estudio..

2. Evaluación del potencial biotecnológico de los aislados cómo biofertilizante, control de plagas y estimulación

de crecimiento.

3. Dos Proyectos de Titulación o Tesis de Licenciatura sobre los temas: Aislamiento de microorganismos

(bacterias y hongos) de rizósfera.

1.11 Vinculación con el Sector Productivo.

Especifique el nombre de la empresa y tipo de cooperación que existirá, así como la responsabilidad en los

resultados del proyecto. Anexe carta compromiso, o mencione los usuarios potenciales de los resultados de su

investigación así como la vinculación que se tiene con otras instituciones y su entorno.

El proyecto está enfocado en un Área Natural Protegida, específicamente “Cerro del Cubilete” el cual aunque

actualmente está dentro del estatus de área protegida, por su uso histórico y actual a sufrido el impacto y deterioro

por su explotación excesiva de los recursos naturales, sobre todo la reducción drástica del área de bosque, lo que

impacta en la cada vez menor captación de agua de las microcuencas hidrológicas en las que tiene su influencia. En

el programa de manejo del Área se establecen acciones que deberán realizarse tanto en el corto, mediano y largo

plazo en materia ambiental para su rescate y conservación, que enuncia directamente el Instituto de Ecología del

Estado de Guanajuato, y que la ahora PAOT refrenda en programa de protección al ambiente. Por tanto, nosotros

dentro del Cuerpo Académico de la Licenciatura en Biología del Instituto Tecnológico Superior de Irapuato, con

fuerte apoyo en infraestructura de la Procuraduría Ambiental y Ordenamiento Territorial del Estado de Guanajuato, hemos formado una Estación Biológica, en la cual estamos comprometidos con la realización de estudios

ambientales sobre todo de las Áreas Naturales Protegidas, con el desarrollo de proyectos que contribuyan en las

acciones de conocimiento de la flora y fauna, impacto ambiental así como restauración y conservación. De esta

manera son varios los usuarios que derivados de la realización de los estudios podrían beneficiarse, pero sobre

todo, los beneficiarios finales somos nosotros todos los que vivimos en el la zona de influencia del esta ANP.

1.12 Referencias

Enuncie las referencias consultadas para la descripción del estado del campo o del arte, planteamiento y desarrollo

del proyecto.

Hong, S.H., J. Bunge, S.O. Jeon, y S.S. Epstein, 2006. Predicting microbial species richness. Proceedings of the

National Academy of Sciences, 103(1): 117-122.

Horton T R and Bruns T D 2001 The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology: peeking into the black-

box. Mol. Ecol. 10, 1855–1871.

Instituto Estatal de Ecología del Estado de Guanajuato (IEE) 2006. Reglas de operación para el manejo del

Fideicomiso “Fondo para el Mejoramiento y Descentralización Ambiental del Estado de Guanajuato”.

Kirk, J. L., L. A. Beaudette, M. Hart, P. Moutoglis, J. N. Klironomo, H. Lee, and J. T. 2004. Trevors. Methods of

studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods 58:169-188.

Nogales, B. 2005. La microbiología del suelo en la era de la biología molecular: descubriendo la punta del

iceberg. Ecosistemas 14 (2): 41-51. http://www.revistaecosistemas.net/articulo.asp?Id=116

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2013

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Tyson G.W., Chapman J., Hugenholtz P., Allen E.E., Ram R.J., Richardson P.M., Solovyev V.V., Rubin E.M.,

Rokhsar D.S. and Banfield J.F. 2004. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial

genomes from the enviroment. Nature. 428. 37 -43.

2. LUGAR(ES) EN DONDE SE VA A DESARROLLAR EL PROYECTO

Especifique el nombre de la Sección, Departamento, Taller o Laboratorio en que se realizará el proyecto, mencionando

la dirección exacta del lugar. Si el proyecto requiere de pruebas de campo, indique: estado, región, zona y municipio,

así como la distancia en Km. con respecto al plantel.

El desarrollo del proyecto se llevará a cabo en el Área Natural Protegida del Cerro del Cubilete, que se localiza en la

región Centro-Oeste del Estado. El acceso se realiza a través de la carretera federal No. 45, después por la carretera

federal No. 110 y posteriormente por un camino revestido que es el acceso principal al área. El tipo de vegetación que se

encuentra en el Área Natural Protegida “Cerro del Cubilete”, es predominantemente matorral subtropical, así como

relictos de bosques templados latifoliadas con diversos grados de alteración, debido entre otros factores al cambio del

uso de suelo para actividades agrícolas, sobrepastoreo y extracción de leña. En el Área se catalogarán zonas con

diferente grado de impacto en suelo y vegetación, principalmente entre el remanente de bosque de encino y zonas de

transición hacia actividad agrícola para determinar el impacto y aislamiento de microorganismos benéficos

potencialmente útiles para su implementación en rescate, reforestación y disminución del impacto ambiental.

3. INFRAESTRUCTURA

Mencione la infraestructura disponible en el plantel para el desarrollo del proyecto. Indique si va a hacer uso de las

instalaciones en otras instituciones o dependencias y si cuenta con convenios de colaboración, anexe una fotocopia del

mismo.

El Instituto Tecnológico Superior de Irapuato (ITESI) es una institución superior descentralizada adscrita a la Secretaría

de Educación de Guanajuato (SEG) y a Secretaría de Educación Pública (SEP). Tiene 15 años de fundado y posee una

matrícula de más de 5 000 estudiantes en 13 carreras universitarias y 3 postgrados. El departamento de Biología fue

fundado hace 5 años tiene 16 profesores, entre ellos 7 Doctores en Ciencia, de los cuales 4 pertenecen al Sistema

Nacional de Investigadores; y 5 Maestros en Ciencia. Contamos con un Laboratorio general de microbiología y una

Estación Biológica de usos múltiples para trabajos de microbiología, fisiología, manejo y estudio de flora y fauna

silvestre. El laboratorio de Microbiología dispone de las siguientes capacidades, pero comparte sus funciones con las de

laboratorio docente lo que se dificulta la actividad de investigación en general.

a) Infraestructura de laboratorio participante:

1. Campana Flujo laminar para microbiología

2. Centrífuga tipo eppendorf hasta 12000 rpm

3. Centrífuga de Mesa hasta 4000 rpm

4. Agitador orbital

5. Equipo de PCR.

6. Parrillas de Calentamiento

7. Cámaras de electroforesis de proteína

8. Cámara de electroforesis de ADN/ARN para muestras m

9. Destilador de Agua





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2013 10. PH metros

11. Microscopios

12. Estereoscopios.

13. Incubadoras de 28°C

14. Incubadora de 37°C

15. Refrigeradores

16. Congelador -20°C

17. Ultra congelador -85°C

18. Cristalería apropiada





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2013

Profesor-Investigador Responsable

Dr. Francisco Alejo Iturvide

Nombre y Firma

4. RESUMEN PRESUPUESTO UTILIZADO PARA LA OPERACIÓN DEL PROYECTO

4.1 Concentrado del presupuesto utilizado

Partida Monto otorgado por

la Institución o Programa

Monto otorgado por

otras Instituciones TOTAL

2000 25,000 25,000 50,000

3000 10,000 10,000 20,000

TOTAL

35,000 35,000 70,000



registro de proyectos protocolo de investigaciÓn 2013 (cr

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